能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌及構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌及構(gòu)建方法及應(yīng)用，能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法，步驟為：①將spnk表達(dá)盒插入大腸桿菌-刺糖多孢菌穿梭質(zhì)粒pOJ260，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLU101；②將重組質(zhì)粒pLU101導(dǎo)入刺糖多孢菌（Saccharopolyspora?spinosa）ATCC49460中，重組質(zhì)粒通過同源重組整合至基因組，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌，命名為LU101；本發(fā)明的方法構(gòu)建的基因工程菌，能使多殺菌素的產(chǎn)量提高。
【專利說明】能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌及構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種高產(chǎn)多殺菌素的基因工程菌及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多殺菌素是由放線菌刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)發(fā)酵產(chǎn)生的21碳的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，包含兩個脫氧糖:3-0-甲基化鼠李糖和福樂糖胺。多殺菌素A和D是在刺糖多胞菌發(fā)酵液中兩個主要組分。多殺菌素已顯示出廣譜的殺蟲活性，是環(huán)境友好且對哺乳動物無藥害的生物聞效殺蟲劑。多殺菌素類綠色殺蟲劑因其低風(fēng)險，無特定祀向物種，環(huán)境影響小，對人畜毒性低等特點被授予1999年的總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎。
[0003]多殺菌素合成途徑由27個基因編碼。五個基因(SpnA, spnB, spnC, spnD和spnE)編碼I型聚酮合成酶(PKS);四個基因(spnF，spnj, spnL, spnM)轉(zhuǎn)換聚酮合成酶的產(chǎn)物；spnG, spnH, spnl和spnK與鼠李糖的附著和甲基化有關(guān)；spnP, spnO, spnN, spnQ, spnR和spnS涉及福樂糖胺的合成；四個基因(0RF-L15，0RF-L16, ORF-Rl, 0RF-R2)不參與多殺菌素的合成；另外四個與鼠李糖合成有關(guān)的基因(gtt，gdh, epi和kre)在基因組的其他區(qū)域而不是基因族中。Madduri 等(Madduri K, et al.Journal of Industrial Microbiologyand Biotechnology, 2001a, 27:399-402)研究發(fā)現(xiàn)，刺糖多胞菌在整個發(fā)酵期都會積累缺少福樂糖胺的中間體pseudoaglycones (PSA)0通過過表達(dá)帶有原始啟動子的鼠李糖合成基因，可以明顯提高多殺菌素的產(chǎn)量[Madduri K, et al.Journal of bacteriology, 2001b, 183:5632-5638]。Pan 等(Pan HX, et al.Biotechnology letters,2011，33:733-739)也通過過表達(dá)PermE*啟動子控制下的鼠李糖合成基因，使多殺菌素產(chǎn)量提高了 3.8倍。Kim等(Kim HJ, White-Phillip JA, Ogasawara Y, et al.Journal of the American ChemicalSociety, 2010, 132(9):2901-2903)發(fā)現(xiàn)，降低spnH的細(xì)胞濃度或者提高spnK的細(xì)胞濃度可以增加PSA的產(chǎn)量。但是上述研究忽視了多殺菌素合成途徑的不平衡的問題。這種不平衡表現(xiàn)為:(I) spnP, spnO, spnN, spnQ, spnR和spnS這六個基因在多殺菌素生物合成途徑中的表達(dá)不足；(2)刺糖多胞菌積累非多殺菌素類化合物是因為spnK表達(dá)量少，使合成多殺菌素的前體通過其它途徑被消耗掉了。因此，通過構(gòu)建理性的菌株改進策略，調(diào)整不平衡的多殺菌素合成途徑，從而提高多殺菌素的產(chǎn)量是亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0005]本發(fā)明的第二個目的是提供一種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌。
[0006]本發(fā)明的第三個目的是提供第二種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明的第四個目的是提供第二種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌。[0008]本發(fā)明的第五個目的是提供第三種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法。
[0009]本發(fā)明的第六個目的是提供第三種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌。
[0010]本發(fā)明的第七個目的是提供第一種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的用途。
[0011]本發(fā)明的第八個目的是提供第二種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的用途。
[0012]本發(fā)明的第九個目的是提供第三種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的用途。
[0013]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下: [0014]一種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0015]①將spnK表達(dá)盒插入大腸桿菌-刺糖多孢菌穿梭質(zhì)粒p0J260,構(gòu)建重組質(zhì)粒pLUlOl ；
[0016]②將重組質(zhì)粒pLUlOl 導(dǎo)入刺糖多抱菌(Saccharopolyspora spinosa)ATCC49460中，重組質(zhì)粒通過同源重組整合至基因組，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌，命名為LUlOl ；
[0017]所述spnK表達(dá)盒由ermE*啟動子、spnK編碼基因和spnK終止子組成；
[0018]所述ermE*啟動子的序列是SEQ ID N0.23所示；spnK編碼基因的序列是SEQ IDN0.13所示。
[0019]上述構(gòu)建方法構(gòu)建的能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LUlOl。
[0020]第二種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0021]①將spnK表達(dá)盒插入大腸桿菌-刺糖多孢菌穿梭質(zhì)粒p0J260,構(gòu)建重組質(zhì)粒pLUlOl ；
[0022]②將spnN表達(dá)盒、spnO表達(dá)盒、spnP表達(dá)盒、spnQ表達(dá)盒、spnR表達(dá)盒和spnS表達(dá)盒,通過粘性末端酶切連接方法插入重組質(zhì)粒pLUlOl，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLU102 ；
[0023]③將所述重組質(zhì)粒pLU102導(dǎo)入刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)ATCC49460中，重組質(zhì)粒通過同源重組整合至基因組，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌,命名為LU102 ；
[0024]所述spnK表達(dá)盒由ermE*啟動子、spnK編碼基因和spnK終止子組成；
[0025]所述spnN表達(dá)盒由spnN啟動子、spnN編碼基因、spnN終止子組成；
[0026]所述spnO表達(dá)盒由spnO啟動子、spnO編碼基因、spnO終止子組成；
[0027]所述spnP表達(dá)盒由spnP啟動子、spnP編碼基因、spnP終止子組成；
[0028]所述spnQ表達(dá)盒由spnQ啟動子、spnQ編碼基因、spnQ終止子組成；
[0029]所述spnR表達(dá)盒由spnR啟動子、spnR編碼基因、spnR終止子組成；
[0030]所述spnS表達(dá)盒由spnS啟動子、spnS編碼基因、spnS終止子組成。
[0031]所述ermE*啟動子的序列是SEQ ID N0.23所示；
[0032]所述spnK編碼基因的序列是SEQ ID N0.13所不；
[0033]所述spnN編碼基因的序列是SEQ ID N0.14所示；
[0034]所述spnO編碼基因的序列是SEQ ID N0.15所示；
[0035]所述spnP編碼基因的序列是SEQ ID N0.16所示；
[0036]所述spnQ編碼基因的序列是SEQ ID N0.17所示；
[0037]所述spnR編碼基因的序列是SEQ ID N0.18所示；[0038]所述spnS編碼基因的序列是SEQ ID N0.19所示。
[0039]第二種構(gòu)建方法構(gòu)建的能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU102。
[0040]第三種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0041]①將spnK表達(dá)盒插入大腸桿菌-刺糖多孢菌穿梭質(zhì)粒p0J260,構(gòu)建重組質(zhì)粒pLUlOl ；
[0042]②將spnN表達(dá)盒、spnO表達(dá)盒、spnP表達(dá)盒、spnQ表達(dá)盒、spnR表達(dá)盒和spnS表達(dá)盒、通過粘性末端酶切連接方法插入重組質(zhì)粒pLUlOl，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLU102 ；
[0043]③將gtt表達(dá)盒、gdh表達(dá)盒和kre表達(dá)盒插入重組質(zhì)粒pLU102,構(gòu)建重組質(zhì)粒PLU104 ；
[0044]④將所述重組質(zhì)粒pLU104導(dǎo)入刺糖多抱菌(Saccharopolyspora spinosa)ATCC49460中，重組質(zhì)粒通過同源重組整合至基因組，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌，命名為LU 104 ；
[0045]所述spnK表達(dá)盒由ermE*啟動子、spnK編碼基因和spnK終止子組成；
[0046]所述spnN表 達(dá)盒由spnN啟動子、spnN編碼基因、spnN終止子組成；
[0047]所述spnO表達(dá)盒由spnO啟動子、spnO編碼基因、spnO終止子組成；
[0048]所述spnP表達(dá)盒由spnP啟動子、spnP編碼基因、spnP終止子組成；
[0049]所述spnQ表達(dá)盒由spnQ啟動子、spnQ編碼基因、spnQ終止子組成；
[0050]所述spnR表達(dá)盒由spnR啟動子、spnR編碼基因、spnR終止子組成；
[0051]所述spnS表達(dá)盒由spnS啟動子、spnS編碼基因、spnS終止子組成；
[0052]所述gtt表達(dá)盒由ermE*啟動子、gtt編碼基因和gtt終止子組成；
[0053]所述gdh表達(dá)盒由ermE*啟動子、gdh編碼基因和gdh終止子組成；
[0054]所述kre表達(dá)盒由ermE*啟動子、kre編碼基因和kre終止子組成。
[0055]所述ermE*啟動子的序列是SEQ ID N0.23所示；
[0056]所述spnK編碼基因的序列是SEQ ID N0.13所示；
[0057]所述spnN編碼基因的序列是SEQ ID N0.14所示；
[0058]所述spnO編碼基因的序列是SEQ ID N0.15所示；
[0059]所述spnP編碼基因的序列是SEQ ID N0.16所示；
[0060]所述spnQ編碼基因的序列是SEQ ID N0.17所示；
[0061]所述spnR編碼基因的序列是SEQ ID N0.18所示；
[0062]所述spnS編碼基因的序列是SEQ ID N0.19所示；
[0063]所述gtt編碼基因的序列是SEQ ID N0.20所示；
[0064]所述gdh編碼基因的序列是SEQ ID N0.21所不；
[0065]所述kre編碼基因的序列是SEQ ID N0.22所示。
[0066]第三種構(gòu)建方法構(gòu)建的能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU104。
[0067]能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU101在發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素中的應(yīng)用。
[0068]能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU102在發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素中的應(yīng)用。
[0069]能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU104在發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素中的應(yīng)用。
[0070]本發(fā)明的優(yōu)點:
[0071]1、實驗證明，本發(fā)明通過理性的刺糖多孢菌改造策略，為了使帶有鼠李糖糖苷配基的大環(huán)(R-AGL)更多的朝著擬甙元(PSA)合成的方向進行，基因spnK在刺糖多孢菌中被過表達(dá)，提高了刺糖多孢菌中spnK的活性，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU101，其多殺菌素產(chǎn)量達(dá)到87mg/L，且PSA產(chǎn)量達(dá)到97mg/L，野生菌種刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa) ATCC49460PSA 產(chǎn)量為 29mg/L, PSA 與野生菌種相比產(chǎn)量提高了 3.3倍。
[0072]2、為了解決福樂糖胺合成量不夠的問題，參與福樂糖胺合成的六個基因(spnP，spnO, spnN, spnQ, spnR和spnS)和spnK被共同表達(dá),進一步提高了初始工程菌的spnP,spnO, spnN, spnQ, spnR, spnS的活性，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU102，在這株基因工程菌中多殺菌素的產(chǎn)量達(dá)到214mg/L，比野生菌種(82mg/L)高2.6倍，而PSA的產(chǎn)量則降低到13mg/L，使得積累的PSA轉(zhuǎn)化成了多殺菌素。
[0073]3、為進一步提高多殺菌素的產(chǎn)量，在基因工程菌LU102的基礎(chǔ)上又提高gtt，gdh和 kre 基因的活性，在過表達(dá)了 gtt, gdh, kre, spnP, spnO, spnN, spnQ, spnR, spnS 和 spnK基因后，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU104，通過發(fā)酵驗證，基因工程菌LU104的多殺菌素的產(chǎn)量達(dá)到了 405mg/L，多殺菌素的發(fā)酵單位較野生菌株提高了 5倍?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0074]圖1為重組質(zhì)粒構(gòu)建過程圖。
[0075]圖2是重組質(zhì)粒pLUlOl的質(zhì)粒圖譜。
[0076]圖3是重組質(zhì)粒pLU102的質(zhì)粒圖譜。
[0077]圖4是重組質(zhì)粒pLU104的質(zhì)粒圖譜。
[0078]圖5是多殺菌素野生菌株與多殺菌素基因工程菌發(fā)酵結(jié)果。
[0079]圖6是重組質(zhì)粒pLUlOl驗證電泳圖。
[0080]圖7是重組質(zhì)粒pLU102驗證電泳圖。
[0081]圖8是重組質(zhì)粒pLU104驗證電泳圖。
【具體實施方式】
[0082]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0083]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0084]實施例1、基因兀件克隆和含有對應(yīng)基因原件的質(zhì)粒構(gòu)建
[0085]將包含ermE*啟動子(SEQ ID N0.23)的pIB139質(zhì)粒用HindIII和XbaI酶切消化，所用酶為Fermentas Fast Taq限制性內(nèi)切酶,酶切體系如下:目的DNA片段30ng,加入2 μ LlOXbuffer，限制性內(nèi)切酶HindIII和XbaI各I μ L(內(nèi)切酶最后加入)，補充蒸餾水至20 μ L0將酶切體系置于37°C 30min，得到0.3kb的包含ermE*啟動子的HindIII/Xbal片段。將該HindIII/Xbal片段插入質(zhì)粒p0J260，得到p0J261質(zhì)粒。
[0086]用引物對spnK-F-Ndel (SEQ ID N0.1)和 spnK-R-Xbal (SEQ ID N0.2)從刺糖多胞菌(Saccharopolyspora spinosa) ATCC49460 (以下簡稱刺糖多胞菌 ATCC49460)染色體中獲取spnK基因序列并擴增，再用Ndel和Xbal酶切消化spnK的PCR產(chǎn)物。隨后將處理過的片段插入到同樣被Ndel和Xbal酶切消化的p0J261質(zhì)粒中，得到重組pLUlOl質(zhì)粒，質(zhì)粒驗證見圖6。[0087]本發(fā)明所用per酶為北京全式金生物技術(shù)有限公司的pfu聚合酶，PCR擴增體系如下:依照下述在冰上配制PCR反應(yīng)體系，先加水，最后加pfu聚合酶；
[0088]
【權(quán)利要求】
1.一種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟: ①將SpnK表達(dá)盒插入大腸桿菌-刺糖多孢菌穿梭質(zhì)粒P0J260,構(gòu)建重組質(zhì)粒pLUlOl； ②將重組質(zhì)粒pLUlOl導(dǎo)入刺糖多抱菌(Saccharopolysporaspinosa) ATCC49460中，重組質(zhì)粒通過同源重組整合至基因組，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌，命名為LUlOl ； 所述spnK表達(dá)盒由ermE*啟動子、spnK編碼基因和spnK終止子組成； 所述ermE*啟動子的序列是SEQ ID N0.23所示；spnK編碼基因的序列是SEQ ID N0.13所示。
2.權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法構(gòu)建的能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU101。
3.一種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟: ①將spnK表達(dá)盒插入大腸桿菌-刺糖多孢菌穿梭質(zhì)粒p0J260,構(gòu)建重組質(zhì)粒pLUlOl； ②將spnN表達(dá)盒、spnO表達(dá)盒、spnP表達(dá)盒、spnQ表達(dá)盒、spnR表達(dá)盒和spnS表達(dá)盒,通過粘性末端酶切連接方法插入重組質(zhì)粒pLUlOl，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLU102 ； ③將所述重組質(zhì)粒pLU102導(dǎo)入刺糖多抱菌(Saccharopolysporaspinosa)ATCC49460中，重組質(zhì)粒通過同源重組整合至基因組，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌，命名為LU102 ； 所述spnK表達(dá)盒由ermE*啟動子、spnK編碼基因和spnK終止子組成； 所述spnN表達(dá)盒由spnN啟動子、spnN編碼基因、spnN終止子組成； 所述spnO表達(dá)盒由spnO啟動子、spnO編碼基因、spnO終止子組成； 所述spnP表達(dá)盒由spnP啟動子、spnP編碼基因、spnP終止子組成； 所述spnQ表達(dá)盒由spnQ啟動子、spnQ編碼基因、spnQ終止子組成； 所述spnR表達(dá)盒由spnR啟動子、spnR編碼基因、spnR終止子組成； 所述spnS表達(dá)盒由spnS啟動子、spnS編碼基因、spnS終止子組成。 所述ermE*啟動子的序列是SEQ ID N0.23所示； 所述spnK編碼基因的序列是SEQ ID N0.13所示； 所述spnN編碼基因的序列是SEQ ID N0.14所示； 所述spnO編碼基因的序列是SEQ ID N0.15所示； 所述spnP編碼基因的序列是SEQ ID N0.16所示； 所述spnQ編碼基因的序列是SEQ ID N0.17所示； 所述spnR編碼基因的序列是SEQ ID N0.18所示； 所述spnS編碼基因的序列是SEQ ID N0.19所示。
4.權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法構(gòu)建的能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU102。
5.一種能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是包括如下步驟: ①將spnK表達(dá)盒插入大腸桿菌-刺糖多孢菌穿梭質(zhì)粒p0J260,構(gòu)建重組質(zhì)粒pLUlOl； ②將spnN表達(dá)盒、spnO表達(dá)盒、spnP表達(dá)盒、spnQ表達(dá)盒、spnR表達(dá)盒和spnS表達(dá)盒、通過粘性末端酶切連接方法插入重組質(zhì)粒pLUlOl，構(gòu)建重組質(zhì)粒pLU102 ； ③將gtt表達(dá)盒、gdh表達(dá)盒和kre表達(dá)盒插入重組質(zhì)粒pLU102,構(gòu)建重組質(zhì)粒PLU104 ； ④將所述重組質(zhì)粒pLU104導(dǎo)入刺糖多抱菌(Saccharopolysporaspinosa)ATCC49460中，重組質(zhì)粒通過同源重組整合至基因組，得到能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌，命名為LU104 ； 所述spnK表達(dá)盒由ermE*啟動子、spnK編碼基因和spnK終止子組成； 所述spnN表達(dá)盒由spnN啟動子、spnN編碼基因、spnN終止子組成； 所述spnO表達(dá)盒由spnO啟動子、spnO編碼基因、spnO終止子組成； 所述spnP表達(dá)盒由spnP啟動子、spnP編碼基因、spnP終止子組成； 所述spnQ表達(dá)盒由spnQ啟動子、spnQ編碼基因、spnQ終止子組成； 所述spnR表達(dá)盒由spnR啟動子、spnR編碼基因、spnR終止子組成； 所述spnS表達(dá)盒由spnS啟動子、spnS編碼基因、spnS終止子組成； 所述gtt表達(dá)盒由ermE*啟動子、gtt編碼基因和gtt終止子組成； 所述gdh表達(dá)盒由ermE*啟動子、gdh編碼基因和gdh終止子組成； 所述kre表達(dá)盒由ermE*啟動子、kre編碼基因和kre終止子組成。 所述ermE*啟動子的序列是SEQ ID N0.23所示； 所述spnK編碼基因的序列是SEQ ID N0.13所示； 所述spnN編碼基因的序列是SEQ ID N0.14所示； 所述spnO編碼基因的序列是SEQ ID N0.15所示； 所述spnP編碼基因的序列是SEQ ID N0.16所示； 所述spnQ編碼基因的序列是SEQ ID N0.17所示； 所述spnR編碼基因的序列是SEQ ID N0.18所示； 所述spnS編碼基因的序列是SEQ ID N0.19所示； 所述gtt編碼基因的序列是SEQ ID N0.20所示； 所述gdh編碼基因的序列是SEQ ID N0.21所示； 所述kre編碼基因的序列是SEQ ID N0.22所示。
6.權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法構(gòu)建的能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU104。
7.權(quán)利要求2所述能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LUlOl在發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求4所述能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU102在發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求6所述能提高多殺菌素產(chǎn)量的基因工程菌LU104在發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/01GK103740631SQ201310756049
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月31日
【發(fā)明者】盧文玉, 薛超友, 張香梅 申請人:天津大學(xué)