同時表達(dá)十二聚體trail及hsv-tk自殺基因的載體及利用其的抗癌干細(xì)胞治療劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含編碼十二聚體TRAIL的核苷酸序列及自殺基因核苷酸序列的DNA盒、包含所述DNA盒的重組表達(dá)載體、利用所述重組表達(dá)載體制備的重組腺病毒、用所述重組腺病毒轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞、包含所述宿主細(xì)胞的癌治療用組合物以及包括向個體給予所述癌治療用組合物的步驟的癌治療方法。通過導(dǎo)入本發(fā)明的DNA盒從而同時生產(chǎn)十二聚體TRAIL及HSV-TK的干細(xì)胞治療劑與現(xiàn)有治療劑相比抗癌效果更加優(yōu)異，因此能夠有效地用于治療多種實(shí)體癌及轉(zhuǎn)移癌。
【專利說明】同時表達(dá)十二聚體TRAIL及HSV-TK自殺基因的載體及利用 其的抗癌干細(xì)胞治療劑

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及同時表達(dá)十二聚體TRAIL(TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體）及HSV-TK(單 純皰疹病毒胸苷激酶）自殺基因的載體及利用其的抗癌干細(xì)胞治療劑。更為詳細(xì)地，本發(fā) 明涉及包含編碼十二聚體TRAIL的核苷酸序列及自殺基因核苷酸序列的DNA盒、包含所述 DNA盒的重組表達(dá)載體、利用所述重組表達(dá)載體制備的重組腺病毒、用所述重組腺病毒轉(zhuǎn)染 的宿主細(xì)胞、包含所述宿主細(xì)胞的癌治療用組合物以及包括向個體給予所述癌治療用組合 物的步驟的癌治療方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC)作為能夠分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等的多能 (pluripotent)成體干細(xì)胞，被廣泛用于組織再生目的的多種疾病的治療劑。而且，已知間 充質(zhì)干細(xì)胞具有能夠在體內(nèi)特異性地找出并移動至腫瘤位點(diǎn)的特性，近來作為靶向遞送載 體用于抗癌劑受到矚目（Aboody et al.，Proc Natl Acad Sci, 97:12846, 2000)。就利用 間充質(zhì)干細(xì)胞的癌特異趨向性對轉(zhuǎn)移癌進(jìn)行靶向治療已進(jìn)行了許多研究。實(shí)際上，報(bào)道稱 將抗癌細(xì)胞因子IL-12或IFN-β，或者溶瘤病毒搭載在間充質(zhì)干細(xì)胞上對轉(zhuǎn)移癌小鼠全身 給藥時，轉(zhuǎn)移癌的大小減小并且小鼠的存活延長（Shah et al.Advanced Drug Delivery Reviews,2011)〇
[0003] 已知TRAIL作為TNF(腫瘤壞死因子）家族蛋白，具有能夠選擇性地誘導(dǎo)癌細(xì) 胞凋亡的特征（Wiley et al.，Immunity, 3(6):673-682, 1995)。實(shí)際上，已查明TRAIL 具有對健康組織無損傷并且只對多種癌細(xì)胞系展現(xiàn)毒性的特征（Ashkenazi et al.，J. Clin. Invest. , 104:155-162, 1999 ；ffalczak et al. , Nat. Med. , 5:157-163,1999),這 是由于在正常細(xì)胞表面上表達(dá)了高水平的誘餌受體l、2(DcRl、DcR2) (Sheridan et al. , Science, 277:818-821, 1997)。DcRl、DcR2雖然能夠與TRAIL結(jié)合，但由于它們?nèi)狈Π?內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域而不轉(zhuǎn)導(dǎo)由TRAIL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號。TRAIL基于其誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異 性凋亡的能力，作為癌治療的具有前景的治療劑而受到矚目。本發(fā)明人在先前專利中，為了 實(shí)現(xiàn)利用TRAIL進(jìn)行有效的抗癌基因治療，在能與TRAIL受體DR4、DR5結(jié)合的TRAIL的胞外 結(jié)構(gòu)域（氨基酸114-281)的氨基酸末端連接作為分泌信號序列的tPA(組織纖溶酶原激活 齊U )及作為十二聚體形成結(jié)構(gòu)域的SPD(表面活性蛋白D)，從而發(fā)明了十二聚體TRAIL(國 際申請?zhí)?PCT/KR2007/001099)。
[0004] 自殺基因療法作為抗癌基因治療方法之一，是向癌細(xì)胞直接傳遞HSV-TK (單純皰 疹病毒胸苷激酶）、胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶、羧酸酯酶、細(xì)胞色素 P450、PNP(嘌呤核苷 磷酸化酶）等自殺基因的方法。自殺基因表達(dá)上述酶中的一種，該酶通過酶促反應(yīng)將注 射的對細(xì)胞無害的前藥轉(zhuǎn)化為具有細(xì)胞毒性的物質(zhì)，其通過間隙連接從表達(dá)自殺基因的 細(xì)胞傳遞到相鄰的細(xì)胞中，從而誘導(dǎo)周邊細(xì)胞凋亡，該現(xiàn)象被稱為旁觀者效應(yīng)（bystander effect)。實(shí)際上，誘導(dǎo)自殺基因表達(dá)于癌組織后，對活體全身性地給予前藥時，只在治療基 因得到表達(dá)的腫瘤細(xì)胞中前藥被轉(zhuǎn)化為毒性物質(zhì)，從而能夠破壞腫瘤細(xì)胞而不給正常組織 帶來明顯損傷（The FASEB journal, 23:1584, 2009)。
[0005] 在各種自殺基因中，HSV-TK作為最為廣泛被使用的自殺基因，已經(jīng)被III期臨床 試驗(yàn)證實(shí)其功效和安全性。HSV-TK將被稱為更昔洛韋（GCV)的前藥磷酸化，而通過被磷 酸化的更昔洛韋三磷酸鹽（GCV-3P)插入DNA中阻止正常基因的合成，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 (Moolten et al·，Cancer Res. 46:5276, 1986) OGCV-3P的作用是特異性地作用于快速增殖 的細(xì)胞，因此該方法可用于選擇性地消除癌細(xì)胞而避免殺傷正常細(xì)胞。實(shí)際上，當(dāng)通過腺病 毒或慢病毒將HSV-TK傳遞到局部腫瘤位點(diǎn)后再給予GCV，則可以期待癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞 凋亡，并且為了進(jìn)一步提高癌特異性，采用癌特異性啟動子或病毒載體的向性修飾的策略。
[0006] TRAIL及HSV-TK在能夠誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異性的細(xì)胞凋亡這一點(diǎn)上，作為靶向癌治療 中安全的候補(bǔ)物質(zhì)，已經(jīng)被應(yīng)用于利用間充質(zhì)干細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移癌，但僅TRAIL或HSV-TK的 單獨(dú)治療抗癌功效微弱，在抗癌治療的臨床應(yīng)用中難以成功（Loebinger et al.，Cancer Res, 69:4134, 2009 ；Miletic et al. Molecular Ther, 15:1373, 2007)〇


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 技術(shù)課題
[0008] 本發(fā)明人為了研發(fā)功效優(yōu)異的靶向抗癌基因治療，構(gòu)建了同時表達(dá)十二聚體 TRAIL及HSV-TK自殺基因的載體，并隨后制備了同時表達(dá)這些基因的重組腺病毒，將其傳 遞到干細(xì)胞時，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞針對多種癌細(xì)胞展現(xiàn)出高的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)能力。與單獨(dú)表達(dá) TRAIL、十二聚體TRAIL或HSV-TK的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，同時表達(dá)十二聚體TRAIL及HSV-TK 的間充質(zhì)干細(xì)胞顯示了協(xié)同地增加的抗癌功效。此外，將同時表達(dá)十二聚體TRAIL及 HSV-TK的間充質(zhì)干細(xì)胞向小鼠轉(zhuǎn)移性腎癌模型全身給藥時，發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞能夠特異性 定位于腫瘤結(jié)節(jié)附近，并顯著地減少轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)的大小和數(shù)目，從而能夠明顯提高小 鼠的存活率。特別是，通過反復(fù)給予同時表達(dá)十二聚體TRAIL和HSV-TK的干細(xì)胞治療劑， 使得抗癌效果進(jìn)一步提高，并且通過3次反復(fù)給藥后小鼠的所有轉(zhuǎn)移性腫瘤結(jié)節(jié)得到完全 治愈，從而完成本發(fā)明。
[0009] 技術(shù)方案
[0010] 本發(fā)明的一個目的是提供包含編碼十二聚體TRAIL(TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體）的 核苷酸序列及自殺基因核苷酸序列的DNA盒。
[0011] 本發(fā)明的另一個目的是提供包含上述DNA盒的重組表達(dá)載體。
[0012] 本發(fā)明的又一個目的是提供利用上述重組表達(dá)載體制備的重組腺病毒。
[0013] 本發(fā)明的又一個目的是提供用上述重組腺病毒轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
[0014] 本發(fā)明的又一個目的是提供包含上述宿主細(xì)胞的癌治療用組合物。
[0015] 本發(fā)明的又一個目的是提供包括向疑似患有癌癥的個體給予上述癌治療用組合 物的步驟的癌治療方法。
[0016] 有益效果
[0017] 相比現(xiàn)有治療劑，通過導(dǎo)入本發(fā)明的DNA盒而同時生產(chǎn)十二聚體TRAIL及HSV-TK 的干細(xì)胞治療劑的抗癌效果更加優(yōu)異，因此能夠有效地用于治療多種不同的實(shí)體癌及轉(zhuǎn)移 癌。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1所示為由人十二聚體TRAIL序列、IRES序列以及HSV-TK序列組成的DNA盒 (dTRAIL-TK)的示意圖。
[0019] 圖2所示為導(dǎo)入dTRAIL-TK DNA盒的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC/dTRAIL-TK)的TRAIL表 達(dá)及HSV-TK表達(dá)的結(jié)果。
[0020] 圖3所示為進(jìn)行GCV處理后，導(dǎo)入dTRAIL-TK DNA盒的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC/ dTRAIL-TK)的細(xì)胞存活及TRAIL表達(dá)的結(jié)果。
[0021] 圖4所示為體外的RENCA細(xì)胞中同時表達(dá)十二聚體TRAIL及HSV-TK的間充質(zhì)干 細(xì)胞（MSC/dTRAIL-TK)的增進(jìn)的癌細(xì)胞殺傷能力的結(jié)果。
[0022] 圖5所示為用MSC/dTRAIL-TK處理后，小鼠轉(zhuǎn)移性腎癌模型中的肺腫瘤結(jié)節(jié)的數(shù) 目。
[0023] 圖6所示為給予MSC/dTRAIL-TK后，轉(zhuǎn)移性腎癌小鼠的存活率。
[0024] 圖7所示為反復(fù)給予MSC/dTRAIL-TK后，轉(zhuǎn)移性腎癌小鼠的存活率。
[0025] 優(yōu)選實(shí)施方式
[0026] 作為實(shí)現(xiàn)上述目的的一個方面，本發(fā)明提供包含編碼十二聚體TRAIL(TNF相關(guān)的 凋亡誘導(dǎo)配體）的核苷酸序列及自殺基因核苷酸序列的DNA盒。
[0027] 本發(fā)明的術(shù)語"十二聚體TRAIL(TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體）"是指，通過表達(dá)的 TRAIL蛋白多聚化而具有十二聚體結(jié)構(gòu)的分泌型TRAIL蛋白，其可以是由國際公開專利 第TO2007/102690號及韓國公開專利第10-2009-0015885號記載的方法制備的十二聚體 TRAIL。已確認(rèn)相比單聚體或三聚體結(jié)構(gòu)的TRAIL，本發(fā)明的十二聚體TRAIL蛋白顯示出更 高的癌細(xì)胞選擇性凋亡誘導(dǎo)活性。本發(fā)明中，為了將TRAIL蛋白制備為十二聚體形態(tài)，使編 碼十二聚體形成結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列位于編碼TRAIL蛋白的核苷酸序列的5'上游區(qū)，為了 蛋白的細(xì)胞外分泌，使編碼分泌信號序列的核苷酸序列位于十二聚體形成結(jié)構(gòu)域的5'上游 區(qū)。
[0028] 本發(fā)明雖然使用了十二聚體TRAIL，但只要其與本發(fā)明的自殺基因同時表達(dá)用于 治療劑時能夠顯示出協(xié)同性抗癌效果，三聚體以上的TRAIL也可以包含于本發(fā)明的范圍 內(nèi)。
[0029] 編碼本發(fā)明的十二聚體TRAIL的核苷酸序列可以包含編碼分泌信號序列的核苷 酸序列、編碼十二聚體形成結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列以及編碼TRAIL的核苷酸序列。
[0030] 本發(fā)明中，術(shù)語"TRAIL(TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體）"是指這樣一種蛋白，其作為配 體以誘導(dǎo)被稱為凋亡的細(xì)胞死亡過程。在本發(fā)明中，編碼TRAIL的核苷酸序列可以為來自 人、猴子、大鼠、小鼠或其它物種的編碼TRAIL蛋白的基因，可以優(yōu)選使用人TRAIL基因。
[0031] 因由本發(fā)明的編碼TRAIL的核苷酸序列表達(dá)的蛋白具有與TRAIL的受體DR4或 DR5反應(yīng)的活性，僅可使用編碼TRAIL的核苷酸序列的一部分?？梢詢?yōu)選使用編碼TRAIL的 114?281氨基酸的核苷酸序列。編碼上述TRAIL的核苷酸序列可由本領(lǐng)域技術(shù)人員從基 因庫（GenelD: 8743, Pitti. R.E et al.，J. Biol. Chem. 271:12687, 1996)獲取信息而容易地 制備。
[0032] 本發(fā)明中，分泌信號序列起到能夠使TRAIL蛋白向細(xì)胞外部分泌的引導(dǎo)作用。因 TRAIL蛋白表達(dá)于細(xì)胞表面上，因此其不具有自身的分泌信號序列，已知TRAIL胞外結(jié)構(gòu)域 通過TRAIL蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡信號。本發(fā)明中，使用分泌信號序列以便使十二聚體結(jié)構(gòu)的 TRAIL蛋白向胞外結(jié)構(gòu)域分泌，從而增加抗癌效果，并且可以使編碼該分泌信號序列的核苷 酸序列位于編碼十二聚體形成結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列的5'上游區(qū)。上述分泌信號序列的實(shí) 例可包括但不限于，tPA、HSV、gDs、SEC2、SEC(CV)等，可以優(yōu)選使用tPA(組織纖溶酶原激 活劑）。
[0033] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，使用tPA作為上述分泌信號序列，tPA為具有優(yōu)異的 分泌誘導(dǎo)性的分泌信號序列，且能夠?qū)⒈景l(fā)明的十二聚體TRAIL蛋白向胞外結(jié)構(gòu)域更有效 地分泌出去。
[0034] 本發(fā)明中，十二聚體形成結(jié)構(gòu)域有助于使TRAIL蛋白形成為十二聚體，以便通過 TRAIL蛋白多聚化將其制備成穩(wěn)定形態(tài)，為此，使編碼上述十二聚體形成結(jié)構(gòu)域的核苷酸序 列位于編碼TRAIL蛋白的核苷酸序列的5'上游區(qū)。上述十二聚體形成結(jié)構(gòu)域優(yōu)選為，但不 限于SPD(表面活性蛋白D)。
[0035] 如上所述，編碼本發(fā)明的十二聚體TRAIL的核苷酸序列可由編碼分泌信號序列的 核苷酸序列、編碼十二聚體形成結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列及編碼TRAIL的核苷酸序列組成。本 發(fā)明的一個實(shí)施方案中，將SEQ ID N0. 4的編碼tPA分泌信號序列的核苷酸序列、SEQ ID NO. 5的編碼SH)十二聚體形成結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列，以及SEQ ID NO. 6的編碼TRAIL核苷 酸序列化學(xué)合成，從而制備密碼子優(yōu)化的編碼十二聚體人TRAIL的核苷酸序列，最終制得 SEQ ID NO. 1的tPA-Sro-TRAIL DNA盒。本發(fā)明的編碼十二聚體TRAIL的核苷酸序列可以 優(yōu)選為具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
[0036] 本發(fā)明中，術(shù)語"自殺基因"是能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因，且其優(yōu)選為但不限于 HSV-TK (單純皰疹病毒胸苷激酶）、胞嘧啶脫氨酶、硝基還原酶、羧酸酯酶、細(xì)胞色素 P450或 PNP (嘌呤核苷磷酸化酶），可以更優(yōu)選為HSV-TK。此外，上述HSV-TK可以優(yōu)選為由SEQ ID NO. 2表示的密碼子優(yōu)化的HSV-TK。
[0037] 本發(fā)明的編碼十二聚體TRAIL及HSV-TK蛋白的核苷酸序列可以原原本本地使用 與野生型相同的序列，但可以優(yōu)選使用十二聚體TRAIL及HSV-TK蛋白的基因密碼子優(yōu)化 的序列，以增加哺乳類特別是人細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達(dá)頻率。上述"基因密碼子優(yōu)化的序列"或 本發(fā)明中使用的術(shù)語"密碼子優(yōu)化"是指，用增加哺乳類特別是人細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白表達(dá)水平 的密碼子取代編碼目標(biāo)蛋白（例如，本發(fā)明的十二聚體TRAIL及HSV-TK蛋白等）的氨基 酸密碼子中的一些氨基酸密碼子。這種一些氨基酸密碼子的取代可由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn) 行多種組合并應(yīng)用。本發(fā)明中，可以將編碼十二聚體TRAIL及HSV-TK蛋白的以下密碼子 中的一個或多個取代為在人細(xì)胞內(nèi)被高頻率識別的密碼子：編碼丙氨酸（Ala:A)、精氨酸 (Arg:R)、天冬酰胺（Asn:N)、天冬氨酸（Asp:D)、半胱氨酸（Cys:C)、谷氨酰胺（Gln:Q)、谷氨 酸（Glu:E)、甘氨酸（Gly:G)、甘氨酸（His:H)、異亮氨酸（Ile:I)、亮氨酸（Leu :L)、賴氨酸 (1^8:1〇、苯基丙氨酸（?116:?)、脯氨酸（?1'〇:?)、絲氨酸（561':5)、蘇氨酸（1111':1')、繳氨酸 (Val:V)及酪氨酸（Tyr:Y)的密碼子。
[0038] 本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，對編碼tPA分泌信號序列的核苷酸序列中的1?23號 核苷酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并將優(yōu)化所得的序列表示為SEQ ID N0. 4,所述編碼tPA分泌信號 序列的核苷酸序列組成編碼十二聚體TRAIL的核苷酸序列，并且對編碼十二聚體形成結(jié)構(gòu) 域的sro核苷酸序列中的78號?314號核苷酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化，將優(yōu)化所得的序列表示為 SEQ ID NO. 5,將密碼子優(yōu)化后的編碼TRAIL的核苷酸序列表示為SEQ ID NO. 6。由此，將密 碼子優(yōu)化后的編碼十二聚體TRAIL及HSV-TK的核苷酸序列分別表示為SEQ ID NO. 1和2。 因此，與野生型相比，上述密碼子優(yōu)化后的編碼十二聚體TRAIL及HSV-TK的核苷酸序列能 夠顯示出更高的蛋白表達(dá)水平，因而可以具有優(yōu)異的誘導(dǎo)抗癌基因分泌的能力。
[0039] 本發(fā)明的DNA盒還可在編碼上述十二聚體TRAIL的核苷酸序列及自殺基因核苷酸 序列之間，包含轉(zhuǎn)錄/翻譯起始核苷酸序列。該序列是為了在一個載體上同時表達(dá)兩種基 因的序列，可以優(yōu)選使用IRES序列、9-nt序列或雙元啟動子系統(tǒng)，更優(yōu)選可以使用IRES序 列。
[0040] 本發(fā)明中術(shù)語"IRES(internal ribosome entry site) "也被稱為內(nèi)部核糖體進(jìn) 入位點(diǎn)，是指核糖體直接與其結(jié)合的存在于mRNA內(nèi)部的特定區(qū)域以便能夠在真核細(xì)胞中 由單個mRNA合成多種蛋白，并且起到能夠同時表達(dá)本發(fā)明的十二聚體TRAIL及自殺基因的 作用。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，表示為SEQ ID N0. 3的IRES序列與編碼十二聚體TRAIL 及HSV-TK的核苷酸序列被化學(xué)合成，從而制備dTRAIL-IRES-TK盒（圖1)。
[0041] 在另一個方面，本發(fā)明提供包含上述DNA盒的重組表達(dá)載體。
[0042] 本發(fā)明的載體作為能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的蛋白，即十二聚體TRAIL及自殺基 因蛋白的重組表達(dá)載體，可以包含必要的調(diào)控元件，基因插入物（上述DNA盒）可操作性地 與其連接以使所述基因插入物被表達(dá)。
[0043] 本發(fā)明中術(shù)語"可操作地連接"是指核苷酸表達(dá)控制序列和編碼目的蛋白的核苷 酸序列被功能性連接，以執(zhí)行一般功能?？梢岳帽绢I(lǐng)域公知的基因重組技術(shù)來制備與重 組表達(dá)載體的可操作性連接，可以使用本領(lǐng)域周知的酶來實(shí)施特定位點(diǎn)上的DNA裂解及連 接。載體可包含啟動子、操縱基因、起始密碼子、終止密碼子、多聚腺苷酸化信號及增強(qiáng)子等 表達(dá)調(diào)控元件。起始密碼子及終止密碼子通常被視為編碼靶蛋白的核苷酸序列的一部分， 其為在被給予基因構(gòu)建體的個體中顯現(xiàn)出功能所必需的，并且必須與所述編碼序列在框內(nèi) (in frame)〇
[0044] 本發(fā)明的載體可包括質(zhì)粒載體、粘粒載體、噬菌體載體及病毒載體等，但不限于 此，優(yōu)選病毒載體，更優(yōu)選腺病毒載體。腺病毒載體作為轉(zhuǎn)染各種細(xì)胞的效率優(yōu)異的載體， 是在癌癥患者的基因治療中被最廣泛使用的載體之一。
[0045] 本發(fā)明所使用的重組腺病毒為5型，并且是缺乏復(fù)制所必需的E1A基因的無法自 我復(fù)制的腺病毒。本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，將通過編碼十二聚體TRAIL核苷酸序列、IRES 序列及HSV-TK序列的化學(xué)合成而制備的DNA盒插入腺病毒穿梭載體中，從而制備能夠同時 表達(dá)十二聚體TRAIL及HSV-TK的重組表達(dá)載體。
[0046] 而且，在另一個方面，本發(fā)明提供利用上述重組表達(dá)載體制備的重組腺病毒。
[0047] 上述重組腺病毒可以通過以下方法來制備：將包含本發(fā)明的DNA盒的源自腺病毒 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到包裝細(xì)胞系，培養(yǎng)所述包裝細(xì)胞，從而收獲由包裝細(xì)胞產(chǎn)生的重組 腺病毒。
[0048] 上述重組腺病毒包括含有誘導(dǎo)型啟動子以響應(yīng)特定化合物來調(diào)控表達(dá)的誘導(dǎo)型 腺病毒。上述誘導(dǎo)型啟動子為CMV-Tet 10,其表達(dá)由四環(huán)素誘導(dǎo)。四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)在體內(nèi)最 為廣泛地被使用，不存在令人擔(dān)憂的副作用，并且十分經(jīng)濟(jì)。
[0049] 在又一個方面，本發(fā)明提供被上述重組腺病毒轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的上述宿 主細(xì)胞同時表達(dá)生產(chǎn)十二聚體TRAIL及HSV-TK而能夠殺滅癌細(xì)胞，并且癌治療效果優(yōu)異， 從而能夠用于癌治療用細(xì)胞治療劑。
[0050] 上述宿主細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域公知的宿主細(xì)胞，只要是能夠用于細(xì)胞治療劑的宿 主細(xì)胞，均可使用，可以優(yōu)選使用干細(xì)胞。在上述宿主細(xì)胞為干細(xì)胞的情況下，可以將其用 作癌治療用干細(xì)胞治療劑。
[0051] 本發(fā)明中術(shù)語"干細(xì)胞"是指，能夠分化為許多種類的細(xì)胞并且能夠自我更新的細(xì) 胞，本發(fā)明中優(yōu)選胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞，更優(yōu)選成體干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞，最優(yōu)選具 有腫瘤趨向特性的人間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0052] 由于間充質(zhì)干細(xì)胞的腫瘤趨向特性，同時表達(dá)十二聚體TRAIL及HSV-TK的間充 質(zhì)干細(xì)胞能夠優(yōu)先向腫瘤移動，從而能夠穩(wěn)定地分泌十二聚體TRAIL，并且HSV-TK將前藥 轉(zhuǎn)換為毒性物質(zhì)，并將其傳遞到相鄰的腫瘤細(xì)胞中。特別是，相比單聚體TRAIL，十二聚體 TRAIL作為分泌型更穩(wěn)定，并且具有更高的誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的能力，不僅對于直接將其注射 到癌細(xì)胞中，而且對于細(xì)胞治療劑制備也特別有用。此外發(fā)現(xiàn)，相比僅表達(dá)十二聚體TRAIL 或HSV-TK的間充質(zhì)干細(xì)胞，同時表達(dá)十二聚體TRAIL或HSV-TK的間充質(zhì)干細(xì)胞顯示出協(xié) 同增加的抗癌效果。
[0053] 在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，利用重組腺病毒制備同時表達(dá)十二聚體TRAIL及 HSV-TK的間充質(zhì)干細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)在上述間充質(zhì)干細(xì)胞在體外與癌細(xì)胞共培養(yǎng)的情況下， 癌細(xì)胞的特異性細(xì)胞凋亡顯著增加（圖4)，并且在轉(zhuǎn)移性腎癌小鼠模型中，通過給予改造 的間充質(zhì)干細(xì)胞，也使肺腫瘤結(jié)節(jié)減少（圖5)，并且小鼠的生存時間顯著增加（圖6)。由 上述結(jié)果可知，本發(fā)明的細(xì)胞，特別是干細(xì)胞可以作為用于治療癌的抗癌細(xì)胞治療劑使用。
[0054] 在又一個方面，本發(fā)明提供包含上述宿主細(xì)胞的癌治療用組合物。如上所述，上述 宿主細(xì)胞通過同時表達(dá)十二聚體TRAIL及自殺基因蛋白使抗癌功效協(xié)同增加，從而具有癌 治療效果。
[0055] 除了上述宿主細(xì)胞，能夠同時生產(chǎn)本發(fā)明的十二聚體TRAIL及HSV-TK蛋白的重組 表達(dá)載體、利用該載體制備的重組腺病毒也可以包含于本發(fā)明的癌治療用組合物中作為有 效成分。
[0056] 能夠被本發(fā)明的組合物治療的癌包括普通的所有癌癥，可以包括但不限于能夠由 本發(fā)明的細(xì)胞治療劑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的癌。其實(shí)例可以包括肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺 癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌、腎癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌等周知的所有癌， 也可以包括實(shí)體癌及轉(zhuǎn)移癌，可以優(yōu)選為轉(zhuǎn)移癌。本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，利用由腎癌細(xì) 胞RENCA細(xì)胞構(gòu)建的小鼠模型，確認(rèn)了癌治療功效（圖5?7)。
[0057] 本發(fā)明的組合物包含藥物上可接受的載體，且可以被制備成片劑、錠劑、膠囊、酏 齊U、懸液、糖漿劑、薄片、注射劑等多種劑型。藥物上可接受的載體包括任意類型的所有溶 齊?、分散介質(zhì)、涂膜劑、抗細(xì)菌劑或抗真菌劑、等滲劑和吸收阻礙劑等。有效地用于具有藥學(xué) 活性的成分中的這些介質(zhì)及材料是公知的。
[0058] 上述組合物可根據(jù)目的制備成適宜的藥物組合物形態(tài)。
[0059] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，提供了表達(dá)本發(fā)明的上述十二聚體TRAIL及HSV-TK 蛋白的載體、利用上述載體制備的腺病毒或干細(xì)胞作為癌治療用組合物。上述治療組合物 可以注射到包括人的其它哺乳類。
[0060] 在具體實(shí)施方案中，包含本發(fā)明的十二聚體TRAIL和HSV-TK蛋白的組合物可以口 服給藥或經(jīng)肌肉內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、動脈內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、皮下及皮內(nèi)注射等非口服 給藥。優(yōu)選的給藥方式及制劑為靜脈內(nèi)注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑、肌內(nèi)注射劑、點(diǎn)滴 注射劑、瘤內(nèi)注射劑等。上述組合物可以單次劑量給藥或多次劑量給藥。特別是，本發(fā)明的 組合物可與GCV (更昔洛韋）一起給藥或在給予GCV后給藥。
[0061] 此外，上述組合物必須以藥學(xué)有效量給藥。藥學(xué)有效量可根據(jù)給藥方式及頻率、癌 的種類及嚴(yán)重程度、患者的年齡及性別、患者的狀態(tài)及其它醫(yī)學(xué)領(lǐng)域周知的因素來決定。上 述組合物可以單次或多次劑量給藥。
[0062] 此外，在又一個方面，本發(fā)明提供包括向疑似患有癌癥的個體給予上述癌治療用 組合物的步驟的癌治療方法。所述癌及癌治療用組合物與上文描述的相同，并且所述癌治 療用組合物通過同時表達(dá)十二聚體TRAIL及自殺基因蛋白使抗癌功效協(xié)同增加，從而能夠 具有癌治療效果，由此通過將其給予至個體中能夠用于癌治療。
[0063] 向疑似患有癌癥的個體給予的癌治療用組合物不僅可以包含上述說明的宿主細(xì) 胞，也可以包含能夠同時表達(dá)本發(fā)明的十二聚體TRAIL及HSV-TK蛋白的重組表達(dá)載體和利 用上述載體制備的重組腺病毒作為有效成分。
[0064] 本發(fā)明中術(shù)語"個體"是指，具有通過給予本發(fā)明的癌治療用藥物組合物能夠使癥 狀得到改善的癌癥的人和馬、羊、豬、山羊、駱駝、羚羊、狗等動物。通過向個體給予上述癌治 療用組合物，能夠有效地預(yù)防和治療癌。
[0065] 本發(fā)明的術(shù)語"給予/給藥"是指，通過某種適宜的方法向個體引入預(yù)定的物質(zhì)， 本發(fā)明的癌治療用組合物的給藥路徑如上所述，只要能夠到達(dá)目的組織，即可通過任何普 通的路徑，經(jīng)口或非經(jīng)口給藥。此外，本發(fā)明的癌治療用組合物可以通過能將活性成分向靶 細(xì)胞輸送的任意器械來給藥。
[0066] 本發(fā)明的癌治療方法還可以包括給予更昔洛韋（GCV)的步驟。上述GCV可以與癌 治療用組合物一起給藥或在給予上述癌治療用組合物之前或之后給藥。在本發(fā)明的一個實(shí) 施方案中，在給予本發(fā)明的干細(xì)胞治療劑之后，給予GCV，從而評價了癌細(xì)胞殺滅及癌治療 功效。

【具體實(shí)施方式】
[0067] 以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明更加詳細(xì)地說明。本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】的技術(shù)人員應(yīng) 明確，這些實(shí)施例只是為了更加詳細(xì)地說明本發(fā)明，根據(jù)本發(fā)明的要旨，本發(fā)明的范圍不受 限于這些實(shí)施例。
[0068]實(shí)施例 1 :tPA-SPD-TRAIL DNA 盒（dTRAIL)的構(gòu)建
[0069] 將密碼子優(yōu)化后的tPA分泌信號序列和密碼子優(yōu)化后的sro十二聚體形成序列以 連接形式進(jìn)行化學(xué)合成，所述tPA分泌信號序列具有SEQ ID N0. 4的核苷酸序列，所述SPD 十二聚體形成序列具有SEQ ID N0. 5的核苷酸序列。在其末端添加 ΚρηΙ (5'）和Notl (3'） 位點(diǎn)，以使其有效地插入載體中。將tPA-SH)信號序列插入被ΚρηΙ和Notl酶切的作為誘導(dǎo) 型腺病毒穿梭載體的pShuttle-TetlO載體中，以構(gòu)建pShuttle-TetlO/tPA-Sro載體。作為 誘導(dǎo)型腺病毒穿梭載體的pShuttle-TetlO具有作為誘導(dǎo)型啟動子的CMV-TetlO。接著，化 學(xué)合成具有SEQ ID NO. 6的核苷酸序列的密碼子優(yōu)化后的人TRAIL(114-281)。同樣，在其 末端添加了 Notl (5'）和Xbal (3'）位點(diǎn)，以便其有效地插入載體中。之后，將其插入被Notl 和 Xbal 酶切的 pShuttle-TetlO/tPA-SPD 載體中，以構(gòu)建pShuttle-TetlO/tPA-SPD-TRAIL， 從而制備 tPA-SPD-TRAIL DNA 盒（SEQ ID NO. 1)。
[0070]實(shí)施例 2 :dTRAIL-IRES-TK 盒的構(gòu)建
[0071] 分別化學(xué)合成具有上述實(shí)施例1中制備的SEQ ID NO. 1的核苷酸序列并且密碼子 優(yōu)化后的十二聚體人TRAIL序列、具有SEQ ID N0. 2的核苷酸序列的IRES序列及具有SEQ ID N0. 3的核苷酸序列并且密碼子優(yōu)化后的HSV-TK序列，從而構(gòu)建DNA盒（圖1)。所構(gòu)建的 DNA盒被插入作為腺病毒穿梭載體的pShuttle載體中，以構(gòu)建pShuttle/dTRAIL-IRES-TK 載體。用Pmel酶切pShuttle/dTRAIL-IRES-TK后，在BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中的無法自我復(fù)制 的pAd/Easy載體中實(shí)施同源重組。之后，利用卡那霉素抗生素來篩選含有dTRAIL-IRES-TK 盒的pAd/dTRAIL-IRES-TK。為了精確的確認(rèn)，用PacI將其酶切，確認(rèn)35+4. 5kb的DNA 帶。然后，將pAd/dTRAIL-IRES-TK轉(zhuǎn)化到作為包裝細(xì)胞的293細(xì)胞系中，10天后獲得表達(dá) dTRAIL-IRES-TK 盒的重組腺病毒 rAd/dTRAIL-IRES-TK。
[0072] 實(shí)施例 3 :MSC/dTRAIL-TK 的 TRAIL 及 HSV-TK 表達(dá)檢測
[0073] 利用上述實(shí)施例2中制備的rAd/dTRAIL-IRES-TK及鐵離子對骨髓衍生的鼠間 充質(zhì)干細(xì)胞（rBM-MSC)轉(zhuǎn)導(dǎo)30分鐘，以制備同時表達(dá)上述dTRAIL和HSV-TK的間充質(zhì)干 細(xì)胞（MSC)MSC/dTRAIL-TK。轉(zhuǎn)導(dǎo)24小時后，通過蛋白質(zhì)印跡法并利用細(xì)胞溶解產(chǎn)物檢測 人TRAIL的表達(dá)，并通過RT-PCR法檢測HSV-TK的表達(dá)（圖2)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，制得的MSC/ dTRAIL-TK 同時表達(dá)出 TRAIL 及 HSV-TK。
[0074] 實(shí)施例4 :GCV (更昔洛韋）處理對MSC/dTRAIL-TK的細(xì)胞存活率及TRAIL表達(dá)率 的影響
[0075] 用10、30、100 μ Μ的GCV對細(xì)胞進(jìn)行處理，以檢測經(jīng)GCV (更昔洛韋）處理的MSC/ dTRAIL-TK的自殺誘導(dǎo)效果。從GCV處理1天之后起，每隔一天用MTS方法檢測MSC/ dTRAIL-TK的細(xì)胞存活率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用100 μ Μ的GCV處理后經(jīng)過一周，幾乎所有細(xì)胞被清 除（圖3)。
[0076] 接著，為了檢測由如上所述被誘導(dǎo)的MSC/dTRAIL-TK細(xì)胞凋亡導(dǎo)致TRAIL的表達(dá) 減少程度，經(jīng)過上述濃度的GCV處理后，每隔24小時收集培養(yǎng)液，并通過ELISA (酶聯(lián)免疫 吸附分析）來檢測TRAIL的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著經(jīng)GCV/TK處理的改造的MSC細(xì)胞的凋亡， TRAIL的表達(dá)減少（圖3)。
[0077] 實(shí)施例5 :檢測體外dTRAIL及HSV-TK的共表達(dá)導(dǎo)致的顯著增加的癌細(xì)胞死亡
[0078] 為了在體外檢測同時表達(dá)十二聚體TRAIL及HSV-TK的MSC在癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡 中是否具有復(fù)合效應(yīng)（協(xié)同效應(yīng)），將癌細(xì)胞和MSC/dTRAIL-TK共培養(yǎng)，從而分析發(fā)生細(xì)胞 凋亡的細(xì)胞和死亡細(xì)胞。此時，為了比較，將未表達(dá)任何物質(zhì)的MSC/模擬（Mock)、只表達(dá) HSV-TK的MSC/TK及只表達(dá)dTRAIL的MSC/dTRAIL共培養(yǎng)作為對照組。為了檢測癌細(xì)胞特 異性細(xì)胞凋亡，用CFSE (羧基熒光素琥珀酰亞胺酯）標(biāo)記腎癌細(xì)胞RENCA細(xì)胞并與上述MSC 共培養(yǎng)48小時后，用100 μ M GCV進(jìn)行處理。將細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)48小時或72小時后，收集 所有細(xì)胞，再進(jìn)行Annexin-V和7-AAD染色，用FACS (熒光激活細(xì)胞分選器）測定細(xì)胞凋亡。 結(jié)果，相比與MSC/dTRAIL或MSC/TK共培養(yǎng)的細(xì)胞，在與MSC/dTRAIL-TK共培養(yǎng)的RENCA細(xì) 胞中觀察到顯著增加的癌細(xì)胞死亡，特別是確認(rèn)了在GCV處理72小時后90%以上的癌細(xì)胞 被清除（圖4)。通過這種體外直接共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由本發(fā)明的MSC/dTRAIL-TK同時表達(dá) 十二聚體TRAIL和HSV-TK的情況下，可以確認(rèn)顯現(xiàn)出癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的協(xié)同效應(yīng)。
[0079] 實(shí)施例6 :小鼠轉(zhuǎn)移癌模型中MSC/dTRAIL-TK的癌治療功效評估
[0080] 為了 RENCA轉(zhuǎn)移癌小鼠模型中評估在體外被證實(shí)的MSC/dTRAIL-TK的抗癌效果， 給小鼠靜脈注射5 X 105的RENCA細(xì)胞，7天后靜脈注射相同個數(shù)的MSC/dTRAIL-TK。此時， 為了比較，使用MSC/EGFP、MSC/dTRAIL、MSC/TK作為對照組。注射2天后，連續(xù)7天每天腹 腔注射50mg/kg GCV，在注射腫瘤第14天后，觀察轉(zhuǎn)移至肺的腫瘤結(jié)節(jié)（nodule)的數(shù)目。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與MSC/TK及MSC/dTRAIL處理組相比，在MSC/dTRAIL-TK處理組中減少了 35 % 左右的肺腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目（圖5)。此外，連續(xù)地觀察轉(zhuǎn)移癌小鼠的存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MSC/ dTRAIL-TK處理的轉(zhuǎn)移癌小鼠的存活時間延長至80天（圖6)。通過上述結(jié)果表明，本發(fā)明 的MSC/dTRAIL-TK在體內(nèi)動物模型實(shí)驗(yàn)中也顯現(xiàn)出優(yōu)異的抗癌效果。
[0081] 實(shí)施例7 :通過反復(fù)給予MSC/dTRAIL-TK誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)移癌的100 %治愈率
[0082] 為了檢測通過反復(fù)給藥是否能夠提高M(jìn)SC/dTRAIL-TK的轉(zhuǎn)移癌治療功效，在與上 述實(shí)施例6中相同的小鼠轉(zhuǎn)移癌模型中，在注射腫瘤后第7天給予MSC/dTRAIL-TK，每隔2 周給藥2次或3次。觀察轉(zhuǎn)移癌小鼠的存活率，結(jié)果，在給藥1次的情況下，90天之前所有 轉(zhuǎn)移癌小鼠出現(xiàn)死亡，相反，在給藥2次的組中，70%的轉(zhuǎn)移癌小鼠被治愈（圖7)。此外，當(dāng) 給予MSC/dTRAIL-TK 3次時，100%的轉(zhuǎn)移癌小鼠被治愈。應(yīng)當(dāng)指出，轉(zhuǎn)移癌的治愈不僅通 過現(xiàn)有的化療、放射線療法難以實(shí)現(xiàn)，而且也沒有報(bào)道過僅利用現(xiàn)有基于干細(xì)胞的基因治 療獲得100%的轉(zhuǎn)移癌治愈率的結(jié)果。因此，本發(fā)明提供了非常優(yōu)異及顯著的結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1. DNA盒，其包含編碼十二聚體TRAIL(TNF相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體）的核苷酸序列及自殺 基因核昔酸序列。
2. 如權(quán)利要求1所述的DNA盒，其中在編碼所述十二聚體TRAIL的核苷酸序列及自殺 基因核苷酸序列之間還包含轉(zhuǎn)錄/翻譯起始核苷酸序列。
3. 如權(quán)利要求2所述的DNA盒，其中所述轉(zhuǎn)錄/翻譯起始核苷酸序列為IRES (內(nèi)部核 糖體進(jìn)入位點(diǎn)）核苷酸序列。
4. 如權(quán)利要求1所述的DNA盒，其中編碼所述十二聚體TRAIL的核苷酸序列包含編碼 分泌信號序列的核苷酸序列、編碼十二聚體形成結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列以及編碼TRAIL的核 苷酸序列。
5. 如權(quán)利要求4所述的DNA盒，其中所述分泌信號序列為tPA (組織纖溶酶原激活劑）。
6. 如權(quán)利要求4所述的DNA盒，其中所述十二聚體形成結(jié)構(gòu)域?yàn)镾PD (表面活性蛋白 D)。
7. 如權(quán)利要求4所述的DNA盒，其中所述TRAIL為與TRAIL氨基酸全序列中的114? 281位氨基酸殘基對應(yīng)的胞外結(jié)構(gòu)域。
8. 如權(quán)利要求1所述的DNA盒，其中所述自殺基因?yàn)镠SV-TK(單純皰疹病毒胸苷激 酶）。
9. 如權(quán)利要求1所述的DNA盒，其中編碼所述十二聚體TRAIL的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 1的核苷酸序列。
10. 如權(quán)利要求8所述的DNA盒，其中編碼所述HSV-TK的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 2 的核苷酸序列。
11. 如權(quán)利要求3所述的DNA盒，其中所述IRES核苷酸序列具有SEQ ID NO. 3的核苷 酸序列。
12. 重組體表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1?11中任一項(xiàng)所述的DNA盒。
13. 如權(quán)利要求12所述的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體源自腺病毒。
14. 重組腺病毒，其利用權(quán)利要求13的重組表達(dá)載體制得。
15. 宿主細(xì)胞，其用權(quán)利要求14的重組腺病毒轉(zhuǎn)染。
16. 如權(quán)利要求15所述的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞為干細(xì)胞。
17. 癌治療用組合物，其包含權(quán)利要求15的宿主細(xì)胞。
18. 癌治療方法，其包括向疑似患有癌癥的個體給予權(quán)利要求17的癌治療用組合物的 步驟。
19. 如權(quán)利要求18所述的癌治療方法，其還包括給予更昔洛韋（GCV)的步驟。
【文檔編號】C12N15/861GK104160027SQ201380012507
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月1日
【發(fā)明者】成永喆, 金世原, 金秀珍, 樸常勛 申請人:浦項(xiàng)工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán), 株式會社拜德