A型流感病毒的檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的在于提供一種A型流感病毒的檢測(cè)試劑盒，其為應(yīng)用了免疫層析法原理的用于迅速診斷流感的檢測(cè)試劑盒，其中，A型流感病毒的檢測(cè)靈敏度比現(xiàn)有的檢測(cè)試劑盒高，可在流感發(fā)病的更早期，穩(wěn)定且高精度地得到“陽性”的判定。本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)A型流感病毒的試劑盒，其中，層析介質(zhì)中所固定的抗體為與未變性的A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)、而與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
【專利說明】A型流感病毒的檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)A型流感病毒的利用免疫層析法的檢測(cè)試劑盒，其使用 了與A型流感病毒核蛋白有特異性抗原抗體反應(yīng)，但是與由SDS (十二烷基硫酸鈉）-聚丙 烯酰胺凝膠電泳分離出的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western Blot法中沒有抗原抗體 反應(yīng)的抗體。

【背景技術(shù)】
[0002] 流感為流感病毒導(dǎo)致的感染癥，作為其典型的癥狀，已知有突然出現(xiàn)發(fā)燒?頭 痛?全身倦怠感?肌肉關(guān)節(jié)痛等，隨之而來并持續(xù)有咳嗽·鼻涕等，一般認(rèn)為這些癥狀在約 1周后減輕。與其它的所謂的感冒綜合征相比，流感的特征在于全身癥狀強(qiáng)，而為了進(jìn)行正 確的診斷需要病毒學(xué)上的根據(jù)。在流感流行的時(shí)期，對(duì)具有感冒癥狀的患者進(jìn)行是否為流 感的正確診斷，不僅與用于治療的抗流感病毒劑的適當(dāng)選擇有緊密聯(lián)系，而且從準(zhǔn)確地把 握流行狀況和判定流感疫苗的效果這樣的免疫學(xué)觀點(diǎn)考慮也很重要。
[0003] 為了正確地進(jìn)行流感的病原診斷，標(biāo)準(zhǔn)方法為以咽拭子液和漱口液為材料分離病 毒，但直至診斷需要長(zhǎng)的時(shí)間。若使用PCR(Polymerase chain reaction)法檢測(cè)病毒基因 組，則雖然可以在短時(shí)間得到精確度高的結(jié)果，但PCR法需要特別的裝置，若不是衛(wèi)生研究 所和特定的檢查室的話則無法進(jìn)行。
[0004] 近年來，開始市售可在床邊或門診等檢測(cè)流感抗原的迅速診斷試劑盒，可在日常 的臨床中容易地進(jìn)行病毒學(xué)診斷。應(yīng)用了免疫層析法原理的流感的迅速診斷試劑盒（參照 專利文獻(xiàn)1?11)使用可容易采集的鼻腔粘膜或咽部粘膜等生物樣品，能夠以簡(jiǎn)便的操作 在短時(shí)間內(nèi)得到檢查結(jié)果，因此，具有接受檢查的患者和實(shí)施檢查的醫(yī)療工作者兩者的負(fù) 擔(dān)都輕這樣的優(yōu)點(diǎn)。另外，在得到"陽性"的結(jié)果的情況下，可以提供用于醫(yī)生做出正確診 斷的有益的信息。然而，目前市售的迅速診斷試劑盒的流感病毒的檢測(cè)靈敏度不足，即使得 至IJ "陰性"的結(jié)果也未必能否定病毒的感染。
[0005] 已知的是，由流感患者的鼻腔粘膜或咽部粘膜檢測(cè)的流感病毒的量，在發(fā)病后 2?3天達(dá)到最高，然后迅速地減少，并在5?7天消失。為了用迅速診斷試劑盒判定為"陽 性"，需要感染后流感病毒在生物體內(nèi)增殖，使生物樣品中的病毒量達(dá)到檢測(cè)靈敏度以上。 在病毒的增殖開始后不久的感染初期的患者和通過接種疫苗抑制了病毒的增殖速度的患 者等中，有時(shí)生物樣品中不存在判定為陽性所需充分的量的病毒，實(shí)際上盡管感染了流感 病毒，但是迅速診斷試劑盒的結(jié)果為"陰性"，有假陰性判定的問題。在臨床現(xiàn)場(chǎng)，利用迅速 診斷試劑盒進(jìn)行檢查，若發(fā)病后經(jīng)過24小時(shí)，則可穩(wěn)定地檢測(cè)病毒而得到精度高的結(jié)果， 但是在發(fā)病后12小時(shí)以內(nèi)，有時(shí)無法檢測(cè)到病毒而無法正確地判定，從這樣的實(shí)際情況考 慮，對(duì)于是"陰性"結(jié)果的患者，根據(jù)其它的發(fā)現(xiàn)，在次日以后實(shí)施再檢查，患者必須再次到 醫(yī)療機(jī)構(gòu)就診，承受在時(shí)間和費(fèi)用方面的過度的負(fù)擔(dān)。
[0006] 進(jìn)而，從用于治療的抗流感病毒劑的選擇的觀點(diǎn)考慮，也要求在感染盡量早的時(shí) 期正確地診斷流感。目前，作為流感治療藥的代表性藥物，廣泛使用磷酸奧司他韋（商品名 達(dá)菲）及扎那米韋（商品名瑞樂砂）等神經(jīng)氨酸酶抑制劑。神經(jīng)氨酸酶在流感病毒在體內(nèi) 從細(xì)胞到細(xì)胞的感染?傳播時(shí)承擔(dān)重要的作用，神經(jīng)氨酸酶抑制劑通過抑制神經(jīng)氨酸酶的 活性來抑制在細(xì)胞內(nèi)增殖的流感病毒流出細(xì)胞外，抑制病毒在細(xì)胞間的傳播，從而發(fā)揮治 療效果。據(jù)認(rèn)為如上所述的由神經(jīng)氨酸酶抑制劑構(gòu)成的抗流感病毒劑在發(fā)病后盡量早的時(shí) 期服用是有效的。一般認(rèn)為流感發(fā)病后12小時(shí)以內(nèi)服用是理想的，在24小時(shí)以內(nèi)服用能 得到充分的有效性，但是發(fā)病后若超過48小時(shí)，則治療效果不足。但是，要求從早期開始利 用抗流感病毒劑進(jìn)行治療，另一方面，已知神經(jīng)氨酸酶抑制劑也有副作用，另外，也存在著 應(yīng)該恰當(dāng)?shù)厥褂每沽鞲胁《緞┮詡淞鞲械谋l(fā)性流行這樣的社會(huì)需求等方面的考慮，因此 要求在正確診斷流感病毒感染下開出抗流感病毒劑的處方。因此，強(qiáng)烈要求臨床現(xiàn)場(chǎng)中廣 泛使用的流感迅速診斷試劑盒具有進(jìn)一步提高流感病毒的檢測(cè)靈敏度，從發(fā)病的盡量早的 時(shí)期，特別是即使在發(fā)病后24小時(shí)以內(nèi)，也可穩(wěn)定且高精度地得到"陽性"的判定這樣的性 能。
[0007] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)
[0009] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開2011-069800號(hào)公報(bào)
[0010] 專利文獻(xiàn)2 :日本特開2010-261912號(hào)公報(bào)
[0011] 專利文獻(xiàn)3 :日本特開2007-093292號(hào)公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)4 :日本特開2007-033293號(hào)公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn)5 :日本特開2006-194688號(hào)公報(bào)
[0014] 專利文獻(xiàn)6 :日本特開2006-194687號(hào)公報(bào)
[0015] 專利文獻(xiàn)7 :日本特開2006-189317號(hào)公報(bào)
[0016] 專利文獻(xiàn)8 :日本特開2006-067979號(hào)公報(bào)
[0017] 專利文獻(xiàn)9 :W02009/148150號(hào)小冊(cè)子
[0018] 專利文獻(xiàn)10 :W02005/007697號(hào)小冊(cè)子
[0019] 專利文獻(xiàn)11 :W02005/007698號(hào)小冊(cè)子


【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 發(fā)明所要解決的問題
[0021] 本發(fā)明的目的在于提供一種A型流感病毒的檢測(cè)試劑盒，其為應(yīng)用了免疫層析法 原理的用于流感的迅速診斷的檢測(cè)試劑盒，其中，A型流感病毒的檢測(cè)靈敏度比現(xiàn)有的檢測(cè) 試劑盒高，可在流感發(fā)病的更早期，穩(wěn)定且高精確度地得到"陽性"的判定。
[0022] 用于解決問題的方法
[0023] 本發(fā)明人為了提高應(yīng)用了免疫層析法原理的流感迅速診斷試劑盒的檢測(cè)靈敏度， 對(duì)于在層析介質(zhì)中固定的抗體以及與標(biāo)記物結(jié)合的抗體當(dāng)中，應(yīng)該使用對(duì)A型流感病毒核 蛋白具有優(yōu)異親和性的抗體，而進(jìn)行了潛心研究。本發(fā)明人考慮到檢測(cè)試劑盒在臨床上使 用，從檢測(cè)用的生物樣品采集后并不能說A型流感病毒核蛋白完全沒有發(fā)生變性的可能 性、以及具有想盡可能地明確檢測(cè)試劑盒中所使用的抗體的特征的要求等方面出發(fā)，作為 檢測(cè)試劑盒中所使用的抗體，尋求不僅對(duì)未變性的A型流感病毒核蛋白具有優(yōu)異親和性、 而且對(duì)變性的（例如）由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（以下也稱為SDS-PAGE)分離的A型 流感病毒核蛋白也具有同樣高的親和性的抗體，并嘗試在檢測(cè)試劑盒中使用。其原因在于， 對(duì)由SDS-PAGE分離的A型流感病毒核蛋白也顯示出高親和性的抗體具有其結(jié)合能力對(duì)核 蛋白的立體結(jié)構(gòu)變化的影響少，而且，也容易明確抗體所識(shí)別的表位區(qū)域這樣的優(yōu)點(diǎn)。然 而，即使在使用了具有這樣的反應(yīng)性的抗體的情況下，超過現(xiàn)有制品的檢測(cè)靈敏度也非常 困難。
[0024] 因此，本發(fā)明人為了開發(fā)超過現(xiàn)有制品的檢測(cè)靈敏度的優(yōu)異的檢測(cè)試劑盒，進(jìn)一 步進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果驚訝地發(fā)現(xiàn)，作為層析介質(zhì)中所固定的抗體，若使用雖然對(duì)未變性 的A型流感病毒核蛋白具有優(yōu)異的親和性、但是與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒 核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體，則可以飛躍性地提高A型流感病毒 檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)靈敏度。
[0025] 即，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)A型流感病毒的試劑盒，其為應(yīng)用了免疫層析法原 理的檢測(cè)試劑盒，其中，層析介質(zhì)中所固定的抗體為與未變性的A型流感病毒核蛋白有抗 原抗體反應(yīng)，但是與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中 沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0026] 對(duì)本發(fā)明更詳細(xì)地進(jìn)行說明，如下所示。
[0027] (1) -種用于檢測(cè)A型流感病毒的試劑盒，其為利用免疫層析法的檢測(cè)試劑盒， 含有：固定有與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有 抗原抗體反應(yīng)的第一抗體的層析介質(zhì)、以及與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B 型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的第二抗體和標(biāo)記物結(jié)合而成的標(biāo)記試劑，其 中，
[0028] 第一抗體為與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白 在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體；第二抗體為與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 泳所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0029] (2)如上述（1)記載的檢測(cè)試劑盒，其中，第一抗體為1種或1種以上的單克隆抗 體。
[0030] (3)如上述⑴或⑵記載的檢測(cè)試劑盒，其中，第一抗體為通過對(duì)A型流感病毒 HlNl亞型的全長(zhǎng)的核蛋白進(jìn)行免疫而得到的抗體。
[0031] (4) 一種A型流感病毒的檢測(cè)方法，其為利用免疫層析法的檢測(cè)方法，使用了固定 有與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反 應(yīng)的第一抗體的層析介質(zhì)、以及與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒 核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的第二抗體和標(biāo)記物結(jié)合而成的標(biāo)記試劑，其中，
[0032] 第一抗體為與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白 在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體；第二抗體為與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電 泳所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0033] (5)如上述⑷記載的檢測(cè)方法，其中，第一抗體為1種或1種以上的單克隆抗體。
[0034] (6)如上述⑷或（5)記載的檢測(cè)方法，其中，第一抗體為通過對(duì)A型流感病毒 HlNl亞型的全長(zhǎng)的核蛋白進(jìn)行免疫而得到的抗體。
[0035] (7) -種A型流感病毒的檢測(cè)試劑，其含有與未變性的A型流感病毒核蛋白有抗原 抗體反應(yīng)、而與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0036] (8)如上述（7)記載的檢測(cè)試劑，其中，A型流感病毒檢測(cè)試劑用于利用免疫層析 法的檢測(cè)試劑盒中。
[0037] (9)如上述⑶記載的檢測(cè)試劑，其中，A型流感病毒檢測(cè)試劑是在利用免疫層析 法的檢測(cè)試劑盒的層析介質(zhì)中固定而使用的。
[0038] (10)如上述（7)?（9)中任意一項(xiàng)記載的檢測(cè)試劑，其中，A型流感病毒檢測(cè)試劑 為1種或1種以上的單克隆抗體。
[0039] (11)如上述（7)?（10)中任意一項(xiàng)記載的檢測(cè)試劑，其中，A型流感病毒檢測(cè)試 劑為通過對(duì)A型流感病毒HlNl亞型的全長(zhǎng)的核蛋白進(jìn)行免疫而得到的抗體。
[0040] 發(fā)明效果
[0041] 本發(fā)明的A型流感病毒檢測(cè)試劑盒由于檢測(cè)靈敏度高，因此比現(xiàn)有的檢測(cè)試劑盒 少的病毒量就能夠得到"陽性"的判定，因此，假陰性的判定減少，對(duì)"陰性"的判定的可靠 性變得非常高。因此，對(duì)于處于流感發(fā)病初期且病毒開始在體內(nèi)增殖不久的患者，能夠提供 醫(yī)生做出流感病毒感染的正確診斷所需的有益信息，并且可以在早期開始用抗流感病毒劑 的治療。另外，即使在利用接種疫苗來抑制病毒增殖速度的患者中，也可以正確地診斷有無 流感病毒的感染，因此，能夠引起對(duì)感染擴(kuò)大的注意，另外，也能夠提供用于判定流感疫苗 效果的免疫學(xué)上重要的信息。
[0042] 另外，本發(fā)明提供了一種A型流感病毒的檢測(cè)試劑，通過使用本發(fā)明的A型流感病 毒檢測(cè)試劑，特別是將本發(fā)明的A型流感病毒檢測(cè)試劑用作利用免疫層析法的檢測(cè)試劑盒 中的層析介質(zhì)中所固定的抗體，可以簡(jiǎn)便且更正確地診斷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1表示抗體1C6、6F7或10G5與A型流感病毒的重組核蛋白（56kDa)的Western blot法的反應(yīng)結(jié)果。圖中上部的M表示分子量標(biāo)記物流過的泳道，rNP表示重組核蛋白流 過的泳道。（a)表示使轉(zhuǎn)印有由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的重組核蛋白的PVDF膜與抗體7307 反應(yīng)的結(jié)果。在分子量50?75kDa的范圍內(nèi)檢測(cè)到色帶。在能夠確認(rèn)抗體7307與重組核 蛋白的抗原抗體反應(yīng)的條件下，對(duì)抗體1C6、6F7或10G5與重組核蛋白的反應(yīng)性進(jìn)行試驗(yàn)。 (b)表不抗體1C6的結(jié)果。（c)表不抗體6F7的結(jié)果。（d)表不抗體10G5的結(jié)果。在能夠 確認(rèn)抗體7307的反應(yīng)性的條件下，無法檢測(cè)到抗體1C6、6F7或10G5與重組核蛋白的反應(yīng)。

【具體實(shí)施方式】
[0044] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)試劑盒，其為利用免疫層析法的A型流感病毒的檢測(cè)試劑 盒，使用了與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗 原抗體反應(yīng)的第一抗體和第二抗體，其特征在于，層析介質(zhì)中所固定的第一抗體使用了與 未變性的A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)、而與由SDS-PAGE所分離的全長(zhǎng)的A型流感 病毒核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0045] 本發(fā)明中使用的第一抗體和第二抗體為與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng) 而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。流感病毒由于核蛋白的抗原性 的不同而分為A型、B型等。進(jìn)而，A型流感病毒在病毒粒子的表面具有血凝素（HA)和神經(jīng) 氨酸酶（NA)這樣的糖蛋白，并且由于這些HA和NA的結(jié)構(gòu)差異而分為各種亞型。本發(fā)明中 所使用的第一抗體和第二抗體由于識(shí)別流感病毒的核蛋白，因此可以與A型流感病毒的各 種亞型的核蛋白廣泛地發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，至少可以與A型流感病毒的HlNl亞型、H3N2亞 型、H5N1亞型以及H7N7亞型等的核蛋白發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，但是是與B型流感病毒的核蛋 白沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。與本發(fā)明的第一抗體和第二抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的A型流 感病毒的核蛋白可以是從病毒中分離的天然蛋白，也可以是基于公知的核蛋白基因的堿基 序列制作的重組蛋白。進(jìn)而，與本發(fā)明的第一抗體和第二抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的核蛋白 可以是從病毒的構(gòu)成成分中分離純化的，也可以是未純化的，但是在未分離的情況下，也可 以是源自用表面活性劑以核蛋白和抗體容易接觸的方式處理過的病毒的核蛋白。
[0046] 本發(fā)明中的"未變性的A型流感病毒核蛋白"，只要?dú)埩粲刑烊淮嬖诘腁型流感病 毒核蛋白的立體結(jié)構(gòu)中的、至少維持與特定的抗體發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的充分的立體結(jié)構(gòu)即 可，但是因 SDS-PAGE等破壞了天然存在的該蛋白的立體結(jié)構(gòu)、無法維持A型流感病毒核蛋 白對(duì)該抗體的實(shí)質(zhì)上的抗原抗體反應(yīng)的除外。
[0047] 本發(fā)明中所使用的第一抗體和第二抗體與流感病毒核蛋白是否發(fā)生抗原抗體反 應(yīng)可以利用周知的免疫測(cè)定方法來進(jìn)行確認(rèn)。即，若以測(cè)定形式來分類，則有三明治法、競(jìng) 爭(zhēng)法、凝聚法等免疫測(cè)定方法，若以使用的標(biāo)記物來分類，則有熒光法、酶法、放射法等免疫 測(cè)定方法，利用這些免疫測(cè)定方法中的任意一者均可以進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的確認(rèn)。在本發(fā) 明中，"實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)"是指，在上述免疫測(cè)定方法中，在可檢測(cè)的水平上沒有抗 原抗體反應(yīng)、或者即使有反應(yīng)該反應(yīng)的程度與A型流感病毒核蛋白的抗原抗體反應(yīng)的程度 相比明顯較弱，與構(gòu)成流感病毒的其它蛋白為同一程度的反應(yīng)，不是特異性反應(yīng)。
[0048] 作為本發(fā)明的第一抗體，是與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感 病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體，進(jìn)而，只要是與天然存在的A型流感病毒核 蛋白的發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的部位的立體結(jié)構(gòu)被破壞了的該蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng) 的抗體即可，作為這樣的抗體，例如，優(yōu)選為與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B 型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體，與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型流感 病毒核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0049] 本發(fā)明中的"SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳"是本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】中慣用的蛋白分 離·分析法，代表性地可以按照Laemmli，U.K.的方法（Nature, 227:680-685 (1970))來進(jìn) 行，但并不局限于該方法。具體而言，例如可以按以下的步驟實(shí)施。首先，在凝膠板上層疊由 10?15%濃度的聚丙烯酰胺構(gòu)成的分離凝膠、在其上層疊由3?5%聚丙烯酰胺構(gòu)成的濃 縮凝膠，將制成的凝膠安裝于平板電泳裝置中。在含有A型流感病毒核蛋白的溶液中添加 等量的2倍濃縮樣品緩沖液（I25mM Tris-HCl、20%甘油、2% SDS、2% 2-巰基乙醇、0. 001 % 溴酚藍(lán)、pH6. 8)，在100°C下加熱處理5?10分鐘，作為電泳用樣品。將電泳用樣品和市售 的分子量標(biāo)記物分別添加到由濃縮凝膠所制作的泳道中，使用電泳用緩沖劑（192mM甘氨 酸、0. 1% SDS、24mM Tris、pH8. 3)，以20mA的恒定電流進(jìn)行30?90分鐘電泳。由SDS-PAGE 分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白可以以相當(dāng)于分離凝膠中的分子量約56kDa的色帶的形 式得到。
[0050] SDS-PAGE中使用的含有A型流感病毒核蛋白的溶液，只要在最終進(jìn)行的Western blot法中，含有與抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)所需的充分量（例如1?2mg)的A型流感病毒核 蛋白即可，不對(duì)其限定，但是關(guān)于核蛋白，可以純化也可以未純化。作為含有A型流感病毒 核蛋白的溶液，例如可以舉出：A型流感病毒懸浮液、市售的HA流感疫苗和重組A型流感病 毒核蛋白溶液等。
[0051] SDS-PAGE中使用的2倍濃縮樣品緩沖劑中的SDS，考慮到SDS的結(jié)合量相對(duì)于1 個(gè)蛋白為1. 2?1. 5左右，可根據(jù)A型流感病毒核蛋白的量在0. 5?5重量％的濃度范圍 內(nèi)適當(dāng)變更使用。另外，2倍濃縮樣品緩沖劑中的2-巰基乙醇作為切斷存在于A型流感病 毒核蛋白中的二硫鍵的還原劑起作用，可以在1?10重量％的濃度范圍適當(dāng)變更使用，也 可以使用由二硫蘇糖醇（DTT)等其它物質(zhì)構(gòu)成的還原劑。
[0052] 本發(fā)明中的"Western blot法"可以通過將由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng) 的A型流感病毒核蛋白按照（例如）Towbin H.等的方法（?1*〇(：.似1:1.六〇3(1.5(^· U.S.A.，76:4350-4354(1979))轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF)膜上來進(jìn)行，但并不局限于該 方法。具體而言，將PVDF膜浸漬于100%甲醇中10秒，進(jìn)一步浸漬于轉(zhuǎn)印用電極緩沖劑 (192mM甘氨酸、5%甲醇、25mM Tris-HCl、pH8. 3)中30分鐘，用于轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印裝置的組裝 通過在陽極電極板上從下面起依次層疊濾紙、PVDF膜、SDS-PAGE結(jié)束后的凝膠、濾紙，并 在其上固定陰極電極板來進(jìn)行。需要說明的是，濾紙預(yù)先浸漬于轉(zhuǎn)印用電極緩沖劑中2? 3分鐘。轉(zhuǎn)印以I. 9mA/cm2的恒定電流進(jìn)行60?90分鐘。轉(zhuǎn)印結(jié)束后的PVDF膜，在封閉 溶液（0.5% BSAUOmM Tris-HCl、140mM NaCl、0.01%Tween20、pH7.5)中，在室溫下培養(yǎng) 60分鐘，進(jìn)行封閉操作。封閉結(jié)束后，用清洗緩沖劑（IOmM Tris-HCl、140mM NaCl、0. 01% Tween20、pH7. 5)在5分鐘內(nèi)培養(yǎng)2次并清洗，使用上述抗A型流感病毒核蛋白抗體作為一 次抗體，在室溫下培養(yǎng)90分鐘使其反應(yīng)。與一次抗體反應(yīng)結(jié)束后，用清洗緩沖劑在5分鐘 內(nèi)培養(yǎng)2次并清洗，使用以（例如）酶、熒光物質(zhì)或放射性同位素等標(biāo)記物所標(biāo)記的、與一 次抗體發(fā)生特異性反應(yīng)的抗體作為二次抗體，在室溫下培養(yǎng)60分鐘使其反應(yīng)。與二次抗體 反應(yīng)結(jié)束后，用清洗緩沖劑在5分鐘內(nèi)培養(yǎng)2次并清洗，然后利用標(biāo)記物的性質(zhì)將PVDF膜 上所轉(zhuǎn)印的與A型流感病毒核蛋白結(jié)合的一次抗體可視化，由此進(jìn)行Western blot法的檢 測(cè)。
[0053] 本發(fā)明的第一抗體是與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。在此，在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)是指： 在標(biāo)準(zhǔn)的Western blot法的抗體濃度、抗原濃度、基質(zhì)濃度或反應(yīng)時(shí)間等條件下，在可檢測(cè) 的水平上沒有抗原抗體反應(yīng)，或者也與A型流感病毒核蛋白以外的蛋白結(jié)合而不是僅與A 型流感病毒核蛋白有特異性抗原抗體反應(yīng)。本發(fā)明的第一抗體與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng) 的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的確認(rèn)，例如，可以將以下 作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來進(jìn)行：將在Western blot法中已確認(rèn)與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反 應(yīng)的市售抗體，例如抗A型流感病毒單克隆抗體、商品編號(hào)7307 (Medix Biochemica公司制 造），用作陽性對(duì)照抗體，陽性對(duì)照抗體與PVDF膜上的A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反 應(yīng)，并且在能檢測(cè)到核蛋白的條件下，無法檢測(cè)到A型流感病毒核蛋白。作為本發(fā)明的第一 抗體，優(yōu)選的是，在Western blot法中，在與陽性對(duì)照抗體能夠檢測(cè)到A型流感病毒核蛋白 的抗體濃度相同的抗體濃度下與A型流感病毒核蛋白沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體，更優(yōu)選為 2倍的抗體濃度下與A型流感病毒核蛋白沒有反應(yīng)的抗體，進(jìn)一步優(yōu)選為5倍或10倍的抗 體濃度下與A型流感病毒核蛋白沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。另外，作為本發(fā)明的第一抗體 優(yōu)選的抗體為在Western blot法中，與陽性對(duì)照抗體能夠檢測(cè)到的A型流感病毒核蛋白的 抗原濃度相同濃度的A型流感病毒核蛋白沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體，更優(yōu)選為在2倍的抗 原濃度下沒有反應(yīng)的抗體，進(jìn)一步優(yōu)選為與5倍或10倍濃度的A型流感病毒核蛋白抗原沒 有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0054] 本發(fā)明中所使用的第一抗體可以通過將A型流感病毒核蛋白用作免疫原，對(duì)小 鼠、大鼠、豚鼠、狗、山羊、綿羊、豬、馬和牛等動(dòng)物給藥來制作。作為用作免疫原的A型流感 病毒核蛋白，只要核蛋白大量存在且可發(fā)揮其作為免疫原的作用就沒有特別限定，例如可 以使用A型流感病毒懸浮液、市售的HA流感疫苗和重組A型流感病毒核蛋白溶液等。為了 抑制抗原中所含的高免疫原性的HA和NA的作用，也可以使用進(jìn)行了利用超離心的核蛋白 純化（例如參照J(rèn). Biochem.，102:1241-1249(1987))或蛋白酶處理（例如參照了.1臟1111〇1· Methods，180:107-116 (1995))的免疫原。本發(fā)明的第一抗體是雖然與A型流感病毒核蛋白 有特異性抗原抗體反應(yīng)、而與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗 原抗體反應(yīng)的抗體，因此，作為免疫原，優(yōu)選未用含有還原劑的SDS-PAGE用樣品緩沖劑處 理的A型流感病毒核蛋白，更優(yōu)選為未用作為陰離子性表面活性劑的SDS處理的A型流感 病毒核蛋白，進(jìn)一步優(yōu)選為未變性的A型流感病毒核蛋白。作為本發(fā)明的第一抗體的免疫 原優(yōu)選的是，將A型流感病毒懸浮在不含有陰離子性表面活性劑的緩沖劑中而得到的免疫 原、或全長(zhǎng)的重組A型流感病毒核蛋白等。
[0055] 在本發(fā)明中所使用的第一抗體為多克隆抗體的情況下，例如可以如下制備。從上 述的A型流感病毒核蛋白免疫了的動(dòng)物中，由（例如）利用使用了結(jié)合有A型流感病毒核 蛋白的載體的親和層析法的純化等方法，來獲得與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而 與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的抗血清或抗血清中的免疫球蛋白級(jí)分。 通過將這些抗血清或免疫球蛋白級(jí)分與轉(zhuǎn)印在PVDF膜上的由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型 流感病毒核蛋白一同培養(yǎng)，使與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白有抗原抗體 反應(yīng)的抗體結(jié)合在PVDF膜上，并從抗血清或免疫球蛋白級(jí)分中分離·除去這些抗體，從而 制作可以用作本發(fā)明第一抗體的多克隆抗體。
[0056] 在本發(fā)明中所使用的第一抗體為1種或1種以上的單克隆抗體的情況下，例如可 以通過從上述的A型流感病毒核蛋白免疫了的動(dòng)物中采集脾臟細(xì)胞等，以公知的方法（例 如，參照Nature，256:495-497 (1975))使其與骨髓瘤細(xì)胞等腫瘤細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞融合，從而 得到產(chǎn)生本發(fā)明中使用的第一抗體的雜交瘤。
[0057] 作為從利用細(xì)胞融合得到的雜交瘤中篩選產(chǎn)生本發(fā)明中所使用的第一抗體的雜 交瘤的方法，例如可以按照以下的步驟進(jìn)行。
[0058] 作為一次篩選，在培養(yǎng)上清液中篩選產(chǎn)生與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng) 而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體的雜交瘤。
[0059] -次篩選可以通過以經(jīng)純化的A型流感病毒核蛋白或重組A型流感病毒核蛋白為 抗原的固相ELISA法來進(jìn)行。使用微量滴定板、磁性粒子或硝基纖維素膜等使抗原吸附在 作為固相的載體上。使雜交瘤的培養(yǎng)上清液與吸附在固相上的抗原接觸，使用由標(biāo)記物標(biāo) 記的抗體等檢測(cè)與固相間接結(jié)合的培養(yǎng)上清液中的抗體。作為陰性對(duì)照，可以通過將B型 流感病毒核蛋白用于抗原來篩選目標(biāo)抗體。
[0060] 作為一次篩選的其它方法，在作為固相的載體上直接或間接地固定雜交瘤的培養(yǎng) 上清液中存在的抗體，將A型流感病毒核蛋白作為抗原使其接觸?？梢酝ㄟ^直接標(biāo)記抗原 或者在抗原上使用特異性抗體等以間接地標(biāo)記，來檢測(cè)與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體 反應(yīng)的抗體。
[0061] 用于獲得本發(fā)明抗體的一次篩選也可以用使抗原或抗體固定在固相上的方法中 的任一方法進(jìn)行，進(jìn)而，也可以在使用吸附有抗原的固相進(jìn)行大致的篩選后，使用固定有抗 體的固相進(jìn)行更嚴(yán)密的篩選。
[0062] 本發(fā)明的第一抗體為固定在層析介質(zhì)上使用的抗體，因此，作為一次篩選的方法， 將存在于雜交瘤的培養(yǎng)上清液中的抗體直接或間接地固定在膜狀的固相載體上、并使之接 觸A型流感病毒核蛋白的方法與使用第一抗體時(shí)的方式類似，是優(yōu)選的。
[0063] 對(duì)由一次篩選得到的與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病 毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體進(jìn)行二次篩選。在二次篩選中，選擇產(chǎn)生與由 SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗 體的雜交瘤。如上所述，將由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜 上。使上述PVDF膜與一次篩選中所選擇的雜交瘤的培養(yǎng)上清液接觸，如上所述進(jìn)行利用 Western blot法的檢測(cè)，由此可以篩選產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤。
[0064] 如在下述實(shí)施例中詳述的那樣，在一次篩選中所選擇的6個(gè)與A型流感病毒核蛋 白有特別強(qiáng)的抗原抗體反應(yīng)的雜交瘤中，作為二次篩選，選擇與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的 A型流感病毒核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體，結(jié)果選擇了 3個(gè)雜交 瘤。將這些雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體固定在層析介質(zhì)上，進(jìn)行A型流感病毒的檢測(cè)，結(jié)果，3 個(gè)單克隆抗體均能以超過現(xiàn)有制品的檢測(cè)靈敏度獲得陽性的判定。即，可以選擇多個(gè)產(chǎn)生 作為本發(fā)明第一抗體優(yōu)選的單克隆抗體的雜交瘤。
[0065] 本發(fā)明的第一抗體通?？梢酝ㄟ^在細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述的各雜交瘤 并從培養(yǎng)上清液中回收來制備。另外,也可以通過對(duì)雜交瘤來源的動(dòng)物的腹腔內(nèi)進(jìn)行給藥， 貯存腹水，從該腹水中回收來制備。
[0066] 本發(fā)明的第二抗體，只要為與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感 病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體，并且為對(duì)A型流感病毒核蛋白的親和性高的 抗體即可，作為優(yōu)選的方式，可根據(jù)與第一抗體的組合，使用與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A 型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0067] 本發(fā)明的第二抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體，在單克隆抗體的情 況下，可以是單一種類的抗體，也可以是多種抗體的混合物。另外，在使用單克隆抗體作為 本發(fā)明抗體的情況下，也可以用作與Fab或F(ab'）2等抗原有結(jié)合性的片段。
[0068] 本發(fā)明中所使用的第二抗體可以使用用于制造上述第一抗體的免疫原來制備。在 本發(fā)明的第二抗體為多克隆抗體的情況下，可通過從免疫的動(dòng)物采集血液，并且如上所述 對(duì)與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反 應(yīng)的抗血清或抗血清中的免疫球蛋白級(jí)分進(jìn)行純化來制造。在本發(fā)明的第二抗體為單克隆 抗體的情況下，可以通過以公知的方法制作雜交瘤，如上所述在培養(yǎng)上清液中篩選產(chǎn)生與A 型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的 抗體的雜交瘤來制造。作為本發(fā)明的第二抗體，在使用與由SDS-PAGE分離的全長(zhǎng)的A型流 感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗體反應(yīng)的抗體的情況下，以如上所述的步驟進(jìn) 行利用Western blot法的二次篩選，通過選擇檢測(cè)到抗原抗體反應(yīng)的抗體，可以篩選目標(biāo) 抗體。
[0069] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒含有固定有上述第一抗體的層析介質(zhì)。在本發(fā)明中，層析介 質(zhì)中所固定的第一抗體形成判定部位。本發(fā)明中所使用的層析介質(zhì)為由顯示出毛細(xì)現(xiàn)象的 微多孔性物質(zhì)構(gòu)成的惰性的層析介質(zhì)，只要是與標(biāo)記試劑和生物樣品中的成分等沒有反應(yīng) 的物質(zhì)，其原料就沒有特別的限定，可以使用公知的物質(zhì)。具體而言，可以舉出：硝基纖維素 或醋酸纖維素等纖維素衍生物和尼龍的膜、濾紙、玻璃纖維濾紙等。
[0070] 層析介質(zhì)的形態(tài)和大小沒有特別限制，從實(shí)際操作的方面和結(jié)果觀察的方面考 慮，只要適當(dāng)即可。為了使操作更簡(jiǎn)便，也可以在層析介質(zhì)的背面設(shè)置由塑料等構(gòu)成的支承 體。該支承體的性狀沒有特別限制，但是在根據(jù)目視判定進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果的觀察的情況下，支 承體優(yōu)選具有與標(biāo)記物所帶來的色彩不類似的色彩，通常優(yōu)選為無色或白色。
[0071] 可以在層析介質(zhì)中任意地引入用于添加生物樣品的試樣添加部位（樣品墊等）、 除去試樣中的固體成分的部位（固體成分分離部位等）、用于添加展開液的展開液添加部 位、吸取未被判定部位捕捉的標(biāo)記試劑和展開液的吸收部位（吸收墊等）、顯示檢測(cè)正常進(jìn) 行的對(duì)照部位等。這些部位的部件只要是試樣溶液和展開液能夠通過毛細(xì)現(xiàn)象移動(dòng)就沒有 特別限定，通常，從硝基纖維素膜、濾紙、玻璃纖維濾紙等多種多孔物質(zhì)中根據(jù)其目的來選 擇使用，以固定有第一抗體的層析介質(zhì)與毛細(xì)管連接的方式進(jìn)行配置。
[0072] 作為將第一抗體固定在層析介質(zhì)上的方法，有：通過物理或化學(xué)方法將第一抗體 直接固定在層析介質(zhì)上的方法；使第一抗體與乳膠顆粒等微粒物理或化學(xué)結(jié)合，使層析介 質(zhì)捕捉該微粒并固定的間接固定方法，但從靈敏度調(diào)整的容易度的方面考慮，優(yōu)選直接固 定的方法。作為直接固定的方法，可以利用物理吸附，也可以利用共價(jià)鍵合。通常，在層析介 質(zhì)為硝基纖維素膜或混合硝基纖維素酯膜的情況下，可以進(jìn)行物理吸附。在使其共價(jià)鍵合 的情況下，通過溴化氰、戊二醛、碳二亞胺等進(jìn)行層析介質(zhì)的活化。對(duì)于層析介質(zhì)和第一抗 體，例如可以用微量注射器、帶調(diào)節(jié)泵的鋼筆、噴墨印刷等方法使其吸附或結(jié)合。作為判定 部位的形態(tài)，沒有特別限定，可以以圓形的點(diǎn)、沿層析介質(zhì)的展開方向垂直延伸的線、數(shù)字、 文字、+、-等符號(hào)等形態(tài)來形成判定部位。
[0073] 根據(jù)需要，對(duì)固定有第一抗體的層析介質(zhì)進(jìn)行封閉處理。作為可以用于封閉處理 的封閉劑，除了牛血清白蛋白、脫脂乳、酪蛋白、明膠等蛋白質(zhì)以外，還可以舉出=Blocking Peptide Fragment(TC)YOBO公司制造）和親水性高分子聚合物等市售的封閉劑。
[0074] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒含有標(biāo)記物與上述第二抗體結(jié)合而成的標(biāo)記試劑。作為本發(fā) 明中所使用的標(biāo)記物，可以使用酶或不溶性載體。作為酶，有堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、 β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等，可以與各酶對(duì)應(yīng)的公知的發(fā)色基質(zhì)一同使用。作 為不溶性載體，可以使用金、銀、鉬之類的膠體狀金屬顆粒，氧化鐵之類的膠體狀金屬氧化 物顆粒，硫等膠體狀非金屬顆粒和由合成高分子制成的乳膠顆粒，以及其它載體。對(duì)膠體狀 金屬顆粒和膠體狀金屬氧化物顆粒而言，例如可以舉出：膠體狀金顆粒、膠體狀銀顆粒、膠 體狀鉬顆粒、膠體狀氧化鐵顆粒、膠體狀氫氧化鋁顆粒等。特別優(yōu)選的是，膠體狀金顆粒和 膠體狀銀顆粒具有適當(dāng)?shù)牧?，膠體狀金顆粒顯示出紅色、膠體狀銀顆粒顯出示黃色的情 況。這些膠體狀金屬顆粒的平均粒徑為Inm?500nm，特別優(yōu)選可得到強(qiáng)的色調(diào)的IOnm? 150nm，更優(yōu)選為40nm?IOOnm的范圍內(nèi)。作為本發(fā)明的標(biāo)記試劑中所使用的標(biāo)記物，優(yōu)選 不溶性載體，進(jìn)一步優(yōu)選膠體狀金屬顆粒，特別優(yōu)選膠體狀金顆粒。
[0075] 作為膠體狀金屬顆粒，例如在使用膠體狀金顆粒的情況下，可以使用市售的物質(zhì)。 或者，可以利用常規(guī)方法，例如用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法來制備膠體狀金顆粒。
[0076] 作為使本發(fā)明中使用的第二抗體與標(biāo)記物結(jié)合的方法，可以利用物理吸附或化學(xué) 結(jié)合等公知的方法進(jìn)行。例如，在用膠體狀金顆粒標(biāo)記第二抗體的情況下，通過在金顆粒以 膠體狀分散的溶液中加入第二抗體使其物理吸附后，添加牛血清白蛋白溶液或上述的市售 封閉劑等以封閉抗體未結(jié)合的顆粒表面來制備。
[0077] 本發(fā)明的標(biāo)記試劑可以作為層析介質(zhì)以外的其它試劑包含在本發(fā)明的試劑盒中， 但是也可以在層析介質(zhì)上設(shè)置標(biāo)記試劑保持部，使此處保持干燥。在將標(biāo)記試劑保持在標(biāo) 記試劑保持部的情況下，優(yōu)選的是以標(biāo)記試劑迅速地溶解在展開液中并能通過毛細(xì)作用而 自由移動(dòng)的方式保持標(biāo)記試劑。對(duì)標(biāo)記試劑保持部而言，為了使標(biāo)記試劑的再溶解性變得 良好，也可以在標(biāo)記試劑中添加蔗糖（寸7力^一 7 )、蔗糖、海藻糖、麥芽糖、乳糖等糖類、 甘露醇等糖醇并涂布，或者將這些物質(zhì)預(yù)先涂布。標(biāo)記試劑保持部的形成也可以通過將標(biāo) 記試劑直接涂布在層析介質(zhì)上并干燥來進(jìn)行，也可以涂布在層析介質(zhì)以外的其它多孔性物 質(zhì)（例如纖維素濾紙、玻璃纖維濾紙、尼龍無紡布）上并干燥而形成標(biāo)記試劑保持部件，然 后以層析介質(zhì)和上述保持部件通過毛細(xì)管連接的方式進(jìn)行配置。
[0078] 作為可應(yīng)用于本發(fā)明檢測(cè)試劑盒的生物樣品，只要是懷疑含有A型流感病毒的物 質(zhì)就沒有特別限制，作為優(yōu)選的試樣，可以舉出：鼻拭子液、鼻腔抽吸液、咽拭子液等?？梢?在本發(fā)明的試劑盒中直接使用這些生物樣品，但通常將試樣懸浮或稀釋在展開液中使用。
[0079] 作為與本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒一同使用的展開液，通常以水為溶劑，優(yōu)選含有磷酸 鹽、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、HEPES、G 〇〇d' s等緩沖劑、氯化鈉等無機(jī)鹽。進(jìn)而，根據(jù)需要， 可以含有牛血清白蛋白（BSA)等蛋白成分、防腐劑等。進(jìn)而，本發(fā)明中所使用的展開液可以 含有非尚子性表面活性劑，以破壞流感病毒的病毒粒子并使本發(fā)明的第一抗體和第二抗體 與核蛋白的接觸變得容易。作為添加到展開液中的非離子性表面活性劑，例如可以舉出：聚 氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯（商品名"Tween"系列）、聚氧乙烯對(duì)叔辛基 苯基醚（商品名"Triton"系列）、聚氧乙烯對(duì)叔壬基苯基醚（商品名"TritonN"系列）等， 但不限定于這些。這些非離子性表面活性劑的含量沒有特別限定，但是可在相對(duì)于展開液 總重量為0.01?10.0重量％的范圍內(nèi)使用，優(yōu)選在0. 1?5.0重量％的范圍內(nèi)使用，更優(yōu) 選在0. 1?1.0重量％的范圍內(nèi)使用，進(jìn)一步優(yōu)選在0.3?1.0重量％的范圍內(nèi)使用。
[0080] 可以使用本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒通過（例如）以下的操作來檢測(cè)A型流感病毒。
[0081] 作為本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，預(yù)先將從受試者采集的生物樣品在展開液中與標(biāo)記 試劑混合，形成核蛋白和標(biāo)記試劑的復(fù)合物后，使其與層析介質(zhì)接觸。含有核蛋白-標(biāo)記試 劑復(fù)合物的展開液作為移動(dòng)相在層析介質(zhì)中移動(dòng)。當(dāng)核蛋白-標(biāo)記試劑復(fù)合物移動(dòng)到層析 介質(zhì)的判定部位時(shí)，固定了的第一抗體將其捕捉，標(biāo)記試劑間接地與判定部位結(jié)合。在標(biāo)記 物為不溶性載體的情況下，通過目視或光密度計(jì)等直接對(duì)判定部位中存在的標(biāo)記試劑進(jìn)行 發(fā)色強(qiáng)度的確認(rèn)，在標(biāo)記物為酶的情況下，通過目視或光密度計(jì)等對(duì)判定部位中存在的標(biāo) 記試劑與基質(zhì)作用得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行發(fā)色強(qiáng)度的確認(rèn)，由此可以進(jìn)行A型流感病毒的檢 測(cè)或定量。
[0082] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，使用具有標(biāo)記試劑保持部的層析介質(zhì)進(jìn)行A型流 感病毒的檢測(cè)。若使生物樣品和展開液與層析介質(zhì)接觸，則它們作為移動(dòng)相在層析介質(zhì)中 移動(dòng)，并溶解標(biāo)記試劑保持部中所保持的標(biāo)記試劑。移動(dòng)相中所溶解的標(biāo)記試劑與試樣中 的A型流感病毒核蛋白形成復(fù)合物，在層析介質(zhì)中移動(dòng)。達(dá)到層析介質(zhì)的判定部位的核蛋 白-標(biāo)記試劑復(fù)合物被判定部位處所固定的第一抗體捕捉，標(biāo)記試劑間接地與判定部位結(jié) 合?？梢酝ㄟ^利用目視或光密度計(jì)等測(cè)定判定部位中存在的標(biāo)記試劑來進(jìn)行A型流感病毒 的檢測(cè)或定量。
[0083] 下面，利用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明更具體地進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不受這些實(shí)施例任何 限定。
[0084] 實(shí)施例
[0085] (實(shí)施例1)抗A型流感病毒核蛋白抗體的制作
[0086] 免疫原使用基于源自A型流感病毒A/Puerto Rico/8/34(HlNl)株的核蛋白的氨 基酸序列（DDBJ/GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)Accession N〇.V01084)制成的重組核蛋白。在免疫原 中加入等量的弗氏完全佐劑并完全地混合后，以2周間隔對(duì)BALB/c小鼠共免疫4次。自 最后的免疫起3天后從免疫過的小鼠中采集脾細(xì)胞，使用公知的標(biāo)準(zhǔn)方法，與骨髓瘤細(xì)胞 (P3U1)融合以制作雜交瘤。10?15日后，使用雜交瘤的培養(yǎng)上清液對(duì)A型流感病毒核蛋 白進(jìn)行特異性抗體的篩選。
[0087] 作為一次篩選，通過依次進(jìn)行以下的篩選操作來選擇與A型流感病毒核蛋白有抗 原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0088] 首先，固相使用微量滴定板，抗原使用與免疫原中使用的相同的重組核蛋白，通過 固相ELISA法進(jìn)行篩選。即，在96孔板（SUMIL0N)的各孔中分別加入100 μ 1的在碳酸緩沖 液中含有10. 〇 μ g/ml重組核蛋白的溶液，在4°C下培養(yǎng)一晚，固定抗原。接著，用含有0. 1 % 的TWeen20(商品名）的PBS(以下稱為PBS-Tween)清洗各孔后，加入用PBS稀釋了的1% BSA，在4°C下進(jìn)行封閉一晚。用PBS-Tween清洗后，各加入培養(yǎng)上清液100 μ 1，使之在37°C 下反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-Tween充分清洗后，在各孔中加入稀釋1000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記抗 小鼠 Igs抗體（Funakosi (株）公司制造），使之在37°C下反應(yīng)1小時(shí)。用PBS-Tween充分 清洗后，在各孔中加入作為基質(zhì)的對(duì)硝基苯基磷酸酯100 μ 1，使之在室溫下反應(yīng)30分鐘。 在各孔中分別加入反應(yīng)停止液1〇〇μ 1，在波長(zhǎng)405nm下測(cè)定發(fā)色水平。使用顯示高的發(fā)色 的孔所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)上清液，進(jìn)行進(jìn)一步的篩選操作。
[0089] 接著，固相使用硝基纖維素膜，抗原使用A型流感病毒，以免疫層析法的測(cè)定系統(tǒng) 進(jìn)行篩選。即，在35mmX 5mm的硝基纖維素膜上涂布培養(yǎng)上清液使其在37°C下干燥1小時(shí)， 由此固定抗體而形成判定線。另外，在50mM HEPES緩沖液中混合培養(yǎng)上清液和金膠體溶液， 由此制作抗體敏感金膠體溶液。將A型流感病毒A/New Caledonia/20/99(H1N1)株或作為 陰性對(duì)照的B型流感病毒B/Tokio/53/99株懸浮于試樣稀釋液（20mM磷酸緩沖液（pH7. 4)、 0.3%脫脂乳、0.3%了￥661120、0.151氯化鈉）中，加入到96孔板（5通111^)的各孔中。進(jìn) 而，在各孔中加入上述抗體敏感金膠體溶液，與病毒懸浮液充分混合。在各孔的混合液中， 插入硝基纖維素膜的端部，使含有病毒的混合液展開。在開始展開10分鐘后，從混合液中 取出硝基纖維素膜，用免疫層析定量?jī)x（浜松Photonics(株）公司制造）測(cè)定判定線上所 捕捉的金膠體的發(fā)色強(qiáng)度。在發(fā)色強(qiáng)度超過8. OmABS的情況下，判定為陽性。選擇在展開A 型流感病毒的情況下，成為陽性，在展開B型流感病毒的情況下，成為陰性的測(cè)定系統(tǒng)中所 使用的抗體作為與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒 有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
[0090] 針對(duì)一次篩選中所選擇的抗體，作為二次篩選，通過使用上述的重組核蛋白進(jìn)行 Western blot法，選擇雖然與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)、但與由SDS-PAGE分 離的A型流感病毒核蛋白沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。即，將0.01mg/ml的上述重組核蛋白 溶液與添加有10%的2-巰基乙醇的2XTris-Glycine SDS Sample Buffer(TEFCC)公司制 造）等量混合，在l〇〇°C下加熱10分鐘，供給至SDS-PAGE。SDS-PAGE使用預(yù)制凝膠J5-20% 12well(BI0-RAD公司制造），按照公知的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。利用印跡裝置（BI0-RAD公司制造） 從電泳后的凝膠中將蛋白轉(zhuǎn)印至Sequi-Blot PVDF Membrane(BK)-RAD公司制造）。用免疫 封閉劑（DS Pharma Laboratories)在室溫下封閉轉(zhuǎn)印后的PVDF膜1小時(shí)。除去封閉液，用 含有0. 05% TWeen20(商品名）的PBS (以下稱為T-PBS)在10分鐘內(nèi)清洗PVDF膜3次后， 與含有一次篩選中所選擇的抗體的培養(yǎng)上清液一同在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。用T-PBS在10分 鐘內(nèi)清洗PVDF膜3次后，與用T-PBS稀釋5000倍的堿性磷酸酶標(biāo)記抗小鼠 IgG (SIGM公司 制造）一同在室溫下培養(yǎng)30分鐘。用T-PBS在10分鐘內(nèi)清洗3次后，與作為發(fā)色基質(zhì)的 l-Skp? NBT/BCIP (PIERCE公司制造）一同培養(yǎng)PVDF膜，使PVDF膜所結(jié)合的抗體可視化。 作為陽性對(duì)照，使用市售的抗A型流感病毒單克隆抗體（商品編號(hào)7307，Medix Biochemica 公司制造）代替培養(yǎng)上清液，在目視可檢測(cè)到陽性對(duì)照抗體與PVDF膜的結(jié)合的條件下，在 無法檢測(cè)到培養(yǎng)上清液中所含的抗體的結(jié)合的情況下，選擇該抗體作為與由SDS-PAGE分 離的A型流感病毒核蛋白沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。對(duì)產(chǎn)生該抗體的雜交瘤克隆，選擇3 個(gè)獨(dú)立的克隆體，分別命名為雜交瘤1C6、6F7和10G5。另外，將雜交瘤1C6、6F7和10G5各 自產(chǎn)生的抗體命名為抗體1C6、6F7和10G5。從3株該雜交瘤中得到的單克隆抗體的亞型均 為 IgGl。
[0091] 將Western blot法中的抗體1C6、6F7和10G5與A型流感病毒的重組核蛋白的反 應(yīng)示于圖1。將抗體的濃度分別調(diào)節(jié)為1〇μ g/ml，使其與每槽1. 0μ g的重組核蛋白反應(yīng)。 如圖1所示，通過抗體7307檢測(cè)到相當(dāng)于全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白的56kDa的色帶，但 是若在相同的條件下使用抗體1C6、6F7或10G5則無法檢測(cè)到色帶。進(jìn)而，使每槽的重組核 蛋白的量增加至5. 0 μ g并再次進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)，在使用抗體1C6、6F7或10G5的情況下，在 Western blot法中無法確認(rèn)到可檢測(cè)的色帶（未顯示數(shù)據(jù)）。
[0092] (實(shí)施例2)利用免疫層析法的檢測(cè)試劑盒的制作
[0093] (1)捕捉抗體用稀釋液的制作
[0094] 將異丙醇用50mM磷酸緩沖液（pH7. 4)混合稀釋以成為5%，制作第一抗體用稀釋 液。
[0095] (2)層析介質(zhì)上的判定部的制作
[0096] 從抗體1C6、6F7和10G5中選擇1種抗體或組合2種抗體，用捕捉抗體用稀釋液以 總抗體濃度為I. 〇mg/ml的方式進(jìn)行稀釋。使用涂布機(jī)（BioDot公司制造）將該抗體溶液 涂布在25X2. 5cm的硝基纖維素膜（Millipore公司制造）上，使其在50°C下干燥5分鐘 后，進(jìn)一步使其在室溫下干燥1小時(shí)，從而在層析介質(zhì)上制作判定部。
[0097] (3)標(biāo)記抗體溶液的制作
[0098] 使用金膠體懸浮液（田中貴金屬工業(yè)（株）公司制造：平均粒徑40nm、金濃度 0. 36mM)作為標(biāo)記物。僅將抗體7307、或者將抗體7307與抗體1C6、6F7或10G5中的任意 一個(gè)組合，用磷酸緩沖液（PH7. 4)稀釋使總抗體濃度為0. 05mg/ml。將0. Iml抗體溶液加入 到0. 5ml金膠體懸浮液中，在室溫下靜置10分鐘。接著，加入含有1% BSA的磷酸緩沖液 (pH7. 4)0. lml，進(jìn)一步在室溫下靜置10分鐘。然后，充分?jǐn)嚢瑁?000Xg進(jìn)行離心分離15 分鐘。除去上清液后，加入含有0. 5 % BSA的磷酸緩沖液（pH7. 4) 2ml。
[0099] (4)利用免疫層析法的檢測(cè)試劑盒的制作
[0100] 將上述（3)中制作的標(biāo)記抗體溶液均一地添加到15mmX300mm的玻璃纖維片 (Millipore公司制造）上之后，用真空干燥機(jī)使其干燥，制作接合墊^ =欠'一 i 3 > 〃 7 K )。其次,在由墊板（packing sheet)制成的基材上粘合上述（2)中制作的層析介 質(zhì)，進(jìn)而，在展開方向的上游依次粘合接合墊以及作為試樣添加部的樣品墊（Millipore公 司制造：300_X30mm)，在展開方向的下游粘合吸收墊后，裁成5mm寬度以制作利用免疫層 析法的檢測(cè)試劑盒。每1個(gè)試劑盒的吸收墊的大小為26_X5mm，使用的標(biāo)記抗體溶液中的 金含量為1 μ g。
[0101] (5)展開液的制備
[0102] 以各試劑的濃度：10%了￥661120為1%、0.說硫酸鎂為51111、二甲基亞砜為0.95%、 20%葡聚糖硫酸鈉（重均分子量：50萬）為2%、以及CE510(JSR Corporation制）為2% 的方式加入到超純水中，混合。進(jìn)一步加入作為防腐劑的疊氮化鈉使其濃度為〇. 05%，混 合，制作展開液。
[0103] (實(shí)施例3) A型流感病毒的測(cè)定
[0104] 使用上述制作的檢測(cè)試劑盒，用以下的方法進(jìn)行與A型流感病毒的反應(yīng)性試驗(yàn)， 對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的性能進(jìn)行試驗(yàn)。
[0105] 從通過使用了 PCR法的感染檢查而判定A型流感病毒（H3N2)的感染為陰性的 受試者采集鼻涕。鼻涕的采集通過將吸集器的一根管子插入至受試者的鼻腔的內(nèi)部，將 另一根管子與抽氣泵連接，并將抽氣泵設(shè)為負(fù)壓來進(jìn)行。通過將鼻涕用展開液稀釋至20 倍來制備A型流感病毒陰性檢測(cè)物。在上述陰性檢測(cè)物中添加失活了的A型流感病毒A/ Panama/2007/99 (H3N2)，作為A型流感病毒陽性檢測(cè)物。
[0106] 將陽性檢測(cè)物或陰性檢測(cè)物分別150 μ 1載于檢測(cè)試劑盒的樣品墊上并使其展 開，10分鐘后以目視判定。將在判定部可確認(rèn)紅色線的情況設(shè)為" + "，將可確認(rèn)到更強(qiáng)的紅 色線的情況設(shè)為"++"，將雖然可確認(rèn)到紅色線但是顏色非常淡的情況設(shè)為" ± "，將無法確 認(rèn)到紅色線的情況設(shè)為將結(jié)果示于表1。
[0107] (比較例1)
[0108] 在上述實(shí)施例2的檢測(cè)試劑盒的制作中，更改涂布于層析介質(zhì)上的判定部處的抗 體以及與金膠體結(jié)合的抗體，除此以外，通過與實(shí)施例3同樣的操作進(jìn)行陽性檢測(cè)物和陰 性檢測(cè)物的測(cè)定。
[0109] 作為涂布于層析介質(zhì)上的判定部處的抗體，使用抗體7307、抗體1C6或它們的組 合來代替抗體1C6、6F7和10G5中的任意一者或者它們的組合。
[0110] 作為與金膠體結(jié)合的標(biāo)記抗體，使用抗體6F7和10G5來代替抗體7307。
[0111] 將結(jié)果示于表1。
[0112] (比較例2)
[0113] 使用利用免疫層析法的市售的A型流感病毒檢測(cè)試劑盒、ImmunoAce Flu(商品 名）（（株）TAUNS公司制造），通過與實(shí)施例3同樣的操作進(jìn)行陽性檢測(cè)物和陰性檢測(cè)物的 測(cè)定。
[0114] 將結(jié)果示于表1。
[0115] [表 1]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測(cè)A型流感病毒的試劑盒，其為利用免疫層析法的檢測(cè)試劑盒，含有：固 定有與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體 反應(yīng)的第一抗體的層析介質(zhì)、以及與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病 毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的第二抗體和標(biāo)記物結(jié)合而成的標(biāo)記試劑，其中， 第一抗體為與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在 Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體，第二抗體為與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)試劑盒，其中，第一抗體為1種或1種以上的單克隆抗 體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的檢測(cè)試劑盒，其中，第一抗體為通過對(duì)A型流感病毒H1N1 亞型的全長(zhǎng)的核蛋白進(jìn)行免疫而得到的抗體。
4. 一種A型流感病毒的檢測(cè)方法，其為利用免疫層析法的檢測(cè)方法，使用了固定有與 A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的 第一抗體的層析介質(zhì)、以及與A型流感病毒核蛋白有抗原抗體反應(yīng)而與B型流感病毒核蛋 白實(shí)質(zhì)上沒有抗原抗體反應(yīng)的第二抗體和標(biāo)記物結(jié)合而成的標(biāo)記試劑，其中， 第一抗體為與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在 Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體，第二抗體為與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其中，第一抗體為1種或1種以上的單克隆抗體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的檢測(cè)方法，其中，第一抗體為通過對(duì)A型流感病毒H1N1 亞型的全長(zhǎng)的核蛋白進(jìn)行免疫而得到的抗體。
7. -種A型流感病毒的檢測(cè)試劑，含有：與未變性的A型流感病毒核蛋白有抗原抗體 反應(yīng)、而與由SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳所分離的全長(zhǎng)的A型流感病毒核蛋白在Western blot法中沒有抗原抗體反應(yīng)的抗體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)試劑，其中，A型流感病毒檢測(cè)試劑用于利用免疫層析法 的檢測(cè)試劑盒中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)試劑，其中，A型流感病毒檢測(cè)試劑是固定在利用免疫層 析法的檢測(cè)試劑盒的層析介質(zhì)中而使用的。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7?9中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑，其中，A型流感病毒檢測(cè)試劑為 1種或1種以上的單克隆抗體。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7?10中任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)試劑，其中，A型流感病毒檢測(cè)試劑為 通過對(duì)A型流感病毒H1N1亞型的全長(zhǎng)的核蛋白進(jìn)行免疫而得到的抗體。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104246504SQ201380017930
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年3月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月30日
【發(fā)明者】巖本久彥, 川本浩子, 加藤伸一 申請(qǐng)人:田中貴金屬工業(yè)株式會(huì)社