人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的表型譜的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及具有以下陽性表面標(biāo)記物的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的實質(zhì)上同質(zhì)的細(xì)胞群：SSEA4、CD73、PTK7和PSA-NCAM。本發(fā)明還涉及利用細(xì)胞分選技術(shù)從人組織中制備這種實質(zhì)上同質(zhì)的細(xì)胞群的方法。
【專利說明】人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的表型譜
[0001]發(fā)明背景
人視網(wǎng)膜的退化(無論是由創(chuàng)傷、年齡或疾病導(dǎo)致的)可導(dǎo)致永久性的視力喪失并影響全世界數(shù)百萬人。退化病癥包括，例如，視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變。這些病癥的特點在于視網(wǎng)膜的感光細(xì)胞的逐漸死亡，并且它們是導(dǎo)致西方世界中不可治愈的失明的主要原因。因為人視網(wǎng)膜的內(nèi)在再生能力極其有限，因此感光細(xì)胞喪失的患者的唯一可行治療方法就是細(xì)胞更換。
[0002]幾種類型的細(xì)胞已被建議作為視網(wǎng)膜退化疾病的細(xì)胞療法手段。這些細(xì)胞類型包括人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(hRPC)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、來源于骨髓和臍帶血的細(xì)胞。多能干細(xì)胞(也稱為祖細(xì)胞、未成熟細(xì)胞、前體細(xì)胞、未分化細(xì)胞或增殖性細(xì)胞)是移植和分化的研究熱點。
[0003]人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞具有用于臨床應(yīng)用的很大潛力，例如用于移植到退化的或患病的視網(wǎng)膜宿主中。這種細(xì)胞通常分離于產(chǎn)前和產(chǎn)后組織中的胎兒視網(wǎng)膜，通過去除睫狀邊緣帶和視神經(jīng)以消除污染而獲得。參見例如U.S.專利號7，514，259，通過引用將其公開內(nèi)容合并至本文。這些細(xì)胞可在體外擴增，并且能夠遷移進入視網(wǎng)膜并使得視網(wǎng)膜細(xì)胞種群恢復(fù)，以形成新的有功能的感光細(xì)胞。
[0004]在臨床應(yīng)用中，例如對于移植來說，活細(xì)胞作為藥物產(chǎn)品的使用要求在宿主細(xì)胞群擴增期間并在將這些細(xì)胞注入受移植人體之前進行全面的細(xì)胞表征。這種表征通常通過識別在細(xì)胞表面表達(dá)的特異性標(biāo)記物來實現(xiàn)。特異性標(biāo)記物(即，特定細(xì)胞系獨特的標(biāo)記物)的識別對于宿主細(xì)胞群的富集或去除也是有用的。
[0005]以往已作出許多努力來識別不同細(xì)胞類型獨特的特異性標(biāo)記物。已通過這種方式成功表征和識別的細(xì)胞群包括造血干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞。
[0006]Carter 等在BMC Ophthalmology, 9:1, 2009 中描述了使用 CD133標(biāo)記物來純化成人視網(wǎng)膜細(xì)胞。視網(wǎng)膜細(xì)胞懸液來源于人尸體組織，并利用磁性自動化細(xì)胞分選來富集。該文獻證實了約95%的細(xì)胞純化率。
[0007]U.S.專利號6，468，794描述了利用結(jié)合至細(xì)胞表面標(biāo)記物的單克隆抗體來富集神經(jīng)干細(xì)胞和祖細(xì)胞的細(xì)胞群。U.S.專利號7，015，037描述了對標(biāo)記物⑶44、⑶45、HLA I類和HLA II類呈表面陰性的分離的多能干細(xì)胞。還可參見U.S.專利號6，908，763、U.S.專利號7，749，754 JPU.S.專利號7，781，179，通過引用將這些專利的各自公開內(nèi)容都合并到本文中。
[0008]Yuan等人在Plos One, 6(3)，el7540, March 2011中描述了改良的分化和富集程序，其產(chǎn)生來源于多能干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)細(xì)胞的高度純化的細(xì)胞群。識別了這些細(xì)胞上的細(xì)胞表面標(biāo)志或標(biāo)記物，從而使得能夠通過突光活化的細(xì)胞分選而從異質(zhì)分化的細(xì)胞群中分離這些細(xì)胞。特別地，該文獻提到，神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞群已通過利用熒光活化的細(xì)胞分選(FACS)和以下標(biāo)記物被成功地分離:⑶184+、⑶271-、⑶44-和⑶24+。該公開文獻的內(nèi)容通過引用全部合并至本文中。
[0009]雖然有各種利用細(xì)胞特異性標(biāo)記物來表征不同類型干細(xì)胞的努力，但人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的特異性表面標(biāo)記物尚未被識別。該標(biāo)記物的成功識別將促進技術(shù)的發(fā)展，其可允許細(xì)胞群的富集，消除培養(yǎng)物中較不期望的細(xì)胞(例如膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞)，以及最終選出高度表達(dá)感興趣的標(biāo)記物的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。該高度純化的細(xì)胞群隨后可利用例如2011年6月14日申請的美國專利申請?zhí)?3/160，002中描述的技術(shù)來培養(yǎng)，并可被制成細(xì)胞庫，以衍生出可用于人體移植從而治療視網(wǎng)膜退化疾病的細(xì)胞。這些細(xì)胞表面標(biāo)記物可代表允許表征要被遞送至患者的細(xì)胞產(chǎn)品的標(biāo)記物，部分地滿足了政府監(jiān)管機構(gòu)對于確定細(xì)胞產(chǎn)品質(zhì)量的要求。
[0010]鑒于以上所述以及人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞對于臨床評價和使用的重要性，容易意識到，需要改善人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的表征、識別和純化，以實現(xiàn)移植和疾病治療。本發(fā)明的這些以及其他目標(biāo)將通過以下描述變得明顯。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明涉及純化的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞和/或?qū)嵸|(zhì)上同質(zhì)的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的細(xì)胞群，以及獲得所述細(xì)胞和/或?qū)嵸|(zhì)上同質(zhì)的細(xì)胞群的方法。本發(fā)明的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的獨特特征在于存在以下細(xì)胞表面標(biāo)記物中的每一個:SSEA4、⑶73、PTK7和PSA-NCAM。在另一個方面，這些細(xì)胞的特征在于表達(dá)恢復(fù)蛋白、Sox2和Pax6。本發(fā)明還公開了含有這些細(xì)胞和/或細(xì)胞群的組合物。
[0012]在一個方面，本發(fā)明的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的特征還在于缺乏以下表面標(biāo)記物:⑶15、CD133、A2B5 和 CD38 (在本領(lǐng)域也表示為 CD15-、CD133-、A2B5-和 CD38-)。CD15 和 CD133是神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)記物。A2B5和⑶38是神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞表面標(biāo)記物。在另一個方面，本發(fā)明的純化的細(xì)胞群包含至少約50%、優(yōu)選至少約60%、最優(yōu)選至少約80%的以所述細(xì)胞表面標(biāo)記物特異性識別的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。本發(fā)明還公開了含有所述細(xì)胞和/或細(xì)胞群的組合物。
[0013]本發(fā)明的方法包括從人體組織中獲得分離的細(xì)胞樣品，以及利用上述標(biāo)記物識別并隨后利用本領(lǐng)域已知的方法分離或純化所述祖細(xì)胞。在一個方面，所述方法包括以下步驟、或?qū)嵸|(zhì)上由以下步驟組成、或由以下步驟組成:去除通常存在于細(xì)胞樣品中的雜質(zhì)和污染物、分選細(xì)胞以分離和純化具有上述表面標(biāo)記物的人祖細(xì)胞、以及收集純化的細(xì)胞以用于臨床或?qū)嶒炗猛?。這些細(xì)胞隨后可被放置到組織培養(yǎng)物中并生長以允許產(chǎn)生大量細(xì)胞以用于治療，這可參見2011年6月14日提交的美國專利申請?zhí)?3/160，002號的公開內(nèi)容，通過引用將其合并至本文中?？捎糜诒景l(fā)明的實際操作中的細(xì)胞分選技術(shù)是普遍已知的，包括例如流式細(xì)胞術(shù)和利用抗體和其片段的特異性熒光活化的細(xì)胞分析，該抗體和片段識別并結(jié)合至細(xì)胞表面標(biāo)記物。
[0014]本發(fā)明的方法允許從多種人組織來源選擇視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，例如骨髓、臍帶血、人胚胎干細(xì)胞或其分化的子代、人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞或其分化的子代，但優(yōu)選的組織來源是成人或胎兒視網(wǎng)膜組織。
[0015]本發(fā)明的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞具有各種治療用途，例如在移植到患病的眼睛中后治療視網(wǎng)膜疾病，并且這些細(xì)胞對于宿主患者或受移植者是自體的或同種異體的。本發(fā)明的細(xì)胞也可通過將細(xì)胞以合適的實驗形式與藥劑接觸從而用于體外藥物發(fā)現(xiàn)和毒性測試。因為視網(wǎng)膜祖細(xì)胞能夠分化成感光細(xì)胞，所以它們可用于替換或修復(fù)患者的感光組織，以及例如用于治療眼睛的退化疾病，例如視網(wǎng)膜色素變性、年齡相關(guān)性黃斑變性和糖尿病視網(wǎng)膜病變。因此，本發(fā)明還提供了通過在合適條件下培養(yǎng)以上識別的細(xì)胞或細(xì)胞群來誘導(dǎo)或支持這些細(xì)胞分化成感光細(xì)胞從而制備感光細(xì)胞的純化的培養(yǎng)物的方法。各種試劑隨后可與這些細(xì)胞接觸(在細(xì)胞或細(xì)胞群的分化期間一次或多次接觸)以確定對細(xì)胞生存率、特性或分化是否有影響。
[0016]本發(fā)明的前述實施方式和方面僅是示例性的，并不意在限制本發(fā)明的精神和范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]本發(fā)明的前述以及其他優(yōu)點和特征將在閱讀以下參考附圖進行的詳細(xì)描述后變得顯而易見。
[0018]圖1顯示了基于人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的所示嚴(yán)格(sternnes)/眼區(qū)標(biāo)記物的表達(dá)柱狀圖。
[0019]圖2顯示了基于人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的所示增殖性/細(xì)胞周期標(biāo)記物的表達(dá)柱狀圖。
[0020]圖3顯示了基于人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的流式細(xì)胞分析的所示神經(jīng)/膠質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)柱狀圖。
[0021]圖4顯示了基于人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)分析的所示嚴(yán)格(SternneS)ZlS區(qū)標(biāo)記物的表達(dá)柱狀圖。
[0022]圖5顯示了基于人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)分析的所示增殖性/細(xì)胞周期標(biāo)記物的表達(dá)柱狀圖。
[0023]圖6顯示了基于人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)分析的所示神經(jīng)/膠質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)柱狀圖。

【具體實施方式】
[0024]除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科技術(shù)語的涵義與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的涵義相同。雖然在本發(fā)明的實踐和測試中可使用類似于或等同于本文所述的方法和材料，但本文現(xiàn)僅描述優(yōu)選的方法、裝置和材料。本文所引用的所有技術(shù)文獻和專利文獻都通過引用將它們整體合并至本文中。本文中的任何部分都不能被解釋為承認(rèn)本發(fā)明不是在這些公開內(nèi)容之前完成的。
[0025]除非另有說明，否則本發(fā)明的實踐將使用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)技術(shù)，包括組織培養(yǎng)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和重組DNA、流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞分選。參見，例如，Sambrook and Russell eds.(2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual,3rd edit1n; the series Ausubel et al.eds.(2007) Current Protocols inMolecular B1logy; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.,N.Y.); MacPherson et al.(1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press atOxford University Press); MacPherson et al.(1995) PCR 2: A Practical Approach;Harlow and Lane eds.(1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005)Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edit1n; Gaited.(1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S.專利號 4，683，195; Hames and Higgins eds.(1984) Nucleic Acid Hybridizat1n; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridizat1n;Hames and Higgins eds.(1984) Transcript1n and Translat1n; Immobilized Cellsand Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to MolecularCloning; Miller and Calos eds.(1987) Gene Transfer Vectors for MammalianCells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed.(2003) Gene Transfer andExpress1n in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds.(1987) ImmunochemicalMethods in Cell and Molecular B1logy (Academic Press, London);以及Herzenberget al.eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunology。還可參見 Yuan etal., Plos One, 6(3)，el7540, March 2011。
[0026]所有數(shù)字表示(包括范圍值)，例如pH、溫度、時間、濃度和分子量，都是近似值，可上(+)下(-)改變0.1。要理解的是，雖然不總是明確表述，但所有數(shù)字表示前都有術(shù)語“約”。術(shù)語“約”也包括精確值“X”和“X”的些微改變，如“X+0.1”或“X-0.1”。還要理解的是，雖然不總是明確表述，但本文所述的試劑僅是示例性的，其等價物在本領(lǐng)域是已知的。
[0027]如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，為任何和所有目的，特別是在提供書面說明方面，本文所公開的所有范圍值也包括任何和所有可能的子范圍值或子范圍值的組合。任何所列舉的范圍可被容易地意識到是充分描述的并且使該范圍能夠被分解為至少兩等份、三等份、四等份、五等份、十等份等。作為一個非限制性的例子，本文所討論的每個范圍值可被容易地分解為下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，像“達(dá)”、“至少”、“大于”、“小于”這樣的語言包括所引用的數(shù)并且是指范圍值，該范圍值隨后可被分解為如上所述的子范圍。
[0028]如說明書和權(quán)利要求中所使用的，單數(shù)形式的“一個”和“該”，除非另有明確說明，都包括單個和多數(shù)引用。例如，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”包括多種藥學(xué)上可接受的載體，包括它們的混合物。
[0029]如本文所使用的，術(shù)語“包括”是指該組合物和方法包括所引述的內(nèi)容，但不排除其他內(nèi)容。當(dāng)用來定義組合物和方法時，“實質(zhì)上由…組成”意味著排除對于該組合物或方法具有任何實質(zhì)性意義的其他內(nèi)容。因此，如文本所定義的，實質(zhì)上由成分組成的組合物不排除由于分離和純化方法帶來的污染物以及藥學(xué)上可接受的載體，例如磷酸鹽緩沖液、防腐劑等。“由…組成”對意味著排除高于痕量的其他組分以及施用本發(fā)明的組合物的實質(zhì)性方法步驟。由每個這些過渡術(shù)語定義的實施方式都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0030]本發(fā)明的“宿主”或“患者”是動物(例如哺乳動物)或人?？稍\斷或治療的非人動物例如是需要治療的猴、鼠科(例如大鼠、小鼠)、犬科(例如狗)、兔科(例如兔子)、家畜、競技動物和寵物。
[0031 ] 術(shù)語“純化的”或“分離的”是指與組分、細(xì)胞或其他物質(zhì)分離，其中細(xì)胞、組織、多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段在自然條件下通常是連在一起的。例如，分離的多核苷酸是與3’和5’相鄰核苷酸相分離，通常在其天然或自然環(huán)境中(例如在染色體上)它們是連在一起的。純化的或分離的細(xì)胞是與組織相分離，在自然狀態(tài)下，通常其是與組織連在一起的。分離的或純化的細(xì)胞是指與不相似的表型或基因型的組織或細(xì)胞分開的細(xì)胞。如本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯知道的，非天然的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段是不需要“分離”從而與其天然副本相區(qū)別的。
[0032]如本文所使用的，“干細(xì)胞”定義為具有在培養(yǎng)物中無限期分化并生成專門細(xì)胞的能力的細(xì)胞。在本文中，為方便起見，干細(xì)胞被分為成體(成人)干細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞。成體干細(xì)胞是在分化的組織中發(fā)現(xiàn)的未分化細(xì)胞，其能夠進行自我更新(克隆)并且在特定條件下能夠分化以產(chǎn)生其所在組織的所有的專門細(xì)胞類型。胚胎干細(xì)胞是來自胚胎的原始(未分化)細(xì)胞，其具有變成各種專門細(xì)胞類型的能力(多能的)。近期，體細(xì)胞(包括完全分化的成人細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞)，通過引入以下一些或所有因子:0ct-3/4、S0X2、c-Myc、Nanog和Klf4可變的像胚胎干細(xì)胞一樣呈多能性的。這些細(xì)胞也被稱作誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPSC)。胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞已可在體外條件下培養(yǎng)數(shù)月至數(shù)年，以讓其增殖而不分化。通過使用合適的標(biāo)記物可將多能干細(xì)胞與其他類型的細(xì)胞區(qū)別開來，這些標(biāo)記物包括，但不限于，Oct-4、堿性磷酸酶、CD30、TDGF-1、GCTM-2、Genesis、生殖細(xì)胞核因子、SSEAl、SSEA3、和 SSEA4。
[0033]術(shù)語“干細(xì)胞”也包括“去分化的”干細(xì)胞，其一個例子是直接轉(zhuǎn)化成干細(xì)胞的體細(xì)胞，即重編程為干細(xì)胞?？寺∈侵概c初始細(xì)胞(本發(fā)明中為干細(xì)胞)遺傳上等同的細(xì)胞系。
[0034]術(shù)語“繁殖”或“增殖”是指使細(xì)胞或細(xì)胞群生長或改變其表型。術(shù)語“生長”或“擴增”是指細(xì)胞在存在支持培養(yǎng)基、營養(yǎng)、生長因子、支持細(xì)胞或獲得期望數(shù)量的細(xì)胞或細(xì)胞類型所需的任何化學(xué)或生物學(xué)化合物的情況下的增殖。在一個實施方式中，細(xì)胞的生長導(dǎo)致組織的再生。在另一個實施方式中，所述組織包含心肌細(xì)胞。
[0035]術(shù)語“培養(yǎng)”是指在各種類型的培養(yǎng)基上或中的細(xì)胞或微生物的體外繁殖?？梢岳斫獾氖牵囵B(yǎng)物中生長的細(xì)胞的子代可能不與親本細(xì)胞完全相同(例如，形態(tài)學(xué)上、遺傳學(xué)上或表型上)?！皵U增”是指細(xì)胞的任何增殖或分裂。
[0036]“克隆增殖”或“克隆擴增”是指通過將單個細(xì)胞連續(xù)分裂成兩個相同的子細(xì)胞和/或相同的細(xì)胞群而實現(xiàn)的細(xì)胞群的生長。
[0037]如本文所使用的，細(xì)胞“譜系”是指細(xì)胞的遺傳性，即，其祖先和后代。細(xì)胞譜系將該細(xì)胞置于發(fā)育和分化的遺傳體制中。
[0038]“分化”描述了非專門細(xì)胞獲得專門細(xì)胞(例如心細(xì)胞、肝細(xì)胞或肌肉細(xì)胞)的特征的過程?！岸ㄏ蚍只笔侵笇Ω杉?xì)胞培養(yǎng)條件進行控制以誘導(dǎo)分化成特定的細(xì)胞類型或細(xì)胞表型?！叭シ只摹笔侵讣?xì)胞回復(fù)到細(xì)胞譜系中較不定型的(committed)位置。如本文所使用的，術(shù)語“分化或分化的”是指細(xì)胞在細(xì)胞譜系中占據(jù)更加定型的(“分化的”)位置。
[0039]如文本所使用的，“抗體”是指整個抗體及其抗原結(jié)合片段或單鏈。因此，術(shù)語“抗體”包括包含免疫球蛋白分子的至少一部分的任何蛋白質(zhì)或含肽分子。例子包括，但不限于，重鏈或輕鏈的互補決定區(qū)(CDR)或其配體結(jié)合部分、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、框架(FR)區(qū)或其任何部分、或結(jié)合蛋白的至少一個部分，它們的任何一個都可被整合到本發(fā)明的抗體中。
[0040]所述抗體可為多克隆的或單克隆的，并且可分離自任何合適的生物來源，例如鼠、兔、羊和狗。
[0041]術(shù)語“抗體”進一步包括單克隆抗體、其消化片段、指定部分、衍生物和變體，包括抗體模擬物或模擬抗體或其指定片段或部分的結(jié)構(gòu)和/或功能的抗體的組成性部分，包括單鏈抗體及其片段。術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”所包含的結(jié)合片段的例子包括Fab片段，它是由VL、VH、CL和CH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的單價片段；F(ab’)2片段，它是包含在鉸鏈區(qū)通過二硫橋相連的兩個Fab片段的二價片段；Fd片段，其由VH和CH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；Fv片段，其由抗體的單個臂的 VL 和 VH 結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；dAb 片段(Ward et al.(1989) Nature 341:544-546),其由VH結(jié)構(gòu)域構(gòu)成；和分離的互補決定區(qū)(CDR)。而且，雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域(VL和VH)由不同基因來編碼，但可利用重組方法經(jīng)由合成連接物使它們形成單個蛋白鏈從而被連接在一起，在該單個蛋白鏈中，VL和VH區(qū)域配對以形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv)).Bird et al.(1988) Science 242:423-426 and Huston et al.(1988) Proc.Natl.AcadSc1.USA 85:5879-5883。單鏈抗體也被包括在術(shù)語“抗體的片段”之內(nèi)。任何上述抗體片段可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī)技術(shù)來獲得，并且這些片段的結(jié)合特異性和中和活性的篩選與完整抗體所進行的方式相同。
[0042]術(shù)語“表位”是指能夠特異性結(jié)合至抗體的蛋白決部位。表位通常由化學(xué)上有活性的分子(例如氨基酸或糖側(cè)鏈)表面群組構(gòu)成，并且通常具有特異的三維結(jié)構(gòu)特征以及特異的電荷特征。構(gòu)象表位和非構(gòu)象表位的區(qū)別在于在存在變形溶劑的情況下，對構(gòu)象表位的結(jié)合喪失，而對非構(gòu)象表位的結(jié)構(gòu)不喪失。
[0043]本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”或“單克隆抗體成分”是指單個分子成分的抗體分子的制劑。單克隆抗體成分表現(xiàn)出對特定表位的單種結(jié)合特異性和親和性。
[0044]本文使用的術(shù)語“視網(wǎng)膜祖細(xì)胞”、或“神經(jīng)視網(wǎng)膜來源的視網(wǎng)膜干細(xì)胞”、或“視網(wǎng)膜干細(xì)胞”是同義詞并且是指可來源于神經(jīng)視網(wǎng)膜組織的分離的活干細(xì)胞。這些細(xì)胞的起始點(point of origin)是可將它們與非神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞區(qū)別開來的一個因素，例如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的色素細(xì)胞、睫狀體或虹膜。本發(fā)明的細(xì)胞可進一步通過不能在缺乏生長因子的情況下增殖的表現(xiàn)而辨別。這些細(xì)胞在正常生長培養(yǎng)物中不表達(dá)大量的感光標(biāo)記物，但在缺乏生長因子并且特別是當(dāng)種植在特定基質(zhì)物質(zhì)(PCL專利申請)時，這些細(xì)胞快速地分化成感光標(biāo)記物呈陽性的細(xì)胞。
[0045]本發(fā)明的細(xì)胞的進一步的特征在于如下進一步描述的獨特群組的細(xì)胞表面標(biāo)記物。本發(fā)明的細(xì)胞可來源于產(chǎn)前或產(chǎn)后來源物，并且是多能的，意思是它們能夠自我更新并且能夠視網(wǎng)膜特異性地分化成感光細(xì)胞。這些細(xì)胞在U.S.專利號7，514，259中有描述，其公開內(nèi)容通過引用整體合并至本文中。
[0046]如本文關(guān)于本發(fā)明的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞所使用的，術(shù)語“多能性”是指視網(wǎng)膜祖細(xì)胞增殖并形成多種成熟視網(wǎng)膜細(xì)胞類型(特別是感光細(xì)胞)的能力。
[0047]“實質(zhì)上同質(zhì)的”細(xì)胞群是指超過約50%、或超過約60%、或超過約70%、或超過約75%、或超過過約80%、或超過約85%、或超過約90%、或超過約95%的細(xì)胞具有相同或類似表型的細(xì)胞群。表型是由下文更詳細(xì)描述的細(xì)胞表面標(biāo)記物決定的。
[0048]如本文所使用的，術(shù)語“治療”等是指獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。該效果可為預(yù)防性的(完全或部分地預(yù)防疾病或疾病的征兆或癥狀)，和/或治療性的(部分地或完全地治愈疾病和/或由該疾病引起的負(fù)面效果)?！爸委煛钡睦影ǖ幌抻?阻止在可能易患某種疾病但尚未被診斷為患有該病的對象中出現(xiàn)該??；抑制疾病，即阻止疾病發(fā)展；和/或減輕或緩解疾病癥狀，例如黃斑變性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，“治療”可包括與病理學(xué)相關(guān)的癥狀的全身性減輕和/或延遲癥狀(例如胸痛)的發(fā)作?！爸委煛钡呐R床和亞臨床表現(xiàn)會因病理學(xué)、個體和治療方式而變化。
[0049]“組合物”是指活性試劑、細(xì)胞或細(xì)胞群、以及另一種惰性(例如可檢測試劑或標(biāo)志物)或活性化合物或組合物的結(jié)合。
[0050]“藥物組合物”包括活性試劑與惰性或活性載體(例如生物相容性支架或基質(zhì))的結(jié)合，使該組合物適于體外、體內(nèi)或間接體內(nèi)的診斷或治療用途。
[0051]術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”(或介質(zhì))，可與術(shù)語生物學(xué)相容性載體或介質(zhì)互換使用，是指試劑、細(xì)胞、化合物、材料、組合物和/或劑量形式，其不僅能與細(xì)胞及其他要被治療性地施用的試劑相容，而且，在合理的醫(yī)學(xué)判斷的范圍內(nèi)，適合用于與人體和動物體的組織接觸，而不會產(chǎn)生過度的毒性、刺激、過敏反應(yīng)或其他具有合理受益/風(fēng)險比率的并發(fā)癥。適合用于本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的載體包括液體、半固體(例如凝膠)和固體材料(例如，細(xì)胞支架和基質(zhì)、管材、片材及其他本領(lǐng)域已知并在本文詳細(xì)描述的這樣的材料)。這些半固體和固體材料可被設(shè)計成在體內(nèi)耐降解(非生物可降解的)，或者它們可被設(shè)計成可在體內(nèi)降解(生物可降解的、生物可侵蝕的)。生物可降解材料可進一步為生物可再吸收的或生物可吸收的，即，它可被溶解并被吸收到體液中(水溶性植入物即是一個例子)，或被降解并最終被從體內(nèi)清除(通過轉(zhuǎn)化成其他材料或分解并經(jīng)由自然途徑消除)。
[0052]“有效量”是足以實現(xiàn)有益的或期望的結(jié)果的量。有效量可在一次或多次施用、應(yīng)用或劑量中施用。
[0053]如本文所使用的，用于體內(nèi)和間接體內(nèi)的術(shù)語“施用”是指向?qū)ο筇峁┯行Я康慕M合物、細(xì)胞或細(xì)胞群，以有效地實現(xiàn)方法的期望目的。施用組合物的方法(如本文所描述的那些方法)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，包括但不限于，腸胃外、局部、口腔、或局部施用以及靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥。在整個治療過程中，施用可連續(xù)進行或間斷進行。確定最有效的使用手段和劑量的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的并且根據(jù)用于治療的細(xì)胞、用于治療的組合物、治療目的和被治療的對象而變化。可進行單次或多次施用，并由治療醫(yī)師選擇劑量水平和模式。例如，組合物可在對象患有治療所針對的疾病或病癥之前或已患有該疾病或病癥時施用。
[0054]視網(wǎng)膜祖細(xì)胞表面標(biāo)記物
本發(fā)明涉及純化的或分離的細(xì)胞和/或?qū)嵸|(zhì)上同質(zhì)的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞群，特點在于存在以下細(xì)胞表面分子的每一個:SSEA4+、CD73+、PTK7+和PSA-NCAM+。
[0055]這些是陽性表面標(biāo)記物，意思是指每個標(biāo)記物都存在于細(xì)胞的表面上并且其存在可被抗體或其他結(jié)合至該表面標(biāo)記物的相關(guān)配體檢測到。本發(fā)明的視網(wǎng)膜細(xì)胞的特點還在于陰性細(xì)胞標(biāo)記物，意思是指無法通過抗這些標(biāo)記物的抗體檢測到這些標(biāo)記物的存在(或觀察到缺少這些標(biāo)記物)。以下是本發(fā)明的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的陰性細(xì)胞標(biāo)記物:CD15-(神經(jīng)干細(xì)胞)、CD 133-(神經(jīng)干細(xì)胞)、A2B5-(神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞)和⑶38-(神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞)。
[0056]本發(fā)明的細(xì)胞群通常具有至少約50%、優(yōu)選至少約60%、最優(yōu)選至少約80%的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的人體來源包括各種器官或組織的組織，例如產(chǎn)前視網(wǎng)膜組織、胎兒組織、成人器官和骨髓、以及視網(wǎng)膜神經(jīng)球。人視網(wǎng)膜組織是這些細(xì)胞的優(yōu)選來源物。這些細(xì)胞可來自活宿主或尸體。
[0057]簡言之，人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分離自16周胎齡的人神經(jīng)視網(wǎng)膜的不同捐獻體，它們獲得自符合倫理和GTP的組織庫，例如位于加州Alameda的ABR Inc公司。這些被分離的細(xì)胞在Ultraculture?培養(yǎng)基的涂布有纖連蛋白的表面上擴增，該培養(yǎng)基補充劑(20 ng/ml rhEGFUO ng/ml bFGF)，增殖至不同的傳代(例如P8和P13)，隨后冷凍以提供藥物物質(zhì)(DS)份(lot)的備用品。這些藥物物質(zhì)份可按GMP制造以用于臨床應(yīng)用。為進行細(xì)胞增殖，DS份被解凍并以20000個細(xì)胞/平方厘米的密度被接種。兩天后，收獲細(xì)胞并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序制備以產(chǎn)生藥物產(chǎn)品(DP)。記錄人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的每個制備批次的細(xì)胞濃度(每mL的實際細(xì)胞數(shù))和細(xì)胞存活率(穩(wěn)定性)。
[0058]為表征這些細(xì)胞，將人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞制備成在無毒賦形劑(如HBSS-NAC)中的視網(wǎng)膜細(xì)胞新鮮懸浮液的形式，濃度為每HiL 5千萬個細(xì)胞。增殖這些細(xì)胞并按標(biāo)準(zhǔn)程序制備以用于移植。參見，2011年6月14日提交的美國專利申請13/160，002號中所述的方法，其全部公開內(nèi)容通過引用合并至本文中。
[0059]這些細(xì)胞可利用以下實施例中描述的流式細(xì)胞分析和免疫細(xì)胞化學(xué)分析來表征。
[0060]治療用途
本發(fā)明還提供替換或保護需要此種治療的患者中感光細(xì)胞的方法，包括將上述人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞移植到患病的或退化的人視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜下空間中。一方面，這些細(xì)胞可治療或減輕需要此種治療的患者的色素性視網(wǎng)膜炎的癥狀。另一方面，這些細(xì)胞可被種植到合適的生物相容性支架上，例如2012年I月23日提交的美國專利申請13/356，073號中描述的內(nèi)容，這些內(nèi)容通過引用被合并至本文中，并且該細(xì)胞-支架組合產(chǎn)品可被移植從而治療或減輕需要此種治療的患者中年齡相關(guān)性黃斑變性的癥狀。對于所有這些治療，視網(wǎng)膜祖細(xì)胞對于患者來說是同種異體的。在另一個方面，本發(fā)明的細(xì)胞可與其他治療結(jié)合施用。
[0061]篩選試驗本發(fā)明提供篩選調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的分化的各種試劑的方法。它也可被用來發(fā)現(xiàn)支持和/或拯救在培養(yǎng)物中由視網(wǎng)膜祖細(xì)胞產(chǎn)生的成熟感光細(xì)胞的治療劑。為本發(fā)明的目的，“試劑”包括但不限于生物學(xué)或化學(xué)化合物(例如簡單或復(fù)雜的有機或無機分子)、肽、蛋白質(zhì)(例如抗體)、多核苷酸(例如反義多核苷酸)或核酶。各種化合物可被合成，例如聚合物(如多肽和多核苷酸)以及基于各種母核結(jié)構(gòu)的合成的有機化合物，這些都被包括在術(shù)語“試劑”中。此外，各種天然來源物可提供用于篩選的化合物，例如植物或動物提取物等。應(yīng)當(dāng)理解的是，雖然不總是明確表述，但所述試劑可單獨使用或與具有相同或不同生物學(xué)活性的另一種試劑(例如通過發(fā)明的篩選方法識別的試劑)結(jié)合使用。
[0062]為在體外進行所述篩選方法，可如以上所述獲得分離的細(xì)胞群。當(dāng)試劑是非DNA或RNA的組合物時，例如是以上所述的小分子，那么該試劑可直接被添加至細(xì)胞或添加至要被添加的培養(yǎng)基中。本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯知道，必須加入“有效”量，這可通過經(jīng)驗確定。當(dāng)試劑是多核苷酸時，其可利用基因槍或電穿孔而被直接加入。
[0063]作為選擇，它可利用基因遞送載體或其他以上所述方法被插入到細(xì)胞中。可進行陽性對照和陰性對照試驗以確認(rèn)藥物或其他試劑的所聲稱的活性。
[0064]試劑盒
本發(fā)明還提供了用于本文所描述的方法的試劑盒，所述試劑盒含有本發(fā)明的細(xì)胞群、細(xì)胞或組合物中的一個或多個，并含有使用說明。任選地，該試劑盒可包括用于所述方法的試劑。
[0065]在另一個方面，本發(fā)明提供用于所述方法的試劑盒，包括用于分離或純化細(xì)胞或細(xì)胞群的說明以及使用說明，并且任選地包括用來從合適的組織來源(如本文所述的來源)分離或純化細(xì)胞或細(xì)胞群的試劑。
[0066]本發(fā)明在以下實施例中進一步詳細(xì)描述，這些實施例不是用來限制本發(fā)明的范圍。
實施例
[0067]視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)
神經(jīng)視網(wǎng)膜的形態(tài)學(xué)在2011年6月14日提交的共同受讓的共同待決的美國專利申請13/160,002號中進一步描述，其全部內(nèi)容通過引用合并至本文中。
[0068]細(xì)胞分離
按以下參考文獻中所描述的(進行小的修改)從胎兒視網(wǎng)膜中分離hRPC(人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞):Klassen, H.J.et al., Multipotent Retinal Progenitors ExpressDevelopmental Markers, Differentiate into Retinal Neurons, and PreserveLight-Mediated Behav1r, Invest.0pthalmol.Vis.Sc1., 2004, 45 ( 11)，pages4167-4173; Klassen, H.et al., Isolat1n of Retinal Progenitor Cells fromPost-Mortem Human Tissue and Comparison with Autologous Brain Progenitors,J.Neuroscience Research, 2004, 77(3)，pages 334-343; Klassen, H.et al.,Progenitor Cells from the Porcine Neural Retina Express Photoreceptor Markersafter Transplantat1n to the Subretinal Space of Allorecipients; Stem Cells,2007， 25(5); pages 1222-1230。
[0069]簡言之，從人胎兒眼睛(14-18周胎齡)切出整個神經(jīng)視網(wǎng)膜，在0.1%膠原酶I(Sigma)中分離4個循環(huán)(總共發(fā)酵1.5小時)，并接種在改性的Ultraculture培養(yǎng)基(10ng/ml rhEGF、20 ng/ml rhbFGF、青霉素/鏈霉素、制霉菌素和L-谷氨酰胺)中或冷凍。單個細(xì)胞及細(xì)胞團的量和成活率利用Trypan藍(lán)和血球計來估算。
[0070]流式細(xì)胞術(shù)分析
按照以下一般性方案處理人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞:
1.固定:對于所有抗原(細(xì)胞周期分析和PCNA除外)，使用冷的新鮮4%多聚甲醛緩沖液(pH 7.4)在4°C處理30分鐘；對于細(xì)胞周期分析和PCNA使用100%乙醇在4°C處理30分鐘
2.洗滌:添加PBS，在1500rpm離心5分鐘
3.透化和封閉:在封閉緩沖液(0.1% Triton-X,10%山羊血清溶液，在5% BSA的PBS中制備)中重懸細(xì)胞團塊，在室溫溫育30分鐘
4.洗滌
5.在染色液(10%山羊血清溶液，在5%BSA的PBS中制備)的X(要添加的抗體數(shù)目)10fll中重懸細(xì)胞團塊；通過100111在5 ml管中等分
6.根據(jù)下表1添加一級抗體；所有抗體溶液在染色液中制備；在室溫溫育45分鐘
7.洗滌
8.根據(jù)表1添加10fll的二級抗體(在染色液中)；在室溫溫育30分鐘
9.洗漆
10.在500fll的PBS中重懸11.在4小時內(nèi)(例如使用BD LSR II)分析門內(nèi)的至少10000個事件。
[0071]碘化丙啶染色(用于細(xì)胞周期分析)
1.在含有20flg/mL的PI和100flg/mL的無DNA酶的RNA酶A的I mL PBS中懸浮細(xì)胞團塊
2.洗滌
3.在500f..tl的PBS中重懸并分析。
[0072]DAPI染色(用于存活率分析)
1.在固定之前，在200ng/ml DAPI的PBS中重懸細(xì)胞
2.在室溫下溫育5分鐘
3.洗滌
4.在4%的冷PFA中固定30分鐘
5.洗滌
6.在500f..11的PBS中重懸并分析。
[0073]表1

【權(quán)利要求】
1.一種人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的純化的實質(zhì)上同質(zhì)的細(xì)胞群，所述人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞具有以下陽性的可識別的表面標(biāo)記物:SSEA4、CD73、PTK7和PSA-NCAM、CD24。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化的細(xì)胞群，其中所述視網(wǎng)膜祖細(xì)胞包括作為陽性可識別標(biāo)記物的恢復(fù)蛋白、Sox2和Pax6。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的純化的細(xì)胞群，其中所述視網(wǎng)膜祖細(xì)胞缺乏以下陰性的神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)記物:⑶15和⑶133。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的任一項所述的純化的細(xì)胞群，其中所述視網(wǎng)膜祖細(xì)胞缺乏以下陰性的神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞表面標(biāo)記物:A2B5和⑶38。
5.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的純化的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群包含至少約50%的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至4的任一項所述的純化的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群包含至少約80%的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。
7.一種組合物，其包含前述任一項權(quán)利要求所述的細(xì)胞群，以及載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，所述載體是藥學(xué)上可接受的載體。
9.一種在混合的細(xì)胞群中識別人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的方法，所述方法包括將具有以下陽性表面標(biāo)記物的細(xì)胞篩選出所述混合的細(xì)胞群:SSEA4、⑶73、PTK7和PSA-NCAM。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，所述方法進一步包括從所述混合的細(xì)胞群中分離或純化出人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞從而提供分離的或純化的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，所述方法進一步包括篩選所述細(xì)胞群中缺乏以下陰性神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)記物的細(xì)胞:⑶15和⑶133。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11中的任一項所述的方法，所述方法進一步包括篩選所述細(xì)胞群中缺乏以下陰性神經(jīng)膠質(zhì)祖細(xì)胞表面標(biāo)記物的細(xì)胞:Α2Β5和⑶38。
13.根據(jù)權(quán)利要求9至12中的任一項所述的方法，其中所述混合的細(xì)胞群分離自至少一個人組織來源。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，所述組織來源是人視網(wǎng)膜組織。
15.根據(jù)權(quán)利要求9至14的任一項所述的方法，其中所述組織來源是人骨髓、或胚胎多能細(xì)胞、或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞、或臍血細(xì)胞。
16.根據(jù)權(quán)利要求9至15的任一項所述的細(xì)胞，其中所述篩選包括利用流式細(xì)胞術(shù)進行的細(xì)胞分選。
17.根據(jù)權(quán)利要求9至15的任一項所述的方法，其中所述篩選包括利用熒光活化的細(xì)胞分選以及識別和結(jié)合至所述陽性細(xì)胞表面標(biāo)記物的抗體進行的細(xì)胞分選。
18.通過權(quán)利要求10至17的任一項權(quán)利要求的方法制備或獲得的純化或的細(xì)胞。
19.通過權(quán)利要求10至17的任一項權(quán)利要求的方法制備的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的實質(zhì)上純化的細(xì)胞群。
20.一種組合物，包含權(quán)利要求18所述的純化或分離的細(xì)胞或權(quán)利要求19所述的細(xì)胞群，以及載體。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述載體是藥學(xué)上可接受的載體。
22.—種制備純化的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的細(xì)胞群的方法，所述方法包括以下步驟: 使用以下陽性可識別的表面標(biāo)記物分選來自于含有人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的人組織來源的分離的細(xì)胞樣品的細(xì)胞:SSEA4、CD73、PTK7和PSA-NCAM，以及 收集所述分離的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞以制備純化的人視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的細(xì)胞群。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，所述方法進一步包括在分選細(xì)胞之前從所述分離的細(xì)胞樣品中除去雜質(zhì)和污染物。
24.—種替換或修復(fù)需要此種治療的患者的感光細(xì)胞的方法,所述方法包括向所述患者施用有效量的一種或多種權(quán)利要求1至6的任一項所述的細(xì)胞群或權(quán)利要求7、8、20或21所述的組合物,從而替換或修復(fù)所述患者的感光細(xì)胞。
25.一種治療或減輕需要所述治療的患者的色素性視網(wǎng)膜炎的癥狀的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的一種或多種權(quán)利要求1至6的任一項所述的細(xì)胞群或權(quán)利要求7、8、20或21所述的組合物，從而治療或減輕所述患者的色素性視網(wǎng)膜炎的癥狀。
26.一種治療或減輕需要所述治療的患者的年齡相關(guān)性黃斑變性的癥狀的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的一種或多種權(quán)利要求1至6的任一項所述的細(xì)胞群或權(quán)利要求7、8、20或21所述的組合物，從而治療或減輕所述患者的年齡相關(guān)性黃斑變性的癥狀。
27.—種試劑盒，其用于權(quán)利要求24至26的任一項所述的方法中，包括一種或多種權(quán)利要求I至6的任一項所述的細(xì)胞群或權(quán)利要求7、8、20或21所述的組合物，以及使用說明。
28.—種試劑盒，其用于權(quán)利要求24至26的任一項所述的方法中，包括分離權(quán)利要求1至5的任一項所述的細(xì)胞群的說明或權(quán)利要求7、8、20或21所述的組合物以及使用說明，并且任選地包括用于從合適的組織來源分離或純化細(xì)胞或細(xì)胞群的試劑。
【文檔編號】C12N5/00GK104136601SQ201380007641
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2013年2月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月17日
【發(fā)明者】邁克爾·J·楊, 彼得·Y·巴拉諾夫 申請人:斯格本斯眼科研究所