共同輕鏈小鼠的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠表達特征為有限的輕鏈可變區(qū)的免疫球蛋白輕鏈群。本發(fā)明提供小鼠，其從它們生殖系中有限群表達只有一個或幾個免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明提供在小鼠中制備輕鏈可變區(qū)的方法，包括人輕鏈可變區(qū)。本發(fā)明提供制備適用于多特異性結合蛋白(例如雙特異性抗體)的人可變區(qū)的方法。
【專利說明】共同輕鏈小鼠

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明提供一種遺傳修飾小鼠，其表達具有與不同的人可變/小鼠恒定重鏈締合 的共同人可變/小鼠恒定輕鏈的抗體。本發(fā)明提供一種從小鼠的B細胞的人可變區(qū)基因序 列制備人雙特異性抗體的方法。

【背景技術】
[0002] 抗體通常包括同源二聚化重鏈組分，其中每條重鏈單體與相同的輕鏈相締合。期 望具有異源二聚化組分的抗體（例如，雙特異性抗體）作為治療性抗體。但制備具有可以 令人滿意地與雙特異性抗體的每條重鏈締合的合適輕鏈組分已被證明是存在問題的。
[0003] 在一個方法中，輕鏈可以通過調查所有輕鏈可變區(qū)使用的統(tǒng)計數據、鑒定人抗體 中最常用的輕鏈并在體外將輕鏈與具有不同特異性的兩條重鏈配對來選擇。
[0004] 在另一個方法中，輕鏈可以通過觀察噬菌體展示文庫（例如包括人輕鏈可變區(qū)序 列的噬菌體展示文庫，例如，人SCFv文庫）中的輕鏈序列并從所述文庫中選擇最常用的輕 鏈可變區(qū)來選擇。然后，所述輕鏈可以在所感興趣的兩條不同重鏈上測試。
[0005] 在另一個方法中，輕鏈可以通過采用感興趣的兩條重鏈的重鏈可變序列作為探針 分析輕鏈可變序列的噬菌體展示文庫來選擇。與兩條重鏈可變序列均相締合的輕鏈可以選 作所述重鏈的輕鏈。
[0006] 在另一個方法中，候選輕鏈可以與重鏈的關聯（cognate)輕鏈比對，并且對輕鏈 作出修飾以更加接近地匹配兩條重鏈的關聯輕鏈通用的序列特征。如果需要將免疫原性的 機率最小化，所述修飾優(yōu)選得到已知存在于人輕鏈序列中的序列，使得基于本領域已知用 于評估免疫原性的可能性的參數和方法蛋白水解處理不太可能產生T細胞表位（即，計算 機分析以及濕法分析（wet assays))。
[0007] 上述所有方法依賴于包含許多先驗限制的體外方法，所述先驗限制例如，序列同 一性、與特定預先選擇的重鏈相締合的能力，等等。本領域需要不依賴于操作體外條件而是 采用更加生物學上可行的方法來制備包括共同輕鏈的人表位結合蛋白的組合物和方法。
[0008] 發(fā)明概述
[0009] 本發(fā)明提供表達人免疫球蛋白重鏈和輕鏈可變區(qū)的遺傳修飾小鼠，其中所述小鼠 具有有限的輕鏈可變群（repertoire)。本發(fā)明提供一種產生人輕鏈可變區(qū)的生物系統(tǒng)，所 述人輕鏈可變區(qū)與不同群的親和力成熟的人重鏈可變區(qū)締合并與其一起表達。本發(fā)明提供 制備包括免疫球蛋白可變區(qū)的結合蛋白的方法，包括用感興趣的抗原免疫具有有限的免疫 球蛋白輕鏈群的小鼠，以及將小鼠的免疫球蛋白可變區(qū)基因序列應用于特異性結合感興趣 的抗原的結合蛋白中。方法包括用于制備適用于制備多特異性抗原結合蛋白的人免疫球蛋 白重鏈可變區(qū)的方法。
[0010] 本發(fā)明提供遺傳工程小鼠，其選擇源自一群未重排的人重鏈可變區(qū)基因片段的合 適的親和力成熟的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)，其中所述親和力成熟的人免疫球蛋白重鏈 可變區(qū)締合源自一種人輕鏈可變區(qū)基因片段的單一人輕鏈可變區(qū)（single human light chain variable domain)并與其一起表達。本發(fā)明還提供遺傳工程小鼠，其提出了兩種人 輕鏈可變區(qū)基因片段的選擇。
[0011] 本發(fā)明提供遺傳工程小鼠，其從有限群的人輕鏈可變區(qū)基因片段表達有限群的人 輕鏈可變區(qū)，或單一人輕鏈可變區(qū)。所述小鼠遺傳工程化以包括單一未重排的人輕鏈可變 區(qū)基因片段（或兩種人輕鏈可變區(qū)基因片段），其表達單一輕鏈（或表達兩種輕鏈之一或二 者）的重排以形成重排的人輕鏈可變區(qū)基因（或兩種重排輕鏈可變區(qū)基因）。所述重排的 人輕鏈可變區(qū)能夠與由所述小鼠所選出的大量親和力成熟的人重鏈配對，其中所述重鏈可 變區(qū)特異性結合不同表位。
[0012] 本發(fā)明提供遺傳工程小鼠，其從有限群的人輕鏈可變區(qū)序列表達有限群的人輕鏈 可變區(qū)，或單一人輕鏈可變區(qū)。所述小鼠遺傳工程化以包括單一的VJ人輕鏈序列（或兩 條V/J序列），其表達單一輕鏈可變區(qū)（或其表達兩種可變區(qū)之一或二者）。包括所述可變 序列的輕鏈能夠與由所述小鼠所克隆選出的大量親和力成熟的人重鏈配對，其中所述重鏈 可變區(qū)特異性結合不同表位。
[0013] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其包括能夠與人J基因片段（從一 個或大量1片段選擇）重排并編碼免疫球蛋白輕鏈的人 '區(qū)的單一人免疫球蛋白輕鏈可 變（')區(qū)基因片段。在另一個方面，所述小鼠包括不多于兩種人'基因片段，其每一個能 夠與人J基因片段（從一個或大量1片段選擇）重排并編碼免疫球蛋白輕鏈的人'區(qū)。
[0014] 在一個實施方案中，所述單一人 '基因片段可操作性連接選自Jk1、JK2、Jk3、 J K 4和J κ 5的人叉片段，其中所述單一人 '基因片段能夠與所述一種或多種人叉片段的 任何一個重排以形成編碼輕鏈可變區(qū)基因的序列。
[0015] 在一個實施方案中，所述遺傳修飾的小鼠包括免疫球蛋白輕鏈基因座（locus)，其 不包括能夠重排以形成免疫球蛋白輕鏈基因的內源性小鼠'基因，其中所述'基因座包括 能夠重排以編碼輕鏈基因的'區(qū)的單一人'基因片段。在一個具體的實施方案中，所述人 '基因片段是人Vk 1-39J κ 5基因片段或人Vk 3-20J κ 1基因片段。在一個實施方案中， 所述遺傳修飾的小鼠包括'基因座，其不包括能夠重排以形成免疫球蛋白輕鏈基因的內源 性小鼠'基因，其中所述\基因座包括能夠重排以編碼輕鏈基因的'區(qū)的不多于兩種人 '基因片段。在一個具體的實施方案中，所述不多于兩種人'基因片段是人V κ 1-39J κ 5 基因片段和人Vk 3-20J κ 1基因片段。
[0016] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其包括編碼人免疫球蛋白輕鏈的 '區(qū)的單一重排（V/J)人免疫球蛋白輕鏈可變（')區(qū)（即'/叉區(qū)）。在另一個方面，所述 小鼠包括能夠編碼人免疫球蛋白輕鏈的 '區(qū)的不多于兩種重排的人 '區(qū)。
[0017] 在一個實施方案中，所述八區(qū)是重排的人VK 1-39/J序列或重排的人VK3-20/J 序列。在一個實施方案中，所述重排的人Vl序列的叉片段選自Jk1、Jk2、Jk3、Jk4 和Jk 5。在一個具體的實施方案中，所述'區(qū)是人Vk 1-39JK 5序列或人Vk 3-20Jk 1序 列。在一個具體的實施方案中，所述小鼠具有人V κ 1-39J κ 5序列和人V κ 3-20J κ 1序列。
[0018] 在一個實施方案中，所述人 '基因片段可操作性連接人或小鼠前導序列。在一個 實施方案中，所述前導序列是小鼠前導序列。在一個具體的實施方案中，所述小鼠前導序列 是小鼠 V K 3-7前導序列。在一個具體的實施方案中，所述前導序列可操作性連接未重排的 人 '基因片段。在一個具體的實施方案中，所述前導序列可操作性連接重排的人/叉序 列。
[0019] 在一個實施方案中，所述 '基因片段可操作性連接免疫球蛋白啟動子序列。在一 個實施方案中，所述啟動子序列是人啟動子序列。在一個具體的實施方案中，所述人啟動子 序列是人VK 3-15啟動子。在一個具體的實施方案中，所述啟動子可操作性連接未重排的 人\基因片段。在一個具體的實施方案中，所述啟動子可操作性連接重排的人'/1序列。
[0020] 在一個實施方案中，所述輕鏈基因座包括5'側接（相對于'基因片段的轉錄方 向）人免疫球蛋白啟動子并3'側接人\基因片段的前導序列，所述人' 基因片段與人J 片段重排并編碼包括內源性小鼠輕鏈恒定區(qū)（CJ的反向嵌合輕鏈的'區(qū)。在一個具體的 實施方案中，所述'基因片段位于小鼠 Vk基因座，并且所述小鼠 Q是小鼠 Ck。
[0021] 在一個實施方案中，所述輕鏈基因座包括5'側接（相對于'基因片段的轉錄方 向）人免疫球蛋白啟動子并3'側接重排的人'區(qū)序列）的前導序列，并且所述重 排的人八區(qū)編碼包括內源性小鼠輕鏈恒定區(qū)（CJ的反向嵌合輕鏈的八區(qū)。在一個具體的 實施方案中，所述重排的人八/叉序列位于小鼠 κ基因座，并且所述小鼠 Q是小鼠 Ck。
[0022] 在一個實施方案中，所述修飾的小鼠的'基因座是κ輕鏈基因座，并且所述K輕 鏈基因座包括小鼠 κ內含增強子、小鼠 Κ 3'增強子或內含增強子和3'增強子。
[0023] 在一個實施方案中，所述小鼠包括非功能性免疫球蛋白λ輕鏈基因座。在一個具 體的實施方案中，所述λ輕鏈基因座包括所述基因座的一個或多個序列的缺失，其中所述 一個或多個缺失使得所述λ輕鏈基因座不能重排以形成輕鏈基因。在另一個實施方案中， 所述λ輕鏈基因座的所有或基本上所有的\基因片段是被缺失的。
[0024] 在一個實施方案中，小鼠制備包括源自人'基因片段的體細胞突變的'區(qū)。在一 個實施方案中，所述包括輕鏈源自人'基因片段和Ck區(qū)的小鼠的體細胞突變的'區(qū)。在 一個實施方案中，所述小鼠不表達λ輕鏈。
[0025] 在一個實施方案中，所述遺傳修飾的小鼠能夠體細胞超變人'區(qū)序列。在一個具 體的實施方案中，所述小鼠包括細胞，所述細胞包括源自能夠重排并編碼' 區(qū)的人 '基因 片段的重排的免疫球蛋白輕鏈基因，并且所述重排的免疫球蛋白輕鏈基因包括體細胞突變 的八區(qū)。
[0026] 在一個實施方案中，所述小鼠包括細胞,所述細胞表達包括連接小鼠 Ck的體細 胞突變的人 '區(qū)的輕鏈，其中所述輕鏈與包括源自人Vh基因片段的體細胞突變的Vh區(qū)的 重鏈相締合，并且其中所述重鏈包括小鼠重鏈恒定區(qū)（C h)。在一個具體的實施方案中，所述 重鏈包括小鼠 CH1、小鼠鉸鏈區(qū)、小鼠 CH2和小鼠 CH3。在一個具體的實施方案中，所述重鏈 包括人ChU鉸鏈區(qū)、小鼠 Ch2和小鼠 Ch3。
[0027] 在一個實施方案中，所述小鼠包括用一個或多個人Vh基因片段替換內源性小鼠 Vh 基因片段，其中所述人Vh基因片段可操作性連接小鼠 Ch區(qū)基因，使得所述小鼠重排所述人 Vh基因片段并表達包括AVh區(qū)和小鼠 Ch的反向嵌合免疫球蛋白重鏈。在一個實施方案中， 90-100%的未重排的小鼠 Vh基因片段由至少一個未重排的人Vh基因片段替換。在一個具體 的實施方案中，所有或基本上所有的內源性小鼠 Vh基因片段由至少一個未重排的人Vh基因 片段替換。在一個實施方案中，所述替換是用至少19、至少39、或至少80或81個未重排的 人V h基因片段。在一個實施方案中，所述替換是用至少12個功能性未重排的人Vh基因片 段、至少25個功能性未重排的人V h基因片段或至少43個功能性未重排的人Vh基因片段。 在一個實施方案中，所述小鼠包括用至少一個未重排的人Dh片段和至少一個未重排的人Jh 片段替換所有小鼠 Dh片段和Jh片段。在一個實施方案中，所述至少一個未重排的人Dh片 段選自 1-1、Dl-7、l-26、2-8、2-15、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13、7-27 及其組 合。在一個實施方案中，所述至少一個未重排的人Jh片段選自1、2、3、4、5、6及其組合。在 一個具體的實施方案中，所述一個或多個人V h基因片段選自1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、 3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1 人 Vh 基因片段及其組合。
[0028] 在一個實施方案中，所述小鼠包括表達特異性結合感興趣的抗原的結合蛋白的B 細胞，其中所述結合蛋白包括源自人Vk I-39/Jk 5重排或人Vk 3-20/Jk 1重排的輕鏈，并 且其中所述細胞包括源自人Vh基因片段的重排的重排的免疫球蛋白重鏈基因，所述基因片 段選自 1-69、2-5、3-13、3-23、3-30、3-33、3-53、4-39、4-59 和 5-51 基因片段。在一個實施 方案中，所述一個或多個人％基因片段與選自1、2、3、4、5、6的人重鏈義基因片段重排。在 一個實施方案中，所述一個或多個人％和1基因片段與選自1-1、1-7、1-26、2-8、2-15、3-3、 3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13和7-27的人011基因片段重排。在一個具體的實施方 案中，所述輕鏈基因具有1、2、3、4或5或多個體細胞超變。
[0029] 在一個實施方案中，所述小鼠包括B細胞,所述B細胞包括重排的免疫球蛋白 重鏈可變區(qū)基因序列，其包括選自 2-5/6-6/1、2-5/3-22/1、3-13/6-6/5、3-23/2-8/4、 3-23/3-3/4,3-23/3-10/4,3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4,3-30/1-7/4, 3-30/3-3/3、3-30/3-3/4、3-30/3-22/5、3-30/5-5/2、3-30/5-12/4、3-30/6-6/1、 3-30/6-6/3、3-30/6-6/4、3-30/6-6/5、3-30/6-13/4、3-30/7-27/4、3-30/7-27/5、 3- 30/7-27/6,3-33/1-7/4,3-33/2-15/4,4-39/1-26/3,4-59/3-16/3,4-59/3-16/4, 4- 59/3-22/3、5-51/3-16/6、5-51/5-5/3、5-51/6-13/5、3-53/1-1/4、1-69/6-6/5 和 1-69/6-13/4的VH/DH/Jh區(qū)。在一個具體的實施方案中，所述B細胞表達包括人免疫球蛋白 重鏈可變區(qū)融合小鼠重鏈恒定區(qū)以及人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)融合小鼠輕鏈恒定區(qū)的結 合蛋白。
[0030] 在一個實施方案中，所述重排的人八區(qū)是人Vk 1-39J κ 5序列，并且所述小鼠表 達包括⑴源自人Vl序列的八結構域和（ii)小鼠 Q的反向嵌合輕鏈；其中所述輕鏈與 包括（i)小鼠 C1^P (ii)體細胞突變的Avh結構域的反向嵌合重鏈相關，所述體細胞突變 的人Vh結構域源自人V h基因片段，其選自1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、 3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1 人 Vh 基因片段及其組 合。在一個實施方案中，所述小鼠表達體細胞突變的輕鏈。在一個實施方案中，所述Q是 小鼠 Ck。在一個具體的實施方案中，所述人％基因片段選自2-5、3-13、3-23、3-30、4-59、 5- 51和1-69基因片段。在一個具體的實施方案中，所述體細胞突變的人Vh結構域包括源 自選自 1-1、1-7、2-8、3-3、3-10、3-16、3-22、5-5、5-12、6-6、6-13 和 7-27 的 Dh 片段的序列。 在一個具體的實施方案中，所述體細胞突變的人Vh結構域包括源自選自1、2、3、4、5或6的 Jh片段的序列。在一個具體的實施方案中，所述體細胞突變的人Vh結構域由重排的人Vh/D h/ Jh 序列編碼，所述序列選自 2-5/6-6/1、2-5/3-22/1、3-13/6-6/5、3-23/2-8/4、3-23/3-3/4、 3-23/3-10/4,3-23/6-6/4,3-23/7-27/4,3-30/1-1/4,3-30/1-7/4,3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5、3-30/5-5/2、3-30/5-12/4、3-30/6-6/1、3-30/6-6/3、3-30/6-6/4、 3- 30/6-6/5、3-30/6-13/4、3-30/7-27/4、3-30/7-27/5、3-30/7-27/6、4-59/3-16/3、 4- 59/3-16/4、4-59/3-22/3、5-51/5-5/3、1-69/6-6/5 和 1-69/6-13/4。
[0031] 在一個實施方案中，所述重排的人' 區(qū)是人V K 3-20J K 1序列，并且所述小鼠表 達包括⑴源自重排的人Vi序列的八結構域和（ii)小鼠 Q的反向嵌合輕鏈；其中所 述輕鏈與包括（i)小鼠 Ch和（ii)體細胞突變的Avh結構域的反向嵌合重鏈相關,所述 體細胞突變的人％結構域源自人￥ 11基因片段，其選自1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、 3- 11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1 人 Vh 基因 片段及其組合。在一個實施方案中，所述小鼠表達體細胞突變的輕鏈。在一個實施方案中， 所述Q是小鼠 Ck。在一個具體的實施方案中，所述人％基因片段選自3-30、3-33、3-53、 4- 39和5-51基因片段。在一個具體的實施方案中，所述體細胞突變的AVh結構域包括 源自選自1-1、1-7、1_26、2-15、3-3、3-16和6-13的0 11片段的序列。在一個具體的實施方 案中，所述體細胞突變的人Vh結構域包括源自選自3、4、5或6的J h片段的序列。在一個 具體的實施方案中，所述體細胞突變的人Vh結構域由重排的人VH/D H/Jh序列編碼，所述序 列選自 3-30/1-1/4、3-30/3-3/3、3-33/1-7/4、3-33/2-15/4、4-39/1-26/3、5-51/3-16/6、 5- 51/6-13/5 和 3-53/1-1/4。
[0032] 在一個實施方案中，所述小鼠包括重排的人Vk 1-39JK 5序列和重排的人 V κ 3-20J κ 1序列，并且所述小鼠表達包括（i)源自人V κ 1-39J κ 5序列或人V κ 3-20J κ 1 序列的'結構域和（ii)小鼠 Q的反向嵌合輕鏈；其中所述輕鏈與包括（i)小鼠 C1^P (ii) 體細胞突變的人Vh結構域的反向嵌合重鏈相關，所述體細胞突變的人Vh結構域源自人V h 基因片段，其選自 1-2、1-8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、 3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1 AVh基因片段及其組合。在一個實施方案中， 所述小鼠表達體細胞突變的輕鏈。在一個實施方案中所述Q是小鼠 C κ。
[0033] 在一個實施方案中，90-100%的內源性未重排的小鼠 Vh基因片段由至少一個未重 排的人Vh基因片段替換。在一個具體的實施方案中，所有或基本上所有的內源性未重排的 小鼠 Vh基因片段由至少一個未重排的人Vh基因片段替換。在一個實施方案中，所述替換是 用至少18、至少39、或至少80或81個未重排的人V h基因片段替換。在一個實施方案中， 所述替換是用至少12個功能性未重排的人Vh基因片段、至少25個功能性未重排的人V h基 因片段或至少43個功能性未重排的人Vh基因片段替換。
[0034] 在一個實施方案中，所述遺傳修飾的小鼠是C57BL品系，在一個具體的實施方案 中選自 C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、 C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr 和 C57BL/01a。在一個具體的實施方案 中，所述遺傳修飾的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合。在另一個實施方案 中，所述小鼠是前述129株的混合，或前述BL/6品系的混合。在一個具體實施方案中，所述 混合的所述129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。
[0035] 在一個實施方案中，所述小鼠表達反向嵌合抗體，所述抗體包括輕鏈和重鏈，所述 輕鏈包括小鼠 C κ和源自重排的人V κ 1-39J κ 5序列或重排的人V κ 3-20J κ 1序列的體細 胞突變的人\結構域，所述重鏈包括小鼠 Ch和體細胞突變的人Vh結構域，所述體細胞突變 的人Vh結構域源自人V h基因片段，其選自1-2、1_8、1-24、1-69、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、 3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、3-53、4-31、4-39、4-59、5-51、6-1 人 Vh 基因片段及其組 合，其中所述小鼠不表達完全（fully)小鼠抗體并且不表達完全人抗體。在一個實施方案 中所述小鼠包括κ輕鏈基因座，所述基因座包括用重排的人Vk 1-39JK 5序列或重排的人 Vk 3-20JK1序列替換內源性小鼠 κ輕鏈基因片段，并且包括用完整或基本上完整群的人 Vh基因片段替換所有或基本上所有內源性小鼠 Vh基因片段。
[0036] 在一個方面，本發(fā)明提供源自本文所述小鼠的一群抗原特異性抗體，其中所述抗 體包括源自人Vk I-39/Jk 5重排或人Vk 3-20/Jk 1重排的輕鏈基因，并且其中所述抗體 包括源自人Vh基因片段重排的重排的免疫球蛋白重鏈基因，所述人V h基因片段選自1-2、 1-3、1-8、1-18、卜24、1-46、卜58、1-69、2-5、2-26、2-70、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-16、 3-20、3-21、3-23、3-30、3-33、3-43、3-48、3-53、3-64、3-72、3-73、4-31、4-34、4-39、4-59、 5-5U6-1人Vh基因片段及其組合。在一個實施方案中，所述一個或多個人Vh基因片段與 選自1、2、3、4、5和6的重鏈基因義片段重排。在一個具體的實施方案中，所述輕鏈具有1、 2、3、4或5或更多個體細胞超變。
[0037] 在一個實施方案中，所述輕鏈具有1、2、3或4個體細胞超變。在一個實施方案中， 所述輕鏈基因具有1或2個突變。在各種實施方案中，所述輕鏈基因能夠沿著其序列發(fā)生 多個突變。
[0038] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk I-39/Jk 5重排并且所述輕鏈具有至 少一個或不多于四個體細胞超變。在一個實施方案中，所述輕鏈包括至少兩個體細胞超變。 在一個實施方案中，所述輕鏈包括至少三個體細胞超變。在一個實施方案中，所述輕鏈包括 至少四個體細胞超變。在一個具體的實施方案中，所述突變存在于所述輕鏈的一個或多個 框架區(qū)（FW)。在一個具體的實施方案中，所述突變存在于所述輕鏈的一個或多個互補決定 區(qū)（CDR)。在一個具體的實施方案中，所述突變存在于所述輕鏈的一個或多個FW和/或一 個或多個CDR。在各種實施方案中，所述框架區(qū)選自框架I (FWl)、框架2 (FW2)、框架3 (FW3) 和/或其組合。在各種實施方案中，所述⑶R選自⑶Rl、⑶R2、⑶R3和/或其組合。
[0039] 在一個實施方案中，所述重鏈在一個或多個FW或一個或多個⑶R中包括至少一個 突變。在一個實施方案中，所述重鏈在一個或多個FW和一個或多個⑶R中包括至少一個突 變。在一個實施方案中，所述重鏈在一個或多個FW和一個或多個⑶R中包括至少兩個突變。 在一個實施方案中，所述重鏈在一個或多個FW和一個或多個⑶R中包括至少三個突變。在 一個實施方案中，所述重鏈在一個或多個FW和一個或多個⑶R中包括至少四個突變。在一 個實施方案中，所述重鏈在一個或多個FW和一個或多個⑶R中包括至少五個突變；在一個 具體的實施方案中，所述重鏈在兩個FW中包括至少五個或多于五個突變；在一個具體的實 施方案中，所述重鏈在一個FW和一個CDR中包括至少五個或多于五個突變。
[0040] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 1-39/JK5重排并且大約9%的 Vk 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具有在FWl中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少9% 的輕鏈包括在FWl中存在一個突變。在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 1-39/J κ 5 重排并且大約25%的V κ 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具有在⑶Rl中存在至少一個或不多于兩 個突變；在一個實施方案中，至少19%的輕鏈具有在CDRl中存在一個突變；在一個實施方 案中，至少5%的輕鏈具有在CDRl中存在兩個突變。
[0041] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk I-39/Jk 5重排并且大約20 %的 V κ 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具有在FW2中存在至少一個或不多于三個突變；在一個實施方 案中，至少17 %的輕鏈具有在FW2中存在一個突變；在一個實施方案中，至少I %的輕鏈具 有在FW2中存在兩個突變；在一個實施方案中，至少1 %的輕鏈具有在FW2中存在三個突 變。
[0042] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk I-39/Jk 5重排并且大約10 %的 Vk 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具有在⑶R2中存在至少一個或不多于兩個突變；在一個實施方 案中，至少10%的輕鏈具有在CDR2中存在一個突變；在一個實施方案中，至少1 %的輕鏈具 有在CDR2中存在兩個突變。
[0043] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk I-39/Jk 5重排并且大約29 %的 V κ 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具有在FW3中存在至少一個或不多于四個突變；在一個實施方 案中，至少21 %的輕鏈具有在FW3中存在一個突變；在一個實施方案中，至少5%的輕鏈具 有在FW3中存在兩個突變；在一個實施方案中，至少2%的輕鏈具有在FW3中存在三個突 變；在一個實施方案中，至少2%的輕鏈具有在FW3中存在四個突變。
[0044] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk I-39/Jk 5重排并且大約37 %的 V κ 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具有在⑶R3中存在至少一個或不多于四個突變；在一個實施方 案中，至少27%的輕鏈具有在CDR3中存在一個突變；在一個實施方案中，至少8%的輕鏈具 有在CDR3中存在兩個突變；在一個實施方案中，至少1 %的輕鏈具有在CDR3中存在三個突 變；在一個實施方案中，至少1 %的輕鏈具有在CDR3中存在四個突變。
[0045] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一群源自如本文所述小鼠的抗原特異性抗體，其 中所述抗體包括源自人V κ 1-39/J κ 5重排并且大約9 %的V κ 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具 有在FWl中存在一個或多個突變，大約25%的Vk I-39/Jk 5-來源的輕鏈具有在⑶Rl中 存在一個或多個突變，大約20%的Vk 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具有在FW2中存在一個或多 個突變，大約10%的Vk 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具有在⑶R2中存在一個或多個突變，大約 29%的Vk I-39/Jk 5-來源的輕鏈具有在FW3中存在一個或多個突變，并且大約37%的 V κ 1-39/J κ 5-來源的輕鏈具有在⑶R3中存在一個或多個突變。
[0046] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 1-39/J κ 5重排并且大約35%的重鏈 具有在FWl中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少25%的重鏈具有在FWl中存在 一個突變；在一個實施方案中，至少9%的重鏈具有在FWl中存在兩個突變；在一個實施方 案中，至少1 %的重鏈具有在FWl中存在三個突變；在一個實施方案中，至少1 %的重鏈具有 在FWl中存在多于五個突變。
[0047] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 1-39/J κ 5重排并且大約92%的重鏈 具有在⑶Rl中存在至少一個或不多于四個突變；在一個實施方案中，至少92%的重鏈具有 在⑶Rl中存在至少一個、至少兩個、至少三個或四個突變；在一個實施方案中，至少26%的 重鏈具有在CDRl中存在一個突變；在一個實施方案中，至少44%的重鏈具有在CDRl中存 在兩個突變；在一個實施方案中，至少19%的重鏈具有在CDRl中存在三個突變；在一個實 施方案中，至少3%的重鏈具有在⑶Rl中存在四個突變。
[0048] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 1-39/J κ 5重排并且大約66%的重鏈 具有在FW2中存在至少一個或不多于三個突變；在一個實施方案中，至少66%的重鏈具有 在FW2中存在至少一個、至少兩個、至少三個突變；在一個實施方案中，至少35%的重鏈具 有在FW2中存在一個突變；在一個實施方案中，至少23 %的重鏈具有在FW2中存在兩個突 變；在一個實施方案中，至少8%的重鏈具有在FW2中存在三個突變。
[0049] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 1-39/J κ 5重排并且大約70%的重鏈 具有在⑶R2中存在至少一個或不多于四個突變；在一個實施方案中，至少70%的重鏈具 有在⑶R2中存在至少一個、至少兩個、至少三個或至少四個突變；在一個實施方案中，至少 34%的重鏈具有在CDR2中存在一個突變；在一個實施方案中，至少20 %的重鏈具有在CDR2 中存在兩個突變；在一個實施方案中，至少12%的重鏈具有在CDR2中存在三個突變；在一 個實施方案中，至少5%的重鏈具有在CDR2中存在四個突變。
[0050] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 1-39/J κ 5重排并且大約91 %的重鏈 具有在FW3中存在至少一個或多至五個或更多個突變；在一個實施方案中，至少91 %的重 鏈具有在FW3中存在至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個或至少五個或更多個突變； 在一個實施方案中，至少19%的重鏈具有在FW3中存在一個突變；在一個實施方案中，至少 33 %的重鏈具有在FW3中存在兩個突變；在一個實施方案中，至少22 %的重鏈具有在FW3 中存在三個突變；在一個實施方案中，至少11%的重鏈具有在FW3中存在四個突變；在一個 實施方案中，至少7%的重鏈具有在FW3中存在五個突變。
[0051] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 1-39/J κ 5重排并且大約63%的重鏈 具有在⑶R3中存在至少一個或不多于兩個突變；在一個實施方案中，至少63%的重鏈具有 在CDR3中存在一個突變；在一個實施方案中，至少54%的重鏈具有在CDR3中存在一個突 變；在一個實施方案中，至少9%的重鏈具有在CDR3中存在兩個突變。
[0052] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一群源自如本文所述小鼠的抗原特異性抗體，其 中所述抗體包括源自人V κ 1-39/J κ 5重排的輕鏈并且大約35%的重鏈具有在FWl中存在 一個或多個突變，大約92%的重鏈具有在CDRl中存在一個或多個突變，大約66%的重鏈具 有在FW2中存在一個或多個突變，大約70 %的重鏈具有在CDR2中存在一個或多個突變，大 約91 %的重鏈具有在FW3中存在一個或多個突變，并且大約63 %的重鏈具有在⑶R3中存 在一個或多個突變。
[0053] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人V κ 3-20/J κ 1重排并且所述輕鏈基因具 有至少一個或不多于兩個體細胞超變；在一個實施方案中，所述輕鏈基因具有至少兩個、至 少三個、至少四個或更多個體細胞超變。在一個具體的實施方案中，所述突變存在于所述輕 鏈的一個或多個框架區(qū)。在一個具體的實施方案中，所述突變存在于所述輕鏈的一個或多 個互補決定區(qū)。在一個具體的實施方案中，所述突變存在于所述輕鏈的一個或多個FW和 /或一個或多個CDR。在各種實施方案中，所述框架區(qū)選自框架I (FWl)、框架2 (FW2)、框架 3(FW3)和/或其組合。
[0054] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/Jk 1重排并且大約10%的 V κ 3-20/J κ 1-來源的輕鏈具有在FWl中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少10 % 的輕鏈具有在FWl中的一個突變。
[0055] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/Jk 1重排并且大約53%的 Vk 3-20/J κ 1-來源的輕鏈具有在⑶Rl中存在至少一個或不多于兩個突變；在一個實施方 案中，至少27%的輕鏈具有在CDRl中存在一個或多個突變；在一個實施方案中，至少54% 的輕鏈具有在CDRl中存在一個或兩個突變。
[0056] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/J κ 1重排并且大約6%的 V K 3-20/J K 1-來源的輕鏈具有在FW2中存在至少一個或不多于兩個突變；在一個實施方 案中，至少6%的輕鏈具有在FW2中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少3%的輕鏈 具有在FW2中存在一個突變；在一個實施方案中，至少3%的輕鏈具有在FW2中存在兩個突 變。
[0057] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/J κ 1重排并且大約3%的 Vk 3-20/Jk 1-來源的輕鏈具有在⑶R2中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少3% 的輕鏈具有在CDR2中存在一個突變。
[0058] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/Jk 1重排并且大約17%的 V κ 3-20/J κ 1-來源的輕鏈具有在FW3中存在至少一個或不多于兩個突變；在一個實施方 案中，至少20%的輕鏈具有在FW3中存在一個突變；在一個實施方案中，至少17%的輕鏈具 有在FW3中存在兩個突變。
[0059] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/Jk 1重排并且大約43%的 Vk 3-20/Jk 1-來源的輕鏈具有在⑶R3中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少 43%的輕鏈具有在CDR3中存在一個突變。
[0060] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一群源自如本文所述小鼠的抗原特異性抗體，其 中所述抗體包括源自人V K 3-20/J K 1重排的輕鏈并且大約10%的V K 3-20/J K 1-來源的 輕鏈具有至少一個或多個突變，大約53%的Vk 3-20/Jk 1來源的輕鏈具有在⑶Rl中存 在一個或多個突變，大約6%的Vk 3-20/J κ 1來源的輕鏈具有在FW2中存在一個或多個突 變，大約3 %的V κ 3-20/J κ 1來源的輕鏈具有在⑶R2中存在一個或多個突變，大約37 %的 V κ 3-20/J κ 1來源的輕鏈具有在FW3中存在一個或多個突變，并且大約43 %的V κ 3-20/ Jk 1來源的輕鏈具有在⑶R3中存在一個或多個突變。
[0061] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/J κ 1重排并且大約43%的重鏈 具有在FWl中存在至少一個或不多于兩個突變；在一個實施方案中，至少41 %的重鏈包括 在FWl中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少41 %的重鏈包括在FWl中存在至少 一個突變；在一個實施方案中，至少2%的重鏈包括在FWl中存在兩個突變。
[0062] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/J κ 1重排并且大約92%的重鏈 具有在⑶Rl中存在至少一個或不多于四個突變；在一個實施方案中，至少43%的重鏈具有 在CDRl中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少25 %的重鏈具有在CDRl中存在兩 個突變；在一個實施方案中，至少15%的重鏈具有在CDRl中存在至少3個突變；在一個實 施方案中，至少10%的重鏈具有在CDRl中存在4個或更多個突變。
[0063] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/J κ 1重排并且大約46%的重鏈 具有在FW2中存在至少一個或不多于三個突變；在一個實施方案中，至少34%的重鏈具有 在FW2中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少10%的重鏈具有在FW2中存在兩個 或更多個突變；在一個實施方案中，至少2%的重鏈具有在FW2中存在三個突變。
[0064] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/J κ 1重排并且大約84%的重鏈 具有在⑶R2中存在至少一個或多至五個或多于五個突變；在一個實施方案中，至少39%的 重鏈具有在⑶R2中存在至少一個或更多個突變；在一個實施方案中，至少18%的重鏈具有 在CDR2中存在兩個或更多個突變；在一個實施方案中，至少21 %的重鏈具有在CDR2中存 在三個或更多個突變；在一個實施方案中，至少3%的重鏈具有在CDR2中存在四個或更多 個突變；在一個實施方案中，至少2%的重鏈具有在CDR2中存在五個或更多個突變。
[0065] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/J κ 1重排并且大約92%的重鏈 具有在FW3中存在至少一個或多至五個或多于五個突變；在一個實施方案中，至少21 %的 輕鏈具有在FW3中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少20%的重鏈具有在FW3中 存在至少兩個突變；在一個實施方案中，至少13%的重鏈具有在FW3中存在至少三個突變； 在一個實施方案中，至少20%的重鏈具有在FW3中存在至少四個突變；在一個實施方案中， 至少18%的重鏈具有在FW3中存在至少5個突變。
[0066] 在一個實施方案中，所述輕鏈是源自人Vk 3-20/J κ 1重排并且大約7%的重鏈具 有在CDR3中存在至少一個突變；在一個實施方案中，至少7%的重鏈具有在CDR3中存在一 個突變。
[0067] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供一群源自小鼠的如本發(fā)明所述的抗原特異性抗 體，其中所述抗體包括源自人Vk 3-20/J κ 1重排的輕鏈并且大約43%的重鏈具有在FWl中 存在一個或多個突變，大約92%的重鏈具有在CDRl中存在一個或多個突變，大約46%的重 鏈具有在FW2中存在一個或多個突變，大約84%的重鏈具有在CDR2中存在一個或多個突 變，大約92 %的重鏈具有在FW3中存在一個或多個突變，并且大約7%的重鏈具有在⑶R3 中存在一個或多個突變。
[0068] 在一個方面，本發(fā)明提供一種表達來自重排的免疫球蛋白輕鏈序列的免疫球蛋白 輕鏈的小鼠，其中所述重排的免疫球蛋白輕鏈序列存在于所述小鼠的生殖系（germline) 中，其中所述免疫球蛋白輕鏈包括人可變序列。在一個實施方案中，所述小鼠的生殖系包括 重排的免疫球蛋白輕鏈序列，其源自與包括重排的輕鏈序列的小鼠的每一個B細胞中存在 的所有非替代（non-surrogate)輕鏈序列相同的V片段和相同的J片段。
[0069] 在一個實施方案中，所述小鼠的生殖系缺乏功能性未重排的免疫球蛋白輕鏈V基 因片段。在一個實施方案中，所述小鼠的生殖系缺乏功能性未重排的免疫球蛋白輕鏈J基 因片段。
[0070] 在一個實施方案中，所述小鼠的生殖系包括不多于一個、不多于兩個或不多于三 個重排的（VJ)輕鏈序列。
[0071] 在一個實施方案中，所述重排的V/J序列包括K輕鏈序列。在一個具體的實施方 案中，所述κ輕鏈序列是人K輕鏈序列。在一個具體的實施方案中，所述K輕鏈序列選自 人VkI-39/J序列、人VK3-20/J序列及其組合。在一個具體的實施方案中，所述κ輕鏈 序列是人Vk 1-39/J κ 5序列。在一個具體的實施方案中，所述κ輕鏈序列是人V κ 3-20/ J κ 1序列。
[0072] 在一個實施方案中，所述小鼠進一步在其生殖系中包括序列，所述序列選自相對 于所述重排的免疫球蛋白輕鏈序列的小鼠 κ內含增強子5'、小鼠 κ 3'增強子以及組合。
[0073] 在一個實施方案中，所述小鼠包括未重排的人Vh基因片段、未重排的人Dh基因片 段以及未重排的人J h基因片段，其中所述VH、Dh和Jh基因片段能夠重排以形成免疫球蛋白 重鏈可變基因序列，其可操作性連接重鏈恒定基因序列。在一個實施方案中，所述小鼠包括 多種人V H、Dh和Jh基因片段。在一個具體的實施方案中，所述人VH、D h和Jh基因片段在內 源性小鼠免疫球蛋白重鏈基因座處替換內源性小鼠％為和義基因片段。在一個具體的實 施方案中，所述小鼠包括用全部或基本上全部功能性人V H、Dh和Jh基因片段替換全部或基 本上全部功能性小鼠 VH、Dh和Jh基因片段。
[0074] 在一個實施方案中，所述小鼠表達包括小鼠恒定序列的免疫球蛋白輕鏈。在一個 實施方案中，所述小鼠表達包括人恒定序列的免疫球蛋白輕鏈。
[0075] 在一個實施方案中，所述小鼠表達包括小鼠序列的免疫球蛋白重鏈，所述序列選 自ChI序列、鉸鏈區(qū)序列、CH2序列、CH3序列及其組合。
[0076] 在一個實施方案中，所述小鼠表達包括人序列的免疫球蛋白重鏈，所述序列選自 ChI序列、鉸鏈區(qū)序列、CH2序列、CH3序列及其組合。
[0077] 在一個實施方案中，所述小鼠的生殖系中的重排的免疫球蛋白輕鏈序列是位于內 源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座。在一個具體的實施方案中，所述小鼠的生殖系中的重排 的免疫球蛋白輕鏈序列于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈基因座處替換所有或基本上所有小 鼠輕鏈V和J序列。
[0078] 在一個方面，本發(fā)明提供一種包括B細胞群的小鼠，特征是，包括非替代輕鏈序列 的每個B細胞包括源自單一人V片段和單一人J片段的重排的輕鏈基因，其中小鼠的生殖 系中唯一的輕鏈可變序列是源自單一人V片段和單一人J片段的重排序列，并且其中包括 所述重排的輕鏈基因的每個B細胞進一步包括編碼關聯人重鏈可變區(qū)的基因，并且其中所 述重排的輕鏈基因包括至少一個、至少二個、至少三個或至少四個體細胞超變。
[0079] 在一個方面，本發(fā)明提供源自如本文所述的小鼠的多能、誘導多能或全能細胞。在 一個具體的實施方案中，所述細胞是小鼠胚胎干（ES)細胞。
[0080] 在一個方面，本發(fā)明提供源自如本發(fā)明所述的小鼠的組織。在一個實施方案中，所 述組織源自本文所述的小鼠的脾、淋巴結或骨髓
[0081] 在一個方面，本發(fā)明提供源自如本發(fā)明所述的小鼠的細胞核。在一個實施方案中， 所述細胞核來自不是B細胞的二倍體細胞。
[0082] 在一個方面，本發(fā)明提供一種小鼠細胞，其分離自如本文所述的小鼠。在一個實施 方案中，所述細胞是ES細胞。在一個實施方案中，所述細胞是淋巴細胞。在一個實施方案 中，所述淋巴細胞是B細胞。在一個實施方案中，所述B細胞表達包括源自人基因片段的可 變區(qū)的嵌合重鏈；和源自重排的人Vk 1-39/J序列、重排的人Vk 3-20/J序列或其組合的輕 鏈；其中所述重鏈可變區(qū)融合至小鼠恒定區(qū)并且所述輕鏈可變區(qū)融合至小鼠或人恒定區(qū)。
[0083] 在一個方面，本發(fā)明提供一種雜交瘤細胞，其中所述雜交瘤細胞由如本文所述的 小鼠的B細胞制備。在一個具體的實施方案中，所述B細胞來自如本發(fā)明所述的小鼠，其 已經用包括感興趣的表位的免疫原免疫過，并且所述B細胞表達結合感興趣的表位的結 合蛋白，所述結合蛋白具有體細胞突變的AV h結構域和小鼠 Ch，并且具有源自重排的人 V κ 1-39J κ 5或重排的人V κ 3-20J κ 1的人八結構域和小鼠 Q。
[0084] 在一個方面，本發(fā)明提供一種小鼠胚胎，其中所述胚胎包括源自如本文所述的小 鼠的供體ES細胞。
[0085] 在一個方面，本發(fā)明提供一種靶向載體，其參照載體的5'和3'小鼠同源臂的序列 從5'到3'的轉錄方向，包括5'小鼠同源臂、人或小鼠免疫球蛋白啟動子、人或小鼠前導序 列和選自重排的人Vk 1-39J κ 5或重排的人Vk 3-20J κ 1的人'區(qū)、以及3'小鼠同源臂。 在一個實施方案中，所述5'和3'同源臂將載體靶向增強子序列5'側的序列，所述增強子 序列存在于小鼠 Ck基因5'側并靠近小鼠 Ck基因。在一個實施方案中，所述啟動子是人 免疫球蛋白可變區(qū)基因片段啟動子。在一個具體的實施方案中，所述啟動子是人Vk 3-15 啟動子。在一個實施方案中，所述前導序列是小鼠前導序列。在一個具體的實施方案中，所 述小鼠前導序列是小鼠 Vk 3-7前導序列。
[0086] 在一個方面，本發(fā)明提供如上所述的靶向載體，但是，代替5'小鼠同源臂，位點特 異性重組酶識別位點（site-specific recombinase recognition site, SRRS)側接于人或 小鼠啟動子5'端，并且代替3'小鼠同源臂，SRRS側接于人'區(qū)3'端。
[0087] 在一個方面，由本文所描述的小鼠制備的反向嵌合抗體，其中所述反向嵌合抗體 包括輕鏈，所述輕鏈包括人' 和小鼠 Q，以及重鏈，所述重鏈包括人Vh和小鼠 CH。
[0088] 在一個方面，本發(fā)明提供一種制備抗體的方法，包括在單個細胞中表達（a)與人Ch 基因序列融合的如本文所述的經免疫的小鼠的第一 Vh基因序列；(b)與人Q基因序列融合 的如本文所述的經免疫的小鼠的'基因序列；以及，（c)在足以表達全人抗體的條件下維 持細胞，并且分離所述抗體。在一個實施方案中，所述細胞包括與人C h基因序列融合的如 本文所述的第二經免疫的小鼠的第二％基因序列，所述第一 Vh基因序列編碼識別第一表位 的Vh結構域，以及所述第二Vh基因序列編碼識別第二表位的V h結構域，其中所述第一表位 和所述第二表位不相同。
[0089] 在一個方面，本發(fā)明提供制備表位結合蛋白的方法，包括將如本文所述的小鼠暴 露給免疫原，所述免疫原包括感興趣的表位，在足以使得小鼠產生特異性結合感興趣的表 位的免疫球蛋白分子的條件下維持所述小鼠，并且分離特異性結合感興趣的表位的免疫 球蛋白分子；其中所述表位結合蛋白包括重鏈，所述重鏈包括經體細胞突變的人V h和小鼠 Ch,所述重鏈與輕鏈結合,所述輕鏈包括小鼠 Q和源自重排的人Vk 1-39J κ 5或重排的人 V κ 3-20J κ 1 的人八。
[0090] 在一個方面，本發(fā)明提供一種表達表位結合蛋白的細胞，其中所述細胞包括：(a) 編碼源自重排的人V κ 1-39J κ 5或重排的人V κ 3-20J κ 1的人 '結構域的人核苷酸序列， 其中所述人核苷酸序列融合（直接或通過接頭）至人免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)cDNA序列（例 如，人κ恒定區(qū)DNA序列）；以及，（b)編碼源自第一人V h核苷酸序列的AVh結構域的第 一人Vh核苷酸序列，其中所述第一人V h核苷酸序列融合（直接或通過接頭）至人免疫球蛋 白重鏈恒定區(qū)cDNA序列；其中所述表位集合蛋白識別第一表位。在一個實施方案中，所述 表位結合蛋白以低于1(Γ 6Μ、低于1(Γ8Μ、低于1(Γ9Μ、低于KTkiMi低于KT 11M或低于KT12M的 解離常數結合所述第一表位。
[0091] 在一個實施方案中，所述細胞包括編碼第二人Vh結構域的第二人核苷酸序列，其 中所述第二人序列融合（直接或通過接頭）至人免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)cDNA序列，并且其 中所述第二人V h結構域不特異性識別所述第一表位（例如，顯示如1(Γ6Μ、1(Γ5Μ、KT 4M或更 高的解離常數），并且其中所述表位結合蛋白識別所述第一表位和所述第二表位，并且其中 所述第一和所述第二免疫球蛋白重鏈各結合（a)的相同的輕鏈。
[0092] 在一個實施方案中，所述第二Vh結構域以低于1(Γ6Μ、低于1(Γ 7Μ、低于1(Γ8Μ、低于 1〇_9Μ、低于ΚΓ^Μ、低于KT 11M或低于KT12M的解離常數結合所述第二表位。
[0093] 在一個實施方案中，所述表位結合蛋白包括第一免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋 白重鏈，每個結合源自重排的選自人Vk 1-39J κ 5或人Vk 3-20J κ 1的人八區(qū)相同的輕鏈， 其中所述第一免疫球蛋白重鏈以納摩爾至皮摩爾范圍的解離常數結合第一表位，所述第二 免疫球蛋白以納摩爾至皮摩爾范圍的解離常數結合第二表位，所述第一表位和所述第二表 位不相同，所述第一免疫球蛋白重鏈不結合第二表位或以弱于微摩爾范圍（例如毫摩爾范 圍）的解離常數結合第二表位，所述第二免疫球蛋白重鏈不結合第一表位或以弱于微摩爾 范圍（例如毫摩爾范圍）的解離常數結合第一表位，并且所述第一免疫球蛋白重鏈的所述 '、所述V h、以及所述第二免疫球蛋白重鏈的Vh中的一個或多個，是體細胞突變的。
[0094] 在一個實施方案中，所述第一免疫球蛋白重鏈包括蛋白A結合殘基，并且所述第 二免疫球蛋白重鏈缺乏所述蛋白A結合殘基。
[0095] 在一個實施方案中，所述細胞選自CHO、C0S、293、HeLa和表達病毒核酸序列的視 網膜細胞（例如PERC. 6?細胞）。
[0096] 在一個方面，本發(fā)明提供一種反向嵌合抗體，包括AVh和小鼠重鏈恒定區(qū)，人'和 小鼠輕鏈恒定區(qū)，其中所述抗體通過包括用包含表位的免疫原免疫如本文所述的小鼠的方 法制備，并且所述抗體特異性結合用來免疫小鼠的所述免疫原的表位。在一個實施方案中， 所述\結構域是體細胞突變的。在一個實施方案中所述V h結構域是體細胞突變的。在一 個實施方案中，所述'結構域和所述Vh結構域均是體細胞突變的。在一個實施方案中，所 述'連接小鼠 C κ結構域。
[0097] 在一個方面，本發(fā)明提供一種小鼠，包括人Vh基因片段，其在內源性小鼠重鏈基因 座替換所有或基本上所有小鼠 Vh基因片段；不多于一個或兩個重排的人輕鏈'/1序列，其 選自重排的Vk 1-39/J和重排的Vk 3-20/J或其組合，替換所有小鼠輕鏈基因片段；其中所 述人重鏈可變基因片段連接小鼠恒定基因，并且所述重排的人輕鏈序列連接人或小鼠恒定 基因。
[0098] 在一個方面，小鼠 ES細胞包括用人重鏈可變基因片段替換所有或基本上所有小 鼠重鏈可變基因片段，并且包括不多于一個或兩個重排的人輕鏈'/1序列，其中所述人重 鏈可變基因片段連接小鼠免疫球蛋白重鏈恒定基因，并且所述重排的人輕鏈序列連 接小鼠或人免疫球蛋白輕鏈恒定基因。在一個具體的實施方案中，所述輕鏈恒定基因是小 鼠恒定基因。
[0099] 在一個方面，本發(fā)明提供一種由如本文所述的小鼠制得的抗原結合蛋白。在一個 具體的實施方案中，所述抗原結合蛋白包括與小鼠恒定區(qū)融合的人免疫球蛋白重鏈可變 區(qū)，以及源自V κ 1-39基因片段或V κ 3-20基因片段的人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)，其中所述 輕鏈恒定區(qū)是小鼠恒定區(qū)。
[0100] 在一個方面，本發(fā)明提供來自如本文所述的小鼠的免疫球蛋白可變區(qū)基因序列制 成的全人抗原結合蛋白（fully human antigen-binding protein),其中所述抗原結合蛋 白包括全人重鏈和全人輕鏈，所述全人重鏈包括源自如本文所述小鼠的序列的人可變區(qū)， 所述全人輕鏈包括V κ 1-39或V κ 3-20。在一個實施方案中，所述輕鏈可變區(qū)包括一至五個 體細胞突變。在一個實施方案中，所述輕鏈可變區(qū)是小鼠的B細胞中與所述重鏈可變區(qū)配 對的關聯輕鏈可變區(qū)。
[0101] 在一個實施方案中，所述全人抗原結合蛋白包括第一重鏈和第二重鏈，其中所述 第一重鏈和所述第二重鏈包括獨立源自如本文所述的小鼠的不相同的可變區(qū)，并且其中所 述第一和第二重鏈的每一個在與源自V K 1-39基因片段或V K 3-20基因片段的人輕鏈締合 的情況下從宿主細胞表達。在一個實施方案中，所述第一重鏈包括特異性結合第一抗原的 第一表位的第一重鏈可變區(qū)，并且所述第二重鏈包括特異性結合第二抗原的第二表位的第 二重鏈可變區(qū)。在一個具體的實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原不同。在一個具 體的實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原相同，并且所述第一表位和所述第二表位 不同；在一個具體的實施方案中，由所述結合蛋白的第一分子結合所述第一表位并不阻斷 由所述結合蛋白的第二分子結合所述第二表位。
[0102] 在一個方面，源自如本文所述的小鼠的人免疫球蛋白的序列的全人結合蛋白包括 第一免疫球蛋白重鏈和第二免疫球蛋白重鏈，其中所述第一免疫球蛋白重鏈包括與所述第 二免疫球蛋白重鏈的可變區(qū)不同的第一可變區(qū)，并且其中所述第一免疫球蛋白重鏈包括野 生型蛋白A結合決定簇，并且所述第二重鏈缺乏野生型蛋白A結合決定簇。在一個實施方 案中，所述第一免疫球蛋白重鏈在分離條件下結合蛋白A，并且所述第二免疫球蛋白重鏈不 結合蛋白A或者比所述第一免疫球蛋白重鏈在分離條件下結合蛋白A弱至少10倍、100倍 或一千倍結合蛋白A。在一個具體的實施方案中，所述第一和所述第二重鏈是IgGl同種型， 其中所述第二重鏈包括選自95R(EU 435R)、96F(EU 436F)及其組合的修飾，并且其中所述 第一重鏈缺乏該修飾。
[0103] 在一個方面，本發(fā)明提供制備雙特異性抗原結合蛋白的方法，包括暴露如本文所 述的第一小鼠于包括第一表位的感興趣的第一抗原，暴露如本文所述的第二小鼠于包括 第二表位的感興趣的第二抗原，允許所述第一和第二小鼠發(fā)生對感興趣的抗原產生免疫反 應，鑒定所述第一小鼠中結合感興趣的第一抗原的第一表位的第一人重鏈可變區(qū)，鑒定所 述第二小鼠中結合感興趣的第二抗原的第二表位的第二人重鏈可變區(qū)，制備編碼結合感興 趣的所述第一抗原的第一表位的第一重鏈的第一全人重鏈基因，制備編碼結合感興趣的 所述第二抗原的第二表位的第二重鏈的第二全人重鏈基因，在表達源自人VK 1-39或人 V κ 3-20基因片段的單一全人輕鏈的細胞中表達所述第一重鏈和所述第二重鏈以形成雙特 異性抗原結合蛋白，并分離所述雙特異性抗原結合蛋白。
[0104] 在一個實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原不同。
[0105] 在一個實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原相同，并且所述第一表位和所 述第二表位不同。在一個實施方案中，所述第一重鏈可變區(qū)結合至所述第一表位并不阻斷 所述第二重鏈可變區(qū)結合至所述第二表位。
[0106] 在一個實施方案中，所述第一抗原選自可溶性抗原和細胞表面抗原（例如，腫瘤 抗原），并且所述第二抗原包括細胞表面受體。在一個具體的實施方案中，所述細胞表面受 體是免疫球蛋白受體。在一個具體的實施方案中，所述免疫球蛋白受體是Fc受體。在一個 實施方案中，所述第一抗原和所述第二抗原是相同的細胞表面受體，并且所述第一重鏈結 合至所述第一表位并不阻斷所述第二重鏈結合至所述第二表位。
[0107] 在一個實施方案中，所述輕鏈的輕鏈可變區(qū)包括2-5個體細胞突變。在一個實施 方案中，所述輕鏈可變區(qū)是表達于帶有所述第一或所述第二重鏈可變區(qū)的所述第一或所述 第二經免疫的小鼠的B細胞中的體細胞突變的關聯輕鏈。
[0108] 在一個實施方案中，所述第一全人重鏈攜帶減弱其對蛋白A親和力的氨基酸修 飾，并且所述第二全人重鏈不包括減弱其對蛋白A親和力的修飾。
[0109] 在一個方面，本發(fā)明提供包括根據本發(fā)明制備的人重鏈可變區(qū)的抗體或雙特異性 抗體。在另一個方面，本發(fā)明提供如本文所述的小鼠用于制備全人抗體或全人雙特異性抗 體的用途。
[oho] 在一個方面，本文所述的遺傳修飾的小鼠、胚胎或細胞包括κ輕鏈基因座，其保 留內源性調控或控制元件，例如小鼠 κ內含增強子、小鼠 K 3'增強子，或同時具有內含增 強子和3'增強子，其中所述調控或控制元件促進所述κ輕鏈基因座的表達序列的體細胞 突變和親和力成熟。
[0111] 在一個方面，本發(fā)明提供一種小鼠，其包括B細胞群，特征是，具有源自不多于一 個或不多于兩個重排的或未重排的免疫球蛋白輕鏈V和J基因片段的免疫球蛋白輕鏈，其 中所述小鼠顯示出與包括免疫球蛋白輕鏈V和J基因片段的野生型補體的小鼠大致相同的 κ : λ輕鏈比。
[0112] 在一個實施方案中，所述免疫球蛋白輕鏈源自不多于一個或不多于兩個重排的免 疫球蛋白輕鏈V和J基因片段。在一個具體的實施方案中，所述輕鏈源自不多于一個重排 的免疫球蛋白輕鏈V和J基因片段。
[0113] 在一個方面，本發(fā)明提供本文所述的小鼠，其表達源自不多于一個或不多于兩個 人Vk/Jk序列的免疫球蛋白輕鏈，其中所述小鼠包括以一個或多個人重鏈可變區(qū)基因片 段替換所有或基本上所有內源性小鼠重鏈可變區(qū)基因片段，并且所述小鼠顯示出（a)表達 具有λ輕鏈的免疫球蛋白的CD19+B細胞與（b)表達具有κ輕鏈的免疫球蛋白的CD19+B 細胞之比為大約1至大約20。
[0114] 在一個實施方案中，所述小鼠表達源自人Vk 1-39JK 5序列的單一 κ輕鏈，并且 表達具有λ輕鏈的免疫球蛋白的CD19+B細胞與表達具有κ輕鏈的免疫球蛋白的CD19+B 細胞之比為大約1至大約20 ;在一個實施方案中，所述比為大約1至至少大約66 ;在一個具 體的實施方案中，所述比為大約1至66。
[0115] 在一個實施方案中，所述小鼠表達源自人Vk 3-20JK 5序列的單一 κ輕鏈，并且 表達具有λ輕鏈的免疫球蛋白的CD19+B細胞與表達具有κ輕鏈的免疫球蛋白的CD19+B 細胞之比為大約1至大約20 ;在一個實施方案中，所述比為大約1至大約21。在具體的實 施方案中，所述比為1至20或1至21。
[0116] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其表達單一重排的κ輕鏈，其中 所述小鼠包括功能性λ輕鏈基因座，并且其中所述小鼠表達B細胞群，其包括表達源自相 同的單一重排κ輕鏈的κ輕鏈的Ig K+細胞。在一個實施方案中，所述小鼠中Ig κ+Ig λ+B 細胞的百分比與野生型小鼠大致相同。在一個具體的實施方案中，所述小鼠中IgK+IgA+B 細胞的百分比為大約百分之2至大約百分之6。在一個具體的實施方案中，其中所述單一重 排的κ輕鏈是源自Vk 1-39JK 5序列的小鼠中IgK+IgA+B細胞的百分比為大約2至大約 3 ;在一個具體的實施方案中，百分比為大約2. 6。在一個具體的實施方案中，其中所述單一 重排的κ輕鏈是源自Vk 3-20JK 1序列的小鼠中IgK+IgX+B細胞的百分比為大約4至大 約8 ;在一個具體的實施方案中，大約6。
[0117] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其中所述小鼠表達源自人Vk和 Jk基因片段的單一重排的κ輕鏈，其中所述小鼠表達包括源自所述單一重排的Κ輕鏈序 列的單一 κ輕鏈的B細胞群，其中所述遺傳修飾的小鼠尚未呈現對體細胞超變的抗性。在 一個實施方案中，表達于所述小鼠 B細胞上的至少90%的κ輕鏈顯示從至少一個至大約五 個的體細胞超變。
[0118] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其被修飾以表達源自不多于一個 或不多于兩個重排的 K輕鏈序列的單一 K輕鏈，其中所述小鼠顯示K輕鏈使用比由野生 型小鼠顯示的κ輕鏈使用或者比包括 Κ輕鏈基因片段的野生群的相同品系的小鼠顯示的 κ輕鏈使用高大約兩倍或更多、至少大約三倍或更多或至少大約四倍或更多。在一個具體 的實施方案中，所述小鼠表達來自不多于一個重排的K輕鏈序列的所述單一 K輕鏈。在一 個更具體的實施方案中，所述重排的K輕鏈序列選自VK 1-39JK5和VK3-20JK 1序列。 在一個實施方案中，所述重排的κ輕鏈序列是Vk 1-39JK 5序列。在一個實施方案中，所 述重排的κ輕鏈序列是Vk 3-20J κ 1序列。
[0119] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其表達源自不多于一個或不多于 兩個重排的 Κ輕鏈序列的單一 Κ輕鏈，其中所述小鼠與由攜帶完整或基本上完整的人Κ 輕鏈基因座的小鼠顯示的同一 κ輕鏈使用率相比展示出高大約100倍或更多、至少大約 200倍或更多、至少大約300倍或更多、至少大約400倍或更多、至少大約500倍或更多、至 少大約600倍或更多、至少大約700倍或更多、至少大約800倍或更多、至少大約900倍或 更多、至少大約1000倍或更多。在一個具體的實施方案中，攜帶完整或基本上完整的人κ 輕鏈基因座的所述小鼠缺乏功能性未重排的小鼠 κ輕鏈序列。在一個具體的實施方案中， 所述小鼠表達來自不多于一個重排的κ輕鏈序列的單一 κ輕鏈。在一個實施方案中，所 述小鼠包括一個拷貝的重排的κ輕鏈序列（例如，雜合體）。在一個實施方案中，所述小 鼠包括兩個拷貝的重排的κ輕鏈序列（例如，純合體）。在一個更具體的實施方案中，所 述重排的κ輕鏈序列選自Vk1-39Jk5和Vk3_20Jk1序列。在一個實施方案中，所述 重排的κ輕鏈序列是Vk 1-39JK 5序列。在一個實施方案中，所述重排的κ輕鏈序列是 V κ 3-20J κ 1 序列。
[0120] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其表達源自不多于一個或不多于 兩個重排的輕鏈序列的單一輕鏈，其中所述遺傳修飾的小鼠中的輕鏈顯示的表達水平比由 攜帶完整或基本上完整輕鏈基因座的小鼠顯示的同一重排的輕鏈的表達高至少10倍至大 約1000倍、100倍至大約1000倍、200倍至大約1000倍、300倍至大約1000倍、400倍至大 約1000倍、500倍至大約1000倍、600倍至大約1000倍、700倍至大約1000倍、800倍至大 約1000倍或900倍至大約1000倍。在一個實施方案中，所述輕鏈包括人序列。在一個具 體的實施方案中，所述人序列是κ序列。在一個實施方案中，所述人序列是λ序列。在一 個實施方案中，所述輕鏈是全人輕鏈。
[0121] 在一個實施方案中，所述表達水平通過定量轉錄的輕鏈序列的mRNA來表征，并將 其與攜帶完整或基本上完整輕鏈基因座的小鼠的轉錄的輕鏈序列進行比較。
[0122] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其表達源自不多于一個或不多于 兩個重排的κ輕鏈序列的單一 κ輕鏈，其中所述小鼠，用抗原免疫后，顯示與用同一抗原 免疫的野生型小鼠相當的血清滴度。在一個具體的實施方案中，所述小鼠表達來自不多于 一個重排的K輕鏈序列的單一 K輕鏈。在一個實施方案中，所述血清滴度表征為總免疫球 蛋白。在一個具體的實施方案中，所述血清滴度表征為IgM特異性滴度。在一個具體的實施 方案中，所述血清滴度表征為IgG特異性滴度。在一個更加具體的實施方案中，所述重排的 κ輕鏈序列選自V κ 1-39J κ 5和V κ 3-20J κ 1序列。在一個實施方案中，所述重排的κ輕 鏈序列是Vk 1-39J κ 5序列。在一個實施方案中，所述重排的κ輕鏈序列是Vk 3-20J Kl 序列。
[0123] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其表達一群抗原特異性抗體，其中 這群抗原特異性抗體的所有免疫球蛋白輕鏈包括源自相同的單一人\基因片段的人輕鏈 可變（VJ區(qū)并且免疫球蛋白重鏈包括源自多個人V h基因片段之一的人重鏈可變（Vh)區(qū)。
[0124] 在各種實施方案中，所述AVh基因片段選自Vh1-2、V h1-3、Vh1_8、Vh1_18、Vh1_24、 Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、V h2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、V h3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-20、 Vh3-21、Vh3-23、Vh3-30、Vh3-33、V h3-43、Vh3-48、Vh3-53、Vh3-64、V h3-72、Vh3-73、Vh4-31、 Vh4-34、Vh4-39、Vh4-59、Vh5-51 和 Vh6-1。
[0125] 在各種實施方案中，相同的單一人'基因片段選自人Vk 1-39基因片段和人 Vk 3-20基因片段。在各種實施方案中，所有免疫球蛋白輕鏈包括選自Jk和基因片 段的人輕鏈J(I)基因片段。在一個具體的實施方案中，所述人叉基因片段選自人Jk 1和 Jk 5基因片段。在各種實施方案中，所述小鼠缺乏選自小鼠免疫球蛋白'基因片段、小鼠 免疫球蛋白1基因片段及其組合的序列。在各種實施方案中，所述人'區(qū)可操作性連接 人、小鼠或大鼠免疫球蛋白輕鏈恒定（CJ區(qū)。在一個具體的實施方案中，所述人\區(qū)可操 作性連接小鼠 Ck區(qū)。在一個具體的實施方案中，所述人'區(qū)可操作性連接大鼠 Ck區(qū)。
[0126] 在各種實施方案中，所述人'區(qū)表達自內源性免疫球蛋白輕鏈基因座。在各種實 施方案中，所述人V h區(qū)可操作性連接人、小鼠或大鼠免疫球蛋白重鏈恒定（Ch)區(qū)。在各種 實施方案中所述（C h)區(qū)包括選自CH1、鉸鏈區(qū)、CH2、CH3、C H4和/或其組合的人序列。在各 種實施方案中，所述人Vh區(qū)表達自內源性免疫球蛋白重鏈基因座。
[0127] 在一個方面，本發(fā)明提供一種遺傳修飾的小鼠，其表達多個與單一輕鏈相締合的 免疫球蛋白重鏈。在一個實施方案中，所述重鏈包括人序列。在各種實施方案中，所述人序 列選自可變序列、C H1、鉸鏈區(qū)、CH2、CH3及其組合。在一個實施方案中，所述單一輕鏈包括人 序列。在各種實施方案中，所述人序列選自可變序列、恒定序列及其組合。在一個實施方案 中，所述小鼠包括失效的（disabled)內源性免疫球蛋白基因座并通過轉基因或染色體外 游離體表達所述重鏈和/或所述輕鏈。在一個實施方案中，所述小鼠包括用一個或多個人 免疫球蛋白序列于內源小鼠基因座替換一些或全部內源性小鼠重鏈基因片段（即V、D、J)， 和/或一些或全部內源性小鼠重鏈恒定序列（例如C H1、鉸鏈區(qū)、CH2、CH3或其組合），和/或 一些或全部內源性小鼠輕鏈序列（例如V、J、恒定或其組合）。
[0128] 在一個方面，本發(fā)明提供適于制備具有相同輕鏈的抗體的小鼠，其中在所述小鼠 中制得的所有或基本上所有抗體以相同的輕鏈表達。在一個實施方案中，所述輕鏈表達自 內源性輕鏈基因座。
[0129] 在一個方面，本發(fā)明提供制備用于人抗體的輕鏈的方法，包括從本文所述的小鼠 獲得輕鏈序列和重鏈序列，并且將所述輕鏈序列和所述重鏈序列應用于制備人抗體。在一 個實施方案中，所述人抗體是雙特異性抗體。
[0130] 在一個方面，本發(fā)明提供一種鑒定人重鏈可變區(qū)的方法，所述人重鏈可變區(qū)能夠 用本發(fā)明所述的工程化的輕鏈結合感興趣的抗原，其中所述方法包括提供源自能夠結合所 述抗原的第一抗體的重鏈可變區(qū)，用生殖系輕鏈序列修復所述重鏈可變區(qū)并轉染細胞使得 每個表達以形成第二抗體，暴露所述第二抗體于所述抗原，以及檢測所述第二抗體與所述 抗原的結合。
[0131] 在一個實施方案中，所述第一抗體的輕鏈包括人V κ 1-39序列。在一個實施方案 中，所述第一抗體的輕鏈包括人V κ 3-20序列。在一個實施方案中，所述生殖系輕鏈序列包 括人Vk 1-39或Vk 3-20序列。在各種實施方案中，所述第二抗體與所述抗原的結合通過 比較所述第一抗體與所示抗原的結合來確定。
[0132] 本發(fā)明所述的任何實施方案和方面可以彼此結合使用，除非另有說明或明顯可以 從上下文看出。其它實施方案對于本領域技術人員在查閱接下來的說明書后將會變得明 顯。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0133] 圖1示例說明用人Vk 1-39JK 5基因區(qū)替換內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基 因片段的靶向策略。
[0134] 圖2示例說明用人Vk 3-20JK 1基因區(qū)替換內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基 因片段的靶向策略。
[0135] 圖3示例說明用人VpreB/JA 5基因區(qū)替換內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基 因片段的靶向策略。
[0136] 圖4顯示來自野生型小鼠（WT)、工程化人重排的Vk 1-39JK 5輕鏈區(qū)純合的小鼠 (V κ 1-39J κ 5H0)和工程化人重排的V κ 3-20J κ 1輕鏈區(qū)純合的小鼠 （V κ 3-20J κ 1H0)的 外周血的⑶19+B細胞的百分比（y軸）。
[0137] 圖5A顯示在定量PCR分析中采用特異性針對工程化人重排的V κ 1-39J κ 5輕鏈 區(qū)連接（junction)的探針（Vk 1-39JK 5Junction探針）和特異性針對在對于用人Vk和 Jk基因片段替換內源性Vk和Jk基因片段純合的小鼠（Hk)、野生型小鼠（WT)和對于 工程化人重排的Vk 1-39JK 5輕鏈區(qū)雜合的小鼠（Vk 1-39JK 5HET)中的人Vk 1-39基因 片段的探針（V κ 1-39探針）獲得的V κ 1-39-來源的輕鏈的相對mRNA表達（y軸）。信號 相對小鼠 Ck的表達進行標準化。N.D.:未檢測到。
[0138] 圖5B顯示在定量PCR分析中采用特異性針對工程化人重排的V κ 1-39J κ 5輕鏈 區(qū)連接的探針（Vk l-39jK5Junction探針）和特異性針對在對于用人Vk和Jk基因片 段替換內源性Vk和Jk基因片段純合的小鼠（Hk)、野生型小鼠（WT)和對于工程化人重 排的^^1-3町1^5輕鏈區(qū)純合的小鼠（￥1〇-3町1^5!10)中的人￥1〇-39基因片段的探針 (V κ 1-39探針）獲得的V κ 1-39-來源的輕鏈的相對mRNA表達（y軸）。信號相對小鼠 C κ 的表達進行歸一化。
[0139] 圖5C顯示在定量PCR分析中采用特異性針對工程化人重排的V κ 3-20J κ 1輕鏈 區(qū)連接的探針（VK3-20Junction探針）和特異性針對在對于用人Vk和Jk基因片段替 換內源性Vk和Jk基因片段純合的小鼠（Hk)、野生型小鼠（WT)和對于工程化人重排 的Vk 3-20JK 1輕鏈區(qū)雜合（HET)和純合（HO)的小鼠中的人Vk 3-20基因片段的探針 (V κ 3-20探針）獲得的V κ 3-20-來源的輕鏈的相對mRNA表達（y軸）。信號相對小鼠 C κ 的表達進行歸一化。
[0140] 圖6A顯示用β -半乳糖苷酶（galatosidase)免疫的野生型（WT ;N = 2)和工程化 人重排的Vk 1-39JK5輕鏈區(qū)純合的小鼠（Vk 1-39Jk5H0;N = 2)中IgM(左）和IgG(右） 滴度。
[0141] 圖6B顯示用β -半乳糖苷酶（galatosidase)免疫的野生型（WT ;N = 5)和工程化 人重排的Vk 3-20JK 1輕鏈區(qū)純合的小鼠（Vk 3-20JK IHO ;N = 5)中總免疫球蛋白（IgM、 IgG、IgA)滴度。
[0142] 發(fā)明詳述
[0143] 本發(fā)明并不限于具體的方法，以及所描述的實驗條件，因為這些方法和條件可變 化。還應當理解的是本文所使用的術語是僅用于描述具體的實施方案，并不意圖是限制性 的，因為本發(fā)明的保護范圍是由權利要求定義的。
[0144] 除非另有定義，本文所用的所有術語和的短語包括所述術語和短語在本領域中已 獲得的含義，除非有相反的明確指示，或者從其中術語或短語被使用的上下文中顯而易見 具有相反的含義。盡管類似或等同于本文描述的方法和材料的任何方法和材料可用來實施 或測試本發(fā)明，現在描述具體的方法和材料。
[0145] 本發(fā)明所使用的術語"抗體"包括免疫球蛋白分子，其包括四條多肽鏈，由二硫 鍵互相連接的兩條重（H)鏈和兩條輕（L)鏈。每條重鏈包括重鏈可變（V h)區(qū)和重鏈恒 定區(qū)（Ch)。所述重鏈恒定區(qū)包括三個結構域，CH1、（^和^^。每條輕鏈包括輕鏈可變 (')區(qū)和輕鏈恒定區(qū)（CJ。所述V h和八區(qū)可進一步細分為超可變區(qū)，稱為互補決定區(qū) (complementarity determining regions, CDR),散布于稱為構架區(qū)（framework regions, FR)的更保守的區(qū)域之間。每個包括三個CDR和四個FR,按照從氨基端到羧基端的 順序安排如下：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重鏈 CDR 可簡寫為 HCDR1、HCDR2 和 HCDR3 ;輕鏈CDR可簡寫為IXDRUIXDR2和IXDR3)。術語"高親和力"抗體是指具有相對于 其靶表位的Kd為大約KT 9M或更低（例如，大約IxKT9MUxKTkK IxKT11M或大約Ixl(T12M) 的抗體。在一個實施方案中，通過表面等離子共振（例如，BIAC0RE?)測量K D;在另一個實 施方案中，通過ELISA測量Kd。
[0146] 短語"雙特異性抗體"包括能夠選擇性結合兩個或更多個表位的抗體。雙特異性 抗體通常包括兩條不同的重鏈，每條重鏈特異性結合不同表位--或者在兩個不同的分子 上（例如，兩個不同的免疫原上的不同表位）或者在同一分子上（例如，同一免疫原的不同 表位）。如果雙特異性抗體能夠選擇性結合兩個不同表位（第一表位和第二表位），第一 表位對第一重鏈的親和力通常會比第二表位對第一重鏈的親和力弱至少一至二或三或四 或更多個數量級，反之亦然。由雙特異性抗體特異性結合的表位可以在相同或不同的靶標 上（例如，在相同或不同的蛋白上）。例如，雙特異性抗體可通過識別同一免疫原的不同表 位的重鏈組合而得。例如，編碼識別同一免疫原的不同表位的重鏈可變區(qū)序列可融合至編 碼相同或不同重鏈恒定區(qū)的核酸序列，并且該序列可以在表達免疫球蛋白輕鏈的細胞中表 達。典型的雙特異性抗體具有兩條重鏈，每條具有三個重鏈⑶R，接著（N-末端至C-末端） ChI結構域、鉸鏈區(qū)、CH2結構域和CH3結構域，以及免疫球蛋白輕鏈，所述輕鏈可以是不賦予 表位結合特異性但可以與每條重鏈相連，也可以是可以與每條重鏈相連并可以結合由重鏈 表位結合區(qū)結合的一個或多個表位，或者是可以與每條重鏈相連并使得重鏈的一條或兩條 能夠與一個或兩個表位結合。
[0147] 術語"細胞"包括適于表達重組核酸序列的任何細胞。細胞包括原核和真核細胞 (單細胞或多細胞）、細菌細胞（例如，大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌屬等菌株）、分枝桿菌細 胞、真菌細胞、酵母細胞（例如，釀酒酵母、裂殖酵母、巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母等）、 植物細胞、昆蟲細胞（例如，SF-9、SF-21、桿狀病毒感染的昆蟲細胞、粉紋夜蛾等）、非人動 物細胞、人細胞、或細胞融合例如雜交瘤細胞或四源雜交瘤細胞（quadromas)。在一些實施 方案中，所述細胞是人、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些實施方案中，所述細胞是真 核細胞并選自以下細胞：〇10(例如，010 1(1、0乂8-11010、￥68816-〇10)、0)5(例如，0)5-7)、 視網膜細胞、Vero、CVl、腎細胞（例如，HEK293、293EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、Hela、 !fepG2、WI38、MRC 5、C〇1〇205、HB 8065、HL-60、（例如，BHK21)、Jurkat、Daudi、A431 (表皮）、 CV-1、U937、3T3、L 細胞、C127 細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、支持細胞（Sertoli cell)、 BRL 3A細胞、HT1080細胞、黑色素瘤細胞、腫瘤細胞和前述細胞衍生的細胞系。在一些實 施方案中，所述細胞包括一個或多個病毒基因，例如，表達病毒基因的視網膜細胞（例如， PER. C6? 細胞）。
[0148] 短語"互補決定區(qū)"或術語"CDR"包括由有機體的免疫球蛋白基因編碼的氨基酸 序列，其通常（即，在野生型動物中）在免疫球蛋白分子（例如抗體或T細胞受體）的輕鏈 或重鏈的可變區(qū)中的兩個框架區(qū)之間出現。例如，CDR可以由生殖系序列或重排或未重排的 序列，并且例如由幼稚或成熟B細胞或T細胞編碼。CDR可以是體細胞突變的（例如從動物 生殖系中編碼的序列變化而來）、人源化的和/或由氨基酸取代、增加或缺失所修飾的。在 某些情況下（例如對CDR3)，CDR可以有兩條或更多條序列（例如，生殖系序列）編碼，所述 序列不相鄰（例如在未重排的核酸序列中）但是在B細胞核酸序列中相鄰，例如作為剪切 或連接所述序列的結果（例如，V-D-J重組以形成重鏈CDR3)。
[0149] 當用于描述保守氨基酸取代，術語"保守"包括通過另一個具有相似化學性質（例 如，電荷或疏水性）側鏈R基團的氨基酸殘基取代氨基酸殘基。通常，保守氨基酸取代不會 實質性改變蛋白的感興趣的功能特性，例如，可變區(qū)以期望的親和力特異性結合靶表位的 能力。具有相似化學性質的側鏈的氨基酸組的例子包括脂肪族側鏈，如甘氨酸、丙氨酸、纈 氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；脂肪族-羥基側鏈如絲氨酸和蘇氨酸；含酰胺側鏈如天冬酰胺和 谷氨酰胺；芳香族側鏈，如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；堿性側鏈的氨基酸如賴氨酸、精氨 酸和組氨酸；酸性側鏈的氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；以及，含硫側鏈的氨基酸如半胱氨 酸和甲硫氨酸。例如，保守氨基酸取代組包括：纈氨酸/亮氨酸/異亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨 酸、賴氨酸/精氨酸、丙氨酸/纈氨酸、谷氨酸/天門冬氨酸、天冬酰胺和/谷氨酰胺。在一些 實施方案中，保守氨基酸取代可以是以丙氨酸取代蛋白質中的任何天然殘基，如在例如丙 氨酸掃描誘變中所使用。在一些實施方案中，保守取代是通過獲得在PAM250對數似然矩陣 (log-likelihood matrix)中具有正值，所述矩陣公開于Gonnet et al. (1992)Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45。在一些實 施方案中，所述取代是中度保守的取代，其中所述取代在PAM250對數似然矩陣中具有非負 值。
[0150] 在一些實施方案中，在免疫球蛋白輕鏈或重鏈的殘基位置相差一個或多個保守的 氨基酸取代。在一些實施方案中，在免疫球蛋白輕鏈或其功能片段（例如，允許例如B細胞 表達和分泌的片段）中的殘基位置與其氨基酸序列在本文列出的輕鏈不同，但相差一個或 多個保守的氨基酸取代。
[0151] 短語"表位結合蛋白"包括具有至少一個⑶R的蛋白并且其能夠選擇性識別表 位，例如，能夠以大約微摩爾或更低的K d(例如，大約1x10_6M、1x10_7M、1x10_9M、1x10_ 9M、 IxKTkK IxKTllM或大約IxKT12M的KD)結合表位。治療性表位結合蛋白（例如，治療性抗 體）通常要求納摩爾或者皮摩爾范圍的KD。
[0152] 短語"功能片段"包括表位結合蛋白的片段，其表達、分泌并以微摩爾、納摩爾或皮 摩爾范圍的K d特異性結合表位。特異性識別包括具有至少在微摩爾范圍、納摩爾范圍或皮 摩爾范圍的KD。
[0153] 術語"生殖系"包括提及非體細胞突變的細胞中的免疫球蛋白核酸序列，例如非體 細胞成熟的B細胞或前B細胞或造血細胞。
[0154] 短語"重鏈"或"免疫球蛋白重鏈"包括來自任何有機體的免疫球蛋白重鏈恒定區(qū) 序列。除非另有規(guī)定，重鏈可變區(qū)包括三個重鏈CDR和四個FR區(qū)。重鏈的片段包括CDR、 ⑶R和FR、及其組合。典型的重鏈在可變區(qū)之后（從N-末端到C-末端）具有C hI結構域、 鉸鏈區(qū)、CH2結構域和CH3結構域。重鏈的功能性片段包括能夠特異性識別表位（例如，以 微摩爾、納摩爾或皮摩爾的范圍的K d識別表位）的片段，所述片段能夠從細胞表達并分泌， 以及所述片段包括至少一個⑶R。
[0155] 當針對序列使用時，術語"同一性"包括由本領域中已知的許多可用于測量核苷酸 和/或氨基酸序列同一'丨生的不同算法來確定的同一'丨生。在本文所描述的一些實施方案中， 采用ClustalW V. 1.83(慢）比對，使用開放空位罰分10. 0、延伸空位罰分0.1，以及采用 Gonnet 相似性矩陣（MACVECT0R?10. 0.2, MacVector Inc. ,2008)來確定同一性。對于序列 同一性而言所比較的序列的長度將取決于特定序列，但是在輕鏈恒定區(qū)的情況下，所述長 度應當包含足夠長度的序列以折疊成輕鏈恒定區(qū)，其能夠自締合以形成典型（canonical) 的輕鏈恒定區(qū)，例如，能夠形成兩個包括β鏈的β折疊并能夠與人或小鼠的至少一個C hI 結構域相互作用。在ChI結構域的情況下，所述序列的長度應當包含足夠長度的序列以折 疊成ChI結構域，其能夠形成兩個包括β鏈的β折疊并能夠與人或小鼠的至少一個輕鏈 恒定區(qū)相互作用。
[0156] 短語"免疫球蛋白分子"包括兩條免疫球蛋白重鏈和兩條免疫球蛋白輕鏈。所述 重鏈可以相同或不同，并且所述輕鏈可以相同或不同。
[0157] 短語"輕鏈"包括來自任何生物體的免疫球蛋白輕鏈序列，并且除非另有說明 包括人Κ和λ輕鏈和VpreB，以及替代輕鏈。除非另有說明，輕鏈可變（\)區(qū)通常 包括三個輕鏈CDR和四個框架（FR)區(qū)。通常，全長輕鏈包括，從氨基端到羧基端，包括 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的V1結構域，以及輕鏈恒定區(qū)。輕鏈包括例如不選擇 性結合第一或第二表位的輕鏈，所述第一或第二表位被所述輕鏈在其中出現的表位結合蛋 白選擇性結合。輕鏈還包括那些結合并識別，或協(xié)助重鏈結合和識別，一個或多個表位的輕 鏈，所述一個或多個表位被所述輕鏈在其中出現的表位結合蛋白選擇性結合。共同輕鏈是 源自重排的人Vk 1-39J κ 5序列或重排的人Vk 3-20J κ 1序列的那些，并且包括體細胞突 變（例如，親和力成熟的）的版本。
[0158] 短語"微摩爾范圍"旨在指1-999微摩爾；短語"納摩爾范圍"旨在指1-999納摩 爾；短語"皮摩爾范圍"旨在指1-999皮摩爾。
[0159] 短語"體細胞突變的"包括提及來自已經經過類別轉換的B細胞的核酸序列，其 中經過類別轉換的B細胞中的免疫球蛋白可變區(qū)的核酸序列（例如重鏈可變區(qū)或包括重 鏈CDR或FR序列）與類別轉換之前的B細胞中的核酸序列不同，例如在沒有經歷類別轉 換的B細胞和經歷類別轉換的B細胞之間的CDR或框架核酸序列的不同。"體細胞突變的" 包括提及與沒有親和力成熟的B細胞中的相應的免疫球蛋白可變區(qū)序列（即生殖系細胞 的基因組中的序列）相比不同的來自親和力成熟的B細胞的核酸序列。短語"體細胞突變 的"還包括提及B細胞暴露給感興趣的表位之后來自B細胞的免疫球蛋白可變區(qū)核酸序列， 其中所述核酸序列與B細胞暴露給感興趣的表位之前的相應核酸序列不同。短語"體細胞 突變的"指已經在例如具有人免疫球蛋白可變區(qū)核酸序列的小鼠的動物中應答免疫原刺激 (challenge)產生的并且由該動物的內在運行的選擇過程產生的抗體的序列。
[0160] 術語"未重排的"在涉及序列時，包括存在于動物生殖系細胞中的核酸序列。
[0161] 短語"可變區(qū)（variable domain) "包括免疫球蛋白輕鏈或重鏈的氨基酸序列（修 改為需要的），其包括以下氨基酸區(qū)，以從N-末端到C-末端的順序（除非另外指明）：FR1、 CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
[0162] 共同輕鏈
[0163] 之前制備有用的多特異性表位結合蛋白例如雙特異性抗體的努力已經被各種問 題阻礙，其共同的模式是：序列的體外選擇或操作以合理地工程化，或通過試錯法工程化， 試錯法是配對異源二聚化雙特異性人免疫球蛋白的合適的形式。不幸的是，即便可行，大部 分（如果不是全部的話）體外工程化方法也主要提供僅適于單個分子的措施。另一方面， 采用復雜有機體以選擇合適的能夠獲得人類治療劑的配對的體內方法還沒有實現。
[0164] 一般來說，天然小鼠序列往往不是人類治療序列的很好的來源。至少這個原因，產 生與人類共同輕鏈配對的小鼠免疫球蛋白重鏈可變區(qū)具有有限的實際效用。更多體外工程 化努力將消耗在嘗試人源化小鼠重鏈可變序列，同時希望保留表位特異性和親和力以及同 時保持結合共同人輕鏈的能力的試錯過程中，具有不確定的結果。在該過程結束時，最終產 物可能維持一些特異性和親和力，并與共同輕鏈締合，但最終人中的免疫原性可能會繼續(xù) 產生深遠的風險。
[0165] 因此，用于制備人類治療劑的合適的小鼠將會包括人重鏈可變區(qū)基因片段的適當 大的群以替換內源性小鼠重鏈可變區(qū)基因片段。所述人重鏈可變區(qū)基因片段應當能夠重排 并與內源性小鼠重鏈恒定區(qū)重組以形成反向嵌合重鏈（即，包括人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的 重鏈）。所述重鏈應當能夠進行類別轉換和體細胞超變，使得可獲得人重鏈可變區(qū)基因片段 的適當大的群以便小鼠選擇一個可以結合人輕鏈可變區(qū)的有限的群的重鏈。
[0166] 對于多條重鏈選擇共同輕鏈的小鼠具有實際應用。在各種實施方案中，在僅可表 達共同輕鏈的小鼠中表達的抗體會具有能夠結合相同或基本上相同輕鏈并與其一起表達 的重鏈。這對于制備雙特異性抗體尤其有用。例如，這樣的小鼠可以用第一免疫原免疫以 產生表達特異性結合第一表位的抗體的B細胞。所述小鼠（或遺傳相同的小鼠）可以用第 二免疫原免疫以產生表達特異性結合第二表位的抗體的B細胞?？勺冎劓渽^(qū)可以從B細 胞克隆并以相同的重鏈恒定區(qū)以及相同的輕鏈表達，并且在細胞中表達以制備雙特異性抗 體，其中所述雙特異性抗體的輕鏈組分已經由小鼠選擇來結合所述輕鏈組分的小鼠并與所 述輕鏈組分一起表達。
[0167] 發(fā)明人已經工程化小鼠用于產生免疫球蛋白輕鏈，其將適合與更多樣家族的重鏈 配對，包括其可變區(qū)與生殖系序列不同的重鏈，例如親和力成熟或體細胞突變的可變區(qū)。在 各種實施方案中，所述小鼠被設計用于將人輕鏈可變區(qū)與包括體細胞突變的人重鏈可變區(qū) 配對，從而使得高親和力結合蛋白適用做人治療劑的途徑成為可能。
[0168] 通過有機體內抗體選擇的長而復雜的過程，遺傳工程化的小鼠使得用有限種類的 人輕鏈選擇配對多樣的人重鏈可變區(qū)集合成為生物學上合適的選擇。為了達到該目標，小 鼠工程化以呈現有限種類的人輕鏈可變區(qū)選擇，其結合廣泛多樣的人重鏈可變區(qū)選擇。在 免疫原刺激后，所述小鼠在其群中最大化解決方案個數以開發(fā)免疫原的抗體，其主要或僅 僅受限于在其群中輕鏈的選擇個數。在各種實施方案中，這包括允許小鼠實現輕鏈可變區(qū) 的合適的并且相容性的體細胞突變，但其將會與相對多種類的人重鏈可變區(qū)相容，尤其包 括體細胞突變的人重鏈可變區(qū)。
[0169] 為了獲得有限的輕鏈選擇群，所述小鼠被工程化以使得其制備或重排天然的小鼠 輕鏈可變區(qū)的能力變成非功能性或基本上非功能性。這可以通過例如缺失小鼠的輕鏈可變 區(qū)基因片段實現。然后，內源性小鼠基因座可由選擇的外源性合適的人輕鏈可變區(qū)基因片 段修飾，所述外源性合適的人輕鏈可變區(qū)基因片段可操作性連接內源性小鼠輕鏈恒定區(qū)， 該連接以使得外源性人輕鏈可變區(qū)基因片段可以結合內源性小鼠輕鏈恒定區(qū)基因并形成 重排的反向嵌合輕鏈基因（人可變、小鼠恒定）的方式進行。在各種實施方案中，所述輕鏈 可變區(qū)能夠被體細胞突變。在各種實施方案中，為了使得輕鏈可變區(qū)獲得體細胞突變的能 力最大化，合適的增強子被保留在小鼠中。例如，在修飾小鼠 κ輕鏈基因座以用人K輕鏈 基因片段替換內源性小鼠 κ輕鏈基因片段時，小鼠 Κ內含增強子和小鼠 Κ 3'增強子被功 能性維持，或未被破壞。
[0170] 本發(fā)明提供一種遺傳工程化的小鼠，其表達有限群的反向嵌合（人可變、小鼠恒 定）輕鏈，所述輕鏈結合各種反向嵌合（人可變、小鼠恒定）重鏈。在各種實施方案中，內 源性小鼠 κ輕鏈基因片段被缺失并用單一（或兩個）重排的人輕鏈區(qū)替換，所述人輕鏈區(qū) 可操作性連接內源性小鼠 Ck基因。在為了最大化重排的人輕鏈區(qū)的體細胞超變的實施方 案中，小鼠 κ內含增強子和小鼠 Κ 3'增強子被維持。在各種實施方案中，所述小鼠還包括 非功能性λ輕鏈基因座、或其缺失或使得基因座不能生產λ輕鏈的缺失。
[0171] 本發(fā)明提供一種遺傳工程化的小鼠，在各種實施方案中，包括輕鏈可變區(qū)基因座， 所述輕鏈可變區(qū)基因座缺乏內源性小鼠輕鏈\和1基因片段并包括重排的人輕鏈可變區(qū)， 在一個實施方案中包括重排的人序列，所述重排的人輕鏈可變區(qū)可操作性連接小鼠 恒定區(qū)，其中所述基因座能夠進行體細胞超變，并且其中所述基因座表達連接小鼠恒定區(qū) 的包括所述人/1序列的輕鏈。因此，在各種實施方中，所述基因座包括小鼠 κ 3'增強 子，其與正?；蛞吧偷捏w細胞超變水平相關。
[0172] 在各種實施方案中所述遺傳工程化的小鼠，當用感興趣的抗原免疫時，產生顯示 各種人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的重排的B細胞，所述重鏈可變區(qū)與一種或與兩種重排的輕 鏈一起表達并行使功能，包括這樣的實施方案，其中所述一種或者兩種輕鏈包括人輕鏈可 變區(qū)，其包括例如1至5個體細胞突變。在各種實施方案中，所表達的人輕鏈能夠結合任何 表達于小鼠的人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)并與其一起表達。
[0173] 結合多于一個表位的表位結合蛋白
[0174] 本發(fā)明所述的組合物和方法可用于制備結合蛋白，其以高親和性結合多于一個表 位，例如雙特異性抗體。本發(fā)明的優(yōu)點包括能夠選擇合適高結合（例如，親和力成熟）重鏈 免疫球蛋白鏈，其每一個會結合單一輕鏈。
[0175] 雙特異性結合蛋白的合成與表達已經存在問題，部分由于與鑒定合適的能夠結合 兩種不同重鏈并與其一起表達的輕鏈的相關問題，并且部分由于分離的問題。本文所述的 方法和組合物允許遺傳修飾的小鼠（否則通過天然過程）選擇合適的能結合多于一種重鏈 并與其一起表達的輕鏈，所述重鏈包括體細胞突變的重鏈（例如，親和力成熟）。來自本文 所述的免疫的小鼠的合適的B細胞（其表達具有反向嵌合重鏈（S卩，人可變和小鼠恒定）的 親和力成熟的抗體）的人 '和Vh序列，，可被鑒定并符合讀框地克隆至帶有合適的人恒定 區(qū)基因序列（例如，人IgGl)的表達載體中?？梢灾苽鋬煞N這樣的構建體，其中每個構建體 編碼結合不同表位的人重鏈可變區(qū)。人'之一（例如人Vk 1-39JK 5或人Vk 3-20JK 1)， 在生殖系序列中或來自其中所述序列已經是體細胞突變的B細胞，可以被符合讀框地融合 至合適的人恒定區(qū)基因（例如人κ恒定基因）。這三種全人重鏈和輕鏈構建體可以置于 合適的細胞中表達。所述細胞會表達兩個主要種類：帶有相同輕鏈的同源二聚化重鏈，以 及帶有相同輕鏈的異源二聚化重鏈。為了允許協(xié)助這些主要種類的分離，重鏈之一被修飾 以省略蛋白A結合決定簇，從異源二聚化結合蛋白得到不同親和力的同源二聚化結合蛋 白。闡述該項的組合物和方法見于USSN 12/832,838,于2010年6月25日遞交，名稱為 "Readily Isolated Bispecific Antibodies with Native Immunoglobulin Format，'，公開 為 US 2010/0331527A1。
[0176] 在一個方面，本發(fā)明提供本文所描述的表位結合蛋白，其中人'和Vh序列是源自 本文所述的已經用包括感興趣的表位的抗原免疫的小鼠。
[0177] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供表位結合蛋白，其包括第一和第二多肽，所述第一 多肽包括，從N-末端到C-末端，選擇性結合第一表位的第一表位結合區(qū)，然后是包括人IgG 的第一 CH3區(qū)的恒定區(qū)，所述IgG選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合；以及，第二多肽包括，從 N-末端到C-末端，選擇性結合第二表位的第二表位結合區(qū)，然后是包括人IgG的第二Ch3 區(qū)的恒定區(qū)，所述IgG選自IgGl、IgG2、IgG4及其組合，其中所述第：C h3區(qū)包括降低或消 除所述第二CH3區(qū)對蛋白A的結合的修飾。
[0178] 在一個實施方案中，所述第二CH3區(qū)包括H95R修飾（MGT外顯子編號；EU編號： H435R)。在另一個實施方案中，所述第二CH3區(qū)還包括Y96F修飾（MGT ;EU編號為Y436F)。
[0179] 在一個實施方案中，所述第二CH3區(qū)來自修飾的人IgGl，并且進一步包括選自由下 列組成的組的修飾：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82IαMGT ;EU為D356E、L358M、N384S、 K392N、V397M 以及 V422I)。
[0180] 在一個實施方案中，所述第二CH3區(qū)來自修飾的人IgG2,并且進一步包括修飾選自 下組：N44S、K52N 和 V82I (MGT ;EU 為 N384S、K392N 和 V422I)。
[0181] 在一個實施方案中，所述第二CH3區(qū)來自修飾的人IgG4,并且進一步包括選自由 下列組成的組的修飾：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q 和 V82I (MGT ;EU 編號為 Q355R、 N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q 和 V422I)。
[0182] 制備結合多于一個表位的表位結合蛋白的一種方法是用包括感興趣的第一表位 的抗原免疫根據本發(fā)明的第一小鼠，其中所述小鼠包括內源性免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)基因 座，其不含有能夠重排并形成輕鏈的內源性小鼠其中位于內源性小鼠免疫球蛋白輕鏈 可變區(qū)基因座的是單一重排的人'區(qū)，該重排的人'區(qū)可操作性連接小鼠內源性輕鏈恒定 區(qū)基因，并且所述重排的人 '區(qū)選自人V κ 1-39J κ 5和人V κ 3-20J κ 1，并且所述內源性小 鼠 Vh基因片段已經全部或部分用AVh基因片段替換，使得由小鼠制得的免疫球蛋白重鏈僅 僅是或基本上是包括人可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的重鏈。當免疫后，該小鼠會生產反向嵌合抗 體，僅包括兩種人輕鏈可變區(qū)的一種（例如，人Vk 1-39JK 5或人Vk 3-20JK 1之一）。一 旦鑒定編碼結合感興趣的表位的Vh的B細胞，所述Vh(以及，任選地，所述VJ的核苷酸序 列可以重新回收（retrieved)(例如，通過PCR)并克隆至符合讀框地帶有合適的人免疫球 蛋白恒定區(qū)的表達構建體中。可以重復該方法以鑒定結合第二表位的第二V h結構域，并且 第二Vh基因序列可以重新回收并克隆至符合讀框地帶有第二合適的人免疫球蛋白恒定區(qū) 的表達載體中。所述第一和所述第二免疫球蛋白恒定區(qū)可以為相同或不同的同種型，并且 所述免疫球蛋白恒定區(qū)之一（但不是另一個）可以如本文或US2010/0331527A1中所述進 行修飾，并且表位結合蛋白可以在合適的細胞中表達并基于其與同源二聚化表位結合蛋白 相比對蛋白A的不同親和力分離，例如US 2010/0331527A1中所述。
[0183] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供制備雙特異性表位結合蛋白的方法，包括從本文 所述的小鼠鑒定第一親和力成熟（例如，包括一個或多個體細胞超變）人Vh核苷酸序列 (VhI)，從本文所述的小鼠鑒定第二親和力成熟（例如，包括一個或多個體細胞超變）人Vh 核苷酸序列（Vh2)，與缺乏如US 2010/0331527A1中所述蛋白A決定簇修飾的人重鏈符合讀 框地克隆VH1，，以形成重鏈I (HCl)，與包括如US 2010/0331527A1中所述的蛋白A決定簇 修飾的人重鏈框架符合讀框地克隆VH2,以形成重鏈2 (HC2)，將包括HCl的表達載體和包括 HC2的相同或不同的表達載體引入細胞，其中所述細胞也表達人免疫球蛋白輕鏈，所述輕鏈 包括融合至人輕鏈恒定區(qū)的人V κ 1-39/J κ 5人或人V κ 3-20/J κ 1，使細胞表達包括由VhI 編碼的Vh結構域和由Vh2編碼的Vh結構域的雙特異性表位結合蛋白，以及基于其與單特異 性同源二聚化表位結合蛋白相比不同的結合蛋白A的能力分離所述雙特異性表位結合蛋 白。在一個具體的實施方案中，HCl是IgGl，并且HC2是包括H95R修飾（MGT ;EU為H435R) 并進一步包括Y96F修飾（MGT;EU為Y436F)的IgGl。在一個實施方案中，所述*VH1編碼 的V h結構域、由VH2編碼的Vh結構域、或二者，是體細胞突變的。
[0184] 與共同人'一起表達的Avh基因
[0185] 來自針對四種不同抗原產生的親和力成熟的抗體的各種人可變區(qū)與它們的關聯 輕鏈或者至少一種選自人￥1^1-3町1^5、人￥1^3-2(^1〇或人仆代81入5的人輕鏈一起表 達（參見實施例1)。對每個抗原的抗體，來自不同基因家族的體細胞成熟的高親和力重鏈 成功與重排的人生殖系V κ 1-39J κ 5和V κ 3-20J κ 1區(qū)配對，并從表達所述重鏈和輕鏈的 細胞分泌。對于Vk 1-39JK5和Vk3-20Jk 1，源自以下人Vh基因家族的Vh結構域被優(yōu) 先表達：1-2、1-8、1-24、2-5、3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-20、3-23、3-30、3-33、3-48、4-31、 4-39、4-59、5_51和6-1。因此，工程化以表達來自Vk 1-39JK 5和Vk 3-20JK 1的一個或 二者的人'結構域的有限群的小鼠會WVh基因座修飾以用人Vh基因片段替換小鼠 Vh基因 片段產生多種群體的體細胞突變的人Vh結構域。
[0186] 遺傳工程化以表達與單一重排輕鏈（例如，Vk 1-39/J或Vk 3-20/J)結合的反向 嵌合（人可變、小鼠恒定）免疫球蛋白重鏈的小鼠，當用感興趣的抗原免疫后，產生包括各 種人V h重排并表達各種高親和力抗原特異性抗體的B細胞，所述特異性抗體具有在阻斷抗 原與其配體結合的能力和結合抗原的變體的能力方面的各種特性（參見實施例5-10)。
[0187] 因此，本發(fā)明所描述的小鼠和方法在制備和選擇人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)中是有 用的，包括體細胞突變的人重鏈可變區(qū)，其是各種重排的結果，顯示廣泛的親和力（包括顯 示大約納摩爾或更低的Kd)、廣泛的特異性（包括結合相同抗原的不同表位），并且結合相 同或基本上相同的人免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)并與其一起表達。
[0188] 以下提供的實施例是使得本領域普通技術人員知曉如何制備和使用本發(fā)明的方 法和組合物，并且不是旨在限制發(fā)明人在其發(fā)明中的保護范圍。已經努力確保所使用的數 字（例如，量、溫度等）的準確性，但某些實驗錯誤和偏差應予以考慮。除非另外指明，份是 重量份，分子量是平均分子量，溫度是攝氏度，以及壓力是大氣壓或接近大氣壓。 實施例
[0189] 以下提供的實施例是使得本領域普通技術人員知曉如何制備和使用本發(fā)明的方 法和組合物，并且不是旨在限制發(fā)明人在其發(fā)明中的保護范圍。已經努力確保所使用的數 字的準確性（例如，量、溫度等），但某些實驗錯誤和偏差應予以考慮。除非另外指明，溫度 是攝氏度，壓力是大氣壓或接近大氣壓，份是重量份，以及分子量是平均分子量。
[0190] 實施例1
[0191] 結合所選人輕鏈可變區(qū)的人重鏈可變區(qū)的鑒定
[0192] 構建體外表達系統(tǒng)以確定單一重排的人生殖系輕鏈能否與來自抗原特異性人抗 體的人重鏈共表達。
[0193] 在遺傳修飾的小鼠中產生人抗體的方法是已知的（參見例如， US 6，596，541，Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE? )。 VELOCIMMUNE?.技術涉及產生具有包括可操作性連接內源性小鼠恒定區(qū)基因座 的人重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因組的遺傳修飾小鼠，這樣所述小鼠響應抗原刺激生產包括人 可變區(qū)和小鼠恒定區(qū)的抗體。編碼由VELOCIMMUNE?小鼠生產的抗體的重鏈和 輕鏈的可變區(qū)的DNA是全人的。最初，高親和力的嵌合抗體是分離的具有人可變區(qū)和小鼠 恒定區(qū)。如下所述，抗體被表征并因為期望的性質被選中，包括親和力、選擇性、表位等。小 鼠恒定區(qū)被期望的人恒定區(qū)替換以產生含有非IgM同種型的全人抗體，例如，野生型或修 飾的IgGl、IgG2、IgG3或IgG4。盡管所選擇的恒定區(qū)可以根據具體的用途改變，但高親和 力抗原結合和靶特異性位于可變區(qū)中。
[0194] VELOCIMMUNE?小鼠用促進血管生成的生長因子（抗原C)免疫，分離 抗原特異性人抗體并且采用本領域已知標準技術測序V基因使用。選定的抗體克隆到人 重鏈和輕鏈恒定區(qū)并且選擇69個重鏈用于和三個人輕鏈之一配對：（1)關聯κ輕鏈連接 人κ恒定區(qū)，⑵重排的人生殖系Vk 1-39J K 5連接人κ恒定區(qū)，⑶重排的人生殖系 V κ 3-20J κ 1連接人κ恒定區(qū)，每個重鏈和輕鏈對采用標準技術共轉染入CHO-Kl細胞。用 抗人IgG在ELISA分析中檢測上清中抗體的存在。對每個重鏈/輕鏈對確定抗體滴度（ng/ ml)以及不同重排的生殖系輕鏈的滴度與所獲得的親本抗體分子（即，與關聯輕鏈配對的 重鏈）的滴度比較并計算天然滴度（native titer)的百分比（表1)。VH:重鏈可變基因。 ND在當前實驗條件下沒有檢測到表達。
[0195] 表 1
[0196]

【權利要求】
1. 一種響應抗原挑戰(zhàn)表達一群抗原特異性抗體的小鼠，其中所述一群抗原特異性抗體 的所有免疫球蛋白輕鏈包括源自相同的單一人'基因片段的人輕鏈可變（VJ區(qū)以及免疫 球蛋白重鏈包括源自人％基因片段的人重鏈可變（V H)區(qū)，所述Avh基因片段選自νΗ1-2、 Vh1-3、Vh1-8、Vh1-18、Vh1-24、V h1-46、Vh1-58、Vh1-69、Vh2-5、V h2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、 Vh3-11、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-20、V h3-21、Vh3-23、Vh3-30、Vh3-33、V h3-43、Vh3-48、Vh3-53、 Vh3-64、Vh3-72、Vh3-73、Vh4-31、V h4-34、Vh4-39、Vh4-59、Vh5-51、V h6-1。
2. 權利要求1所述的小鼠，其中相同的單一人'基因片段是人Vk 1-39基因片段。
3. 權利要求1所述的小鼠，其中相同的單一人'基因片段是人Vk 3-20基因片段。
4. 權利要求1所述的小鼠，其中所有免疫球蛋白輕鏈包括人輕鏈ja)基因片段。
5. 權利要求4所述的小鼠，其中所述人叉基因片段選自人J κ 1和J κ 5基因片段。
6. 權利要求1所述的小鼠，其中所述小鼠缺少選自小鼠免疫球蛋白 '基因片段、小鼠 免疫球蛋白1基因片段及其組合的序列。
7. 權利要求1所述的小鼠，其中所述人'區(qū)可操作性連接人、小鼠或大鼠免疫球蛋白 輕鏈恒定（CJ區(qū)。
8. 權利要求1所述的小鼠，其中所述人'區(qū)由內源性免疫球蛋白輕鏈基因座表達。
9. 權利要求1所述的小鼠，其中所述人VH區(qū)可操作性連接人、小鼠或大鼠免疫球蛋白 重鏈恒定（CH)區(qū)。
10. 權利要求1所述的小鼠，其中所述人VH區(qū)由內源性免疫球蛋白重鏈基因座表達。
11. 一種響應抗原挑戰(zhàn)表達一群抗原特異性抗體的小鼠，其中所述一群抗原特異性抗 體的所有免疫球蛋白輕鏈包括源自人Vk 1-39基因片段的人'區(qū)以及免疫球蛋白重鏈包 括源自人％基因片段的人重鏈可變（VH)區(qū)，所述、V H基因片段選自Vh1-18、Vh1-69、Vh2-5、 Vh3-9、Vh3-13、Vh3-15、Vh3-20、V h3-23、Vh3-30、Vh3-48、Vh3-53、V h3-64、Vh4-31、Vh4-34、 Vh4-39、Vh4-59、Vh5-51 和 Vh6-1。
12. 權利要求11所述的小鼠，其中所述人八區(qū)包括Jk 5序列。
13. 權利要求11所述的小鼠，其中所述小鼠缺乏小鼠免疫球蛋白'和/或叉基因片 段。
14. 權利要求11所述的小鼠，其中所述人 '區(qū)可操作性連接人、小鼠或大鼠免疫球蛋 白輕鏈恒定（CJ區(qū)。
15. 權利要求11所述的小鼠，其中所述人'區(qū)由內源性免疫球蛋白輕鏈基因座表達。
16. 權利要求11所述的小鼠，其中所述人VH區(qū)包括編碼人JH區(qū)的序列，所述人JH區(qū)選 自人 JH1、JH2、JH3、JH4、JH5 和 JH6 基因片段。
17. 權利要求11所述的小鼠，其中所述人VH區(qū)可操作性連接人、小鼠或大鼠免疫球蛋 白重鏈恒定（Ch)區(qū)。
18. 權利要求11所述的小鼠，其中所述人 '區(qū)可操作性連接人、小鼠或大鼠免疫球蛋 白輕鏈恒定（CJ區(qū)。
19. 一種響應抗原挑戰(zhàn)表達一群抗原特異性抗體的小鼠，其中所述一群抗原特異性抗 體的所有免疫球蛋白輕鏈包括源自人Vk 3-20基因片段的人\區(qū)以及免疫球蛋白重鏈包 括源自人％基因片段的人重鏈可變（VH)區(qū)，所述、V H基因片段選自Vh1-18、Vh1-69、Vh2-70、 Vh3-11、Vh3-30、Vh3-33、Vh3-53、V h4-39、Vh4-59、Vh5-51 和 Vh6-1。
20. 權利要求19所述的小鼠，其中所述人'區(qū)包括Jk 5序列。
21. 權利要求19所述的小鼠，其中所述小鼠缺乏小鼠免疫球蛋白'和/或叉基因片 段。
22. 權利要求19所述的小鼠，其中所述小鼠缺乏小鼠免疫球蛋白'和/或叉基因片 段。
23. 權利要求19所述的小鼠，其中所述人'區(qū)由內源性免疫球蛋白輕鏈基因座表達。
24. 權利要求19所述的小鼠，其中所述人VH區(qū)包括編碼人JH區(qū)的序列，所述人JH區(qū)選 自人J H2、JH3、JH4、JH5和JH6基因片段。
25. 權利要求19所述的小鼠，其中所述人VH區(qū)可操作性連接人、小鼠或大鼠免疫球蛋 白重鏈恒定（Ch)區(qū)。
26. 權利要求19所述的小鼠，其中所述人VH區(qū)由內源性免疫球蛋白重鏈基因座表達。
27. 提供一種制備遺傳修飾的小鼠的方法，包括用人VH基因片段替換所有或基本上所 有位于內源性小鼠重鏈基因座的小鼠 VH基因片段；其中所述小鼠被遺傳修飾以包括不多 于一個或兩個重排的人輕鏈'/1序列替換所有小鼠輕鏈基因片段；其中所述人重鏈可變 基因片段連接小鼠恒定基因，并且所述重排的人輕鏈序列連接人或小鼠恒定基因；其中所 述人 VH 基因片段選自 Vh1_2、Vh1_3、Vh1-8、Vh1-18、V h1-24、Vh1-46、Vh1-58、Vh1-69、V h2-5、 Vh2-26、Vh2-70、Vh3-7、Vh3-9、V h3-1 1、Vh3-1 3、Vh3-1 5、Vh3-20、Vh3-2 1、Vh3-23、Vh3-30、Vh3-33、 Vh3-43、Vh3-48、Vh3-53、Vh3-64、V h3-72、Vh3-73、Vh4-3 1、Vh4-34、Vh4-39、Vh4-59、Vh5-5 1、Vh6-1 及其組合。
28. 權利要求27所述的方法，其中所述兩個重排的人輕鏈基因片段包括重排的 V κ 1-39/J、重排的V κ 3-20/J及其組合。
【文檔編號】C12N15/85GK104244709SQ201380012671
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年3月5日 優(yōu)先權日:2012年3月6日
【發(fā)明者】R·巴布, J·麥克沃特, L·麥克唐納, S·史蒂文斯, S·戴維斯, D·R·巴克勒, K·A·馬爾, A·J·莫菲 申請人:瑞澤恩制藥公司