葡萄糖二酸的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于提供具有顯著改善的葡萄糖二酸生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體的制作方法和利用該轉(zhuǎn)化體有效生產(chǎn)葡萄糖二酸的方法。在本發(fā)明的葡萄糖二酸的制造方法中，向保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)化體中導(dǎo)入對(duì)功能性肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行誘導(dǎo)的基因重組或變異。
【專利說(shuō)明】葡萄糖二酸的制造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因重組技術(shù)在葡萄糖二酸的制造中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]葡萄糖二酸(四羥基己二酸)是在植物和哺乳動(dòng)物中早已發(fā)現(xiàn)的化合物。
[0003]近年來(lái)，在美國(guó)國(guó)家再生能源研究所關(guān)于需要由生物物質(zhì)制作的高附加值化學(xué)品的報(bào)告(非專利文獻(xiàn)I)中舉出了葡萄糖二酸作為前12名以內(nèi)的化合物。在該報(bào)告中作為可以以葡萄糖二酸為原料制備出的葡萄糖二酸衍生物還示例出了葡糖二酸-Y -內(nèi)酯、葡糖二酸-S-內(nèi)酯或葡糖二酸二內(nèi)酯等內(nèi)酯類(可期待其作為溶劑的用途)；多羥基聚酰胺類(可期待其作為新型尼龍的用途)等。此外，該報(bào)告中還推測(cè)可利用淀粉的硝酸氧化反應(yīng)或堿性漂白劑存在下的催化氧化反應(yīng)作為已知的葡萄糖二酸制造方法。
[0004]進(jìn)一步地，最近在專利文獻(xiàn)I中公開(kāi)了可進(jìn)行葡萄糖二酸的生物合成的轉(zhuǎn)化體。即，在該專利文獻(xiàn)中，分別編碼肌肉肌醇-1-磷酸合成酶(Inol)、肌肉肌醇加氧酶(M1X)和糖醛酸脫氫酶(udh)的3個(gè)基因被轉(zhuǎn)染至大腸桿菌宿主中。這樣得到的轉(zhuǎn)化體在培養(yǎng)基內(nèi)以0.72g/L~1.13g/L的濃度生產(chǎn)出了葡萄糖二酸。但是，據(jù)專利文獻(xiàn)I的發(fā)明人推測(cè)，在該專利文獻(xiàn)的轉(zhuǎn)化體中無(wú)需導(dǎo)入肌醇單磷酸酶(suhB)基因。
[0005]即，在以葡萄糖為底物進(jìn)行葡萄糖二酸的生物合成的通路中，理論上需要下述5種活性:
[0006]活性1:由適當(dāng)?shù)奶荚瓷善咸烟?6-磷酸的活性；
[0007]活性2:將葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)換為肌肉肌醇-1-磷酸的活性、即肌醇-1-磷酸合成酶活性；
[0008]活性3:將肌肉肌醇-1-磷酸轉(zhuǎn)換為肌肉肌醇的活性、即以肌肉肌醇-1-磷酸為底物的磷酸酶活性；
[0009]活性4:將肌肉肌醇轉(zhuǎn)換為葡萄糖醛酸的活性、即肌肉肌醇加氧酶活性；和
[0010]活性5:將葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換為葡萄糖二酸的活性、即糖醛酸脫氫酶活性。
[0011]但是，實(shí)際上，由于活性I的產(chǎn)物葡萄糖-6-磷酸為原核微生物普遍生成的代謝中間體，因而無(wú)需對(duì)原核微生物賦予該活性。
[0012]此外，關(guān)于活性3，已知也有不少微生物株表達(dá)內(nèi)源性肌醇單磷酸酶、或者具有能夠以肌肉肌醇-1-磷酸為底物的通用單磷酸酶活性。因而，在專利文獻(xiàn)I的轉(zhuǎn)化體中沒(méi)有導(dǎo)入肌醇單磷酸酶基因。
[0013]并且，在專利文獻(xiàn)I中，基于所制作的轉(zhuǎn)化體的代謝分析，得出在用于進(jìn)行葡萄糖二酸的生物合成的轉(zhuǎn)化體中無(wú)需導(dǎo)入肌醇單磷酸酶基因的結(jié)論。即，在專利文獻(xiàn)I中記載了下述內(nèi)容:“應(yīng)當(dāng)注意的是，我們并沒(méi)有過(guò)量表達(dá)SUhB基因或同源磷酸酶。但是，培養(yǎng)產(chǎn)物中未檢測(cè)到肌肉肌醇-1-磷酸，而另一方面，卻有肌肉肌醇的積聚。因此，我們得出結(jié)論:磷酸酶活性并不限制通過(guò)該通路的代謝的流量(flux)?！?第33頁(yè)、第2~5行)。
[0014]因而并不存在將肌醇單磷酸酶基因?qū)氲接糜谄咸烟嵌岬纳锖铣傻霓D(zhuǎn)化體中的明確動(dòng)機(jī)。
[0015]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0016]專利文獻(xiàn)
[0017]專利文獻(xiàn)1:W02009/145838號(hào)小冊(cè)子
[0018]非專利文獻(xiàn)
[0019]非專利文獻(xiàn)1:Top Value Added Chemicals from B1mass Volume 1-Results ofScreening for Potential Candidates from Sugars and Synthesis Gas，”，、http://wwwl.eere.energy, gov/b1mass/pdfs/35523, pdf > T.Werpy 和 G.Peterson 編、2004 年 8 月發(fā)行


【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]發(fā)明所要解決的課題
[0021]本發(fā)明所要解決的課題在于具有顯著改善的葡萄糖二酸生產(chǎn)能力的轉(zhuǎn)化體的制造及其應(yīng)用。
[0022]解決課題的手段
[0023]如上所述，即使是在公開(kāi)了能夠生物合成葡萄糖二酸的轉(zhuǎn)化體的專利文獻(xiàn)I中，也并未向該轉(zhuǎn)化體中導(dǎo)入肌醇單磷酸酶基因，并且該活性也并未引起特別的關(guān)注。
[0024]但是，與專利文獻(xiàn)I的預(yù)想相反，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，肌醇單磷酸酶活性在用于葡萄糖二酸生物合成的轉(zhuǎn)化體中具有重要作用。特別值得吃驚的是，通過(guò)增強(qiáng)肌醇單磷酸酶活性，這樣的轉(zhuǎn)化體的葡萄糖二酸生產(chǎn)能力提高了數(shù)十~百倍。
[0025]因而，本發(fā)明的第一方面在于:
[0026](I) 一種葡萄糖二酸的制造方法，其包括下述工序:
[0027]I)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化體的工序，該轉(zhuǎn)化體保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因，并具有對(duì)該轉(zhuǎn)化體內(nèi)的功能性肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行誘導(dǎo)的基因重組或變異；
[0028]2)在適于上述轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)和/或維持的條件下，使該轉(zhuǎn)化體與能夠由該轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)換為葡萄糖二酸的碳源進(jìn)行接觸的工序；以及
[0029]3)從在上述2)中得到的培養(yǎng)物中分離出葡萄糖二酸或者葡萄糖二酸鹽的工序。
[0030]更特定地說(shuō)，上述制造方法為使用轉(zhuǎn)化體的葡萄糖二酸的制造方法，該轉(zhuǎn)化體保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因，其特征在于，上述轉(zhuǎn)化體具有對(duì)功能性肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行誘導(dǎo)的基因重組或變異。
[0031]本發(fā)明葡萄糖二酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，使用下述碳源作為培養(yǎng)基材是適宜的，該基材含有適于生成作為肌醇-1-磷酸合成酶(上述活性2)的底物的葡萄糖-6-磷酸的化合物。因而，本發(fā)明的適宜方式為:
[0032](2)如上述(I)所述的制造方法，其中，上述碳源包括可在上述轉(zhuǎn)化體內(nèi)轉(zhuǎn)換為葡萄糖-6-磷酸的化合物；和
[0033](3)如上述(2)所述的制造方法，其中，上述碳源為選自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纖維素、米糠、廢糖蜜以及含有D-葡萄糖的生物物質(zhì)組成的組中的I種以上。
[0034] 對(duì)于以大腸桿菌為代表的原核微生物來(lái)說(shuō)，由于其迅速的生長(zhǎng)能力以及發(fā)酵管理的容易性，因而從工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)的方面考慮是極富魅力的，同時(shí)從應(yīng)用基因重組技術(shù)時(shí)的實(shí)際成績(jī)、可靠的安全性的方面考慮也具有優(yōu)點(diǎn)。此外，對(duì)于不具有從葡萄糖經(jīng)肌肉肌醇來(lái)生物合成葡萄糖二酸的通路的多數(shù)原核微生物來(lái)說(shuō)，通過(guò)使用與基因重組技術(shù)聯(lián)合的合成生物學(xué)方法，具有容易調(diào)節(jié)葡萄糖二酸生產(chǎn)率的優(yōu)點(diǎn)。特別是大腸桿菌等原核微生物宿主不具有對(duì)作為葡萄糖二酸生物合成通路中間體的肌肉肌醇的同化能力(分解能力)，因而更容易應(yīng)用合成生物學(xué)的方法。因而，本發(fā)明的適宜方式包括:
[0035](4)如上述(I)至(3)的任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，上述轉(zhuǎn)化體來(lái)源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物；和
[0036](5)如上述(I)至(4)的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，上述轉(zhuǎn)化體來(lái)源于選自由大腸桿菌、芽胞桿菌屬細(xì)菌、棒狀桿菌屬細(xì)菌、發(fā)酵單胞菌屬細(xì)菌組成的組中的細(xì)菌。
[0037]無(wú)論宿主微生物是否具有內(nèi)源性肌醇單磷酸酶活性，均可通過(guò)肌醇單磷酸酶在該細(xì)胞內(nèi)的過(guò)剩生產(chǎn)來(lái)增強(qiáng)該細(xì)胞的肌醇單磷酸酶活性?？蓱?yīng)用各種公知的技術(shù)使肌醇單磷酸酶在細(xì)胞中過(guò)剩生產(chǎn)。因而，本發(fā)明包括下述方式:
[0038](6)如上述(I)至(5)的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，上述肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)是通過(guò)對(duì)上述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行以下操作而被誘導(dǎo)的:
[0039]a)導(dǎo)入外來(lái)肌醇單磷酸酶基因、
[0040]b)增加內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數(shù)、
[0041 ] c)在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域?qū)胱儺悺?
[0042]d)利用高表達(dá)誘導(dǎo)性外來(lái)調(diào)整區(qū)域來(lái)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域、或者
[0043]e)使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域缺失；和
[0044](7)如上述(6)所述的制造方法，其中，上述肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)是通過(guò)對(duì)上述轉(zhuǎn)化體導(dǎo)入外來(lái)肌醇單磷酸酶基因而被誘導(dǎo)的。
[0045]此外，在宿主細(xì)胞具有內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的情況下，也可利用下述方式來(lái)增強(qiáng)該細(xì)胞的肌醇單磷酸酶活性。
[0046](8)如上述(I)至(5)的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，上述肌醇單磷酸酶的活化是通過(guò)對(duì)上述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行以下操作而被誘導(dǎo)的:
[0047]f)在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因中導(dǎo)入變異、
[0048]g)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部、
[0049]h)使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失、
[0050]i)使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質(zhì)減少、
[0051]j)使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物的生成減少。
[0052]此外，本發(fā)明還謀求用于上述葡萄糖二酸的制造方法的轉(zhuǎn)化體。因而，本發(fā)明的第二方面在于:
[0053](9) 一種轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因，其中，該轉(zhuǎn)化體具有對(duì)該轉(zhuǎn)化體內(nèi)的功能性肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行誘導(dǎo)的基因重組或變異。
[0054]更特定地說(shuō)，上述轉(zhuǎn)化體為保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，其具有對(duì)功能性肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行誘導(dǎo)的基因重組或變異。
[0055]此外，本發(fā)明第一方面中記載的方式也適用于本發(fā)明的第二方面。這些方式為:
[0056](10)如上述(9)所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，上述轉(zhuǎn)化體來(lái)源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物；
[0057](11)如上述(9)或(10)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，上述轉(zhuǎn)化體來(lái)源于選自由大腸桿菌、芽胞桿菌屬細(xì)菌、棒狀桿菌屬細(xì)菌、發(fā)酵單胞菌屬細(xì)菌組成的組中的細(xì)菌；
[0058](12)如上述(9)至(11)的任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，上述肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)是通過(guò)對(duì)上述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行以下操作而被誘導(dǎo)的:
[0059]a)導(dǎo)入外來(lái)肌醇單磷酸酶基因、
[0060]b)增加內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數(shù)、
[0061]c)在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域?qū)胱儺悺?br> [0062]d)利用高表達(dá)誘導(dǎo)性外來(lái)調(diào)整區(qū)域來(lái)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域、或者
[0063]e)使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域缺失；
[0064](13)如上述(12)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，上述肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)是通過(guò)對(duì)上述轉(zhuǎn)化體導(dǎo)入外來(lái)肌醇單磷酸酶基因而被誘導(dǎo)的；和
[0065](14)如上述(9)至(11)的任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，上述肌醇單磷酸酶的活化是通過(guò)對(duì)上述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行以下操作而被誘導(dǎo)的:
[0066]f)在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因中導(dǎo)入變異、
[0067]g)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部、
[0068]h)使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失、
[0069]i)使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質(zhì)減少、
[0070]j)使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物的生成減少。
[0071]發(fā)明的效果
[0072]根據(jù)本發(fā)明，能夠利用微生物培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)葡萄糖二酸工業(yè)生產(chǎn)的效率化。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0073]圖1示出了 INOl基因的編碼區(qū)域(序列編號(hào)I)。
[0074]圖2示出了 suhB基因的編碼區(qū)域(序列編號(hào)3)。
[0075]圖3示出了 m1x基因的編碼區(qū)域(序列編號(hào)5)。
[0076]圖4示出了 udh基因的編碼區(qū)域(序列編號(hào)7)。

【具體實(shí)施方式】
[0077]本發(fā)明的課題通過(guò)增強(qiáng)保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)化體中的肌醇單磷酸酶活性而得到解決。
[0078] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可使用各種宿主微生物細(xì)胞來(lái)制作。特別是在以原核微生物為宿主時(shí)，由于能夠在該宿主細(xì)胞內(nèi)新構(gòu)建葡萄糖二酸生物合成通路(即，無(wú)現(xiàn)有的內(nèi)源性通路的影響)，因而在合成生物學(xué)方法的應(yīng)用中是極富魅力的。所示例出的原核微生物為埃希氏菌、假單胞菌、芽胞桿菌、地芽胞桿菌、甲烷單胞菌、甲基芽孢桿菌、嗜甲基菌、精朊桿菌、甲基球菌、棒狀桿菌、短桿菌、發(fā)酵單胞菌和李斯特氏菌屬的細(xì)菌。在工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中適宜的原核微生物的非限定性示例包括大腸桿菌、芽胞桿菌屬細(xì)菌、棒狀桿菌屬細(xì)菌、發(fā)酵單胞菌屬細(xì)菌。大腸桿菌由于其迅速的生長(zhǎng)能力和發(fā)酵管理的容易性的原因，為特別優(yōu)選的本發(fā)明的宿主微生物的示例。
[0079]此外，能夠作為本發(fā)明的宿主細(xì)胞使用的細(xì)胞株可以為通常含義下的野生型，或者也可以為營(yíng)養(yǎng)要求性變異株、抗生素耐性變異株。進(jìn)一步地，能夠作為本發(fā)明的宿主細(xì)胞使用的細(xì)胞株可以已經(jīng)被轉(zhuǎn)化從而使之具有與上述變異相關(guān)的各種標(biāo)記基因。這些變異或基因能夠提供對(duì)于本發(fā)明轉(zhuǎn)化體的制作?維持?管理有益的性質(zhì)。優(yōu)選可通過(guò)使用對(duì)于氯霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素等抗生素顯示出耐性的菌株來(lái)簡(jiǎn)便地進(jìn)行本發(fā)明葡萄糖二酸的生產(chǎn)。
[0080]在面向合成生物學(xué)的本發(fā)明中，為了在宿主細(xì)胞中構(gòu)建新的葡萄糖二酸生物合成通路，在宿主細(xì)胞不表達(dá)內(nèi)源性肌醇-1-磷酸合成酶的情況下，導(dǎo)入外來(lái)肌醇-1-磷酸合成酶基因。需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，使用“外來(lái)”或“外來(lái)性”這一術(shù)語(yǔ)所表示的含義是，在轉(zhuǎn)化前的宿主微生物不具有要由本發(fā)明導(dǎo)入的基因的情況下；在實(shí)質(zhì)上不表達(dá)由該基因編碼的酶的情況下；以及在該酶的氨基酸序列由不同的基因編碼、但在轉(zhuǎn)化后不表達(dá)相匹配的內(nèi)源性酶活性的情況下，向宿主中導(dǎo)入基于本發(fā)明的基因或核酸序列。
[0081]肌醇-1-磷酸合成酶基因是已知的(例如，基因庫(kù)登錄號(hào)Nos.AB032073、AF056325、AF071103、AF078915、AF120146、AF207640、AF284065、BC111160、L23520、U32511)，它們均可用于本發(fā)明的目的。特別是具有序列編號(hào)I所表示的編碼區(qū)域核苷酸序列的肌醇-1-磷酸合成酶基因能夠在本發(fā)明中適當(dāng)?shù)厥褂谩５?，能夠在本發(fā)明中使用的肌醇-1-磷酸合成酶基因并不限于上述基因，其可來(lái)源于其它生物、或者也可人工合成，只要在上述宿主微生物細(xì)胞內(nèi)能夠?qū)嵸|(zhì)性地表達(dá)肌醇-1-磷酸合成酶活性即可。
[0082]從而，對(duì)于能夠用于本發(fā)明目的的肌醇-1-磷酸合成酶基因，只要在上述宿主微生物細(xì)胞內(nèi)能夠?qū)嵸|(zhì)性地表達(dá)肌醇-1-磷酸合成酶活性，可以具有能夠在自然界發(fā)生的全部變異、或者具有人工導(dǎo)入的變異和修飾。例如，已知在編碼特定氨基酸的各種密碼子中存在冗余密碼子(redundancy)。因此，在本發(fā)明中也可利用最終可翻譯成相同氨基酸的代替密碼子。即，由于基因編碼的簡(jiǎn)并，因而編碼某一特定氨基酸時(shí)可使用2個(gè)以上的密碼子，因此氨基酸序列可利用任意的I組類似的DNA低聚核苷酸進(jìn)行編碼得到。雖然該組中僅唯一的成員與天然型酶的基因序列相同，但即使是有錯(cuò)配的DNA低聚核苷酸，在適當(dāng)?shù)膰?yán)謹(jǐn)條件下(例如，3xSSC、68°C雜交、2xSSC、0.1% SDS和68°C清洗)也能夠與天然型序列雜交，能夠?qū)幋a天然型序列的DNA進(jìn)行鑒定、分離，進(jìn)一步還可將這樣的基因用于本發(fā)明中。特別是已知大部分生物優(yōu)選使用特定密碼子(最佳密碼子)的子集(Gene, Vol.105, pp.61-72，1991等)，因而根據(jù)宿主微生物進(jìn)行“密碼子最佳化”也是有用的。
[0083]并且，在本發(fā)明中，也可通過(guò)將肌醇-1-磷酸合成酶基因以“表達(dá)盒”的形式導(dǎo)入到宿主微生物細(xì)胞內(nèi)來(lái)更穩(wěn)定地得到高水平的肌醇-1-磷酸合成酶活性，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是可以理解的。在本說(shuō)明書中，“表達(dá)盒”是指含有與表達(dá)對(duì)象的核酸或表達(dá)對(duì)象的基因功能性結(jié)合的對(duì)于轉(zhuǎn)錄和翻譯進(jìn)行調(diào)節(jié)的核酸序列的核苷酸。代表性地，本發(fā)明的表達(dá)盒以功能性結(jié)合的狀態(tài)在編碼序列的5’上游含有啟動(dòng)子序列、在3’下游含有終止子序列、根據(jù)情況進(jìn)一步含有通常的調(diào)節(jié)元件，在這樣的情況下，表達(dá)對(duì)象的核酸或表達(dá)對(duì)象的基因被“可表達(dá)地導(dǎo)入”到宿主微生物中。
[0084]關(guān)于啟動(dòng)子，不論是結(jié)構(gòu)性啟動(dòng)子還是調(diào)節(jié)啟動(dòng)子，均被定義為使RNA聚合酶與DNA結(jié)合、引發(fā)RNA合成的DNA序列。強(qiáng)啟動(dòng)子是指高頻引發(fā)mRNA合成的啟動(dòng)子，也適于用于本發(fā)明中。可根據(jù)該宿主細(xì)胞的性質(zhì)等使用Iac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌體的主要操縱子和啟動(dòng)子區(qū)域、fd包覆蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)區(qū)域、針對(duì)糖酵解系酶(例如，3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、谷氨酸脫羧酶A、絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的啟動(dòng)子等。除了啟動(dòng)子和終止子序列以外，可作為其它調(diào)節(jié)元件的示例舉出的序列為選擇標(biāo)記、擴(kuò)增信號(hào)、復(fù)制起點(diǎn)等。適宜的調(diào)節(jié)序列例如記載于“Gene Express1n Technology:Methods inEnzymology 185”，Academic Press (1990)中。
[0085]上述說(shuō)明的表達(dá)盒嵌入到例如由質(zhì)粒、曬菌體、轉(zhuǎn)座子、IS元件、曬粒、粘粒、或者線狀或環(huán)狀DNA等構(gòu)成的載體中而被插入到宿主微生物中。優(yōu)選質(zhì)粒和噬菌體。這些載體在宿主微生物中可自體復(fù)制，也可通過(guò)染色體復(fù)制。適宜的質(zhì)粒例如為:大腸桿菌的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pR印4、pHSl、pKK223_3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-1II113-Bl、Agtll 或 pBdCI ;桿菌的 pUB110、pC194或pBD214 ;棒狀桿菌屬的pSA77或pAJ667等。除它們以外，能夠使用的質(zhì)粒等還記載于“Cloning Vectors”, Elsevier, 1985中。表達(dá)盒向載體中的導(dǎo)入可通過(guò)包括利用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈?、克隆化以及連接的慣用方法進(jìn)行。
[0086]在如上所述構(gòu)建出本發(fā)明的具有表達(dá)盒的載體后，作為將該載體導(dǎo)入到宿主微生物中時(shí)能夠適用的方法，例如使用共沉淀、原生質(zhì)體融合、電穿孔、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染等慣用的克隆化法和轉(zhuǎn)染法。它們的示例記載于“分子生物學(xué)的最新實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(CurrentProtocols in Molecular B1logy)，，,F.Ausubel 等，Publ.Wiley Interscience, New York,1997 ;或 Sambrook 等分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”,第 2 版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 中。
[0087]本發(fā)明人令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在不具有內(nèi)源性葡萄糖二酸生物合成通路的宿主微生物內(nèi)導(dǎo)入葡萄糖二酸生物合成通路而得到的轉(zhuǎn)化體中，肌醇單磷酸酶活性具有重大作用。如上所述，在迄今為止的研究中，均未對(duì)肌醇單磷酸酶活性予以特別關(guān)注。但是，出人意料地，通過(guò)增強(qiáng)肌醇單磷酸酶活性，這樣的轉(zhuǎn)化體的葡萄糖二酸生產(chǎn)能力大幅提高。
[0088]因而，本發(fā)明的一個(gè)方式包括:在保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因的轉(zhuǎn)化體中進(jìn)行肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)。
[0089]對(duì)于本發(fā)明中謀求的肌醇單磷酸酶，除了對(duì)肌醇-1-磷酸顯示出高底物特異性外，還顯示出了可作用于廣泛的底物的磷酸單酯水解酶活性，從而包括實(shí)質(zhì)上能夠水解肌醇-1-磷酸的蛋白質(zhì)。作為代表性的肌醇單磷酸酶，例如已知有肌醇-1-單磷酸酶，大量生物來(lái)源的該基因(SUhB基因)在基因庫(kù)登錄號(hào)Nos.ZP — 04619988、YP — 001451848等中公布。特別是大腸桿菌來(lái)源的suhB基因(序列編號(hào)3:AAC75586(MG1655))的使用在以大腸桿菌為宿主細(xì)胞的情況下較為方便。
[0090]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物所應(yīng)具有的下述生物活性為肌肉肌醇加氧酶活性。該酶代表性地通過(guò)下述反應(yīng)將肌肉肌醇轉(zhuǎn)換為葡萄糖醛酸。
[0091][化1]
[0092]
肌肉肌醇+O2 ^-?葡萄糖醛酸+H2O
[0093]各種肌肉肌醇加氧酶基因是已知的，且可加以利用。例如，在W02002/074926號(hào)小冊(cè)子中公開(kāi)了隱球菌和人來(lái)源的肌肉肌醇加氧酶基因及其異源表達(dá)。此外，專利文獻(xiàn)I所公開(kāi)的肌肉肌醇加氧酶基因也可用于本發(fā)明中。進(jìn)一步地，例如已知有被賦予了下述基因庫(kù)登錄號(hào)的來(lái)源于多種生物的肌肉肌醇加氧酶基因，它們可用于本發(fā)明中。
[0094]ACCESS1N N0.AY738258 (智人肌肉肌醇加氧酶(M1X))
[0095]ACCESS1N N0.NM101319 (擬南芥肌醇加氧酶 I (M1Xl))
[0096]ACCESS1N N0.NM001101065 (牛肌肉肌醇加氧酶(M1X))
[0097]ACCESS1N N0.NM001030266 (斑馬魚肌肉肌醇加氧酶(m1x))
[0098]ACCESS1N N0.NM214102 (野豬肌肉肌醇加氧酶(M1X))
[0099]ACCESS1N N0.AY064416 (智人肌肉肌醇加氧酶(M1X))
[0100]ACCESS1N N0.NM001247664(番茄肌肉肌醇加氧酶(M1X))
[0101]ACCESS1N N0.XM630762 (盤基網(wǎng)柄菌 AX4 肌醇加氧酶(m1x))
[0102]ACCESS1N N0.NM 145771 (褐鼠肌肉肌醇加氧酶(M1x))
[0103]ACCESS1N N0.NM017584(智人肌肉肌醇加氧酶(M1X))
[0104]ACCESS1N N0.NM001131282 (蘇門答臘猩猩肌肉肌醇加氧酶(M1X))
[0105]具有序列編號(hào)5所表示的編碼區(qū)域核苷酸序列的m1x基因的使用是特別方便的。
[0106]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物所應(yīng)具有的最后一種生物活性為糖醛酸脫氫酶活性。該酶代表性地在NAD+的存在下通過(guò)下述反應(yīng)將葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)換為葡萄糖二酸。
[0107][化2]
[0108]
葡萄糖醛酸+NAD++ H2O ^-?葡萄糖二酸+NADH + H_
[0109]各種糖醛酸脫氫酶基因是已知的且可加以利用。例如，專利文獻(xiàn)I所記載的綠膿桿菌或農(nóng)桿菌屬細(xì)菌的糖醛酸脫氫酶也可在本發(fā)明中進(jìn)行使用。進(jìn)一步地，例如已知有被賦予了下述基因庫(kù)登錄號(hào)的udh基因，它們可用于本發(fā)明中。
[0110]ACCESS1N N0.BK006462 (根癌農(nóng)桿菌 str.C58 糖醛酸脫氫酶(udh)基因)
[0111]ACCESS1N N0.EU377538 ( 丁香假單胞菌番茄致病變種str.DC3000糖醛酸脫氫酶(udh)基因)
[0112]具有序列編號(hào)7所表示的編碼區(qū)域核苷酸序列的Udh基因的使用是特別方便的。
[0113]本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在肌醇-1-磷酸合成酶基因中記載的變異、修飾和密碼子最佳化以及表達(dá)盒、啟動(dòng)子等調(diào)節(jié)序列和質(zhì)粒等以及基于此的轉(zhuǎn)化的說(shuō)明對(duì)于本發(fā)明的肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因也是全部適用的。因而，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體可以保有包含編碼肌醇-1-磷酸合成酶的核酸的表達(dá)盒、包含編碼肌醇單磷酸酶基因的核酸的表達(dá)盒、包含編碼肌肉肌醇加氧酶的核酸的表達(dá)盒和包含編碼糖醛酸脫氫酶的核酸的表達(dá)盒這4個(gè)表達(dá)盒。本發(fā)明的適宜的轉(zhuǎn)化體保有包含具有序列編號(hào)I所表示的核苷酸序列的核酸的表達(dá)盒、包含具有序列編號(hào)3所表示的核苷酸序列的核酸的表達(dá)盒、包含具有序列編號(hào)5所表示的核苷酸序列的核酸的表達(dá)盒以及包含具有序列編號(hào)7所表示的核苷酸序列的核酸的表達(dá)盒。
[0114]上述4個(gè)表達(dá)盒可配置在I個(gè)載體上被轉(zhuǎn)染至宿主微生物中?；蛘呖梢詫⑴渲糜衅渲腥我?個(gè)以上的表達(dá)盒的載體與配置有剩下的表達(dá)盒的載體共轉(zhuǎn)染至宿主微生物中，還可以將配置有各個(gè)表達(dá)盒的4個(gè)載體共轉(zhuǎn)染至宿主微生物中。進(jìn)一步地，也可以將上述4個(gè)表達(dá)盒中的任意一個(gè)以上嵌入到宿主微生物的基因組中，剩下的表達(dá)盒以質(zhì)粒的形式存在于該轉(zhuǎn)化微生物內(nèi)。例如，也可將配置有包含編碼肌肉肌醇加氧酶的核酸的表達(dá)盒和包含編碼糖醛酸脫氫酶的核酸的表達(dá)盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到大腸桿菌AKC-018株(于2011年10月25日以FERM P-22181保藏于獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利生物保藏中心。國(guó)際保藏編號(hào):FERM BP-11514)中，該大腸桿菌AKC-018株在染色體上具有包含編碼肌醇-1-磷酸合成酶的核酸(INOl)的表達(dá)盒和包含編碼肌醇單磷酸酶的核酸(suhB)的表達(dá)盒這兩種表達(dá)盒。
[0115]此外還認(rèn)為有多種微生物細(xì)胞表達(dá)本發(fā)明中謀求的肌醇單磷酸酶活性(即具有編碼肌醇單磷酸酶活性的內(nèi)源性基因)。因而，本發(fā)明中的肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)可通過(guò)下述操作進(jìn)行誘導(dǎo):增加內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數(shù)；在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域?qū)胱儺悾焕酶弑磉_(dá)誘導(dǎo)性外來(lái)調(diào)整區(qū)域來(lái)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域；和使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域缺失。具體地說(shuō)，為了實(shí)現(xiàn)肌醇單磷酸酶的過(guò)剩表達(dá)，可通過(guò)進(jìn)行下述操作來(lái)實(shí)現(xiàn):利用含有內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因、或者含有在該內(nèi)源性基因的編碼區(qū)域添加了適宜的調(diào)整區(qū)域的表達(dá)盒的構(gòu)建體對(duì)上述宿主微生物進(jìn)行轉(zhuǎn)化，使該轉(zhuǎn)化體內(nèi)該肌醇單磷酸酶基因的拷貝數(shù)與原來(lái)的宿主細(xì)胞相比有實(shí)質(zhì)性的增加；或者利用公知的基因重組技術(shù)對(duì)于具有內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的原來(lái)的宿主細(xì)胞實(shí)施染色體的變異、添加和缺失；或者使用誘變劑等在染色體中隨機(jī)導(dǎo)入變異?？墒褂霉腟DS-PAGE分析法等對(duì)肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)進(jìn)行確認(rèn)。
[0116]進(jìn)一步地，用于增強(qiáng)肌醇單磷酸酶活性的本發(fā)明的其它方式包括在宿主微生物細(xì)胞中誘導(dǎo)肌醇單磷酸酶的活化。為了完成該目的，可示例出下述這樣的方法:1)在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因中導(dǎo)入變異；2)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部；3)使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失；4)使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質(zhì)減少；和/或5)使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物的生成減少。
[0117]關(guān)于上述用于增強(qiáng)肌醇單磷酸酶活性的I)~5)的方法，具體地說(shuō)，可在對(duì)肌醇單磷酸酶的基因?qū)嵤┳儺?、添加或者缺失后?duì)該基因所編碼的肌醇單磷酸酶的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而得到肌醇單磷酸酶活性得到增強(qiáng)的肌醇單磷酸酶。
[0118]對(duì)于上述得到的轉(zhuǎn)化體，為了進(jìn)行本發(fā)明的葡萄糖二酸的生產(chǎn)，可在適于上述轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)和/或維持的條件下進(jìn)行培養(yǎng)和維持。來(lái)源于各種宿主微生物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體所用的適宜的培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員為已知的。
[0119]培養(yǎng)基可以為含有I種以上的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、維生素以及必要時(shí)的微量元素或維生素等微量成分的天然、半合成、合成培養(yǎng)基。但是，不消說(shuō)所使用的培養(yǎng)基必須適當(dāng)滿足所要培養(yǎng)的轉(zhuǎn)化體的營(yíng)養(yǎng)要求。進(jìn)一步地，為了使上述轉(zhuǎn)化體與能夠由該轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)換為葡萄糖二酸的碳源接觸，本發(fā)明的培養(yǎng)基需要含有最終能夠用作葡萄糖二酸生產(chǎn)的底物的碳源、即需要含有可在轉(zhuǎn)化體內(nèi)轉(zhuǎn)換為葡萄糖-6-磷酸的化合物。碳源可以為D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纖維素、米糠、廢糖蜜，進(jìn)一步可為含有D-葡萄糖的生物物質(zhì)。作為適宜的生物物質(zhì)，可示例出玉米分解液或纖維素分解液。此外，在轉(zhuǎn)化體表達(dá)有用的附加性狀的情況下、例如在具有針對(duì)抗生素的耐性標(biāo)記的情況下，培養(yǎng)基也可以含有相應(yīng)的抗生素。由此使發(fā)酵中的雜菌所致的污染風(fēng)險(xiǎn)降低。
[0120]在宿主微生物無(wú)法同化上述纖維素或多糖類等碳源的情況下，可通過(guò)實(shí)施在該宿主微生物中導(dǎo)入外來(lái)基因等公知的基因工程方法使其適應(yīng)于使用這些碳源的葡萄糖二酸的生產(chǎn)中。作為外來(lái)基因，例如可以舉出纖維酶基因或淀粉酶基因等。
[0121]培養(yǎng)可以為分批式也可以為連續(xù)式。并且，在任一情況下，均可為在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)刻補(bǔ)給所追加的上述碳源等的形式。進(jìn)一步地，培養(yǎng)應(yīng)該在維持適宜的溫度、氧濃度、PH等的條件下繼續(xù)進(jìn)行。來(lái)源于一般的微生物宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化體的適宜培養(yǎng)溫度通常為15°C~45°C、優(yōu)選為25°C~37°C的范圍。宿主微生物為好氧性的情況下，為了確保發(fā)酵中的適當(dāng)?shù)难鯘舛?，需要進(jìn)行振蕩(燒瓶培養(yǎng)等)、攪拌/通氣(發(fā)酵罐培養(yǎng)等)。這些培養(yǎng)條件可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地設(shè)定。
[0122]本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過(guò)公知方法的組合由上述培養(yǎng)物中精制出葡萄糖二酸。例如，在專利文獻(xiàn)I中具體記載了對(duì)于該目的有用的葡萄糖二酸的檢測(cè)和定量方法。
[0123]被提供了上述說(shuō)明的本領(lǐng)域技術(shù)人員可充分實(shí)施本發(fā)明。下面出于進(jìn)一步說(shuō)明的目的提供實(shí)施例，因而本發(fā)明并不限于該實(shí)施例。需要說(shuō)明的是，在本說(shuō)明書中，只要不特別聲明，核苷酸序列被記載為從5’向3’方向。
[0124]實(shí)施例
[0125]實(shí)施例1:質(zhì)粒的構(gòu)建
[0126]1-a)肌醇單磷酸酶表達(dá)盒
[0127]在LB培養(yǎng)基中(2ml)中于37°C對(duì)大腸桿菌株W3110 (NBRC 12713)進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)終止后，從培養(yǎng)液中回收菌體，使用Nucleo Spin Tissue (產(chǎn)品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因組DNA。將所提取的基因組DNA用于模板，利用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(產(chǎn)品名、Taraka-B1 制造)反應(yīng)條件:98°C 10sec,55°C 5sec,72°C 20sec，28循環(huán))，克隆suhB基因的編碼區(qū)域(序列編號(hào)3)。
[0128][化3]
[0129]正向:atgcatccgatgctgaac(序列編號(hào) 9)
[0130]反向:ttaacgcttcagagcgtcg(序列編號(hào)10)
[0131]所得到的suhB編碼區(qū)域可轉(zhuǎn)錄地插入到下述序列的啟動(dòng)子的下游。
[0132][化4]
[0133]啟動(dòng)子:gtcgtttttctgcttaggattttgttatttaaattaagcctgtaatgccttgcttccattgcggataaatcctacttttttattgccttcaaataaatttaaggagttc (序列編號(hào) 11)
[0134]即，在質(zhì)粒pNFP-A51 (于2011年10月25日以FERM P-22182保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利生物保藏中心。國(guó)際保藏編號(hào)=FERM BP-11515)的多克隆位點(diǎn)插入終止子序列和上述啟動(dòng)子序列。在所導(dǎo)入的啟動(dòng)子序列的下游連接上述克隆的suhB編碼區(qū)域，構(gòu)建pNFP-A54。將所構(gòu)建的pNFP-A54利用氯化鈣法(參照羊土社遺伝子工學(xué)実験7—卜(基因工程實(shí)驗(yàn)筆記)上田村隆明著)轉(zhuǎn)染到大腸桿菌AKC-016株(于2011年4月20日以FERM P-22104保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心。國(guó)際保藏編號(hào):FERM BP-11512)中。通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)到肌醇單磷酸酶在該大腸桿菌的可溶性級(jí)分中的高表達(dá)。
[0135]ι-b)肌醇-1-磷酸合成酶表達(dá)盒
[0136]從釀酒酵母的培養(yǎng)液中回收菌體，使用Nucleo Spin Tissue (產(chǎn)品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因組DNA。將所提取的基因組DNA用于模板，利用下述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(產(chǎn)品名、Taraka-B1制造)反應(yīng)條件:98 °C 10sec，55°C 5sec，72°C 20sec，28循環(huán))，克隆INOl基因的編碼區(qū)域(序列編號(hào)I)。
[0137][化5]
[0138]正向:atgacagaagataatattgct (序列編號(hào) 12)
[0139]反向:ttacaacaatctctcttcg(序列編號(hào) 13)
[0140]所得到的inol編碼區(qū)域可轉(zhuǎn)錄地插入到下述序列的啟動(dòng)子的下游。
[0141][化6]
[0142]啟動(dòng)子:ctcaagcccaaaggaagagtgaggcgagtcagtcgcgtaatgcttaggcacaggattgatttgtcgcaatgattgacacgattccgcttgacgctgcgtaaggtttttgtaattttacaggcaaccttttattcactaacaaatagctggtggaa (序列編號(hào) 14)
[0143]即，在上述質(zhì)粒PNFP-A51的多克隆位點(diǎn)插入終止子序列和上述啟動(dòng)子序列。在所導(dǎo)入的啟動(dòng)子序列的下游連接上述克隆的inol編碼區(qū)域，構(gòu)建PNFP-D78。將所構(gòu)建的PNFP-D78利用氯化鈣法(參照羊土社遺伝子工學(xué)実験V —卜上田村隆明著)轉(zhuǎn)染到大腸桿菌AKC-016株(于2011年4月20日以FERM P-22104保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心。國(guó)際保藏編號(hào):FERM BP-11512)中。通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)到肌醇-1-磷酸合成酶在該大腸桿菌的可溶性級(jí)分中的高表達(dá)。
[0144]Ι-c)肌肉肌醇加氧酶表達(dá)盒
[0145]肌肉肌醇加氧酶(m1x)基因如下得到:通過(guò)人工合成制作具有序列編號(hào)5的核苷酸序列的DNA，以該DNA為模板，利用下述引物進(jìn)行PCR(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(產(chǎn)品名、Taraka-B1 制造)反應(yīng)條件:98°C 1sec, 55°C 5sec，72°C 20sec, 28 循環(huán))，從而得到該肌肉肌醇加氧酶(m1x)基因。
[0146][化7]
[0147]正向:atgaaagttgatgttggtcct(序列編號(hào) 15)
[0148]反向:ttaccaggacagggtgcc(序列編號(hào) I6)
[0149]將所得到的m1x編碼區(qū)域可轉(zhuǎn)錄地插入到序列編號(hào)11的啟動(dòng)子的下游。即，在上述PNFP-A51的多克隆位點(diǎn)插入終止子序列和上述啟動(dòng)子序列。在所導(dǎo)入的啟動(dòng)子序列的下游連接上述克隆的m1x編碼區(qū)域，構(gòu)建pNFP-H26。將所構(gòu)建的pNFP_H26利用氯化鈣法(參照羊土社遺伝子工學(xué)実験)一卜上田村隆明著)轉(zhuǎn)染到大腸桿菌株FERM P-22104中。通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)到肌肉肌醇加氧酶在該大腸桿菌的可溶性級(jí)分中的高表達(dá)。
[0150]Ι-d)糖醛酸脫氫酶表達(dá)盒
[0151]糖醛酸脫氫酶(udh)基因如下得到:通過(guò)人工合成制作具有序列編號(hào)7的核苷酸序列的DNA，以該DNA為模板，利用下述引物進(jìn)行PCR(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(產(chǎn)品名、Taraka-B1 制造)反應(yīng)條件:98°C 1sec, 55°C 5sec，72°C 20sec, 28 循環(huán))，從而得到該糖醛酸脫氫酶(udh)基因。
[0152][化8]
[0153]正向:atgaccactacccccttcaat(序列編號(hào) IT7)
[0154]反向:tcagttgaacgggccgg(序列編號(hào)I8)
[0155]將所得到的Udh編碼區(qū)域可轉(zhuǎn)錄地插入到序列編號(hào)11的啟動(dòng)子的下游。即，在上述pNFP_A51的多克隆位點(diǎn)插入終止子序列和上述啟動(dòng)子序列。在所導(dǎo)入的啟動(dòng)子序列的下游連接上述克隆的udh編碼區(qū)域，構(gòu)建pNFP-H45。將所構(gòu)建的pNFP-H45利用氯化鈣法(參照羊土社遺伝子工學(xué)実験V —卜上田村隆明著)轉(zhuǎn)染至大腸桿菌株FERM P-22104中。通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)到糖醛酸脫氫酶在該大腸桿菌的可溶性級(jí)分中的高表達(dá)。
[0156]Ι-e)用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒的構(gòu)建
[0157]將上述制作的pNFP-D78利用SalI消化，進(jìn)行末端平滑化和5’末端脫磷酸化。將PNFP-A54中的suhB表達(dá)盒克隆化，與pNFP_D78連接。得到了與pNFP_D78中的INOl表達(dá)盒順?lè)较虻剡B接有suhB表達(dá)盒的pNFP-G22。接下來(lái)，將pNFP_G22利用SalI消化，進(jìn)行末端平滑化和5’末端脫磷酸化。將實(shí)施例1中制作的PNFP-H26中的m1x表達(dá)盒和pNFP_H45中的udh表達(dá)盒克隆化，將兩個(gè)表達(dá)盒與pNFP-G22連接。得到了與pNFP-G22中的INOl表達(dá)盒和suhB表達(dá)盒順?lè)较虻剡B接有m1x表達(dá)盒和udh表達(dá)盒的本發(fā)明的質(zhì)粒。
[0158]實(shí)施例2:
[0159]2-a)利用經(jīng)含有表達(dá)盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染而得到的轉(zhuǎn)化體、使用罐狀培養(yǎng)槽所進(jìn)行的葡萄糖二酸的生產(chǎn)
[0160]使用氯化鈣法(參照羊土社遺伝子工學(xué)実験V —卜上田村隆明著)，將按照上述步驟構(gòu)建的本發(fā)明的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌AKC-016株(于2011年4月20日以FERMP-22104保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)專利微生物保藏中心。國(guó)際保藏編號(hào):FERM BP-11512)中。
[0161]將所得到的轉(zhuǎn)化體在含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB微板上于37°C培養(yǎng)一天，形成菌落。將含有氨芐青霉素(100mg/L)的LB培養(yǎng)基30mL裝入150mL容量的燒瓶中，利用白金耳從上述微板進(jìn)行菌落的植菌，在37°C以180rpm進(jìn)行3~5小時(shí)的培養(yǎng)，直至OD (600nm)為0.5左右，將其作為主培養(yǎng)所用的前培養(yǎng)液。
[0162]在100mL容量的罐狀培養(yǎng)裝置(丸菱生物工程社制造)中加入300mL含有10g/L的葡萄糖與100mg/L氨節(jié)青霉素的合成培養(yǎng)基(表1)，添加6mL的前培養(yǎng)液進(jìn)行主培養(yǎng)(使用罐狀培養(yǎng)裝置的葡萄糖二酸生產(chǎn)試驗(yàn))。培養(yǎng)條件如下:培養(yǎng)溫度32°C;培養(yǎng)pH 6.0 [下限];堿添加28% (重量/容量)氨水；攪拌850rpm ;通氣lvvm。適當(dāng)添加作為原料的葡萄糖添料溶液(表2)，使培養(yǎng)液中的葡萄糖濃度為0g/L~5g/L。
[0163][表 I]
[0164]合成培養(yǎng)基組成
[0165]

【權(quán)利要求】
1.一種葡萄糖二酸的制造方法，其包括下述工序: 1)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化體的工序，該轉(zhuǎn)化體保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因，并具有對(duì)該轉(zhuǎn)化體內(nèi)的功能性肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行誘導(dǎo)的基因重組或變異； 2)在適于所述轉(zhuǎn)化體的生長(zhǎng)和/或維持的條件下，使該轉(zhuǎn)化體與能夠由該轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)換為葡萄糖二酸的碳源進(jìn)行接觸的工序；以及 3)從在所述2)中得到的培養(yǎng)物中分離出葡萄糖二酸或者葡萄糖二酸鹽的工序。
2.如權(quán)利要求1所述的制造方法，其中，所述碳源包括可在所述轉(zhuǎn)化體內(nèi)轉(zhuǎn)換為葡萄糖-6-磷酸的化合物。
3.如權(quán)利要求2所述的制造方法，其中，所述碳源為選自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纖維素、米糠、廢糖蜜以及含有D-葡萄糖的生物物質(zhì)組成的組中的I種以上。
4.如權(quán)利要求1~3的任一項(xiàng)所述的制造方法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體來(lái)源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物。
5.如權(quán)利要求1~4的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述轉(zhuǎn)化體來(lái)源于選自由大腸桿菌、芽胞桿菌屬細(xì)菌、棒狀桿菌屬細(xì)菌、發(fā)酵單胞菌屬細(xì)菌組成的組中的細(xì)菌。
6.如權(quán)利要求1~5的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)是通過(guò)對(duì)所述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行以下操 作而被誘導(dǎo)的: a)導(dǎo)入外來(lái)肌醇單磷酸酶基因； b)增加內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數(shù)； c)在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域?qū)胱儺悾? d)利用高表達(dá)誘導(dǎo)性外來(lái)調(diào)整區(qū)域來(lái)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域；或者 e)使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域缺失。
7.如權(quán)利要求6所述的制造方法，其中，所述肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)是通過(guò)對(duì)所述轉(zhuǎn)化體導(dǎo)入外來(lái)肌醇單磷酸酶基因而被誘導(dǎo)的。
8.如權(quán)利要求1~5的任一項(xiàng)所述的制造方法，其中，所述肌醇單磷酸酶的活化是通過(guò)對(duì)所述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行以下操作而被誘導(dǎo)的: f)在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因中導(dǎo)入變異； g)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部； h)使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失； i)使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質(zhì)減少； j)使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物的生成減少。
9.一種轉(zhuǎn)化體，該轉(zhuǎn)化體保有肌醇-1-磷酸合成酶基因、肌醇單磷酸酶基因、肌肉肌醇加氧酶基因和糖醛酸脫氫酶基因，并且具有對(duì)該轉(zhuǎn)化體內(nèi)的功能性肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)或肌醇單磷酸酶的活化進(jìn)行誘導(dǎo)的基因重組或變異。
10.如權(quán)利要求9所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體來(lái)源于不具有肌肉肌醇同化能力的微生物。
11.如權(quán)利要求9或10所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述轉(zhuǎn)化體來(lái)源于選自由大腸桿菌、芽胞桿菌屬細(xì)菌、棒狀桿菌屬細(xì)菌、發(fā)酵單胞菌屬細(xì)菌組成的組中的細(xì)菌。
12.如權(quán)利要求9~11的任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)是通過(guò)對(duì)所述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行以下操作而被誘導(dǎo)的: a)導(dǎo)入外來(lái)肌醇單磷酸酶基因； b)增加內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的拷貝數(shù)； c)在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域?qū)胱儺悾? d)利用高表達(dá)誘導(dǎo)性外來(lái)調(diào)整區(qū)域來(lái)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域；或者 e)使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的調(diào)整區(qū)域缺失。
13.如權(quán)利要求12所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述肌醇單磷酸酶的過(guò)剩生產(chǎn)是通過(guò)對(duì)所述轉(zhuǎn)化體導(dǎo)入外來(lái)肌醇單磷酸酶基因而被誘導(dǎo)的。
14.如權(quán)利要求9~11的任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，其中，所述肌醇單磷酸酶的活化是通過(guò)對(duì)所述轉(zhuǎn)化體進(jìn)行以下操作而被誘導(dǎo)的: f)在內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因中導(dǎo)入變異； g)置換內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分或全部； h)使內(nèi)源性肌醇單磷酸酶基因的一部分缺失； i)使降低肌醇單磷酸酶活性的其它蛋白質(zhì)減少； j)使降低肌醇單磷酸酶活性的化合物的生成減少。
【文檔編號(hào)】C12N1/15GK104080918SQ201380006973
【公開(kāi)日】2014年10月1日 申請(qǐng)日期:2013年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月24日
【發(fā)明者】小西一誠(chéng), 今津晉一 申請(qǐng)人:旭化成化學(xué)株式會(huì)社