單核細(xì)胞增殖劑、單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基、單核細(xì)胞的制造方法、樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供能高效且簡(jiǎn)便地使單核細(xì)胞增殖的手段。本發(fā)明提供了一種在從單核細(xì)胞到樹(shù)突狀細(xì)胞的分化處理前使用的單核細(xì)胞增殖劑，其含有Flt-3L、IL-3或IFN-γ中的一種以上。另外本發(fā)明還提供了在從單核細(xì)胞到樹(shù)突狀細(xì)胞的分化處理前使用的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基，其含有Flt-3L、IL-3或IFN-γ中的一種以上。本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基也可含有GM-CSF。
【專利說(shuō)明】單核細(xì)胞增殖劑、單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基、單核細(xì)胞的制造方法、樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法、及樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及單核細(xì)胞增殖劑、單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基、單核細(xì)胞的制造方法、樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法、及樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，在癌癥的治療中，關(guān)注于樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的使用。樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗是由向樹(shù)突狀細(xì)胞(來(lái)自于給予疫苗的對(duì)象(例如癌癥患者))中引入了(脈沖了)癌抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞制備的，其被給予至疫苗給予對(duì)象的體內(nèi)。給予的樹(shù)突狀細(xì)胞將癌抗原提呈至T細(xì)胞，提呈了抗原的T細(xì)胞(CTL)特異性攻擊癌細(xì)胞，因此能在不損傷體內(nèi)正常細(xì)胞的情況下治
療癌癥。
[0003]但是，制造樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗所必需的樹(shù)突狀細(xì)胞無(wú)法從體內(nèi)直接分離。因此，從由給予疫苗的對(duì)象采集的血液中分離單核細(xì)胞，將該單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞，由此來(lái)獲得樹(shù)突狀細(xì)胞。
[0004]作為以往已知的為制造樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗而使用的單核細(xì)胞的采集方法，已知有使用成分采血裝置分離血液中的白細(xì)胞的方法(下文中將該方法稱為“血采集術(shù)(apheresis)”)。但是，血采集術(shù)不僅裝置運(yùn)用花費(fèi)高，而且還要求高技術(shù)來(lái)進(jìn)行裝置的操作。另外，使用血采集 術(shù)采集的是不僅含有單核細(xì)胞、還含有除單核細(xì)胞以外的成分(白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等)的混合物。因此，為除去紅細(xì)胞、血小板等除單核細(xì)胞以外的成分，血采集術(shù)之后一般還要進(jìn)行單核細(xì)胞的分離步驟。
[0005]樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的臨床應(yīng)用中，優(yōu)選在一次給予中使用大約IX IO7個(gè)的細(xì)胞數(shù)。為了確保這樣的細(xì)胞數(shù)，通常，隔開(kāi)間隔從同一對(duì)象進(jìn)行8次左右血采集術(shù)。另外，因?yàn)檠褐写嬖诘膯魏思?xì)胞的比例較低，為了獲得能制造樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的充分的量的單核細(xì)胞而使用血采集術(shù)時(shí)，必須要使得血液在血采集術(shù)裝置內(nèi)循環(huán)并充分采集白細(xì)胞成分，這會(huì)對(duì)患者在體力上或時(shí)間上造成非常大的負(fù)擔(dān)。因此，存在下述情況:在血采集術(shù)中，患者狀態(tài)突然變化時(shí)，血采集術(shù)中途中斷，因此不得不放棄樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗療法。另外，在通過(guò)血采集術(shù)采集單核細(xì)胞的成分的情況下，雖然通常能制作大約5~8次分量的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，但得到的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的實(shí)際量根據(jù)患者的血液狀態(tài)等而變動(dòng)。
[0006]另外，從胳膊等采集末梢血等以往的采血方法中，雖然患者負(fù)擔(dān)較輕，但存在下述缺點(diǎn):即使根據(jù)以往的方法使得到的單核細(xì)胞直接分化為樹(shù)突狀細(xì)胞，也無(wú)法獲得足量的細(xì)胞數(shù)。因此，為了由從末梢血的采血得到的單核細(xì)胞制造細(xì)胞數(shù)充足的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，在該過(guò)程中使單核細(xì)胞增殖是一個(gè)課題，克服其的技術(shù)是人們所期望的。另外，這樣的技術(shù)中，考慮到樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的給予間隔的情況下，關(guān)于樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造時(shí)間，更期望能以2周左右進(jìn)行制造。
[0007]因此，為了解決上述課題，考慮在體外使從血液分離的單核細(xì)胞增殖。作為這樣的方法，專利文獻(xiàn)I中公開(kāi)了在抑制單核細(xì)胞中特定物質(zhì)的表達(dá)的狀態(tài)下培養(yǎng)單核細(xì)胞。但是，該方法需要重組體的制造步驟以及長(zhǎng)期的培養(yǎng)時(shí)間。
[0008]專利文獻(xiàn)1:日本特表2010-515442號(hào)公報(bào)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供能高效且簡(jiǎn)便地使單核細(xì)胞增殖的手段。
[0010]本發(fā)明的發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，參與造血干細(xì)胞的增殖等的特定細(xì)胞因子能高效增殖單核細(xì)胞，由此完成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明提供了下述內(nèi)容。
[0011](I) 一種在從單核細(xì)胞到樹(shù)突狀細(xì)胞的分化處理前使用的單核細(xì)胞增殖劑，所述單核細(xì)胞增殖劑含有Flt-3L、IL-3或IFN-Y中的一種以上。
[0012](2) 一種在從單核細(xì)胞到樹(shù)突狀細(xì)胞的分化處理前使用的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有Flt-3L、IL-3或IFN-Y中的一種以上。
[0013](3)如(2)所述的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有GM-CSF。
[0014](4) 一種單核細(xì)胞的制造方法，所述方法包括:
[0015]通過(guò)在(2)或(3)所述的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中培養(yǎng)原料單核細(xì)胞而使其增殖的增殖步驟。
[0016](5)如(4)所述的單核細(xì)胞的制造方法，其中，使用含有單核細(xì)胞以及除單核細(xì)胞以外的白細(xì)胞成分的混合物作為所述原料單核細(xì)胞。
[0017](6)如(4)或(5)所述的單核細(xì)胞的制造方法，包括:
[0018]在所述增殖步驟之前使體液中除單核細(xì)胞以外的成分的含有率降低而得到所述原料單核細(xì)胞的降低步驟。
[0019](7)如(6)所述的單核細(xì)胞的制造方法，其中，所述降低通過(guò)使用磁性珠粒來(lái)進(jìn)行，所述磁性珠粒針對(duì)所述原料單核細(xì)胞中的單核細(xì)胞以及除單核細(xì)胞以外的白細(xì)胞成分、血漿、紅細(xì)胞中的至少一者的親和性較之針對(duì)其他成分的親和性更高。
[0020](8)如(6)或(7)所述的單核細(xì)胞的制造方法，其中，從IOOmL以下的末梢血獲得所述原料單核細(xì)胞。
[0021](9)如(6)~(8)中任一項(xiàng)所述的單核細(xì)胞的制造方法，其中不包括冷凍貯藏所述單核細(xì)胞的冷凍貯藏步驟。
[0022]( 10) 一種樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法，所述方法包括:
[0023]通過(guò)(4)~(9)中任一項(xiàng)所述的單核細(xì)胞的制造方法制造單核細(xì)胞的單核細(xì)胞制造步驟、和
[0024]使通過(guò)所述單核細(xì)胞制造步驟獲得的單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞的分化步驟。[0025](11)如(10)所述的樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法，其中，在所述分化步驟中，在含有Flt-3L、IL-3或IFN-Y中的一種以上的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述單核細(xì)胞。
[0026](12)如(10)或(11)所述的樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法，所述方法包括脈沖所述樹(shù)突狀細(xì)胞的脈沖步驟。
[0027]( 13) 一種樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法，所述方法包括:
[0028]通過(guò)(10)~(12)中任一項(xiàng)所述的樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法制造樹(shù)突狀細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞制造步驟、和[0029] 將通過(guò)所述樹(shù)突狀細(xì)胞制造步驟獲得的樹(shù)突狀細(xì)胞制備為樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制備步驟。
[0030](14)如(13)所述的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法，其中不包括冷凍貯藏所述單核細(xì)胞及所述樹(shù)突狀細(xì)胞中的至少一者的冷凍貯藏步驟。
[0031](15)如(13)或(14)所述的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法，其中，所述原料單核細(xì)胞是由從給予所述樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的對(duì)象采集的體液獲得的。
[0032]通過(guò)本發(fā)明，能夠提供能高效且簡(jiǎn)便地使單核細(xì)胞增殖的手段。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0033]圖1為表示從末梢血分離單核細(xì)胞之前(A)以及分離之后(B)時(shí)各細(xì)胞試樣(3X IO5個(gè)細(xì)胞)中含有的單核細(xì)胞數(shù)的圖。
[0034]圖2為表示在本發(fā)明的一種實(shí)施方式所涉及的單核細(xì)胞增殖劑存在下培養(yǎng)3天、之后對(duì)單核細(xì)胞培養(yǎng)11天、使其分化為樹(shù)突狀細(xì)胞時(shí)的細(xì)胞數(shù)的隨時(shí)間變化的圖。
[0035]圖3為表示通過(guò)本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑增殖的單核細(xì)胞分化為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的圖(A)和圖(B)以及表示(A)和(B)中獲得的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞具有抗原提呈能力的圖(C)。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下文對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說(shuō)明，但并非意圖對(duì)本發(fā)明加以限制。
[0037]<單核細(xì)胞增殖劑>
[0038]本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑包含F(xiàn)lt-3L、IL-3或IFN-Y中的一種以上，在從單核細(xì)胞到樹(shù)突狀細(xì)胞的分化處理前使用。需要說(shuō)明的是，本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑的使用形式?jīng)]有特別限定，一般認(rèn)為能夠以添加至可培養(yǎng)單核細(xì)胞的培養(yǎng)基中、或作為培養(yǎng)基的成分預(yù)混合的形式來(lái)使用。
[0039]“從單核細(xì)胞到樹(shù)突狀細(xì)胞的分化處理”是指:在適于使單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞的條件下、即、在規(guī)定量的特定細(xì)胞因子(GM-CSF、IL-4及IL-6等)存在下培養(yǎng)單核細(xì)胞。已知即使在分化處理的過(guò)程中單核細(xì)胞數(shù)也有一定程度的增加，但本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑并非用于該分化處理中，而是用于其之前的階段。
[0040]關(guān)于上述各種細(xì)胞因子，使單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞的量是指:使在含有該量的細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)了 6天時(shí)總細(xì)胞數(shù)中的樹(shù)突狀細(xì)胞數(shù)為20%以上的量，具體的量根據(jù)培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)條件而異。
[0041]通過(guò)本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑，能在進(jìn)行上述的分化處理之前將單核細(xì)胞增殖至對(duì)于制造樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗來(lái)說(shuō)充足的量(例如IO6~IO7個(gè)細(xì)胞/mL以上)，不必為樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗而重復(fù)多次單核細(xì)胞的培養(yǎng)步驟，因此是簡(jiǎn)便的。
[0042]雖然已知卩1卜31^^1七3-配體)、11^-3(白介素-3)、正^丫 (干擾素-Y )是參與造血干細(xì)胞的增殖等的細(xì)胞因子，但本發(fā)明的發(fā)明人等經(jīng)過(guò)研究，結(jié)果令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，它們能高效地增殖單核細(xì)胞。
[0043](Flt-3L)
[0044]適合用于使單核細(xì)胞增殖的Flt-3L的量沒(méi)有特別限定，相對(duì)于可培養(yǎng)單核細(xì)胞的培養(yǎng)基而言，可以是100~10000 IU/mL、優(yōu)選1000~5000 IU/mL、最優(yōu)選1000~3000
IU/mL。
[0045](IL-3)
[0046]適合用于使單核細(xì)胞增殖的IL-3的量沒(méi)有特別限定，相對(duì)于可培養(yǎng)單核細(xì)胞的培養(yǎng)基而言，可以是100~10000IU/mL、優(yōu)選100~5000IU/mL、最優(yōu)選500~3000IU/mL。
[0047]( IFN- Y )
[0048]適合用于使單核細(xì)胞增殖的IFN-Y的量沒(méi)有特別限定，相對(duì)于可培養(yǎng)單核細(xì)胞的培養(yǎng)基而言，可以是I~1000ng/mL、優(yōu)選I~500ng/mL、最優(yōu)選I~50ng/mL。
[0049]本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑可以單獨(dú)使用Flt-3L、IL_3或IFN- y中的任一種，也可組合兩種以上。如上文所述，因?yàn)镕lt-3L、IL-3及IFN-Y具有類似的功能，所以認(rèn)為它們組合使用也不會(huì)妨礙相互的功能。在組合它們中兩種以上的情況下，各自的細(xì)胞因子配合量可以在上文所述的范圍內(nèi)，也可以比其少。
[0050]通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析所得細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物，來(lái)確認(rèn)通過(guò)本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑增殖的細(xì)胞是否是單核細(xì)胞。作為單核細(xì)胞的細(xì)胞表面的標(biāo)志物，可以舉出CD14等。具有這樣的標(biāo)志物的細(xì)胞可認(rèn)為是單核細(xì)胞。
[0051]〈單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基〉
[0052]本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基含有Flt_3L、IL-3或IFN-Y中的一種以上，在從單核細(xì)胞到樹(shù)突狀細(xì)胞的分化處理前使用。具體而言，單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基可進(jìn)一步含有可用于培養(yǎng)單核細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)成分、pH調(diào)節(jié)劑等。作為含有上述成分的培養(yǎng)基沒(méi)有特別限定，可舉出淋巴細(xì)胞用的無(wú)血清合成培養(yǎng)基、AIM-V, RPM1-1640等。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書中的“培養(yǎng)基”不僅包含液體化的制備完成的形態(tài)，也包含制備前的成分混合物(通常為粉末形式)。
[0053]本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基也可進(jìn)一步含有參與單核細(xì)胞分化的細(xì)胞因子(GM-CSF (粒細(xì)胞巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte Macrophage Colony-StimulationFactor))。
[0054]單核細(xì)胞具有在GM-CSF存在下易于向巨噬細(xì)胞分化、在GM-CSF及IL-4存在下易于向樹(shù)突狀細(xì)胞分化的傾向。但是，本發(fā)明的發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，利用含有GM-CSF的本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基，能顯著促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖。GM-CSF自身具有單核細(xì)胞的增殖效果雖然是以往已知的，但含有GM-CSF的本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基能在不使單核細(xì)胞分化的情況下顯著促進(jìn)單核細(xì)胞的增殖。另外，本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中除了 GM-CSF之外還可進(jìn)一步含有比使單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞的量(例如500~2000 IU/mL)少的IL-4。本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中含有的GM-CSF，例如可為500~2000IU/mL的范圍。
[0055]本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中可含有細(xì)胞培養(yǎng)中通常使用的試劑。作為這樣的試劑，可舉出抗生素(慶大霉素、卡那霉素等)、清蛋白、血清(胎牛血清等)等。另外，本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中可含有來(lái)自生物體(例如人、豬、牛、馬、山羊、綿羊、兔、袋鼠、猴等哺乳類動(dòng)物)的自體血漿(即，意味著想要增殖的單核細(xì)胞和自體血漿是從相同生物體獲得的)。另外，為了促進(jìn)向樹(shù)突狀細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中可含有氯化Picibanil、前列腺素E2 (PGE2)等。[0056]<單核細(xì)胞的制造方法>
[0057]本發(fā)明的單核細(xì)胞的制造方法包括通過(guò)在本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中培養(yǎng)原料單核細(xì)胞使其增殖的增殖步驟。
[0058](增殖步驟)
[0059]作為本發(fā)明的增殖步驟中使用的條件，沒(méi)有特別限定，從在較多單核細(xì)胞分化開(kāi)始前使單核細(xì)胞增殖的觀點(diǎn)來(lái)看，可以在30~40°C、2~8%C02的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間可根據(jù)所需要的單核細(xì)胞的量適當(dāng)?shù)卣{(diào)整，可以為3~20日、3~18日、3~14日、3~10日。培養(yǎng)中，可根據(jù)以往公知的方法適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行培養(yǎng)基更換。
[0060]根據(jù)本發(fā)明的單核細(xì)胞的制造方法，例如可以以14天這樣的短的培養(yǎng)時(shí)間使原料單核細(xì)胞中的單核細(xì)胞增殖至可臨床使用的水平(例如，IO6~IO7個(gè)細(xì)胞/mL以上)。所謂可臨床使用的水平是指:在將樹(shù)突狀細(xì)胞(使已增殖的單核細(xì)胞分化而成的)制備為樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的情況下，獲得的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗可直接作為非冷凍處理疫苗使用的水平。
[0061]本發(fā)明的單核細(xì)胞的制造方法中，在于本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞這樣的、對(duì)單核細(xì)胞的負(fù)荷較少的條件下使單核細(xì)胞增殖。因此，能夠期待通過(guò)本發(fā)明的單核細(xì)胞的制造方法以高的活細(xì)胞率(例如超過(guò)90%)獲得單核細(xì)胞。
[0062](原料單核細(xì)胞)
[0063]本發(fā)明的原 料單核細(xì)胞為含有單核細(xì)胞的試樣。原料單核細(xì)胞可以僅由單核細(xì)胞構(gòu)成，另外，因?yàn)橥ㄟ^(guò)本發(fā)明的單核細(xì)胞的制造方法能選擇性地高效增殖單核細(xì)胞，所以原料單核細(xì)胞也可以為含有單核細(xì)胞和除單核細(xì)胞以外的白細(xì)胞成分(例如淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、NKT細(xì)胞)的混合物。該混合物可進(jìn)一步含有血漿、紅細(xì)胞。作為混合物，可以是從血液等體液的試樣經(jīng)密度梯度離心分離等獲得的、主要含有單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的單核細(xì)胞級(jí)分。
[0064](降低步驟)
[0065]優(yōu)選在上述增殖步驟之前進(jìn)行降低步驟，即，降低體液中的單核細(xì)胞以外的成分的含有率來(lái)獲得上述原料單核細(xì)胞。降低例如可通過(guò)使用磁性珠粒的方法、密度梯度離心法、通過(guò)僅將體液中的成分中的單核細(xì)胞粘附于培養(yǎng)皿而分離單核細(xì)胞的方法、上述方法的組合等來(lái)進(jìn)行。
[0066]從能簡(jiǎn)便且高效地回收單核細(xì)胞、對(duì)單核細(xì)胞的損傷小的方面來(lái)說(shuō)，優(yōu)選使用磁性珠粒。該磁性珠粒對(duì)原料單核細(xì)胞中的單核細(xì)胞及除單核細(xì)胞之外的白細(xì)胞成分、血漿、紅細(xì)胞中的至少一種(優(yōu)選全部)具有比對(duì)其它物質(zhì)更高的親和性。所述磁性珠?？梢跃哂嗅槍?duì)想要分離的物質(zhì)的抗體等結(jié)合在帶有磁性的載體上的構(gòu)造。另外，關(guān)于對(duì)體液進(jìn)行密度梯度離心得到的單核細(xì)胞級(jí)分，從單核細(xì)胞的收率進(jìn)一步提高的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選通過(guò)磁性珠粒進(jìn)行處理。
[0067]使用針對(duì)單核細(xì)胞具有相對(duì)高的親和性的磁性珠粒時(shí)，能從體液主要分離單核細(xì)胞(這被稱為單核細(xì)胞的陽(yáng)性選擇)。通過(guò)以往公知的方法從分離的單核細(xì)胞除去磁性珠粒，由此能夠獲得原料單核細(xì)胞。雖然從準(zhǔn)備的磁性珠粒的種類較少的觀點(diǎn)來(lái)看這種方式是有利的，但是必需要有從單核細(xì)胞除去磁性珠粒的步驟，對(duì)單核細(xì)胞的損傷存在若干擔(dān)憂。
[0068]使用對(duì)除單核細(xì)胞以外的白細(xì)胞成分、血漿、紅細(xì)胞中的至少一種具有相對(duì)高的親和性的磁性珠粒時(shí)，可從體液除去除單核細(xì)胞以外的成分(這被稱為單核細(xì)胞的陰性選擇)。其結(jié)果，能獲得主要含有單核細(xì)胞的原料單核細(xì)胞。雖然從準(zhǔn)備的磁性珠粒的種類較多的觀點(diǎn)來(lái)看這種形式是不利的，但不需要從單核細(xì)胞除去磁性珠粒的步驟，從能確實(shí)地獲得優(yōu)質(zhì)單核細(xì)胞的方面考慮為優(yōu)選。進(jìn)行單核細(xì)胞的陰性選擇的試樣也可以是對(duì)體液進(jìn)行密度梯度離心獲得的單核細(xì)胞級(jí)分。這種情況下，使用針對(duì)淋巴細(xì)胞具有相對(duì)高的親和性的磁性珠粒。
[0069]使用磁性珠粒的情況下，可使用磁性細(xì)胞分離裝置。磁性細(xì)胞分離裝置通過(guò)在裝置內(nèi)設(shè)置血液等體液的試樣以及磁性珠粒等試劑，基于規(guī)定的程序從體液分離單核細(xì)胞。從能從體液迅速且高效地分離單核細(xì)胞的觀點(diǎn)來(lái)看，使用這樣的裝置是優(yōu)選的。以高收率分離單核細(xì)胞時(shí)，能顯著提高由本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑獲得的單核細(xì)胞的增殖效率。
[0070]作為適于本發(fā)明的磁性細(xì)胞分離裝置，例如可舉出“RoboS印(商標(biāo))”(株式會(huì)社Veritas)等。
[0071](體液)
[0072]作為用于獲得原料單核細(xì)胞的試樣，可舉出血液、骨髓液這樣的體液。血液采集自生物體(例如人癌癥患者)，可舉出末梢血、臍帶血等。其中從減輕被采集者的負(fù)擔(dān)的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選末梢血。作為體液的采集方法沒(méi)有特別限定，可采用使用注射器、蝴蝶針等從胳膊、手腕、腳等部位進(jìn)行采集的方法。本發(fā)明的單核細(xì)胞的制造方法中，由于使用的體液的量少，所以與以往使用的血采集術(shù)等方法相比，采集體液時(shí)對(duì)生物體的負(fù)擔(dān)(費(fèi)用、時(shí)間等)顯著較低。
[0073]以往為了制造樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，從生物體采集例如300~400mL的大量血液。但是，根據(jù)本發(fā)明的單核細(xì)胞的制造方法，使用的體液的量也可為IOOmL以下、90mL以下、8OmL以下、70mL以下、60mL以 下、50mL以下、40mL以下、35mL以下、30mL以下、25mL以下、2OmL以下、15mL以下、IOmL以下、5mL以下、ImL以下、0.5mL以下的較少的量。體液量的下限沒(méi)有特別限定，例如可以為0.1mL以上。
[0074]根據(jù)本發(fā)明的單核細(xì)胞的制造方法獲得的單核細(xì)胞可以直接經(jīng)過(guò)分化步驟分化為樹(shù)突狀細(xì)胞，也可采用以往公知的方法冷凍貯藏。冷凍貯藏的單核細(xì)胞可以在解凍之后用于單核細(xì)胞的分化步驟。但是，從防止能分化的單核細(xì)胞的損失的觀點(diǎn)來(lái)看，優(yōu)選不冷凍貯藏單核細(xì)胞。本發(fā)明中，不需要為了獲得供給于分化步驟的單核細(xì)胞而進(jìn)行多次單核細(xì)胞培養(yǎng)，因此可以將單核細(xì)胞供給于單核細(xì)胞的分化步驟而不冷凍貯藏。
[0075]<樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法>
[0076]本發(fā)明的樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法包括:根據(jù)本發(fā)明的單核細(xì)胞的制造方法制造單核細(xì)胞的單核細(xì)胞制造步驟、和使根據(jù)上述單核細(xì)胞制造步驟獲得的單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞的分化步驟。
[0077](分化步驟)
[0078]使單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞的方法本身是以往公知的。即，通過(guò)在含有例如IL-4等的分化用培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞，單核細(xì)胞分化為未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。通過(guò)在含有TNF- a等的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所得的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞分化為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。本發(fā)明中的樹(shù)突狀細(xì)胞包括未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞及成熟樹(shù)突狀細(xì)胞雙方。
[0079]在本發(fā)明的分化步驟中，也優(yōu)選使用含有Flt-3L、IL-3或IFN-Y中的一種以上的培養(yǎng)基。由此可在增殖單核細(xì)胞的同時(shí)使其向樹(shù)突狀細(xì)胞分化，能獲得更多數(shù)量的樹(shù)突狀細(xì)胞。但是，通過(guò)增殖步驟所得的單核細(xì)胞的數(shù)量充足、或者所需要的樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)量不多的情況下，也可不使用含有上述成分的培養(yǎng)基。
[0080](脈沖步驟)
[0081]通過(guò)向獲得的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞或成熟樹(shù)突狀細(xì)胞引入(脈沖)從癌細(xì)胞提取的物質(zhì)(肽等)或癌特異性抗原、人工抗原等，能獲得可提呈所期望的抗原的樹(shù)突狀細(xì)胞。需要說(shuō)明的是，脈沖步驟可在制造樹(shù)突狀細(xì)胞的過(guò)程中進(jìn)行，也可如下文所述在樹(shù)突狀細(xì)胞的制造后的疫苗制備的過(guò)程中進(jìn)行。
[0082]作為脈沖的方法，只要是能將期望的抗原引入樹(shù)突狀細(xì)胞中的方法即可，沒(méi)有特別限定，可舉出將樹(shù)突狀細(xì)胞與期望的抗原一起培養(yǎng)的方法等。一般而言，與成熟樹(shù)突狀細(xì)胞相比，未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞更容易引入抗原，因此優(yōu)選對(duì)未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行脈沖。
[0083]通過(guò)采用流式細(xì)胞術(shù)分析樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物，來(lái)確認(rèn)得到的細(xì)胞是否是樹(shù)突狀細(xì)胞。作為樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物，可以舉出CD83等。具有這樣的標(biāo)志物的細(xì)胞認(rèn)為是樹(shù)突狀細(xì)胞。
[0084]通過(guò)采用流式細(xì)胞術(shù)分析樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物，來(lái)確認(rèn)根據(jù)本發(fā)明的樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法獲得的樹(shù)突狀細(xì)胞是否具有抗原提呈能力。作為具有抗原提呈能力的樹(shù)突狀細(xì)胞的細(xì)胞表面的標(biāo)志物，可以舉出MHC Class I分子(HLA-A、B、C)及MHC ClassII分子(HLA-DR)等。認(rèn)為具有這樣的標(biāo)志物的樹(shù)突狀細(xì)胞具有抗原提呈能力。
[0085]〈樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗 的制造方法〉
[0086]本發(fā)明的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法包括:根據(jù)本發(fā)明的樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法制造樹(shù)突狀細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞制造步驟、及將通過(guò)上述樹(shù)突狀細(xì)胞制造步驟獲得的樹(shù)突狀細(xì)胞制備為樹(shù)關(guān)狀疫苗的制備步驟。
[0087](制備步驟)
[0088]將樹(shù)突狀細(xì)胞制備為樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的方法沒(méi)有特別限定，可以舉出:將樹(shù)突狀細(xì)胞與在通常的疫苗制劑中配方的藥劑(生理鹽水、林格液等)混合。另外，使用未經(jīng)過(guò)脈沖步驟的樹(shù)突狀細(xì)胞的情況下，對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞進(jìn)行脈沖步驟。
[0089]本發(fā)明的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法也可不包括對(duì)單核細(xì)胞及樹(shù)突狀細(xì)胞中的至少一者進(jìn)行冷凍貯藏的冷凍貯藏步驟。本發(fā)明的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法中，能在短時(shí)間內(nèi)獲得能足以制造樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的充分的量的單核細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞，因此能即時(shí)制備單核細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞不需要貯存。因此，根據(jù)需要制造的單核細(xì)胞或樹(shù)突狀細(xì)胞可以不冷凍保存而供給至樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造。由此，可以避免冷凍可能造成的細(xì)胞損傷、樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈能力的降低。
[0090]獲得的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗可通過(guò)皮內(nèi)注射等以往已知的方法給予生物體。
[0091]原料單核細(xì)胞優(yōu)選為由從給予樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的對(duì)象中采集的體液獲得的。通過(guò)使用來(lái)自給予樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的對(duì)象的原料單核細(xì)胞，能獲得有害的副作用少的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。但是，只要給予樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗產(chǎn)生的免疫反應(yīng)被許可，則也可使用從并非給予對(duì)象的人員中采集的體液。
[0092]實(shí)施例
[0093]下面基于實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不限于下述實(shí)施例。[0094]〈實(shí)施例1:單核細(xì)胞的分離〉
[0095]從3名癌癥患者的胳膊采集25mL末梢血。將上述末梢血分別用Ficoll溶液(GEHealthcare Japan株式會(huì)社)進(jìn)行密度梯度離心,獲得單核細(xì)胞級(jí)分的細(xì)胞。將獲得的單核細(xì)胞級(jí)分的細(xì)胞裝到磁性細(xì)胞分離裝置(商品名:RoboSep,株式會(huì)社Veritas),按照設(shè)定為用于單核細(xì)胞分離的程序，分離了 CD14+單核細(xì)胞及CD16+單核細(xì)胞。
[0096]針對(duì)分離單核細(xì)胞之前的末梢血以及從末梢血分離出單核細(xì)胞后的試樣，按照下述條件測(cè)量各試樣中的單核細(xì)胞數(shù)。
[0097]針對(duì)各試樣中的3X IO5個(gè)細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面的標(biāo)志物。需要說(shuō)明的是，作為標(biāo)志物使用單核細(xì)胞的標(biāo)志物CD14。其結(jié)果示于圖1。如圖1所示，將分離單核細(xì)胞前(A)和分離之后(B)進(jìn)行比較可知，通過(guò)分離步驟，相對(duì)于試樣中細(xì)胞數(shù)的單核細(xì)胞個(gè)數(shù)(分離前:534個(gè)；分離后:2938個(gè))顯著增加，獲得了單核細(xì)胞被濃縮的試樣。
[0098]〈實(shí)施例2:單核細(xì)胞的增殖〉
[0099]按照下述條件，在含有本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑(本實(shí)施例中使用了 Flt-3L)的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中，培養(yǎng)按照上述方法分離的來(lái)自癌患者的單核細(xì)胞(CD14+單核細(xì)胞及⑶16+單核細(xì)胞)。
[0100](單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基的組成)
[0101]淋巴細(xì)胞用無(wú)血清合成培養(yǎng)基(X-VIV0 15、Takara Bio株式會(huì)社)
[0102]Flt-3L (Cellgenix 公司)2000 IU/mL·[0103]GM-CSF (Miltenyi Biotec 公司)1000 IU/mL
[0104]慶大霉素50 ng/mL
[0105]5%自體血漿(從各癌癥患者獲得的血漿)
[0106]向上述單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中添加經(jīng)分離的單核細(xì)胞使其相對(duì)于培養(yǎng)基為2 X IO5個(gè)細(xì)胞/mL，于37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)3天。培養(yǎng)第4天起用實(shí)施例3中的單核細(xì)胞分化用培養(yǎng)基(I)培養(yǎng)8天。培養(yǎng)的第12天起用實(shí)施例3中的單核細(xì)胞分化用培養(yǎng)基(2)培養(yǎng)3天。即，培養(yǎng)時(shí)間總計(jì)為14天。
[0107]將培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)刻、培養(yǎng)3天后、培養(yǎng)6天后、培養(yǎng)11天后及培養(yǎng)14天后的各時(shí)間點(diǎn)的單核細(xì)胞回收，臺(tái)盼藍(lán)染色，用顯微鏡觀察，計(jì)算細(xì)胞數(shù)。該結(jié)果示于圖2。如圖2所示，在培養(yǎng)第3天的時(shí)間點(diǎn)單核細(xì)胞增至2X IO6個(gè)細(xì)胞/mL左右。在該時(shí)間點(diǎn)，可供給至分化步驟。進(jìn)而，在分化步驟中也在本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑的存在下進(jìn)行培養(yǎng)，由此能期待獲得IO7個(gè)細(xì)胞/mL以上的樹(shù)突狀細(xì)胞。
[0108]〈實(shí)施例3:單核細(xì)胞的分化〉
[0109]按照下述條件培養(yǎng)上述獲得的單核細(xì)胞
[0110](單核細(xì)胞分化用培養(yǎng)基(I)的組成)
[0111]通過(guò)向單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中添加1000 IU IL-4 (Miltenyi Biotec公司)，制備用于使得單核細(xì)胞向未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞分化的培養(yǎng)基。下文中將該培養(yǎng)基稱為“單核細(xì)胞分化用培養(yǎng)基(I)”。
[0112](單核細(xì)胞分化用培養(yǎng)基(2)的組成)
[0113]通過(guò)向單核細(xì)胞分化用培養(yǎng)基(I)中進(jìn)一步添加下述成分，制備用于使未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞向成熟樹(shù)突狀細(xì)胞分化的培養(yǎng)基。下文中將該培養(yǎng)基稱為“單核細(xì)胞分化用培養(yǎng)基⑵”。
[0114]IL-1 P (Miltenyi Biotec 公司)10ng/mL
[0115]IL-6 (Miltenyi Biotec 公司)1000IU/mL
[0116]PGE-2 (Cayman Chemical 公司)I U g/mL
[0117]TNF- a (Miltenyi Biotec 公司)20ng/mL
[0118]0.1KE 氯化 Picibanil (中外制藥)
[0119]慶大霉素50ng/mL
[0120]5%自體血漿(從各癌癥患者獲得的血漿)
[0121]將增殖的單核細(xì)胞(即，在實(shí)施例2的條件下在第3天培養(yǎng)獲得的單核細(xì)胞)于單核細(xì)胞分化用培養(yǎng)基(I)中在與單核細(xì)胞的增殖相同的條件下培養(yǎng)8天，使其分化為未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。在8天的培養(yǎng)結(jié)束的時(shí)間點(diǎn)，添加抗原肽，進(jìn)行脈沖。
[0122]將獲得的未成熟樹(shù)突狀細(xì)胞于單核細(xì)胞分化用培養(yǎng)基(2)中在與單核細(xì)胞的增殖相同的條件下培養(yǎng)3天，使其分化為成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。
[0123]針對(duì)獲得的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞表面的標(biāo)志物。需要說(shuō)明的是，作為標(biāo)志物，使用成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的標(biāo)志物CD83和單核細(xì)胞的標(biāo)志物CD14。其結(jié)果示于圖3(A)。另外，使用成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的標(biāo)志物CD83作為標(biāo)志物，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析獲得的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的數(shù)量。其結(jié)果示于圖3 (B)。由圖3 (A)及(B)所示可知，分化后的細(xì)胞中不存在表達(dá)CD14的細(xì)胞(即單核細(xì)胞)，但存在表達(dá)CD83的細(xì)胞(即成熟樹(shù)突狀細(xì)胞)，因此單核細(xì)胞分化為了成熟樹(shù)突狀細(xì)胞。
[0124]另外，使用MHC Class I 分子(HLA_A、B、C)及 MHC Class II 分子(HLA-DR)作為標(biāo)志物，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析獲得的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞的抗原提呈能力。其結(jié)果示于圖3 (C)。由圖3(C)所示可知，獲得的成熟樹(shù)突狀細(xì)胞表達(dá)MHC Class I分子及MHC Class II分子，具有抗原提呈能力。
[0125]〈實(shí)施例4:關(guān)于各種細(xì)胞因子對(duì)單核細(xì)胞增殖的影響的研究〉
[0126]按照下述條件研究本發(fā)明的單核細(xì)胞增殖劑(Flt-3L、IL-3或IFN- y )及各種細(xì)胞因子(SCF、IFN-a或IFN-P )對(duì)單核細(xì)胞的增殖造成的影響。
[0127]將按照實(shí)施例1記載的方法分離的單核細(xì)胞添加至96孔板內(nèi)，使其在培養(yǎng)基中為I X IO3個(gè)細(xì)胞/孔，于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)6天。需要說(shuō)明的是，該培養(yǎng)基的組成如下文所述。
[0128](培養(yǎng)基組成)
[0129]淋巴細(xì)胞用無(wú)血清合成培養(yǎng)基(X-VIV0 15、Takara Bio株式會(huì)社)
[0130]按照表1的矩陣組合的細(xì)胞因子(各細(xì)胞因子的使用量如下所示)
[0131]
【權(quán)利要求】
1.一種在從單核細(xì)胞到樹(shù)突狀細(xì)胞的分化處理前使用的單核細(xì)胞增殖劑，所述單核細(xì)胞增殖劑含有Flt-3L、IL-3或IFN-Y中的一種以上。
2.一種在從單核細(xì)胞到樹(shù)突狀細(xì)胞的分化處理前使用的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有Flt-3L、IL-3或IFN-Y中的一種以上。
3.如權(quán)利要求2所述的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基含有GM-CSF。
4.一種單核細(xì)胞的制造方法，所述方法包括: 通過(guò)在權(quán)利要求2或3所述的單核細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基中培養(yǎng)原料單核細(xì)胞而使得其增殖的增殖步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的單核細(xì)胞的制造方法，其中，使用含有單核細(xì)胞以及除單核細(xì)胞以外的白細(xì)胞成分的混合物作為所述原料單核細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求4或5所述的單核細(xì)胞的制造方法，包括: 在所述增殖步驟之前，使體液中除單核細(xì)胞以外的成分的含有率降低而得到所述原料單核細(xì)胞的降低步驟。
7.如權(quán)利要求6所述的單核細(xì)胞的制造方法，其中，所述降低通過(guò)使用磁性珠粒來(lái)進(jìn)行，所述磁性珠粒針對(duì)所述原料單核細(xì)胞中的單核細(xì)胞以及除單核細(xì)胞以外的白細(xì)胞成分、血漿、紅細(xì)胞中的至少一者的親和性較之針對(duì)其他成分的親和性更高。
8.如權(quán)利要求6或7所述的單核細(xì)胞的制造方法，其中從IOOmL以下的末梢血獲得所述原料單核細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求6~8中任一項(xiàng)所述的單核細(xì)胞的制造方法，其中不包括冷凍貯藏所述單核細(xì)胞的冷凍貯藏步驟。
10.一種樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法，所述方法包括: 通過(guò)權(quán)利要求4~9中任一項(xiàng)所述的單核細(xì)胞的制造方法制造單核細(xì)胞的單核細(xì)胞制造步驟、和 使通過(guò)所述單核細(xì)胞制造步驟獲得的單核細(xì)胞分化為樹(shù)突狀細(xì)胞的分化步驟。
11.如權(quán)利要求10所述的樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法，其中，在所述分化步驟中，在含有Flt-3L、IL-3或IFN-Y中的一種以上的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述單核細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求10或11所述的樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法，所述方法包括脈沖所述樹(shù)突狀細(xì)胞的脈沖步驟。
13.—種樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法，所述方法包括: 通過(guò)權(quán)利要求10~12中任一項(xiàng)所述的樹(shù)突狀細(xì)胞的制造方法制造樹(shù)突狀細(xì)胞的樹(shù)突狀細(xì)胞制造步驟、和 將通過(guò)所述樹(shù)關(guān)狀細(xì)胞制造步驟猶得的樹(shù)關(guān)狀細(xì)胞制備為樹(shù)關(guān)狀細(xì)胞疫苗的制備步驟。
14.如權(quán)利要求13所述的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法，其中不包括冷凍貯藏所述單核細(xì)胞及所述樹(shù)突狀細(xì)胞中的至少一者的冷凍忙藏步驟。
15.如權(quán)利要求13或14所述的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制造方法，其中所述原料單核細(xì)胞是由從給予所述樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的對(duì)象采集的體液獲得的。
【文檔編號(hào)】C12N5/0786GK103597072SQ201380001273
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年2月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月10日
【發(fā)明者】阿部博幸, 川崎廣明 申請(qǐng)人:醫(yī)療法人社團(tuán)博心厚生會(huì), 株式會(huì)社生命科學(xué)研究所