食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型涉及一種食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒，其特征是：包括盒體、盒蓋和若干個(gè)發(fā)酵增菌容器，所述盒體內(nèi)均勻排列發(fā)酵增菌容器，所述發(fā)酵增菌容器內(nèi)設(shè)有集氣窗，所述集氣窗前端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)前壁固接，集氣窗末端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)底部固接，所述集氣窗橫向截面形狀呈開(kāi)口矩形，其縱向截面形狀呈直角三角形，所述集氣窗與發(fā)酵增菌容器固接后，在發(fā)酵增菌容器的底部呈坡度的氣泡收集空間。有益效果：通過(guò)致病菌定量檢測(cè)的數(shù)目可以定量評(píng)價(jià)檢測(cè)目標(biāo)的污染程度是否達(dá)到安全限量標(biāo)準(zhǔn)，為食品安全致病菌檢測(cè)提供了可靠的數(shù)據(jù)?？蓮V泛應(yīng)用于食品、自來(lái)水、純凈水、飲料、制藥、保健品、化妝品、疾病預(yù)防控制、出入境檢疫局等十余個(gè)行業(yè)。
【專利說(shuō)明】 食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于食品檢測(cè)，尤其涉及一種直接應(yīng)用于食品、飲用水的食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]2012年食源性致病菌檢測(cè)手冊(cè)中對(duì)部分致病菌由原有的定性檢測(cè)方法重新修訂為定量檢測(cè)方法。即，對(duì)食品中大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、阪崎腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌等致病菌、采用九管定量檢測(cè)，即九管發(fā)酵法(MPN)檢測(cè)方法。其培養(yǎng)基載體為液體培養(yǎng)基，檢測(cè)程序多達(dá)六個(gè)步驟:試劑配制、分裝、消毒、檢測(cè)、洗滌、烘烤。該方法檢測(cè)成本高、檢測(cè)周期長(zhǎng)，檢驗(yàn)方法及操作程序繁雜。專利申請(qǐng)?zhí)?201010550133.8公開(kāi)了一種對(duì)食品中的沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌進(jìn)行同時(shí)快速檢測(cè)的多重?zé)晒舛縋CR方法，其特征是由以下步驟構(gòu)成:(I)應(yīng)用一定配比的含7.5%氯化鈉肉湯和GN的混合培養(yǎng)基對(duì)含有上述致病菌的食品進(jìn)行快速同時(shí)增菌，并使用離心柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取培養(yǎng)液中的細(xì)菌基因組總DNA ; (2)應(yīng)用根據(jù)沙門氏菌的復(fù)制原點(diǎn)C基因、金黃色葡萄球菌的Nuc基因、志賀氏菌的IpaH基因設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物和Taqman探針對(duì)上述細(xì)菌基因組總DNA進(jìn)行多重?zé)晒舛縋CR同時(shí)檢測(cè)，并使用自行設(shè)計(jì)的重組DNA片段作為陽(yáng)性內(nèi)參監(jiān)控反應(yīng)體系，根據(jù)分別代表三種致病菌的熒光信號(hào)在一定循環(huán)數(shù)內(nèi)是否出現(xiàn)顯著擴(kuò)增判定食品中是否存在上述致病菌。該方法手段復(fù)雜、檢測(cè)周期很長(zhǎng)。專利申請(qǐng)?zhí)?201010556679.4公開(kāi)了一種快速檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的PCR方法，其特征是包括以下幾個(gè)步驟:(I)阪崎腸桿菌的培養(yǎng)；(2)制備阪崎腸桿菌基因組DNA ； (3)構(gòu)建阪崎腸桿菌重組質(zhì)粒,作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量；(4)構(gòu)建ompA內(nèi)標(biāo)重組質(zhì)粒，與目的基因在同一反應(yīng)體系內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增，監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系，排除假陰性；(5)建立分子信標(biāo)熒光定量技術(shù)檢測(cè)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的方法，優(yōu)化反應(yīng)條件；(6)對(duì)3種從嬰兒配方奶粉中高效提取阪崎腸桿菌的方法進(jìn)行比較；(7)確定分子信標(biāo)熒光定量方法的靈敏度；(8)人工污染樣品，確定檢測(cè)限；(9)實(shí)際檢測(cè)，確定該方法的特異性、靈敏度、符合率。該方法只針對(duì)阪崎腸桿菌的檢測(cè)，只能定性分析，不能滿足食源性致病菌檢測(cè)手冊(cè)中有關(guān)“定量檢測(cè)”的規(guī)定。食品檢測(cè)部門亟待開(kāi)發(fā)一種可以一目了然觀察檢測(cè)目標(biāo)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖過(guò)程，對(duì)檢測(cè)目標(biāo)致病菌檢測(cè)的數(shù)目可以定量評(píng)價(jià)的檢測(cè)裝置和方法。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0003]本實(shí)用新型的目的在于克服上述技術(shù)的不足，而提供一種食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒，采用定量檢測(cè)方法，通過(guò)培養(yǎng)基包被技術(shù)，將食源性致病菌相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基包被在無(wú)色透明的試劑盒載體上，檢測(cè)目標(biāo)致病菌檢測(cè)的數(shù)目可以定量評(píng)價(jià)，為食品安全提供了檢測(cè)目標(biāo)的污染程度是否達(dá)到安全限量標(biāo)準(zhǔn)。
[0004]本實(shí)用新型為實(shí)現(xiàn)上述目的，采用以下技術(shù)方案:一種食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒，其特征是:包括盒體、盒蓋和若干個(gè)發(fā)酵增菌容器，所述盒體內(nèi)均勻排列發(fā)酵增菌容器，所述發(fā)酵增菌容器內(nèi)設(shè)有集氣窗，所述集氣窗前端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)前壁固接，集氣窗末端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)底部固接，所述集氣窗橫向截面形狀呈開(kāi)口矩形，其縱向截面形狀呈直角三角形，所述集氣窗與發(fā)酵增菌容器固接后，在發(fā)酵增菌容器的底部呈坡度的氣泡收集空間。
[0005]所述盒體、盒蓋和發(fā)酵增菌容器均為無(wú)色透明體，采用能夠降解的材料制成。
[0006]所述發(fā)酵增菌容器數(shù)量為十個(gè)，發(fā)酵增菌容器在盒體中前后排列各五個(gè)。
[0007]所述發(fā)酵增菌容器觀測(cè)面的側(cè)壁上設(shè)有試驗(yàn)標(biāo)識(shí)刻線。
[0008]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型提供了一種省去了實(shí)驗(yàn)前的大量準(zhǔn)備工作，方便、快捷、準(zhǔn)確的定量測(cè)試食源性致病菌的裝置。由原來(lái)的定性檢測(cè)逐步改為定量檢測(cè)，通過(guò)上述致病菌定量檢測(cè)的數(shù)目的多少可以定量評(píng)價(jià)以上檢測(cè)目標(biāo)的污染程度是否達(dá)到安全限量標(biāo)準(zhǔn)，為食品安全致病菌檢測(cè)提供了可靠的數(shù)據(jù)。本試劑盒通過(guò)培養(yǎng)基包被技術(shù)，將培養(yǎng)基包被在無(wú)色透明的試劑盒載體上，本試劑盒提高了試驗(yàn)準(zhǔn)確性和標(biāo)準(zhǔn)化程度，簡(jiǎn)化了操作程序，縮短檢驗(yàn)時(shí)間，減輕了工作強(qiáng)度，減少了試驗(yàn)耗材，提高了工作效率。本試劑盒為一次性無(wú)菌用品，可降解再生，避免污染?？蓮V泛應(yīng)用于食品行業(yè)、自來(lái)水公司、純凈水行業(yè)、飲料行業(yè)、制藥行業(yè)、保健品行業(yè)、化妝品行業(yè)、疾病預(yù)防控制系統(tǒng)、出入境檢疫局、技術(shù)監(jiān)督部門、環(huán)境保護(hù)行業(yè)、工商管理部門等十余個(gè)行業(yè)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0009]圖1是本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0010]圖2是圖1中集氣窗的縱向截面剖視圖。
[0011]圖中:1、盒體，2、盒蓋，3、發(fā)酵增菌容器，4、集氣窗，5、試驗(yàn)標(biāo)識(shí)刻線。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合較佳實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)用新型的【具體實(shí)施方式】。
[0013]實(shí)施例
[0014]詳見(jiàn)附圖，一種食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒，包括盒體1、盒蓋2和若干個(gè)發(fā)酵增菌容器3，所述盒體內(nèi)均勻排列發(fā)酵增菌容器，本實(shí)施例的發(fā)酵增菌容器數(shù)量為十個(gè)，發(fā)酵增菌容器在盒體中前后對(duì)應(yīng)排列各五個(gè)，第1-9個(gè)發(fā)酵增菌容器為試驗(yàn)檢測(cè)容器，第10個(gè)發(fā)酵增菌容器為試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)照容器。所述發(fā)酵增菌容器內(nèi)設(shè)有集氣窗4，所述集氣窗前端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)前壁固接，集氣窗末端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)底部固接，所述集氣窗橫向截面形狀呈開(kāi)口矩形，其縱向截面形狀呈直角三角形，所述集氣窗與發(fā)酵增菌容器固接后，在發(fā)酵增菌容器的底部呈坡度的氣泡收集空間，例如:大腸埃希氏、阪崎腸桿菌主要的生化反應(yīng)是產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而產(chǎn)氣是判定這兩個(gè)致病菌的是與否的重要指標(biāo)之一，通過(guò)固定的集氣窗直接觀察其大腸埃希氏、阪崎腸桿菌產(chǎn)氣情況，對(duì)其致病菌的判定起到了重要作用。所述發(fā)酵增菌容器觀測(cè)面的側(cè)壁上設(shè)有試驗(yàn)標(biāo)識(shí)刻線5，每個(gè)發(fā)酵增菌容器的試驗(yàn)標(biāo)識(shí)刻線是符合試驗(yàn)要求的9mL、10mL的試驗(yàn)標(biāo)線。
[0015]本實(shí)用新型的優(yōu)選方案是:所述盒體、盒蓋和發(fā)酵增菌容器均為無(wú)色透明體，采用能夠降解的材料制成，為一次性無(wú)菌用品，可降解再生，避免污染。
[0016]使用方法:[0017]本試劑盒可以實(shí)現(xiàn)2012年食源性致病菌檢測(cè)手冊(cè)中規(guī)定的定量檢測(cè)方法。試劑盒培養(yǎng)基的包被:與2012年食源性致病菌檢測(cè)手冊(cè)中所規(guī)定的，大腸艾希氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、創(chuàng)傷弧菌、阪崎腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌定量檢測(cè)中所應(yīng)用的培養(yǎng)基相同。事先將濃縮月桂基硫酸鹽胰蛋白胨培養(yǎng)基、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、10%氯化鈉胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基、3%堿性蛋白胨水、李氏增菌肉湯(LBI )、改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素培養(yǎng)基包被在試劑盒中，隨時(shí)取用。通過(guò)培養(yǎng)基包被技術(shù)，將上述致病菌相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基包被放在無(wú)色透明的試劑盒載體內(nèi)。
[0018]大腸埃希氏菌的定量檢測(cè)
[0019]試劑盒使用說(shuō)明書
[0020]I適用范圍:適用于食源性致病菌大腸埃希氏菌定量(MPN)方法的檢測(cè)。
[0021]2方法原理:依據(jù)《2012年食源性致病菌監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》中的定量檢驗(yàn)方法，采用包被技術(shù)，將月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯培養(yǎng)基包被在試劑盒底部，隨時(shí)取用，省去了實(shí)驗(yàn)前的大量準(zhǔn)備工作，方便、快捷。
[0022]3試劑盒的組成:試劑盒由5個(gè)發(fā)酵增菌容器前后對(duì)應(yīng)并排共10個(gè)發(fā)酵增菌容器組成，第1-9發(fā)酵增菌容器為試驗(yàn)盒，第10發(fā)酵增菌容器為試驗(yàn)對(duì)照盒。用前加入無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌生理鹽水至盒的標(biāo)線處即為IOmL月桂基硫酸鹽胰蛋白胨培養(yǎng)基。
[0023]4操作步驟
[0024]4.1樣品制備:以無(wú)菌操作稱取檢樣25g(mL)，加入225mL磷酸鹽緩沖液或無(wú)菌生理鹽水中制備成1:10的均勻樣品稀釋液。
[0025]4.2增菌培養(yǎng):
[0026]4.2.1試劑盒的準(zhǔn)備:打開(kāi)盒蓋，試劑盒1-10發(fā)酵增菌容器中加入無(wú)菌鹽水9~IOmL即可，備用；
[0027]4.2.2加樣:選擇上述樣品勻液三個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，接種到含有月桂基硫酸鹽胰蛋白胨培養(yǎng)基的發(fā)酵增菌容器中(1-3，4-6，7-9。)，每個(gè)稀釋度接種3盒，每盒接種lmL。第10發(fā)酵增菌容器不加樣液為陰性對(duì)照，于36°C ± 1°C培養(yǎng)48h±2h ;
[0028]4.3分離培養(yǎng):對(duì)所有渾濁生長(zhǎng)，集氣窗有氣泡產(chǎn)生的試劑盒增菌液，用接種環(huán)移取I環(huán)，接種EC肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24h，檢查試劑盒中的集氣窗是否有氣泡產(chǎn)生，如未有產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h ;記錄在24h和48h內(nèi)產(chǎn)氣的EC肉湯管數(shù)。如所有EC肉湯管均未產(chǎn)氣，即可報(bào)告大腸埃希氏菌MPN結(jié)果；如有產(chǎn)氣者，則進(jìn)行EMB平板分離培養(yǎng)。
[0029]4.4鑒定:挑取EMB平板典型菌落做確正實(shí)驗(yàn)；
[0030]4.5結(jié)果:根據(jù)證實(shí)為大腸埃希氏菌陽(yáng)性的試管管數(shù)，查MPN檢索表，報(bào)告每g(mL)樣品中大腸埃希氏菌MPN值；
[0031]5注意事項(xiàng)
[0032]5.1加入樣品后不需搖勻，平拿平放；
[0033]5.2加樣時(shí)可用一次性無(wú)菌塑料吸管，將樣品稀釋液加至試劑盒所標(biāo)刻度處；
[0034]5.3在培養(yǎng)箱中取試劑盒時(shí)應(yīng)平托出來(lái)，不要傾斜以免液體外逸造成污染；
[0035]5.4試劑盒為一次性無(wú)菌包裝用品，供一次性即開(kāi)即用
[0036]6保存條件和有效期:
[0037]避光于保存于干燥處，最佳溫度為2?8°C，有效期18個(gè)；[0038]備注:如果樣品污染嚴(yán)重，實(shí)驗(yàn)時(shí)直接將1:10樣品勻液加入試劑盒中，不需實(shí)驗(yàn)前加入無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌生理鹽水即可，
[0039]備注:如果樣品污染嚴(yán)重，每孔直接接種1:10樣品的稀釋液10mL，稀釋后的10_2接種10mL，稀釋后的10_3接種10mL，每個(gè)稀釋度接種3盒，(1-3，4-6，7-9。)省去了制備雙料培養(yǎng)基及單料培養(yǎng)基試管的繁瑣的工作。
[0040]阪岐腸桿菌的定量檢測(cè)
[0041]試劑盒使用說(shuō)明書
[0042]I適用范圍:適用于食源性致病菌阪岐腸桿菌定量(MPN方法)的檢測(cè)。
[0043]2方法原理:依據(jù)《2012年食源性致病菌監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》中的定量檢驗(yàn)方法，采用包被技術(shù)將改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素培養(yǎng)基包被在試劑盒底部，隨時(shí)取用，省去了實(shí)驗(yàn)前的大量準(zhǔn)備工作，方便、快捷。
[0044]3試劑盒的組成:試劑盒由5個(gè)發(fā)酵增菌容器前后對(duì)應(yīng)并排共10個(gè)發(fā)酵增菌容器組成，第1-9發(fā)酵增菌容器為試驗(yàn)盒，第10發(fā)酵增菌容器為試驗(yàn)對(duì)照盒。用前加入無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌生理鹽水至盒的標(biāo)線處即為IOmL改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素
培養(yǎng)基。
[0045]4操作步驟
[0046]4.1樣品制備:方法見(jiàn)《2012年食源性致病菌監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)》中的阪岐腸桿菌定量檢驗(yàn)(7.1)。
[0047]4.2增菌培養(yǎng):
[0048]4.2.1試劑盒的準(zhǔn)備:打開(kāi)盒蓋，試劑盒1-10發(fā)酵增菌容器中加入無(wú)菌鹽水9~IOmL即可，備用。
[0049]4.2.2加樣:用滅菌吸管分別吸取18小時(shí)培養(yǎng)后的三份不同重量前增菌,各ImL,(每份不同重量樣品各取3個(gè)ImL)分別加入含有IOmL改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)古霉素的試劑盒的發(fā)酵增菌容器中(1-3，4-6，7-9。)。第10發(fā)酵增菌容器不加樣液為陰性對(duì)照，置44°C ±0.5°C恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h ；
[0050]4.3分離培養(yǎng):對(duì)所有顯示渾濁并產(chǎn)生大量氣體的試劑盒增菌液,用接種環(huán)接種于阪岐顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。置36°C培養(yǎng)24h±2h ；
[0051]4.4鑒定:挑取可疑菌落(藍(lán)綠色)，劃線接種胰蛋白胨大豆瓊脂平板(TSA)，250C ±1°C培養(yǎng)24-48h，挑取黃色菌落用全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)VITEK-2進(jìn)行生化鑒定；
[0052]4.5結(jié)果:根據(jù)證實(shí)為阪岐腸桿菌的陽(yáng)性管數(shù)查MPN檢索表；
[0053]5注意事項(xiàng)
[0054]5.1加入樣品后不需搖勻，平拿平放；
[0055]5.2加樣時(shí)可用一次性無(wú)菌塑料吸管，將樣品稀釋液加至試劑盒所標(biāo)刻度處；
[0056]5.3在培養(yǎng)箱中取試劑盒時(shí)應(yīng)平托出來(lái)，不要傾斜以免液體外逸造成污染。
[0057]5.4試劑盒為一次性無(wú)菌包裝用品，供一次性即開(kāi)即用
[0058]6保存條件和有效期:
[0059]避光于保存于干燥處，最佳溫度為2?8°C，有效期18個(gè)。
[0060]備注:如果樣品污染嚴(yán)重，每孔直接接種1:10樣品的稀釋液10mL，稀釋后的10_2接種10mL，稀釋后的10_3接種10mL，每個(gè)稀釋度接種3盒，(1-3，4-6，7-9。)省去了制備雙料培養(yǎng)基及單料培養(yǎng)基試管的繁瑣的工作。
[0061]食源性致病菌定量檢測(cè)項(xiàng)目，包含了七種致病菌定量檢測(cè)，相對(duì)有七種定量致病菌檢測(cè)試劑盒。
[0062]以上所述，僅是本實(shí)用新型的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)作任何形式上的限制。凡是依據(jù)本實(shí)用新型的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與修飾，均仍屬于本實(shí)用新型的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒，其特征是:包括盒體、盒蓋和若干個(gè)發(fā)酵增菌容器，所述盒體內(nèi)均勻排列發(fā)酵增菌容器，所述發(fā)酵增菌容器內(nèi)設(shè)有集氣窗，所述集氣窗前端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)前壁固接，集氣窗末端與發(fā)酵增菌容器內(nèi)底部固接，所述集氣窗橫向截面形狀呈開(kāi)口矩形，其縱向截面形狀呈直角三角形，所述集氣窗與發(fā)酵增菌容器固接后，在發(fā)酵增菌容器的底部呈坡度的氣泡收集空間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述盒體、盒蓋和發(fā)酵增菌容器均為無(wú)色透明體，采用能夠降解的材料制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述發(fā)酵增菌容器數(shù)量為十個(gè)，發(fā)酵增菌容器在盒體中前后排列各五個(gè)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的食源性致病菌定量檢測(cè)試劑盒，其特征是:所述發(fā)酵增菌容器觀測(cè)面的側(cè)壁上設(shè)有試驗(yàn)標(biāo)識(shí)刻線。
【文檔編號(hào)】C12M1/34GK203668405SQ201320894143
【公開(kāi)日】2014年6月25日 申請(qǐng)日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】劉軍 申請(qǐng)人:劉軍