用于生物測定的信號放大的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本文中公開了用于通過放大測定法檢測目標分析物的方法和系統(tǒng)。本發(fā)明的方法和系統(tǒng)利用已被偶聯(lián)于固體支持物(以進一步放大通過結合劑與目標分析物的相互作用產(chǎn)生的信號)的生物分子的高度特異性作為檢測存在于樣品中的低水平的目標分析物的手段。在某些實施方案中，對于其中將待鑒定的蛋白質直接或通過捕獲抗體結合于鈍化表面的免疫化學(例如，ELISA或RIA)或免疫熒光測定，可實現(xiàn)～10,000倍的放大。
【專利說明】用于生物測定的信號放大的方法和系統(tǒng)
[0001] 本申請要求2012年2月21日提交的美國臨時專利申請61/601，244的優(yōu)先權。將 美國臨時專利申請61/601，244的公開內容通過引用整體并入本文。 發(fā)明領域
[0002] 本發(fā)明涉及用于生物測定法的信號放大的方法和系統(tǒng)。
[0003] 背景
[0004] 免疫測定是用于研究和診斷測定的重要工具。因此，存在對提高這樣的測定的靈 敏度的需要。
[0005] 概述
[0006] 本發(fā)明的實施方案包括用于檢測目標分析物的放大方法和用于進行這樣的測定 法的試劑盒。本發(fā)明可以以多種方式體現(xiàn)。
[0007] 在一個實施方案中，本發(fā)明包括用于檢測目標分析物的方法，其包括：向目標分析 物中添加包含固體支持物的檢測支持物，所述固體支持物包含識別目標分析物并與其結合 的結合劑的多個分子；和檢測在檢測支持物上所述多個結合劑分子的至少一些結合劑分 子。在一個實施方案中，該方法還可包括添加捕獲支持物，該捕獲支持物包括至少一種捕獲 載體結合劑，其識別目標分析物并與其結合以將目標分析物固定在捕獲支持物上。在某些 實施方案中，該方法還可包括添加特異性識別檢測支持物上所述多個結合劑分子的至少一 些并與其結合的結合劑。在一些實施方案中，可特異性識別檢測支持物上所述多個結合劑 分子的至少一些并與其結合的結合劑可包含可檢測部分。
[0008] 在其它實施方案中，本發(fā)明包括用于進行本文中公開的方法的試劑盒。
[0009] 附圖概述
[0010] 本發(fā)明可通過參考下列非限定性附圖來更好地理解。
[0011] 圖1，圖框A和B舉例說明根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的一種測定法，其中圖框A 描述本發(fā)明的放大免疫測定的一個實施方案，圖框B描述現(xiàn)有技術的標準夾心免疫測定。
[0012] 圖2,圖框A-E舉例說明用于根據(jù)本發(fā)明的可選擇實施方案的目標蛋白的多種檢 測法。
[0013] 詳述
[0014] 定義
[0015] 除非本文中另外定義，否則與本發(fā)明結合使用的科學和技術術語具有為本領域技 術人員通常理解的含義。此外，除非另外地根據(jù)上下文要求，否則單數(shù)術語包括復數(shù)并且復 數(shù)術語包括單數(shù)。一般來說，與細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和 蛋白質及核酸化學以及本文中描述的雜交結合使用的術語和所述領域的技術是本領域中 公知的和通常使用的術語和技術。除非另有指出，否則通常按照本領域中公知的和各種一 般和更專業(yè)的參考資料中描述的常規(guī)方法進行已知的方法和技術，所述常規(guī)方法在整個本 說明書中進行了討論。按照制造商的說明書進行酶促反應和純化技術，如通常在本領域中 實現(xiàn)的或如本文中描述的。與本文中描述的實驗室方法和技術結合使用的術語是本領域公 知的和通常使用的那些術語。
[0016] 除非另外指出，否則下列術語將被理解為具有下列含義：
[0017] 如本文中所用，除非明確地另有所指，否則術語"一個/ 一種（a) "、"一個/ 一種 (an) "和"所指物（the) "可指一個/ 一種或多個/多種。
[0018] 除非明確地表示僅指供選項或供選項共同排斥，否則術語"或"的使用用于表示 "和/或"，盡管本公開內容支持僅指供選項和"和/或"的定義。如本文中所用，"另一個" 可表示至少第二個或更多個。
[0019] 在整個本申請中，術語"約"用于表示數(shù)值包括對于裝置、用于測定數(shù)值的方法的 固有誤差變化或存在于樣品間的變化。
[0020] 術語"固體支持物"或"支持物"意指提供生物分子可結合于其上的基底的結構。 例如，固體支持物可以是測定孔（即，例如微量滴定板），或固體支持物可以是陣列上的位 置，或可移動支持物例如珠粒。
[0021] 術語"抗體"包括單克隆抗體、多克隆抗體、合成抗體以及嵌合抗體，例如通過組 合誘變和噬菌體展示產(chǎn)生的。術語〃抗體〃還包括抗體的模擬物或擬肽。擬肽是基于肽 和蛋白質或從其衍生的化合物。本發(fā)明的擬肽通?？赏ㄟ^使用非天然氨基酸、構象限制 (conformational restraint)、電子等排取代等對已知肽序列進行結構修飾來獲得。
[0022] 術語"結合劑"是指可特異性和選擇性結合第二（即，不同的）目標分子的分子。 相互作用可以是非共價的，例如作為氫鍵合、范德瓦爾斯相互作用或靜電或疏水相互作用 的結果，或其可以是共價的。術語"可溶性結合劑"是指不與固體支持物結合（即，共價地 或非共價地結合的）的結合劑。
[0023] 如本文中所用，"分析物〃是指待測量的分子或化合物。在一些實施方案中，分析 物與結合劑相互作用。如本文中描述的，術語"分析物"可指目標蛋白或肽。分析物可以是 激動劑、拮抗劑或調節(jié)劑。或者，分析物可以不具有生物作用。分析物可包括小分子、糖、寡 糖、脂質、膚、擬膚、有機化合物等。
[0024] 術語"可檢測部分"或"可檢測生物分子"或"報道分子"是指可在定量測定中被 測量的分子。例如，可檢測部分可包括可用于將底物轉化成可被測量的產(chǎn)物（例如，可視產(chǎn) 物）的酶?；蛘?，可檢測部分可以是可被定量的放射性同位素?；蛘?，可檢測部分可以是熒 光基團?；蛘撸蓹z測部分可以是發(fā)光分子?；蛘?，可使用其它可檢測分子。
[0025] 如本文中所用，術語"等價帶（equivalence zone) "表示其中抗原和抗體的濃度導 致最大沉淀的沉淀素反應中的區(qū)域。因此，如果抗原或抗體過量，則沉淀不發(fā)生。
[0026] 信號放大的方法
[0027] 在某些方面，本發(fā)明使用已被偶聯(lián)至固體支持物以進一步放大信號的生物分子的 高度特異性作為檢測存在于樣品中的低水平的分析物（例如，目標蛋白）的手段。在某些 實施方案中，對于其中將待鑒定的蛋白質直接或通過捕獲抗體結合于鈍化表面的免疫化學 (例如，ELISA或RIA)或免疫熒光測定法，可實現(xiàn)至少10, 000倍的信號放大。
[0028] 因此，在某些實施方案中，本發(fā)明包括用于檢測目標分析物的方法，包括將檢測支 持物添加至目標分析物，所述檢測支持物包含含有識別目標分析物并與其結合的結合劑的 多個分子的固體支持物；和檢測存在于檢測支持物上的所述多個結合劑分子的至少一些。 在某些實施方案中，該方法還包括添加捕獲支持物，捕獲支持物包含識別目標分析物并與 其結合（以將目標分析物固定在捕獲支持物上）的至少一種捕獲支持物結合劑。在一個實 施方案中，將目標分析物結合于捕獲支持物，隨后與檢測支持物相互作用?；蛘?，可將目標 分析物在與檢測支持物相互作用后結合于捕獲支持物。在某些實施方案中，該方法還可包 括添加可特異性識別檢測支持物上的所述多個結合劑分子的至少一些并與其結合的結合 齊IJ。在一個實施方案中，可特異性識別檢測支持物上的多個結合劑分子的至少一些并與其 結合的結合劑是可溶性結合劑。
[0029] 在一個實施方案中，捕獲固體支持物可以是測定孔（S卩，例如微量滴定板）?；蛘?， 捕獲固體支持物可以是陣列上的位置或可移動支持物，例如珠粒。在一個實施方案中，檢測 支持物是可移動支持物例如珠粒。在某些實施方案中，目標分析物可存在于溶液中?；蛘?， 目標分析物可以是微生物和/或組織內部的蛋白質，從而在固定后，細胞中的大分子充當 捕獲支持物。例如，在一個實施方案中，免疫測定放大法可用于蛋白質的原位檢測。
[0030] 在一個實施方案中，將包含特異性識別目標分析物的結合劑的多個分子的檢測支 持物過量地添加至包含該目標分析物的樣品中。同樣地，在一個實施方案中，檢測支持物包 含包含可檢測部分的多個分子?；蛘撸斒褂每商禺愋宰R別檢測支持物上的多個結合劑分 子的至少一些并與其結合的結合劑時，可溶性結合劑可包含可檢測部分。
[0031] 多種結合劑可用于本發(fā)明的方法。例如，連接于檢測支持物的多個結合劑可以是 識別目標分析物的抗體或抗體片段。此外和/或可選擇地，連接于捕獲支持物的結合劑可 以是識別目標分析物的抗體或抗體片段。此外和/或可選擇地，可特異性識別檢測支持物 上的多個結合劑分子的至少一些并與其結合的結合劑可以是抗體或抗體片段?；蛘撸东@ 或檢測支持物的任一種上的結合劑、或可特異性識別檢測支持物上的多個結合劑分子的至 少一些并與其結合的結合劑可包括結合非蛋白質靶的蛋白（即，例如特異性結合小分子目 標分析物的蛋白或結合蛋白質的受體）。
[0032] 在一個實施方案中，可特異性識別檢測支持物上的多個結合劑分子的至少一些并 與其結合的結合劑不識別用于將目標分析物結合于捕獲固體支持物的捕獲結合劑。
[0033] 包含識別目標分析物的多個結合劑的檢測支持物的使用提供了信號的放大。在可 選擇的實施方案中，檢測支持物包含超過1，〇〇〇個，或超過10, 〇〇〇個，或超過100, 〇〇〇個， 或超過500, 000個，或超過1，000, 000個特異于目標分析物的結合劑分子。因此，在一些可 選擇的實施方案中，本發(fā)明的方法提供了超過在標準非放大免疫測定中看到信號的1，〇〇〇 倍，或10, 000倍，或100, 000倍，或500, 000倍，或1，000, 000倍的放大，所述標準非放大免 疫測定不包含含有多個檢測結合劑的檢測支持物。因此，在一些可選擇的實施方案中，本 發(fā)明的方法提供了范圍在于標準非放大免疫測定中看到的信號的1，〇〇〇至1，〇〇〇, 〇〇〇, 〇〇〇 倍，1，000 至 100, 〇〇〇, 000 倍，或 5, 000 至 10, 000, 000 倍，或 10, 000 至 1，000, 000 倍，或 10, 000至500, 000倍，或50, 000至500, 000倍內的放大，所述標準非放大免疫測定不包含 含有多個檢測結合劑的檢測支持物。或可實現(xiàn)這些范圍內的范圍。
[0034] 在某些實施方案中，目標分析物是蛋白質，結合劑是抗體。因此，在某些實施方案 中，本發(fā)明包括用于通過免疫測定進行蛋白質檢測的信號放大的方法。
[0035] 檢測支持物和/或捕獲支持物的使用可包括多種形式。
[0036] 例如，在一些實施方案中，可以首先將目標分析物結合于捕獲支持物，隨后使其與 檢測支持物相互作用。因此，該方法可包括將可特異性結合目標蛋白的多個結合劑連接于 捕獲支持物的步驟。該方法還可包括將目標分析物添加至捕獲支持物。隨后該方法可包括 向結合于捕獲支持物的目標分析物中添加包含特異于目標分析物的多個檢測結合劑的檢 測支持物，從而所述多個檢測結合劑的檢測提供信號的放大。
[0037] 同樣地，在某些實施方案中，該方法還可包括添加可特異性識別所述多個檢測結 合劑并與其結合的第三結合劑。在一個實施方案中，可特異性識別所述多個檢測結合劑并 與其結合的結合劑是可溶性結合劑。第三結合劑可包含可檢測部分。因此，在一些實施方 案中，進行本方法的步驟產(chǎn)生由捕獲支持物：捕獲結合劑：目標分析物：檢測結合劑：檢 測支持物：可溶性結合劑：可檢測部分組成的復合物。
[0038] 圖1A描述了根據(jù)上述形式的本發(fā)明放大免疫測定的一個實施方案。例如，如圖1A 中描述的，該方法可包括以下步驟：將多個結合劑208固定于捕獲固體支持物214,以便結 合劑可特異性識別目標蛋白206并將其捕獲。在一個實施方案中，該蛋白質可從細胞膜分 離或從目標細胞釋放，隨后被添加至固相。在一個實施方案中，連接于捕獲固體支持物的捕 獲結合劑是識別蛋白質的初級抗體或抗體片段。例如，在一個實施方案中，捕獲支持物214 可以是用針對目標蛋白206的抗體208(例如，兔抗體）涂覆的微量滴定板孔?；蛘?，可使 用其它結合劑例如識別特定配體的受體、可與互補序列雜交的核酸分子、識別特異性配體 的多糖、脂質、脂多糖、磷壁酸或脂磷壁酸等。固定化的抗體208可特異性識別目標分析物 206,而其它蛋白質或生物分子202、204不被結合。
[0039] 隨后，可添加利用也識別目標分析物206的檢測結合劑211的多個分子涂覆的檢 測支持物216 (例如，珠粒）。在一個實施方案中，檢測支持物可包含數(shù)千個至數(shù)萬，至數(shù) 十萬個檢測結合劑。在一個實施方案中，檢測結合劑為抗體。例如，捕獲結合劑可以是識別 目標蛋白的兔抗體，而檢測結合劑可以是也識別目標蛋白的豚鼠初級抗體。這樣，目標蛋白 206將包含識別目標蛋白206的多個檢測結合劑分子211的檢測支持物216連接于固定在 捕獲固體支持物214上的捕獲結合劑208。
[0040] 隨后，可添加識別檢測結合劑211的可溶性結合劑（例如，第二抗體例如抗豚鼠抗 體）212。在一個實施方案中，利用可檢測部分210 ( S卩，報道分子）標記可溶性結合劑212。 例如，可溶性結合劑可用熒光部分（例如，qDOTS?)或酶（例如，辣根過氧化物酶）標記。 或者，在一個實施方案中，第二支持物上的檢測結合劑可用這樣的可檢測部分標記。因此， 信號的極大放大可源自單個蛋白質分子206。
[0041] 因此，如圖1A中顯示的，由于蛋白質206可識別一抗（即，珠粒216上的豚鼠抗體 211和捕獲支持物214上的兔抗體208)，因此其可有助于珠粒216的至少一個與結合于固 體表面214的抗體208之間的夾心復合物形成。因此，在洗去任何未結合的珠粒216后，結 合于目標蛋白206的珠?？墒褂米R別結合于珠粒的一抗211的二抗212來檢測。在一個實 施方案中，將第二抗體連接于可檢測部分210例如酶、熒光基團、(JD0TS⑩等。
[0042] 因此，該方法可包括將多個結合劑固定于固體支持物（"捕獲支持物"）的步驟，以 便結合劑可特異性識別目標分析物并捕獲其。隨后，該方法可包括添加利用數(shù)萬個第二結 合劑（"檢測支持物"）涂覆的可移動第二支持物（例如，珠粒），所述第二結合劑可特異性 結合固定在第一支持物上的至少一個分子。該方法還可包括添加第三結合劑-報道分子復 合物（例如，偶聯(lián)至可檢測部分的可溶性結合劑）的步驟，所述復合物特異性結合第二支持 物上的所述多個第二結合劑的至少一些。隨后該方法可包括檢測由捕獲支持物：捕獲結合 齊IJ :目標分析物：檢測結合劑：檢測支持物：可溶性結合劑：可檢測部分組成的復合物的 步驟。如圖1A中舉例說明的，由于存在大量連接于檢測支持物216的結合劑分子211 (其 可結合具有報道分子210的可溶性結合劑212)，因此信號（S卩，結合于捕獲支持物214上的 結合劑208的蛋白206)的放大得到極大增強。
[0043] 圖1B提供了用于比較的現(xiàn)有技術內非放大免疫測定的圖解說明。因此，圖1B的免 疫測定包括包含捕獲支持物214:第一一抗208:目標分析物206:第二一抗211:二抗212: 可檢測部分210的夾心的形成。
[0044] 圖2舉例說明可用于檢測目標分析物的放大免疫測定的幾個可選擇的實施方案， 在所述測定中可改變將不同組分添加至測定法內的順序。
[0045] 如圖2A(方法1)中顯示的，在一些實施方案中，可將目標分析物結合于捕獲結合 劑230,隨后將捕獲結合劑連接于捕獲支持物240。隨后，可添加包含多個檢測結合劑211 的檢測支持物233。最后，添加包含可檢測部分210并識別檢測結合劑211的可溶性結合劑 212。
[0046] 例如，在一個實施方案中，添加特異于目標分析物206 (例如，目標蛋白）并用生物 素205標記的一抗230的分子（例如，兔）以結合溶液中的分析物分子206。生物素化抗 體230可特異性識別目標分析物206,而其它蛋白質或生物分子202、204不被結合。在該點 上，可添加磁性鏈霉抗生物素蛋白-涂覆的"捕獲"珠粒（或珠粒）240 (例如，直徑約1微 米）以定量地結合生物素化抗體-蛋白質復合物。在一個實施方案中，該方法可包括通過 添加生物素和牛血清白蛋白（BSA)來封閉珠粒-蛋白質復合物。
[0047] 在該點上，添加利用數(shù)千至數(shù)萬，至數(shù)十萬個第二種一抗211的分子（所述抗體識 別目標蛋白206,但在與生物素化捕獲抗體230不同的物種例如豚鼠中產(chǎn)生）涂覆的"檢測" 珠?；蚨鄠€珠粒233以結合分析物206上開放的未被占據(jù)的表位。檢測抗體211的量可使 用識別第二一抗211 (例如針對豚鼠一抗的抗-豚鼠抗體）的二抗212來檢測。在一個實施 方案中，二抗212用可檢測部分210進行標記。例如，二抗可用熒光部分（例如，tJDOTS? )或酶（例如，辣根過氧化物酶）進行標記。因此，信號的極大放大可源自單個蛋白質分子。
[0048] 圖2B (方法2)舉例說明了方法1的放大測定法的可選擇形式，但其中將包含檢測 結合劑分子211的檢測支持物或支持物233添加至具有捕獲結合劑230的測定孔，隨后添 加識別捕獲結合劑230的捕獲支持物240。一旦捕獲支持物：捕獲結合劑：目標分析物： 檢測結合劑：檢測支持物的復合物形成，就可添加利用可檢測部分210標記的可溶性結合 齊[J 212的分子。
[0049] 圖2C(方法3)舉例說明了方法1的測定法的可選擇形式，但其中包含多個檢測結 合劑211的檢測支持物或支持物233還包含連接于（例如，通過共價附著或涂覆表面）檢測 支持物的表面而非結合于分開的可溶性結合劑的可檢測部分210的多個分子。在一個實施 方案中，如果檢測支持物包含多個可檢測部分，則該方法可允許使用更少的檢測結合劑。例 如，檢測支持物上的可檢測部分：檢測結合劑的比例可以為1:1，或5:1，或10:1，或100:1， 或500:1,或1000:1或10, 000:1或更大?？蓹z測部分可包含熒光部分（例如，QD0TS? ) 或酶（例如，辣根過氧化物酶）。同樣地，可看出在該實施方案中，不需要使用可特異性識別 檢測支持物上的所述多個結合劑分子的至少一些并與其結合的結合劑（例如，可溶性抗體 212)。
[0050] 圖2D (方法4)舉例說明了方法3的測定法的可選擇形式，但其中在添加捕獲支持 物240之前，添加利用檢測結合劑211涂覆的檢測支持物或支持物233和多個可檢測部分 210。在一些實施方案中，同時添加利用檢測結合劑211涂覆的檢測支持物233以及多個可 檢測部分210和捕獲結合劑230。在一個實施方案中，這可促進目標分析物206和檢測支持 物233與捕獲結合劑230之間的復合物形成。
[0051] 圖2E (方法5)舉例說明了方法2的可選擇形式，但其中在添加捕獲結合劑230和 捕獲支持物240之前添加檢測支持物233。在一個實施方案中，這可促進目標分析物206與 檢測支持物233之間的復合物形成。
[0052] 可能非常重要的是可特異性識別檢測支持物上的所述多個結合劑分子的至少一 些和/或檢測結合劑并與其結合的結合劑不結合捕獲支持物或捕獲支持物結合劑，因為這 樣的結合可導致本底。因此，在某些實施方案中，檢測的步驟包括添加識別檢測珠粒上的檢 測一抗試劑的可溶性二抗，但其中可溶性二抗不識別用于將目標蛋白結合于捕獲支持物的 捕獲結合劑（例如，第 抗）。
[0053] 在某些實施方案中，捕獲和/或檢測固體支持物可利用鈍化劑處理。例如，在某些 實施方案中，可將目標分析物捕獲在鈍化的表面（即，經(jīng)處理而減少非特異性結合的表面） 上。一種這樣的鈍化劑為BSA。此外和/或可選擇地，當使用的結合劑是抗體時，可用蛋白 A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L或以高親和力結合結合劑抗體的另一種試劑涂覆捕獲和/或檢 測固體支持物。這些蛋白質結合抗體的Fc結構域，從而可使識別目標蛋白的抗體的結合定 向。
[0054] 檢測和/或捕獲支持物可以是聚苯乙烯珠粒或由相似的或其它材料制造的珠粒， 以便珠粒可用蛋白質涂覆，但不與測定中的其它組分反應。在某些實施方案中，珠粒是充 分大的，從而多個抗體分子可被連接于珠粒。例如，珠粒在尺寸上直徑可從〇. 1 μ m變化至 50 μ m，或從0· 2 μ m變化至40 μ m，或從0· 3 μ m變化至30 μ m，或從1 μ m變化至20 μ m，或 從1變化至15或約從1變化至3 μ m的范圍內。珠粒的尺寸可取決于待進行的測定法的尺 寸。對于在微量滴定孔中進行的測定法，可使用約1微米（μπι)的珠粒。
[0055] 在可選擇的實施方案中，檢測支持物可包含多個檢測結合劑。例如，在可選擇的實 施方案中，檢測支持物上結合劑的數(shù)量可以是超過1〇〇個，或超過500個，或超過1，000個， 或超過5, 000個，或超過10, 000個，或超過20, 000個，或超過50, 000個，或超過100, 000 個，或超過500, 000個，或超過1，000, 000個分子的檢測結合劑。例如，在一個實施方案中， 檢測支持物可包含利用數(shù)萬或數(shù)十萬個抗體分子涂覆的珠粒。在可選擇的實施方案中，對 于直徑約為15 μ m的檢測支持物珠粒，可存在約10, 000至10, 000, 000個，或約50, 000至 500, 000個，或約100, 000至1，000, 000個結合劑分子（例如，一抗）。對于具有不同尺寸 的檢測支持物珠粒，可使用對應的表面覆蓋度?；蛘撸蓪崿F(xiàn)在這些范圍內的范圍。
[0056] 如上所述，可將與酶或熒光材料（qDOTS?或其它熒光標記）復合的結合劑添加 至用作檢測支持物上的檢測結合劑的大量抗體。免疫化學（例如，ELISA)測定或熒光材料 的激發(fā)和可視化（在適當?shù)陌l(fā)射成像系統(tǒng)中）可用于定量蛋白質。在一個實施方案中，關 于大的信號放大倍數(shù)的關鍵是可容納檢測結合劑的結合的檢測支持物的大表面積。例如， 對于抗體，可將約>10, 〇〇〇和>100, 〇〇〇個分子用于分別涂覆1 μ m和2. 8 μ m的珠粒。
[0057] 被捕獲支持物上的目標分析物的分子占據(jù)的面積應當滿足至檢測支持物的表面 的可達性。例如，充當捕獲支持物并且具有1 μ m尺寸的1，000, 000個珠粒的二維匯合陣列 (confluent array)可占據(jù)約1mm2。在一個實施方案中，可將包含106個分子的目標分析物 的樣品的系列稀釋物用于固定化（例如，微量滴定孔）捕獲支持物，以便為每一個樣品應用 產(chǎn)生單獨的位置。對于可移動捕獲支持物（例如，珠粒），可結合的具有特定尺寸的檢測支 持物的數(shù)量可受到位阻效應限制。對于固定或可移動支持物，可結合被>1〇 4或>1〇5個一抗 涂覆的1 μ m或2. 8 μ m珠粒的目標分析物的各分子可通過ELISA、RIA或免疫熒光測定在標 記二抗結合后分別提供在該范圍內的放大。
[0058] 例如，在一個實施方案中，本發(fā)明可包括在間接免疫化學或免疫熒光測定中使信 號放大?10, 〇〇〇倍的方法，包括：將用蛋白A/G和>10, 000個特異于待鑒定的蛋白質的抗 體分子涂覆的聚苯乙烯檢測珠粒（直徑通常為1微米）連接于以適當?shù)拈g隔固定（直接或 通過特異性捕獲抗體）在鈍化的表面上或固定在捕獲珠粒上的蛋白質分子；通過洗滌除去 未結合的珠粒-抗體復合物；結合與例如酶或熒光材料((JD0TS?)或其它熒光標記復合的 二抗；和通過例如ELISA或通過熒光材料的激發(fā)和可視化（在適當?shù)陌l(fā)射成像系統(tǒng)中）定 量蛋白質。
[0059] 此外和/或可選擇地，目標分析物可存在于溶液中，并且測定法可包括使分析物 將多個檢測支持物連接在一起作為檢測分析物的裝置。例如，可將溶液中的蛋白質用于連 接多個檢測珠粒（例如，直徑約15至20 μ m)、檢測珠粒各自具有多個抗體，從而通過對兩 個珠粒上的抗體的結合促進珠粒凝集。當使用多克隆抗血清（這樣的抗血清將允許抗體識 別目標蛋白上的不同表位）時，這可以特別有效?？蓽y試蛋白質的系列稀釋物的最大珠粒 凝集，以確定抗體-珠粒和蛋白質的最佳濃度，即等價帶?？贵w過量的前帶效應（prozone effect)是不可能的，因為抗體被固定在珠粒上。
[0060] 在另一個實施方案中，當目標分析物在微生物內或組織樣品內時，可將樣品中的 細胞濃縮至具有適當孔徑的過濾器（例如，對于細菌，通常地0. 45 μ m的旋轉過濾器）的表 面上。濃縮后，可在小體積的緩沖液（如本文中描述的）中裂解它們，以釋放目標分析物的 分子?？蓪繕朔治鑫锏募毎呀馕飶倪^濾器表面轉移至載玻片或微量滴定板的孔 中。在該點上，目標分析物（例如，蛋白質）可通過在添加?300至?1，000個大的（通常 直徑15至20 μ m)用蛋白G、蛋白A或蛋白A/G和特異性抗體涂覆的聚苯乙烯珠粒后網(wǎng)格的 形成來鑒定。珠粒凝集可直接看到或借助50至100倍的放大來看到。再次地，抗體在珠粒 上的固定可消除前帶效應；然而，可能需要與恒定數(shù)量的珠粒-抗體復合物混合的蛋白質 的系列稀釋物來觀察因可能的抗原過量導致的珠粒凝集。與已知量的目標分析物聚集（凝 集）的珠粒-蛋白G-抗體復合物可用作陽性對照，無任何目標分析物（例如，來自已知的 陰性對照的裂解物）的緩沖液中的未聚集珠粒-蛋白G-抗體復合物可用作陰性對照。
[0061] 用于信號放大的試劑念
[0062] 在可選擇的實施方案中，本發(fā)明可包括進行本發(fā)明的方法的試劑盒。在一個實施 方案中，本發(fā)明可包括用于測定目標分析物的試劑盒，其包括檢測支持物，所述檢測支持物 包含含有可識別目標分析物并與其結合的多個結合劑分子的固體支持物。在一個實施方案 中，試劑盒可包括捕獲支持物，該捕獲支持物包含識別目標分析物并與其結合的至少一種 捕獲支持物結合劑。在一些實施方案中，試劑盒還可包含可特異性識別檢測支持物上的多 個結合劑分子并與其結合的結合劑。在一個實施方案中，可特異性識別檢測支持物上的多 個結合劑分子并與其結合的結合劑是可溶性結合劑。
[0063] 檢測和/或捕獲支持物可包括多種形式。在一個實施方案中，捕獲固體支持物可 以是測定孔（即，例如微量滴定板）。或者，捕獲固體支持物可以是陣列上的位置，或可移動 支持物例如珠粒。在一個實施方案中，檢測支持物是可移動支持物例如珠粒。
[0064] 多種結合劑可用于本發(fā)明的試劑盒。例如，所述多個連接于檢測支持物的結合劑 分子可以是識別目標分析物的抗體或抗體片段的分子。此外和/或可選擇地，連接于捕獲 支持物的結合劑可以是識別目標分析物的抗體或抗體片段。此外和/或可選擇地，可特異 性識別檢測支持物上的多個結合劑分子并與其結合的結合劑可以是抗體或抗體片段。在實 施方案中，可特異性識別檢測支持物上的多個結合劑分子并與其結合的結合劑不識別用于 將目標分析物結合于捕獲固體支持物的捕獲結合劑?；蛘撸东@或檢測支持物任一者上的 結合劑，或可特異性識別檢測支持物上的多個結合劑分子并與其結合的結合劑可包括結合 非蛋白質靶的蛋白（即，例如特異性結合小分子目標分析物的蛋白或結合蛋白質的受體）。 [0065] 檢測支持物可包含多個分子的可檢測部分。此外和/或可選擇地，可特異性識別 檢測支持物上的多個結合劑分子并與其結合的結合劑可包含可檢測部分。
[0066] 包含多個識別目標分析物的結合劑的檢測支持物的使用提供了信號的放大。在 可選擇的實施方案中，檢測支持物可包含多個檢測結合劑。例如，在可選擇的實施方案中， 檢測支持物上的結合劑的數(shù)量可以是超過100個，或超過500個，或超過1，000個，或超過 5, 000個，或超過10, 000個，或超過20, 000個，或超過50, 000個，或超過100, 000個，或超 過500, 000個，或超過1，000, 000個分子的檢測結合劑。例如，在一個實施方案中，檢測支 持物可包含用數(shù)萬或數(shù)十萬個抗體分子涂覆的珠粒。在可選擇的實施方案中，對于直徑約 為15 μ m的檢測支持物珠粒，可存在約10, 000至10, 000, 000個或約50, 000至500, 000個， 或約100, 000至1，000, 000個結合劑分子（例如，一抗）。對于具有不同尺寸的檢測支持物 珠粒，可使用對應的表面覆蓋度。或者，可達到這些范圍內的范圍。
[0067] 因此，在可選擇的實施方案中，本發(fā)明的方法提供了為在標準非放大免疫測定中 看到的信號的1，〇〇〇倍，或超過10, 〇〇〇倍，或超過100, 〇〇〇倍，或超過500, 000倍，或超過 1，000, 000倍放大，所述非放大免疫測定不包括包含多個檢測結合劑的檢測支持物。例如， 在可選擇的實施方案中，本發(fā)明的試劑盒提供了范圍在于標準非放大免疫測定中看到的信 號的 1，000 至 1，000, 000, 000 倍，或 1，000 至 100, 000, 000 倍，或 5, 000 至 10, 000, 000 倍， 或 10, 000 至 1，000, 000 倍，或 10, 000 至 500, 000 倍，或 50, 000 至 500, 000 倍內的放大，所 述非放大免疫測定不包括包含多個檢測結合劑的檢測支持物?；蛘?，可達到這些范圍內的 范圍。
[0068] 因此，在某些實施方案中，試劑盒可包括用于基于珠粒的免疫測定法的試劑。因 此，在一個實施方案中，檢測支持物可包含用識別目標蛋白的抗體（或抗體片段）的分子 涂覆的珠粒。在某些實施方案中，珠?？梢允堑鞍譍、蛋白A或蛋白A/G涂覆的聚苯乙烯珠 粒，其可在多種尺寸上商購獲得（例如，Life Technologies/Invitrogen, Carlsbad CA)。 可能有用的其它珠粒包括用這些相同蛋白涂覆的磁性二氧化娃珠粒（來自AmsBio, Lake Forest, CA 的 MagSi 珠粒）·
[0069] 在可選擇的實施方案中，對于直徑約為15μπι的檢測支持物珠粒，可存在約 10, 000 至 10, 000, 000 或約 50, 000 至 1，000, 000,或約 100, 000 至 500, 000 個結合劑分子 (例如，一抗）。對于具有不同尺寸的檢測支持物珠粒，可使用對應的表面覆蓋度。在某些 實施方案中，檢測支持物珠粒充分大，從而可將多個結合劑分子連接于珠粒。例如，珠粒在 尺寸上直徑可從約0· 1 μ m變化至50 μ m，或從0· 2 μ m變化至40 μ m，或從0· 5 μ m變化至 30 μ m，或從1 μ m變化至20 μ m，或從1 μ m變化至15 μ m或從約1 μ m變化至3 μ m。當待連 接于珠粒的結合劑是抗體時，可使用利用蛋白G、蛋白A或蛋白A/G預涂覆的商購可得的珠 粒，因為這些蛋白結合抗體的Fc結構域，從而將抗體定向，使得Fab結構域自由用于結合抗 原的表位。
[0070] 用于基于珠粒的免疫測定法的試劑盒還可包括針對目標蛋白的另外的一抗，其中 這樣的抗體來自第二物種。這些抗體在如本文中描述的間接測定中具有特殊功用，因為它 們可容納第二抗-抗體-報道分子復合物的特異性結合。此外，這些二抗-報道分子復合 物將不結合來自第一物種的一抗，所述一抗將靶蛋白固定于固體表面或蛋白A/G珠粒上， 從而消除假陽性反應。此外，二抗-報道分子復合物不結合蛋白A/G珠粒的表面，從而消除 假陽性反應。
[0071] 試劑盒還可包含可用可檢測標志物或可與可檢測標志物復合的結合劑進行標 記的可溶性二抗。例如，在某些實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可包含結合于熒光基團的 二抗。在一個實施方案中，突光基團可包括QD0T⑩。例如，在一個實施方案中，抗-抗 體-QD0T?綴合物識別多個珠粒-結合的一抗。
[0072] 待用于本發(fā)明的試劑盒的基底包括但不限于聚苯乙烯珠粒 (Spherotech, Libertyville, 111.)、磁性珠粒（Invitrogen ;AmsBio)、膠乳涂層、薄膜濾 器、纖維濾器、不溶解纖維（free fiber)或多孔固體基底。磁性珠粒的使用方法（例如，對 于 Dynabeads Protein G Prod. No. 10003D 的包裝說明書）可見于 Kala 等人，Analytical Biochemistry254:263_266(1997)和Dutton, Genetic Engineering News,第22卷，Number 13, July 2002 中。
[0073] 具有寬范圍尺寸的一系列顆粒，特別地磁性和聚苯乙烯珠粒是可商購獲得的。對 于某些實施方案，優(yōu)選的一組顆粒具有約1微米（即，微米）的平均粒度（即，最大顆粒 尺度）。對于某些實施方案，優(yōu)選的一組顆粒具有不小于10微米（即，微米）的平均粒度 (即，最大顆粒尺度）。示例性的商購可得的珠粒是可從Invitrogen, Carlsbad, CA或從 Spherotech, Libertyville, 111獲得的蛋白G、蛋白A和蛋白A/G-涂覆的聚苯乙烯珠粒和 鏈霉抗生物素蛋白涂覆的聚苯乙烯珠粒。聚苯乙烯和磁性珠粒的其它提供商包括Thermo Scientific Pierce,Millipore, Polyscience 和 New England Biolabs。AmsBio, Lake Forest, IL是磁性二氧化硅珠粒的提供商，對于上文中給出的所有蛋白質涂層，所述二氧化 娃珠粒是可獲得的。Invitrogen還提供了環(huán)氧樹脂表面磁性珠粒，其共價地結合抗體。珠 ?？梢允蔷郾揭蚁⒍趸?、玻璃或其它材料的平面或經(jīng)衍生用于連接至特定化學基團。 實施例
[0074] 本發(fā)明的實施方案還可通過下列非限定性實例來說明。
[0075] 實施例1:利用基于珠粒的信號放大檢測蛋白質
[0076] 可利用固定在鈍化表面的對于目標蛋白（例如，生物素化兔一抗）是特異性的抗 體例如中性抗生物素蛋白（Neutravidin)捕獲目標蛋白質或蛋白質亞單位，以使假陽性減 少至最少（例如，參見Jain等人，Nature, 2011，473:484-488)。隨后，在夾心測定中，添加 用蛋白A/G和特異于在第二物種（例如，豚鼠）中產(chǎn)生的蛋白質的另一種類型抗體（對于 1 μ m和2. 8 μ m珠粒通常>104和>105個）涂覆的1 μ m或2. 8 μ m聚苯乙烯珠粒以結合固 定的靶蛋白亞單位。隨后添加綴合于（例如，共價地結合于）酶、放射性標記或熒光材料例 如gDOTs?的二抗或抗體片段（例如，抗-豚鼠抗體），以結合多個特異于目標分析物的珠 粒-結合的一抗。通過在連續(xù)的添加之間進行洗滌（2次）來除去未結合的蛋白質分子或 抗體。
[0077] ELISA、RIA或免疫熒光測定可用于檢測和定量目標蛋白或蛋白質亞單位。為了測 定熒光，用UV光激發(fā)點，隨后在超光譜成像系統(tǒng)中，利用適當?shù)陌l(fā)射濾光片，使用照相機使 點可視化。
[0078] 實施例2:使用珠粒放大的各種形式捕獲核糖體蛋白
[0079] 進行實驗以比較圖2的圖框B(S卩，方法2)中描述的各種測定形式?；旧?，通 過裂解細菌細胞，將其中的核糖體在6M(10, 000個細胞/ μ 1)異硫氰酸胍中分解成蛋白質 組分來制備大腸桿菌（E.coli)裂解物（500, 000個細胞）。隨后通過稀釋入磷酸鹽緩沖液 (例如，將90, 000個細胞稀釋至450 μ 1)將異硫氰酸胍濃度降至0. 12或0. 6M。隨后使用 圖2中顯示的捕獲檢測法（表1)之一捕獲核糖體蛋白。顯示了最初輸入的細胞和來自細 胞的被評估的核糖體蛋白的結果；100個大腸桿菌細胞具有約2. 7pg的核糖體蛋白。
[0080]
【權利要求】
1. 一種用于信號放大的方法，包括： 將包含固體支持物的檢測支持物添加至目標分析物，所述固體支持物包含識別目標分 析物并與其結合的結合劑的多個分子；和 檢測在檢測支持物上的所述多個結合劑分子中的至少一些。
2. 權利要求1的方法，其中所述檢測支持物為珠粒。
3. 權利要求1的方法，其中所述檢測支持物包含可檢測部分的多個分子。
4. 權利要求1的方法，還包括添加捕獲支持物，所述捕獲支持物包含識別所述目標分 析物并與其結合以將所述目標分析物固定在捕獲支持物上的至少一個捕獲支持物結合劑。
5. 權利要求4的方法，其中在與所述檢測支持物相互作用之前將所述目標分析物結合 于所述捕獲支持物。
6. 權利要求4的方法，其中在與所述檢測支持物相互作用之后將所述目標分析物結合 于所述捕獲支持物。
7. 權利要求1的方法，還包括添加可特異性識別所述檢測支持物上的多個結合劑分子 的至少一些并與其結合的結合劑。
8. 權利要求7的方法，其中所述可特異性識別所述檢測支持物上的所述多個結合劑分 子的至少一些并與其結合的結合劑包含可檢測部分。
9. 權利要求4的方法，其中所述捕獲支持物為珠粒。
10. 權利要求4的方法，其中連接于捕獲支持物的結合劑是可識別所述目標分析物并 與其結合的抗體或抗體片段。
11. 權利要求1的方法，其中連接于檢測支持物的所述多個結合劑分子為識別所述目 標分析物并與其結合的抗體或抗體片段。
12. 權利要求7的方法，其中可特異性識別所述檢測支持物上的所述多個結合劑分子 的至少一些并與其結合的結合劑為抗體或抗體片段。
13. 權利要求7的方法，其中可特異性識別所述檢測支持物上的所述多個結合劑分子 的至少一些并與其結合的結合劑不識別用于將所述目標分析物結合于所述捕獲固體支持 物的捕獲結合劑。
14. 權利要求7的方法，其中可特異性識別所述檢測支持物上的所述多個結合劑分子 的至少一些并與其結合的結合劑包括可溶性結合劑。
15. 權利要求1的方法，其中所述檢測支持物包含超過10, 000個特異于所述目標分析 物的結合劑分子。
16. 權利要求1的方法，其中所述檢測支持物包含超過100, 000個特異于所述目標分析 物的結合劑分子。
17. -種用于測定目標分析物的試劑盒，其包括：檢測支持物，所述檢測支持物包含含 有可識別所述目標分析物并與其結合的多個結合劑分子的固體支持物。
18. 權利要求17的試劑盒，其還包括捕獲支持物，所述捕獲支持物包含識別所述目標 分析物并與其結合的至少一個捕獲支持物結合劑。
19. 權利要求17的試劑盒，其還包括可識別所述檢測支持物上的多個結合劑并與其結 合的結合劑。
20. 權利要求19的試劑盒，其中可特異性識別所述檢測支持物上的所述多個結合劑分 子的至少一些并與其結合的結合劑包括可溶性結合劑。
21. 權利要求17的試劑盒，其中所述檢測支持物為珠粒。
22. 權利要求17的試劑盒，其中所述檢測支持物包含多個可檢測部分分子。
23. 權利要求17的試劑盒，其中連接于檢測支持物的所述多個結合劑分子是可識別所 述目標分析物并與其結合的抗體或抗體片段。
24. 權利要求18的試劑盒，其中所述捕獲支持物為珠粒。
25. 權利要求18的試劑盒，其中所述捕獲支持物結合劑是可識別所述目標分析物并與 其結合的抗體或抗體片段。
26. 權利要求19的試劑盒，其中可特異性識別所述檢測支持物上的所述多個結合劑分 子的至少一些并與其結合的結合劑是可識別所述目標分析物并與其結合的抗體或抗體片 段。
27. 權利要求19的試劑盒，其中可特異性識別所述檢測支持物上的所述多個結合劑分 子的至少一些并與其結合的結合劑包含可檢測部分。
28. 權利要求17的試劑盒，其中所述檢測支持物包含超過1，000個特異于所述目標分 析物的結合劑分子。
29. 權利要求17的試劑盒，其中所述檢測支持物包含超過10, 000個特異于所述目標分 析物的結合劑分子。
30. 權利要求17的試劑盒，其中所述檢測支持物包含超過100, 000個特異于所述目標 分析物的結合劑分子。
【文檔編號】C12Q1/70GK104245960SQ201380017257
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年2月21日 優(yōu)先權日:2012年2月21日
【發(fā)明者】D·L·安德森, A·J·康拉德, S·E·埃里克森, B·B·霍普金斯 申請人:美國控股實驗室公司