新型l-氨基酸氧化酶、l-賴氨酸的測定方法、試劑盒和酶傳感器的制造方法
【專利摘要】提供利用突變型酶的L-賴氨酸的測定方法、L-賴氨酸測定用試劑盒和酶傳感器。具有規(guī)定的氨基酸突變、并且具有對L-賴氨酸的底物特異性高的氧化酶活性的突變型L-氨基酸氧化酶、以及利用該突變型酶的L-賴氨酸的測定方法、L-賴氨酸測定用試劑盒和酶傳感器。
【專利說明】新型L-氨基酸氧化酶、L-賴氨酸的測定方法、試劑盒和酶 傳感器
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求于2012年1月30日申請的日本專利2012-16165號的優(yōu)先權(quán)，并將其全部 記載作為公開援用于本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及新型L-氨基酸氧化酶、以及使用該新型L-氨基酸氧化酶的L-賴氨酸 的測定方法、用于該方法的試劑盒和酶傳感器。更詳細地，本發(fā)明涉及對L-賴氨酸的底物 特異性高的突變型L-氨基酸氧化酶、以及利用該突變型酶的L-賴氨酸的測定方法、L-賴 氨酸測定用試劑盒和酶傳感器。

【背景技術(shù)】
[0003] L-賴氨酸是蛋白質(zhì)構(gòu)成氨基酸之一，是在體內(nèi)無法產(chǎn)生的必需氨基酸。包括L-賴 氨酸的氨基酸的濃度在機體內(nèi)被維持恒定，但由于先天性代謝異?；騼?nèi)臟疾病，血中濃度 會發(fā)生大幅變動。不限于L-賴氨酸，機體內(nèi)的氨基酸濃度可以成為檢測疾病的有用手段。 因此，通過測定1種或多種氨基酸的血中濃度，可以對上述疾病進行檢測（專利文獻1和非 專利文獻1)。
[0004] 近年來，作為氨基酸的定量方法，多數(shù)已知的是利用酶的方法。利用酶的方法與機 器分析方法相比具有能夠廉價且簡便地進行的優(yōu)點。作為定量用酶，多使用例如脫氫酶或 氧化酶。使用氧化酶的情形，可舉出使氧化酶與氨基酸作用，由此生成過氧化氫，并用過氧 化物酶對該過氧化氫進行檢測、定量的方法(專利文獻2)。在該檢測和定量中，還可以利用 比色法、熒光法、電極法的任一方法。
[0005] 作為L-賴氨酸的定量方法，也已知利用酶的方法。例如，利用氧化酶的定量使用 了 L-賴氨酸α氧化酶[EC 1. 4. 3. 14]。來源于綠色木霉（fricAoofe/ma ririofe)的L-賴 氨酸α氧化酶與其它的L-氨基酸氧化酶相比，底物特異性高并且有市售，因而被利用作為 酶傳感器等的元件(非專利文獻2、非專利文獻3和非專利文獻4)。
[0006] 此外，據(jù)報道來源于突光假單胞菌(Aewt/offlmas 的L-賴氨酸單加 氧酶具有L-賴氨酸氧化酶活性(非專利文獻5和非專利文獻6)。該酶以L-賴氨酸、L-鳥 氨酸、L-精氨酸為底物。
[0007] 專利文獻1 :國際公開W02006/129513號公報 專利文獻2 :日本特開昭55-43409號公報 非專利文獻 l:Anal. Chem. 81: 307-314 (2009) 非專利文獻 2 :Sens. Actuators, B 126: 424-430 (2007) 非專利文獻 3 :Anal. Bioanal. Chem. 391: 1255-1261 (2008) 非專利文獻 4 :Anal. Bioanal. Chem. 406: 19-23 (2010) 非專利文獻 5:J. Biol. Chem. 249: 2579-2586 (1974) 非專利文獻 6: J. Biol. Chem. 249: 2587-2592 (1974)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 然而，來源于綠色木霉的L-賴氨酸α氧化酶對L-賴氨酸以外的氨基酸也顯示氧 化酶活性。因此，使用L-賴氨酸α-氧化酶對血漿之類的含有多種氨基酸的試樣進行定量 時，存在過量評價的傾向。
[0009] 此外，最近報道了與上述L-賴氨酸α -氧化酶相比，底物特異性高的來源于海水 魚的粘液的L-賴氨酸α -氧化酶（非專利文獻3)。但是，該L-賴氨酸α -氧化酶來源于海 水魚的粘液，還沒有關(guān)于利用培養(yǎng)來生產(chǎn)酶的報道。因此，難以大量生產(chǎn)該酶來用于L-賴 氨酸的定量。
[0010] 進而，也沒有將來源于熒光假單胞菌的L-賴氨酸單加氧酶用于L-賴氨酸定量的 報道。此外，即使將該酶用于L-賴氨酸定量，如上所述，由于對L-賴氨酸以外的L-鳥氨酸 和L-精氨酸也具有加氧酶活性，因而對于血漿之類的含有多種氨基酸的試樣，無法嚴格地 進行L-賴氨酸的定量。
[0011] 利用L-賴氨酸的氧化酶的定量方法若能實現(xiàn)，則從能夠比機器分析方法更廉價 且簡易地進行的觀點出發(fā)是有用的。但是，如上所述，對于血漿之類的含有多種氨基酸的試 樣，由于迄今為止能利用的酶的底物特異性低、或者酶生產(chǎn)率上存在問題等方面的原因，仍 是無法提供于實用的狀況。
[0012] 因此，本發(fā)明的目的是提供對L-賴氨酸的底物特異性高的酶來作為即使是含有 多種氨基酸的機體試樣也能夠特異性地定量L-賴氨酸的酶，進而提供使用該酶的L-賴氨 酸的酶學(xué)測定方法。
[0013] 進而，本發(fā)明的目的還在于提供可在實施上述酶學(xué)測定方法時利用的測定用的試 劑盒。
[0014] 此外，本發(fā)明的目的還在于提供可用于上述酶學(xué)測定方法的酶傳感器。
[0015] 本發(fā)明人為了實現(xiàn)上述目的而深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過將來源于假單胞菌屬 (Pseudomonas sp.) Η-8-1-3株的上述L-氨基酸氧化酶的氨基酸序列中的第254位的半 胱氨酸替換為規(guī)定的氨基酸而得的突變型L-氨基酸氧化酶對L-賴氨酸具有高的底物特異 性。本發(fā)明是根據(jù)上述見解完成的發(fā)明。
[0016] SP，本發(fā)明如下所述。
[0017] 〔1〕 下述（1)至（3)中任一項所述的蛋白質(zhì)： (1) 具有SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸被蛋氨酸、苯丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天 冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或脯氨酸所替換的氨基酸序列的蛋白 質(zhì)； (2) 由上述（1)中規(guī)定的蛋白質(zhì)中的除上述第254位的氨基酸以外的區(qū)域中有1個或 數(shù)個氨基酸缺失、被替換和/或被添加的氨基酸序列組成，并且具有與由SEQ. ID N0 :2所 示的氨基酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對L-賴氨酸的底物特異性更高的氧化酶活性的 蛋白質(zhì)；或 (3)由與上述（1)所規(guī)定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少67%的序列同一性的氨基 酸序列組成，并且具有與由SEQ. ID NO : 2所示的氨基酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對 L-賴氨酸的底物特異性更高的氧化酶活性的蛋白質(zhì)，但該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的與上述 第254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸沒有突變。
[0018] 〔2〕 〔1〕所述的蛋白質(zhì)，其中，上述第254位的氨基酸為蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、丙氨酸、 纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或絲氨酸。
[0019] 〔3〕 〔1〕或〔2〕所述的蛋白質(zhì)，其中，上述第254位的氨基酸為異亮氨酸或酪氨酸。
[0020] (4) 〔1〕至〔3〕中任一項所述的蛋白質(zhì)，其中，在將具有上述（2)或（3)所規(guī)定的、第254位 的半胱氨酸被色氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或脯氨 酸以外的氨基酸所替換的氨基酸序列的蛋白質(zhì)對L-賴氨酸的氧化酶活性設(shè)為100%時，上 述蛋白質(zhì)對L-精氨酸的氧化酶活性為15%以下，并且對L-鳥氨酸的氧化酶活性為80%以 下。
[0021] 〔5〕 核酸，其編碼〔1〕至〔4〕中任一項所述的蛋白質(zhì)。
[0022] 〔 6〕 載體，其含有〔5〕所述的核酸。
[0023] 〔 7〕 經(jīng)〔6〕所述的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
[0024] 〔 8〕 檢測或定量L-賴氨酸的方法，其包括以下步驟： (A) 在水和氧的存在下保持待測物和〔1〕至〔4〕中任一項所述的蛋白質(zhì)的步驟；和 (B) 檢測或定量通過上述蛋白質(zhì)對L-賴氨酸的氧化酶活性的作用而在反應(yīng)液中生成 的至少一種反應(yīng)產(chǎn)物的步驟。
[0025] 〔 9〕 〔8〕所述的方法，其中，在步驟（B)中檢測或定量的反應(yīng)產(chǎn)物是過氧化氫。
[0026] 〔10〕 〔9〕所述的方法，其中，使用過氧化物酶來檢測或定量上述過氧化氫。
[0027] 〔11〕 〔8〕所述的方法，其中，在步驟（B)中檢測或定量的反應(yīng)產(chǎn)物是氨。
[0028] 〔12〕 〔11〕所述的方法，其中，使用氨檢測試劑來檢測或定量氨。
[0029] 〔13〕 〔8〕所述的方法，其中，在步驟（B)中檢測或定量的反應(yīng)產(chǎn)物是L-賴氨酸的脫氨基化產(chǎn) 物。
[0030] (14) L-賴氨酸的檢測或定量用試劑盒，其包含〔1〕至〔4〕中任一項所述的蛋白質(zhì)。
[0031] 〔15〕 〔14〕所述的試劑盒，其進一步包含反應(yīng)用緩沖液、過氧化氫檢測試劑、氨檢測試劑、和 L-賴氨酸的脫氨基化產(chǎn)物檢測試劑的至少一者。
[0032] 〔16〕 L-賴氨酸的檢測或定量用酶傳感器，其含有過氧化氫檢測用電極，其中，在上述過氧化 氫檢測用電極的表面或該表面的附近配置有〔1〕至〔4〕中任一項所述的蛋白質(zhì)。
[0033] (17) 〔16〕所述的傳感器，其中，上述過氧化氫檢測用電極是酶式過氧化氫電極或隔膜式過 氧化氫電極。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明，可提供對L-賴氨酸的底物特異性高的新型的突變型L-氨基酸氧化 酶。通過使用該突變型L-氨基酸氧化酶，即使是對含有其它氨基酸等大量夾雜物的試樣， 也可以特異性并且精度良好地對L-賴氨酸進行簡便·迅速的檢測和定量。本發(fā)明特別是對 血漿、血清或尿之類的機體試樣有效，通過使之與過氧化物酶等酶偶聯(lián)，不僅可用發(fā)色法、 熒光法來定量L-賴氨酸，而且還可提供電極型酶傳感器。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] [圖1]圖1示出來源于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸 氧化酶(野生型酶）催化的以L-賴氨酸為底物的單加氧酶反應(yīng)和氧化酶反應(yīng)的反應(yīng)機制及 其比例。
[0036] [圖2]圖2示出上述野生型酶的SDS-PAGE的照片。
[0037] [圖3]圖3示出根據(jù)編碼上述野生型酶的堿基序列預(yù)測的氨基酸序列。
[0038] [圖4]圖4示出對上述野生型酶的氨基酸序列、作為本發(fā)明的蛋白質(zhì)的突變型酶 C254I的氨基酸序列、以及公知同源基因的氨基酸序列進行比對分析的結(jié)果。圖4中，LysOX 野生型表示來源于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶；LysOX C254I表示本發(fā)明的突變型酶C254I，其它的公知氨基酸序列用登錄號表示。
[0039] [圖5]圖5示出圖4所示比對分析的續(xù)圖。
[0040] [圖6]圖6示出實施例中純化的野生型酶對L-賴氨酸（Lys)、L-鳥氨酸（Orn) 和L-精氨酸（Arg)的酶活性（pH依賴性)。
[0041] [圖7]圖7示出使用實施例中純化的野生型酶標準品的、以1?6mM的L-賴氨 酸水溶液為待測物時的L-賴氨酸濃度與492nm下的吸光度（absorbance)的相關(guān)關(guān)系。
[0042] [圖8]圖8示出以L-賴氨酸、L-鳥氨酸、和L-精氨酸為底物來對野生型酶和本 發(fā)明的突變型酶C254I調(diào)查酶活性（pH依賴性）的結(jié)果。
[0043] [圖9]圖9示出對野生型酶和本發(fā)明的突變型酶C254I調(diào)查底物特異性的結(jié)果。
[0044] [圖10]圖10示出使用野生型酶和本發(fā)明的突變型酶C254I、并以1?10mM的 L-賴氨酸水溶液為待測物時的L-賴氨酸濃度與吸光度（absorbance)的關(guān)系。圖10中， LysOX野生型表示野生型酶的結(jié)果；LysOX C254I表示本發(fā)明的突變型酶C254I的結(jié)果。
[0045] [圖11]圖11示出對野生型酶的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸突變?yōu)楦?種氨基酸而得的各種突變型酶的底物特異性進行調(diào)查的結(jié)果。
[0046] [圖12]圖12示出將圖11的結(jié)果中的對L-賴氨酸的氧化酶活性設(shè)為100%時的 L_精氨酸和L-鳥氨酸的相對活性。
[0047][圖13]圖13示出使用野生型酶對添加有L-賴氨酸、L-精氨酸和L-鳥氨酸的 血漿樣品定量各氨基酸的結(jié)果。
[0048][圖14]圖14示出使用本發(fā)明的突變型酶C254I對添加有L-賴氨酸、L-精氨酸 和L-鳥氨酸的血漿樣品定量各氨基酸的結(jié)果。

【具體實施方式】
[0049] <突變型L-氨基酸氧化酶> 本發(fā)明涉及下述（1)至（3)中任一項所述的蛋白質(zhì)。
[0050] (1)具有SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸被蛋氨酸、苯 丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨 酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或脯氨酸所替換的氨基酸序列 的蛋白質(zhì)； (2) 由上述（1)中規(guī)定的蛋白質(zhì)中的除上述第254位的氨基酸以外的區(qū)域中有1個或 數(shù)個氨基酸缺失、被替換和/或被添加的氨基酸序列組成，并且具有與由SEQ. ID N0 :2所 示的氨基酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對L-賴氨酸的底物特異性更高的氧化酶活性的 蛋白質(zhì)；或 (3) 由與上述（1)所規(guī)定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少67%的序列同一性的氨基 酸序列組成，并且具有與由SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對 L-賴氨酸的底物特異性更高的氧化酶活性的蛋白質(zhì)，但該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的與上述 第254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸沒有突變。
[0051] 上述（1)所述的蛋白質(zhì)中，SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列是通過從自然界分離 新的假單胞菌屬菌株，并對編碼屬于該假單胞菌屬的微生物產(chǎn)生的L-氨基酸氧化酶的基 因進行克隆而得的。該點將在實施例中詳述。
[0052] 由上述SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，如實施例中所確認，是具 有L-氨基酸氧化酶活性的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)所具有的L-氨基酸氧化酶活性是在氧和水的 存在下、在PH7. 0 (30°C )下，分別作用于L-賴氨酸、L-鳥氨酸和L-精氨酸而生成過氧化 氫和氨的活性。本說明書中，以下將對L-賴氨酸、L-鳥氨酸和L-精氨酸的上述氧化酶活 性分別稱為L-賴氨酸氧化酶活性、L-鳥氨酸氧化酶活性、和L-精氨酸氧化酶活性。應(yīng)予 說明，上述氧化酶活性可通過使用以下實施例中記載的測定試劑和測定方法來測定。
[0053] 本發(fā)明的上述（1)所規(guī)定的蛋白質(zhì)是通過將SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列中 的第254位的半胱氨酸替換為蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、 異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、 谷氨酰胺或脯氨酸而得的突變型L-氨基酸氧化酶。如實施例所示，將上述第254位的氨基 酸替換為這些氨基酸而得的蛋白質(zhì)，與由SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列組成的氨基酸氧 化酶相比對L-賴氨酸的氧化酶活性的特異性更高。
[0054] 具有"與由SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對L-賴氨 酸的底物特異性更高的氧化酶活性"的本發(fā)明的蛋白質(zhì)是指與野生型氨基酸氧化酶（以下， 稱為野生型酶）相比對L-賴氨酸的底物特異性相對更高的蛋白質(zhì)。具體地，意指與野生型 酶相比，L-精氨酸氧化酶活性相對于L-賴氨酸氧化酶活性的比率低、L-鳥氨酸氧化酶活 性相對于L-賴氨酸氧化酶活性的比率低、或L-精氨酸氧化酶活性相對于L-賴氨酸氧化酶 活性的比率與L-鳥氨酸氧化酶活性相對于L-賴氨酸氧化酶活性的比率兩者均低。本發(fā)明 中，作為具有"與由SEQ. ID NO :2所示的氨基酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對L-賴氨 酸的底物特異性更高的氧化酶活性"的蛋白質(zhì)，從對L-賴氨酸的底物特異性更高的觀點出 發(fā)，優(yōu)選為L-精氨酸氧化酶活性相對于L-賴氨酸氧化酶活性的比率、和L-鳥氨酸氧化酶 活性相對于L-賴氨酸氧化酶活性的比率兩者均比上述野生型酶低的蛋白質(zhì)。
[0055] 進而，從賦予與野生型酶相比，"對L-賴氨酸的底物特異性更高的氧化酶活性"的 觀點出發(fā)，上述（1)所規(guī)定的蛋白質(zhì)中，優(yōu)選上述第254位的氨基酸為蛋氨酸、苯丙氨酸、酪 氨酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或絲氨酸。這是因為在將上述 第254位的氨基酸替換為這些氨基酸時，如以下實施例所示，L-精氨酸氧化酶活性相對于 L-賴氨酸氧化酶活性的比率、以及L-鳥氨酸氧化酶活性相對于L-賴氨酸氧化酶活性的比 率兩者均較上述野生型酶低的緣故。進而，從獲得對L-賴氨酸的氧化酶活性的底物特異性 顯著提高的蛋白質(zhì)(氨基酸氧化酶）的觀點出發(fā)，上述第254位的氨基酸優(yōu)選為異亮氨酸或 酪氨酸。
[0056] 在上述（2)和（3)所規(guī)定的范圍中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)只要具有上述對L-賴氨酸的 底物特異性高的氧化酶活性，則沒有特別限定，但在將該蛋白質(zhì)的L-賴氨酸氧化酶活性設(shè) 為100%時，該蛋白質(zhì)的L-精氨酸氧化酶活性優(yōu)選為15%以下、進一步優(yōu)選為10%以下、5% 以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0· 5%以下、0· 01%以下、0%。另外，該蛋白質(zhì)的L-鳥 氨酸氧化酶活性優(yōu)選為80%以下、進一步優(yōu)選為60%以下、更進一步優(yōu)選為50%以下、更進 一步優(yōu)選為20%以下、15%以下、10%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、0· 5% 以下、0. 01%以下、0%。另外，作為基準的野生型酶的情形，在將pH7. 0、30°C下的L-賴氨酸 氧化酶活性設(shè)為100%時，L-精氨酸氧化酶活性為20%左右，和L-鳥氨酸氧化酶活性為83% 左右。
[0057] 進而，本發(fā)明的蛋白質(zhì)只要顯示上述的"對L-賴氨酸的底物特異性高的氧化酶活 性"，則對該L-賴氨酸氧化酶活性的絕對值沒有特別限定。例如，本發(fā)明蛋白質(zhì)的L-賴氨 酸氧化酶活性優(yōu)選至少與野生型酶的L-賴氨酸氧化酶活性等同，或者為其以上。具體地， 本發(fā)明的蛋白質(zhì)在PH7. 0下的L-賴氨酸氧化酶活性優(yōu)選為0. 6U/mg以上、進一步優(yōu)選為 1. OU/mg 以上。
[0058] 此外，對于作為L-賴氨酸、L-鳥氨酸和L-精氨酸以外的蛋白質(zhì)構(gòu)成氨基酸的、 L-酪氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮 氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-天冬酰胺、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、 L-纈氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的突變型L-氨基酸氧化酶不顯示活性。
[0059] 本發(fā)明中，上述（2)所規(guī)定的蛋白質(zhì)是"由上述（1)中規(guī)定的蛋白質(zhì)中的除上述第 254位的氨基酸以外的區(qū)域中有1個或數(shù)個氨基酸缺失、被替換和/或被添加的氨基酸序列 組成，并且具有與由SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對L-賴氨 酸的底物特異性更高的氧化酶活性的蛋白質(zhì)"。本文中，對于"有1至數(shù)個氨基酸缺失、被替 換和/或被添加的氨基酸序列"中的"1至數(shù)個"的范圍，只要具有缺失等的蛋白質(zhì)具有上 述對L-賴氨酸的底物特異性高的氧化酶活性，則沒有特別限定。前述" 1至數(shù)個"的范圍， 由于具有上述對L-賴氨酸的底物特異性高的氧化酶活性的蛋白質(zhì)的比例高，因而例如為1 至30個、優(yōu)選為1至20個、更優(yōu)選為1至10個、進一步優(yōu)選為1至7個、更進一步優(yōu)選為 1至5個、特別優(yōu)選為1至3個、1至2個、可以為1個左右。
[0060] 本發(fā)明中，上述（3)所規(guī)定的蛋白質(zhì)是"由與上述（1)所規(guī)定的蛋白質(zhì)的氨基酸序 列具有至少67%的序列同一性的氨基酸序列組成，并且具有與由SEQ. ID N0 :2所示的氨基 酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對L-賴氨酸的底物特異性更高的氧化酶活性的蛋白質(zhì)， 但該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的與上述第254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸沒有突變。"。
[0061] 本發(fā)明中，對于"與上述（1)所規(guī)定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少67%的序列同 一性的氨基酸序列"中的"序列同一性"，只要具有該氨基酸序列的同一性的蛋白質(zhì)是具有 對上述L-賴氨酸的底物特異性高的氧化酶活性的酶，則沒有特別限定。前述氨基酸序列的 序列同一性只要為67%以上則沒有特別限定，優(yōu)選為68%以上、69%以上、70%以上、71%以 上、72%以上、73%以上或74%以上、進一步優(yōu)選為75%以上、進一步優(yōu)選為80%以上、85%以 上、90%以上、更進一步優(yōu)選為91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96%以上、 97%以上、98%以上、99%以上、99. 5%以上。本發(fā)明中，"序列同一性"的用語是指2個以上氨 基酸序列相對于彼此的氨基酸同一性的程度。因此，某兩個氨基酸序列的同一性越高，則它 們的序列同一性或相似性越高。2種氨基酸序列是否具有同一性可以通過序列的直接比較 來進行分析，具體地，可以使用市售的序列分析軟件等進行分析。
[0062] 進而，本發(fā)明中，"但該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中與上述第254位的氨基酸對應(yīng)的氨 基酸沒有突變。"中的"突變"具體意指氨基酸的缺失或替換。即，"但該蛋白質(zhì)的氨基酸序 列中與上述第254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸沒有突變。"意指在上述（3)所規(guī)定的蛋白質(zhì) 的氨基酸序列中，與作為序列同一性的判斷基準的上述（1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的第 254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸與上述（1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的第254位的氨基酸相 同。因此，上述（1)的蛋白質(zhì)中的被替換的氨基酸若為異亮氨酸，則上述（3)的蛋白質(zhì)的氨 基酸序列中的與上述第254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸為異亮氨酸。
[0063] 上述（3)所規(guī)定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中，與作為序列同一性的判斷基準的上述 (1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的第254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸，可通過上述序列同一性 或同源性的分析來調(diào)查。具體地，只要使用市售的序列分析軟件等，相對于SEQ. ID N0 :2 所示的氨基酸序列或上述（1)的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，進行分析對象氨基酸序列的比對分 析，則可以檢索與上述第254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸。這種比對分析的方法是廣為本領(lǐng) 域技術(shù)人員所知的。
[0064] 本發(fā)明的上述蛋白質(zhì)只要屬于上述（1)至（3)所規(guī)定的范圍，則對其來源沒有特 別限定。例如，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以是通過各種基因工程技術(shù)制造的重組蛋白質(zhì)，也可以是 通過化學(xué)合成制造的合成蛋白質(zhì)，或者是通過向具有由SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列組 成的L-氨基酸氧化酶的基因同源性的特定生物種(例如，細菌)賦予突變原而獲得能夠產(chǎn)生 本發(fā)明的突變型酶的突變體，通過提取和生成由該突變體產(chǎn)生的蛋白質(zhì)而制造的蛋白質(zhì)。
[0065] 通過基因工程技術(shù)來制造本發(fā)明的重組蛋白質(zhì)時，制作編碼上述蛋白質(zhì)（1)、（2) 或（3)的核酸（DNA或RNA)，并插入各種表達載體，由此可以表達本發(fā)明的蛋白質(zhì)。在制作 編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸時，為了將SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列中的第254位的半胱 氨酸或與該半胱氨酸相應(yīng)的氨基酸替換為上述（1)中記載的規(guī)定的氨基酸，或為了在上述 (2)所規(guī)定的蛋白質(zhì)中實施氨基酸的缺失、替換和/或添加，或者為了準備編碼上述（3)所 規(guī)定的蛋白質(zhì)中與SEQ. ID NO :2的氨基酸序列具有規(guī)定同一性的蛋白質(zhì)的核酸，例如，可 以通過易錯PCR法、DNA改組法、各種位點特異性突變導(dǎo)入法等來進行任意的堿基的缺失、 替換和/或插入。通過將如此制作的編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸導(dǎo)入適當(dāng)?shù)谋磉_系統(tǒng)，可以 制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
[0066] 作為可用于制造本發(fā)明蛋白質(zhì)的表達系統(tǒng)，沒有特別限定，例如，可以利用能夠在 各種生物種(宿主）中表達重組蛋白質(zhì)的表達載體。作為可利用的表達載體，可使用能夠在 細菌、菌類(例如、酵母類）等微生物、植物、昆蟲細胞、哺乳類細胞等宿主中表達蛋白質(zhì)的各 種表達載體，可以是病毒載體(包括噬菌體載體)，也可以是質(zhì)粒載體?；蛘?，也可以采用使 用了兔網(wǎng)織紅細胞裂解物、小麥胚芽裂解物、大腸桿菌裂解物等的無細胞蛋白質(zhì)表達系統(tǒng) 來制造本發(fā)明的蛋白質(zhì)。
[0067] 在通過使用特定生物種作為宿主的表達系統(tǒng)來表達本發(fā)明的蛋白質(zhì)時，可通過下 述制造方法來制備，該方法包括：將編碼上述本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸插入載體上，用該載體 轉(zhuǎn)化宿主細胞后，培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細胞，在培養(yǎng)物中蓄積前述基因所編碼的蛋白質(zhì)，并收 集蓄積的蛋白質(zhì)。
[0068] 編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸、包含該核酸的載體、經(jīng)該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體是本發(fā)明 的一個方式。
[0069] 編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸的取得方法沒有特別限定。例如，如以下實施例所述，可 以將編碼分離自假單胞菌屬（Pseudomonas sp. )Η-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶基因（SEQ. ID N0 :1和2)的核酸作為材料來獲得編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸，或者也可以從各種細菌分 離與本發(fā)明蛋白質(zhì)或SEQ. ID N0 :2所述氨基酸序列（L-氨基酸氧化酶）具有同源性的基 因，制備編碼該基因的核酸，并進行與上述第254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸的替換，從而制 造編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸。此外，編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核酸可以基于SEQ. ID N0 :1中記 載的堿基序列或SEQ. ID N0 :2中記載的氨基酸序列、或與SEQ. ID N0 :1中記載的堿基序 列具有一定的同一'I"生的公知堿基序列或與SEQ. ID N0 :2中記載的氨基酸序列具有一定的 同一性的公知氨基酸序列的信息，通過化學(xué)合成、基因工程方法或突變誘導(dǎo)等本領(lǐng)域技術(shù) 人員已知的任意方法來制作。
[0070] SEQ. ID N0 :2所示的氨基酸序列是來自本發(fā)明人從自然界分離的假單胞菌屬 (Pseudomonas sp.) H-8-1-3株的L-氨基酸氧化酶(野生型酶)的氨基酸序列，但與該L-氨 基酸氧化酶顯示一定的同源性的基因已有大量已知。例如，已知有來源于表1所示細菌的 基因。
[0071] [表 1]

【權(quán)利要求】
1. 下述（1)至（3)中任一項所述的蛋白質(zhì)： (1) 具有SEQ. ID NO :2所示的氨基酸序列中的第254位的半胱氨酸被蛋氨酸、苯丙氨 酸、酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天 冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或脯氨酸所替換的氨基酸序列的蛋白 質(zhì)； (2) 由所述（1)中規(guī)定的蛋白質(zhì)的除所述第254位的氨基酸以外的區(qū)域中有1個或數(shù) 個氨基酸缺失、被替換和/或被添加的氨基酸序列組成，并且具有與由SEQ. ID NO :2所示 的氨基酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對L-賴氨酸的底物特異性更高的氧化酶活性的蛋 白質(zhì)；或 (3) 由與所述（1)所規(guī)定的蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少67%的序列同一性的氨基 酸序列組成，并且具有與由SEQ. ID NO : 2所示的氨基酸序列組成的氨基酸氧化酶相比對 L-賴氨酸的底物特異性更高的氧化酶活性的蛋白質(zhì)，但該蛋白質(zhì)的氨基酸序列中的與所述 第254位的氨基酸對應(yīng)的氨基酸沒有突變。
2. 權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其中，所述第254位的氨基酸為蛋氨酸、苯丙氨酸、酪氨 酸、丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或絲氨酸。
3. 權(quán)利要求1或2所述的蛋白質(zhì)，其中，所述第254位的氨基酸為異亮氨酸或酪氨酸。
4. 權(quán)利要求1至3中任一項所述的蛋白質(zhì)，其中，在將具有所述（2)或（3)所規(guī)定的、第 254位的半胱氨酸被色氨酸、甘氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺 或脯氨酸以外的氨基酸所替換的氨基酸序列的蛋白質(zhì)對L-賴氨酸的氧化酶活性設(shè)為100% 時，所述蛋白質(zhì)對L-精氨酸的氧化酶活性為15%以下，并且對L-鳥氨酸的氧化酶活性為 80%以下。
5. 核酸，其編碼權(quán)利要求1至4中任一項所述的蛋白質(zhì)。
6. 載體，其含有權(quán)利要求5所述的核酸。
7. 經(jīng)權(quán)利要求6所述的載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
8. 檢測或定量L-賴氨酸的方法，其包括以下步驟： (A) 在水和氧的存在下保持待測物和權(quán)利要求1至4中任一項所述的蛋白質(zhì)的步驟； 和 (B) 檢測或定量通過所述蛋白質(zhì)對L-賴氨酸的氧化酶活性的作用而在反應(yīng)液中生成 的至少一種反應(yīng)產(chǎn)物的步驟。
9. 權(quán)利要求8所述的方法，其中，在步驟（B)中檢測或定量的反應(yīng)產(chǎn)物是過氧化氫，并 且使用過氧化物酶來檢測或定量所述過氧化氫。
10. 權(quán)利要求8所述的方法，其中，在步驟（B)中檢測或定量的反應(yīng)產(chǎn)物是氨，并且使用 氨檢測試劑來檢測或定量氨。
11. 權(quán)利要求8所述的方法，其中，在步驟（B)中檢測或定量的反應(yīng)產(chǎn)物是L-賴氨酸的 脫氨基化產(chǎn)物。 12. L-賴氨酸的檢測或定量用試劑盒，其包含權(quán)利要求1至4中任一項所述的蛋白質(zhì)。
13. 權(quán)利要求12所述的試劑盒，其進一步包含反應(yīng)用緩沖液、過氧化氫檢測試劑、氨檢 測試劑、和L-賴氨酸的脫氨基化產(chǎn)物檢測試劑的至少一者。 14. L-賴氨酸的檢測或定量用酶傳感器，其含有過氧化氫檢測用電極，其中，在所述過 氧化氫檢測用電極的表面或該表面的附近配置有權(quán)利要求1至4中任一項所述的蛋白質(zhì)。
15.權(quán)利要求14所述的傳感器，其中，所述過氧化氫檢測用電極是酶式過氧化氫電極 或隔膜式過氧化氫電極。
【文檔編號】C12N1/21GK104066843SQ201380007227
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2013年1月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月30日
【發(fā)明者】淺野泰久, 松井大亮 申請人:富山縣政府, 味之素株式會社