使用了嵌入劑的變異基因的識(shí)別檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明的課題在于提高利用LH法得到的變異型DNA與探針的雜交體或/和野生型DNA與探針的雜交體的分離中的分離能力。本發(fā)明涉及“一種變異型DNA或/和野生型DNA的檢測(cè)方法，其包括以下工序：（1)使具有置換堿基、缺損堿基區(qū)域、或者插入堿基區(qū)域的單鏈DNA(變異型DNA)中的至少1種或/和與其對(duì)應(yīng)的野生型單鏈DNA(野生型DNA)與和兩單鏈DNA雜交的探針接觸，形成與變異型DNA的雜交體（變異型雜交體）或/和與野生型DNA的雜交體（野生型雜交體）的工序(其中，變異型雜交體和野生型雜交體中的至少1種具有環(huán)結(jié)構(gòu)）；(2)使所得到的變異型雜交體或/和野生型雜交體與嵌入劑接觸的工序；和（3)對(duì)變異型雜交體與嵌入劑的結(jié)合體或/和野生型雜交體與嵌入劑的結(jié)合體進(jìn)行分離，從而檢測(cè)變異型DNA或/和野生型DNA的有無的工序”。
【專利說明】使用了嵌入劑的變異基因的識(shí)別檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及使用了嵌入劑的基于環(huán)雜交法的變異型DNA或野生型DNA的高精度檢 測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，在各種領(lǐng)域中逐漸重視特定基因中的變異的有無。例如，在法醫(yī)學(xué)中的 DNA鑒定中，作為個(gè)體識(shí)別的方法，對(duì)由于DNA中的變異或多態(tài)性所致的單堿基置換的有無 進(jìn)行確認(rèn)的做法是眾所周知的。另外，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中還已知在特定的基因多態(tài)性與藥物敏 感性之間具有相關(guān)關(guān)系，通過調(diào)查特定的基因多態(tài)性，實(shí)現(xiàn)了藥害風(fēng)險(xiǎn)的降低。另外，還被 用于遺傳性疾病的變異型DNA持有者的檢測(cè)等，基因變異的檢測(cè)比以前更加重要。
[0003] 另外，作為基因變異的檢測(cè)法，已知下述環(huán)雜交法（LH法）：其在DNA片段的PCR反 應(yīng)后的反應(yīng)液中添加單鏈低聚DNA而與目標(biāo)DNA片段雜交，根據(jù)所得到的雜交體的結(jié)構(gòu)差 異用電泳法分離，并根據(jù)需要使嵌入劑反應(yīng)，判斷所分離的變異基因（專利文獻(xiàn)1、非專利 文獻(xiàn)1)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005] 專利文獻(xiàn)
[0006] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2007-61080
[0007] 非專利文獻(xiàn)
[0008]非專利文獻(xiàn) I :Clinica Chimica Acta, 412, 1688-1672


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 發(fā)明要解決的課題
[0010] 上述LH法是變異型DNA的檢測(cè)中有用的方法，但具有難以分離檢測(cè)堿基數(shù)相同的 序列的變異型DNA和野生型DNA、或堿基數(shù)相同的序列的變異型DNA彼此的問題。因此，本 發(fā)明的課題在于提高利用LH法得到的變異型DNA與探針的雜交體或/和野生型DNA與探 針的雜交體的分離能力。
[0011] 用于解決課題的方案
[0012] 鑒于上述狀況，本發(fā)明人進(jìn)行了深入研究，結(jié)果意外地發(fā)現(xiàn)：若使由LH法得到的 雜交體與嵌入劑接觸并用電泳進(jìn)行分離，即用電泳對(duì)雜交體與嵌入劑的結(jié)合體進(jìn)行分離， 則分離能力提高，能夠分離檢測(cè)堿基數(shù)相同的序列的變異型DNA和野生型DNA、或堿基數(shù)相 同的序列的變異型DNA彼此，由此完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明涉及：
[0013] "一種變異型DNA或/和野生型DNA的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下的工序 ⑴?⑶：
[0014] (1)使具有置換堿基、缺損堿基區(qū)域、或者插入堿基區(qū)域的單鏈DNA (變異型DNA) 中的至少1種或/和與其對(duì)應(yīng)的野生型單鏈DNA (野生型DNA)與和兩單鏈DNA雜交的探針 接觸，形成與變異型DNA的雜交體（變異型雜交體）或/和與野生型DNA的雜交體（野生 型雜交體）的工序（其中，變異型雜交體和野生型雜交體中的至少1種具有環(huán)結(jié)構(gòu)）；
[0015] (2)使所得到的變異型雜交體或/和野生型雜交體與嵌入劑接觸的工序；
[0016] (3)對(duì)變異型雜交體與嵌入劑的結(jié)合體或/和野生型雜交體與嵌入劑的結(jié)合體進(jìn) 行分離，從而檢測(cè)變異型DNA或/和野生型DNA的工序"。
[0017] 發(fā)明的效果
[0018] 根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，由于變異型雜交體與野生型雜交體、或者變異型雜交體 彼此的分離能力高，因而即使在變異型DNA與野生型DNA為相同堿基數(shù)的情況下，而且即使 變異型DNA有復(fù)數(shù)個(gè)且其變異型DNA為相同堿基數(shù)的情況下也能夠分離識(shí)別，其結(jié)果，即便 是具有各種多態(tài)性的變異型DNA，也能夠檢測(cè)變異型DNA和野生型DNA。特別是，在使用電 泳法的情況下可顯著表現(xiàn)出上述效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是在實(shí)施例1中使利用EGFR基因中的野生型DNA (N)和變異型DNA (Gl?G5) 得到的環(huán)雜交反應(yīng)產(chǎn)物（LH反應(yīng)產(chǎn)物）在嵌入劑的共存下用微芯片電泳進(jìn)行分離分析的結(jié) 果。
[0020] 圖2是在比較例1中使利用EGFR基因中的野生型DNA (N)和變異型DNA (Gl?G5) 得到的Cy5標(biāo)記LH反應(yīng)產(chǎn)物在嵌入劑的非共存下用微芯片電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0021] 圖3是在比較例2中使EGFR基因中的野生型DNA(N)和變異型DNA(Gl?G5)在 嵌入劑的共存下用微芯片電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0022] 圖4是在比較例3中使利用EGFR基因中的野生型DNA (N)和變異型DNA (Gl?G5) 得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物用凝膠電泳泳動(dòng)后，添加嵌入劑所測(cè)定的分離分析結(jié)果。
[0023] 圖5是在比較例4中使利用EGFR基因中的野生型DNA (N)和變異型DNA (Gl?G5) 得到的Cy5標(biāo)記LH反應(yīng)產(chǎn)物在嵌入劑的非共存下用凝膠電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0024] 圖6是在實(shí)施例2中使利用KRAS基因中的野生型DNA(WT)和變異型DNA (G12W) 得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物在嵌入劑的共存下用微芯片電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0025] 圖7是在比較例5中使利用KRAS基因中的野生型DNA(WT)和變異型DNA (G12W) 得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物在嵌入劑的非共存下用微芯片電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0026] 圖8是在實(shí)施例3和比較例6中使利用IDHl中的野生型DNA和變異型DNA得到 的LH反應(yīng)產(chǎn)物在嵌入劑的共存下和非共存下用凝膠電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0027] 圖9是在實(shí)施例4中使利用IDHl中的野生型DNA和變異型DNA得到的LH反應(yīng)產(chǎn) 物在嵌入劑的共存下用微芯片電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0028] 圖10是在比較例7中使利用IDHl中的野生型DNA和變異型DNA得到的LH反應(yīng) 產(chǎn)物在嵌入劑的非共存下用微芯片電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0029] 圖11是在實(shí)施例5和比較例8中使利用ALDH2基因中的野生型DNA和變異型DNA 得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物在嵌入劑的共存下或非共存下用凝膠電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0030] 圖12是在實(shí)施例6和比較例9中使利用ALDH2基因中的野生型DNA和變異型DNA 得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物在嵌入劑的共存下或非共存下用微芯片電泳進(jìn)行分離分析的結(jié)果。
[0031] 圖13是在實(shí)施例7中將向利用EGFR基因中的野生型DNA (N)和變異型DNA (Gl? G5)得到的LH反應(yīng)產(chǎn)物中添加嵌入劑所得到的物質(zhì)作為試樣，用凝膠電泳進(jìn)行分離分析的 結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0032] 「本發(fā)明的奪異型DNA ?野牛型DNAI
[0033] 本發(fā)明的變異型DNA只要具有置換堿基、缺損堿基區(qū)域、或插入堿基區(qū)域（下文中 有時(shí)將它們統(tǒng)稱簡(jiǎn)記為變異堿基區(qū)域），且至少這些變異堿基區(qū)域的前后5?150堿基為已 知的單鏈DNA則可以使用任意的DNA。需要說明的是，本發(fā)明的變異型DNA還包括單堿基置 換DNA或微衛(wèi)星區(qū)域的重復(fù)堿基數(shù)不同的DNA等多態(tài)性DNA。作為這樣的DNA，為由動(dòng)物、 微生物、細(xì)菌、植物等生物分離的基因組DNA片段、能夠由病毒分離的DNA片段、和以mRNA 為模板所合成的cDNA片段等。在這樣的變異型DNA中，可以舉出來自人細(xì)胞的癌基因作為 優(yōu)選的變異型DNA。另外，形成雜交體的變異型DNA的鏈長(zhǎng)通常為20?2000堿基、優(yōu)選為 100?500堿基。
[0034] 關(guān)于上述變異堿基區(qū)域，置換堿基表示在變異為置換變異的情況下野生型DNA的 正常堿基通過變異而發(fā)生了置換的置換堿基，缺損堿基區(qū)域表示在變異為缺損變異的情況 下野生型DNA的正常堿基通過變異而發(fā)生了缺損的堿基部分，插入堿基區(qū)域表示在變異為 插入變異的情況下通過變異而插入野生型DNA中的堿基部分。需要說明的是，上述缺損堿 基區(qū)域和插入堿基區(qū)域通常為1?200堿基。另外，與本發(fā)明的變異型DNA和野生型DNA 雜交的探針由于將特定的變異堿基區(qū)域作為檢測(cè)對(duì)象而形成本發(fā)明的環(huán)結(jié)構(gòu)，因此除了作 為檢測(cè)對(duì)象的變異堿基區(qū)域以外，置換堿基、缺損堿基區(qū)域或插入堿基區(qū)域也可以存在于 本發(fā)明的變異型DNA中。
[0035] 關(guān)于本發(fā)明的野生型DNA，除了變異堿基區(qū)域外與本發(fā)明的變異型DNA的堿基序 列是相同的，其長(zhǎng)度與變異型DNA相同程度，通常為20?2000堿基、優(yōu)選為100?500堿 基。
[0036] 將與上述變異型DNA的變異部分對(duì)應(yīng)的野生型DNA的正常堿基部分稱為正常堿基 區(qū)域。在變異為置換變異的情況下，相對(duì)于通過變異而發(fā)生了置換的置換堿基的野生型DNA 的正常堿基（變異前的堿基）為正常堿基區(qū)域（正常堿基），在變異為缺損變異的情況下， 相對(duì)于通過變異而發(fā)生了缺損的堿基部分的野生型DNA的正常堿基部分（通過變異而發(fā)生 缺損的堿基部分）為正常堿基區(qū)域，在變異為插入變異的情況下，相對(duì)于通過變異而發(fā)生 了插入的堿基部分的野生型DNA的正常堿基部分為正常堿基區(qū)域。下面，示出關(guān)于變異堿 基區(qū)域和正常堿基區(qū)域的示意圖。
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種變異型DNA或/和野生型DNA的檢測(cè)方法，其包括以下的工序（1)?（3): ⑴使變異型DNA中的至少1種或/和野生型DNA與和兩單鏈DNA雜交的探針接觸，形 成與變異型DNA的雜交體即變異型雜交體或/和與野生型DNA的雜交體即野生型雜交體的 工序，所述變異型DNA是具有置換堿基、缺損堿基區(qū)域、或者插入堿基區(qū)域的單鏈DNA，所述 野生型DNA是與所述變異型DNA中的至少1種對(duì)應(yīng)的野生型單鏈DNA，其中，變異型雜交體 和野生型雜交體中的至少1種具有環(huán)結(jié)構(gòu)； (2) 使所得到的變異型雜交體或/和野生型雜交體與嵌入劑接觸的工序；和 (3) 對(duì)變異型雜交體與嵌入劑的結(jié)合體或/和野生型雜交體與嵌入劑的結(jié)合體進(jìn)行分 離，從而檢測(cè)變異型DNA或/和野生型DNA的有無的工序。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，環(huán)結(jié)構(gòu)包含置換堿基、缺損堿基區(qū)域或插入堿基區(qū) 域，或者包含正常堿基或正常堿基區(qū)域。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，環(huán)結(jié)構(gòu)具有莖結(jié)構(gòu)。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，對(duì)變異型雜交體與嵌入劑的結(jié)合體或/和野生型雜 交體與嵌入劑的結(jié)合體進(jìn)行分離的方法為電泳法。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中，嵌入劑是吖啶色素、乙錠化合物、碘化合物、7-氨基 放線菌素 D(7-AAD)、花青二聚物系色素、花青單體系色素、SYTOX系色素、GelRed系色素、與 DNA雙螺旋的小溝結(jié)合的物質(zhì)、或者與腺嘌呤-胸腺嘧啶序列特異性結(jié)合的物質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104220597SQ201380015360
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2013年3月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月22日
【發(fā)明者】松隈章一, 石川友一, 黑澤龍雄 申請(qǐng)人:和光純藥工業(yè)株式會(huì)社, 地方獨(dú)立行政法人神奈川縣立醫(yī)院, 機(jī)構(gòu)