油脂水解用酶促方法
【專利摘要】本文提供一種用于在均質(zhì)混合物中酶促水解油脂的有效方法。本發(fā)明特別提供用于由脂肪生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?MAG)、sn-區(qū)域二?；视?DAG)和甘油的方法，其中超過98％的脂肪可轉(zhuǎn)化為期望產(chǎn)物。本發(fā)明還提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，在終產(chǎn)物中幾乎無sn-區(qū)域二?；视?DAG)且包括小于5％的sn-區(qū)域單?；视?MAG)。
【專利說明】油脂水解用酶促方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于由脂肪生產(chǎn)油化學(xué)品（oleochemicals)如脂肪酸和甘油的有效 且節(jié)約成本的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 油脂為甘油三酯，典型地由甘油及飽和及不飽和脂肪酸組成。近年來這些越來 越多地用于開發(fā)有競爭力的高效產(chǎn)品，既有利于消費(fèi)者也有利于環(huán)境（Hill K，Pure and Applied Chemistry 72 (2000)pp. 1255 - 1264)。對(duì)于大部分進(jìn)一步的使用，油脂必須分成 所謂的油化學(xué)品類材料，主要是脂肪酸和甘油。發(fā)現(xiàn)中間體和單?；视停∕AG)、二?；?油（DAG)、脂肪酸甲基酯以及脂肪酸甲基酯的氫化產(chǎn)物（即，脂肪醇）在油脂化學(xué)工業(yè)中有 巨大作用（Falbe 等人，Angew. Chem. Int. Ed. Engl.，27 (1988)ρρ· 41-62)。
[0003] 用以產(chǎn)生游離的脂肪酸（FAs)、MAGs和甘油的三?；视停═AG)的水解是初級(jí)反 應(yīng)，由此產(chǎn)生的脂肪酸進(jìn)一步被互酯化（interesterified)、酯轉(zhuǎn)移（transesterified)或轉(zhuǎn) 化成高價(jià)態(tài)脂肪醇。這些基材接著用作生產(chǎn)洗滌和清潔劑、化妝品、表面活性劑、聚合物和 潤滑劑的中間體。存在許多有巨大商業(yè)價(jià)值的有用的單甘油酯如由脂肪酸和甘油合成的甘 油單硬脂酰酯、甘油單油酸酯和甘油單蓖麻醇酸酯，每年共計(jì)超過10, 〇〇〇噸。
[0004] 已通過使用催化劑在高溫高壓下商業(yè)化完成油的水解，如特威切爾法（Twitchell process)和高露潔法（Colgate-Emery process)。顯色、副產(chǎn)物形成、聚合誘導(dǎo)和隨后蒸饋 的要求是這些方法的主要弊端。反應(yīng)副產(chǎn)物與不期望的黑色和燒焦味道相關(guān)，因而需要專 業(yè)技術(shù)（如分子蒸餾）除去顏色和副產(chǎn)物。該領(lǐng)域的快速發(fā)展已導(dǎo)致引入更溫和的化學(xué)反 應(yīng)條件用于脂肪分解；然而，該方法的資本支出（CAPEX)仍舊非常高，且需要更好的技術(shù)。
[0005] 油脂的水解，特別是利用脂肪酶作為生物催化劑的油脂的水解，提供了包括在常 壓低溫下反應(yīng)在內(nèi)的幾種優(yōu)勢。除了控制反應(yīng)產(chǎn)生MAGs的可能性以外，還存在幾種其它酶 促方法的優(yōu)勢。然而，迄今為止，通過使用脂解酶的脂肪分解僅在實(shí)驗(yàn)性試驗(yàn)中進(jìn)行。酶促 方法由于成本高和反應(yīng)時(shí)間長還未商業(yè)化。
[0006] Hammond 等人(Journal of American Oil Chemist's Society, 67 (1990)，ρρ· 761-765)描述了在約58天內(nèi)90%脂解，其中在4天內(nèi)僅實(shí)現(xiàn)10% 的轉(zhuǎn)化率。作者推測水解的緩慢速率可能是由于酶受到反應(yīng)產(chǎn)物甘油的抑制。US5932458 描述了使用從粉碎種子中回收的脂肪酶催化劑用于分解飽和度和羥基化程度不同的各種 類型的油脂。
[0007] 還研究了在60°C下在雙相混合物庚烷-緩沖液pH 7.0中將微生物脂肪酶作為 葵花油、大豆卵磷脂及其混合物水解的催化劑（Ferreira等人，Enzyme and Microbial Technology，41 (1-2)2007, pp. 35-43)。使用膜結(jié)合脂肪酶在兩相反應(yīng)體系中的棕櫚油的 水解，MAGs 的產(chǎn)率為 32 - 50% (Tianwei Tan 等人，Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 18(2002)，pp. 325-331)。Fernandesa MLM 等人（Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic, 30(1)2004, pp.43-49)描述了在 Α0Τ/異辛燒反向微胞體系中由 TLL脂肪酶催化的水解和合成反應(yīng)。Bilyk等人（Journal of American Oil Chemist's Society，68 (1991)，pp. 320-323)報(bào)道了在20小時(shí)內(nèi)在中等溫度、仲胺的存在下通過使用 真菌脂肪酶產(chǎn)生的76%的水解。還報(bào)道了在45°C下產(chǎn)率的進(jìn)一步改進(jìn)。
[0008] Kulkarni 等人（Indian Journal of Biotechnology, 4 (2005)，ρρ· 241-245)報(bào) 道了對(duì)菌麻油酶促水解的反應(yīng)器和反應(yīng)條件的優(yōu)化。Ramachandran等人（Biochemical Engineering Journal, 34(2007)，pp. 228-235)描述了使用含固定化脂肪酶的填充床反 應(yīng)器用于研究不同油水解的動(dòng)力學(xué)并用于改進(jìn)水解反應(yīng)中使用的脂肪酶的操作穩(wěn)定性。 Goswami 等人（Bioresource technology, 101 (1)2010, ρρ· 6-13)描述了表面活性劑增強(qiáng)的 菌麻油水解用于生產(chǎn)脂肪酸。Martinez等人描述了在連續(xù)流的超臨界C02中通過填充床 反應(yīng)器的芥花油水解（Biocatalysis and Biotransformation, 12 (2) 2002, ρρ· 147-157)。 Helena Sovova等人描述了在填充床反應(yīng)器中使用超臨界C02通過脂肪酶（Lipozyme)催化 黑醋栗子油水解（Chemical Engineering Science，58(ll)2003，pp. 2339-2350)。
[0009] WO 91/016442和US5116745描述了用于將甘油三酯選擇性水解為2-?；视王?的方法。該方法使用一元低級(jí)烷基醇、緩沖液體系和1，3-脂肪酶。2-?；鶈胃视王タ捎?于通過與酸酐的酯化作用和1，3-脂肪酶催化作用制備立體特異性的1，2-二?；视王セ?2, 3-二?；视王?。立體特異性的甘油三酯可由這些材料通過標(biāo)準(zhǔn)酯化反應(yīng)在控制重排的 條件下制備。
[0010] W090/013656描述了兩步酶促方法，其包括脂肪酶-催化的甘油三酯的酯轉(zhuǎn)移，接 著低溫結(jié)晶化用于制備Ω-3脂肪酸顯著富集的油基產(chǎn)品。該方法產(chǎn)生高度純的單甘油酯 的混合物，其中至少60%含有Ω-3脂肪酸。W090/04033描述了用于通過脂肪酶催化的酯 轉(zhuǎn)移生產(chǎn)高純度單甘油酯的方法。記載的方法包括將油或純甘油三酯與醇類、少量水和脂 肪酶混合。反應(yīng)在溫和條件下進(jìn)行，產(chǎn)生高產(chǎn)率的β-單甘油酯產(chǎn)物。
[0011] US6500974描述了用于制備單甘油酯的方法，其中使脂肪酸和甘油在食品級(jí)極性 溶劑的存在下反應(yīng)并避免使用催化劑。Eitel Pastor等人（Biocatalysis and Biotrans formation，12 (2) 1995, pp. 147-157)描述了使用硬脂酸乙酯作為?；w在南極假絲酵母 (Candida antarctica)脂肪酶（Novozym-435)的存在下使用極性不同的各種溶劑將甘油 與硬脂酸直接酯化或酯轉(zhuǎn)移。
[0012] 在幾乎所有的實(shí)例中，水解或者不完全，或者需要較長的反應(yīng)時(shí)間（超過三天達(dá) 到完全）。脂肪酶作為催化劑的效力通常被高生產(chǎn)和分離成本所抵消，以至于研究組不斷地 致力于增加酶的產(chǎn)率或酶的產(chǎn)量。另外，商業(yè)化應(yīng)用已受到高酶耗、長反應(yīng)時(shí)間和低生產(chǎn)率 的限制，這已阻礙了成功的工業(yè)應(yīng)用。
[0013] 典型地，已使用水包油或油包水型乳液進(jìn)行脂肪酶催化的酶促水解，其中如果使 用游離形式的酶，酶溶液的再利用性會(huì)產(chǎn)生問題。另外，固定化酶制劑具有基質(zhì)可達(dá)性 (substrate accessibility)問題，其中在非均質(zhì)介質(zhì)中不良的基質(zhì)擴(kuò)散性限制了其有效 的轉(zhuǎn)化率。
[0014] 現(xiàn)有技術(shù)的方法中沒有提供以下三點(diǎn)期望的特性，即，酶催化的低成本、油的完全 水解和酶的高度穩(wěn)定性。在引用的現(xiàn)有技術(shù)中，沒有嘗試分離不完全水解的油（MAGs和 DAGs)和 FAs。
[0015] 對(duì)于酶促單甘油酯合成的所有報(bào)道均主要集中在使用甘油的各種基質(zhì)如蓖麻油、 大豆油、椰子油、棕櫚油、菜籽油、米糠的甘油解（glycerolysis)上。使用不同的油和甘油 經(jīng)甘油解生產(chǎn)MAG是昂貴的過程。
[0016] 因此，需要開發(fā)出用于由油生產(chǎn)油化學(xué)品如脂肪酸和甘油的有效方法。該過程可 為油和/或脂的水解的方法，該方法繞過了甘油介導(dǎo)的水解，即甘油解，并直接通過控制的 油水解產(chǎn)生較高級(jí)的脂肪酸MAGs。
[0017] 本公開的其它方面將闡述于說明書中的某一部分，該部分的發(fā)明從描述中顯而易 見，或可通過實(shí)施本發(fā)明而知曉。本發(fā)明在所附權(quán)利要求中闡述并特別指出，并且本公開不 應(yīng)理解為以任何方式限定權(quán)利要求的范圍。下述詳細(xì)描述包括本發(fā)明各種實(shí)施方案的示例 性代表，其不限制所要求保護(hù)的本發(fā)明。附圖構(gòu)成本說明書的一部分，與描述一起，僅用于 說明各種實(shí)施方案，并不限制本發(fā)明。
[0018] 本申請(qǐng)中各種文獻(xiàn)的引用并不是認(rèn)可這些文獻(xiàn)為本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
[0019] 本領(lǐng)域中公開的酶促水解方法沒有記載油和水的均質(zhì)混合物的形成。另外，該方 法非常耗時(shí)，水解完成花費(fèi)多達(dá)72小時(shí)。因此，本領(lǐng)域需要快速且較容易的方法用于在均 質(zhì)混合物中酶促水解油脂。
[0020] 本發(fā)明提供一種用于脂肪、油以及油和脂的組合的水解的酶催化方法，該方法可 在6小時(shí)內(nèi)完成。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0021] 因此，本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域（sn-regio)單?；视停∕AG)、 sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和水 的均質(zhì)混合物，并使均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，其中水解產(chǎn) 物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油。
[0022] 另外，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn_區(qū)域二酰基甘油 (DAG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和水的均質(zhì)混合物；使 均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，其中水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、 DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理水解產(chǎn)物，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以 獲得混合物，其中所述混合物包括脂肪酸和甘油，其中混合物具有小于5%的單酰基甘油 (MAG)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 以下附圖構(gòu)成本說明書的一部分并包括在內(nèi)以說明本發(fā)明的各方面。通過參考附 圖并結(jié)合本文示出的具體實(shí)施方案的詳細(xì)描述，可更好地理解本發(fā)明。
[0024] 圖1示出在均質(zhì)介質(zhì)中利用不同脂肪酶的蓖麻油的水解。
[0025] 圖2示出蓖麻油、叔丁醇和水的三相圖。
[0026] 圖3示出不含溶劑和在不同極性有機(jī)溶劑中使用HypLIP (固定化疏綿狀嗜熱絲孢 菌（Thermomyces langinousa)脂肪酶）在間歇式條件下6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化 率（％ )。
[0027] 圖4示出油水解的半連續(xù)法的方案。
[0028] 圖5示出用于生產(chǎn)二?；视秃椭舅岬倪B續(xù)法的方案。
[0029] 圖6示出sn-2單甘油酯和脂肪酸的生產(chǎn)方法。
[0030] 圖7示出了固定化脂肪酶柱的水解產(chǎn)物的HPLC-MS譜。
[0031] 圖8示出油水解導(dǎo)致sn-1 (3)單甘油酯和脂肪酸生產(chǎn)的兩步方案。
[0032] 圖9示出來自重排柱的水解產(chǎn)物的HPLC-MS譜。
[0033] 圖10示出用于油水解導(dǎo)致脂肪酸和甘油生產(chǎn)的三步PBR方案。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到本文記載的發(fā)明除了具體記載的那些以外，可進(jìn)行變型 和改變。應(yīng)該理解的是，本文記載的發(fā)明包括所有這些變型和改變。本發(fā)明還單獨(dú)或共同 包括本說明書中提及或指出的所有這些步驟、特征、組合物和化合物，所述步驟或特征的任 意兩種以上的任一或所有組合。
[0035] 定義
[0036] 為了方便起見，在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，說明書、實(shí)施例和所附權(quán)利要求中采用 的某些術(shù)語集中于此。這些定義應(yīng)有利于本公開其他部分的閱讀并被本領(lǐng)域技術(shù)人員所理 解。除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解 的相同的含義。貫穿本說明書使用的術(shù)語如下定義，除非在特定情況下限定。
[0037] 冠詞〃一〃和所述/該用于指一個(gè)或超過一個(gè)（即至少一個(gè)）該冠詞的語法上的 主語。
[0038] 術(shù)語〃包括〃、〃包含〃、〃含有〃、〃特征在于〃及其語法上的等同物以包含的開 放式含義使用，意指可包括其它元素。不意欲將其理解為〃僅由...組成"。
[0039] 如本文使用的，"由...組成"及其語法上的等同物排出權(quán)利要求中未限定的任何 元素、步驟或成分。
[0040] 本文使用的術(shù)語"油化學(xué)品"是指源自植物、微生物或動(dòng)物脂肪的物質(zhì)。油化學(xué) 品的實(shí)例包括但不限于脂肪酸、脂肪酸甲基酯（FAME)、脂肪醇、脂肪胺、甘油、醇乙氧基化物 (alcohol ethoxylates)、醇硫酸鹽、醇醚硫酸鹽、季銨鹽、單酰基甘油（MAG)、二酰基甘油 (DAG)、結(jié)構(gòu)化三?；视停═AG)、糖酯，和其它油化學(xué)品。
[0041] 用于本發(fā)明的術(shù)語"極性有機(jī)溶劑"是指允許溶質(zhì)在溶解介質(zhì)中離子化的有機(jī)溶 劑。
[0042] 術(shù)語〃脂肪〃應(yīng)歸屬于其最廣義的含義，從而包括油、脂肪和脂質(zhì)。用于本說明書 的術(shù)語"脂肪"是指甘油三酯、甘油和幾種脂肪酸的任一種的三酯。
[0043] 如本文使用的術(shù)語"區(qū)域選擇性酶（regioselective enzyme) "意指酶對(duì)于脂質(zhì)中 脂肪酸在甘油骨架上的位置的選擇性。
[0044] 術(shù)語"區(qū)域選擇性酶"和"特異性酶"可互換使用。
[0045] 術(shù)語"基質(zhì)混合物"是指包括脂肪、油或其混合物，極性有機(jī)溶劑和水的單相體系 (均質(zhì)混合物），其中術(shù)語基質(zhì)混合物與術(shù)語"反應(yīng)混合物"可互換使用。
[0046] 本發(fā)明不限于本文記載的具體實(shí)施方案限定的范圍，僅意欲出于舉例的目的。如 本文所記載的，功能等同的產(chǎn)品、組合物和方法明顯在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0047] 本發(fā)明涉及有效且節(jié)約成本的用于生產(chǎn)油化學(xué)品如脂肪酸，甘油，和/或來自油、 脂肪或其混合物的sn-區(qū)域單酰基甘油（sn-區(qū)域MAG異構(gòu)體）的方法。這些水解產(chǎn)物在 油化學(xué)品工業(yè)中具有巨大的潛力。
[0048] 本發(fā)明特別公開了通過采用固定化脂肪酶和單相基質(zhì)混合物的油、脂肪或其混合 物水解的有效的方法，其中極性有機(jī)溶劑用于將油溶入水中。本發(fā)明進(jìn)一步公開了包括多 步驟的水解方法，借助這些步驟可控制水解方法以獲得脂肪酸、甘油和/或sn-區(qū)域單酰基 甘油產(chǎn)率。
[0049] 此外，公開于本發(fā)明的方法導(dǎo)致在所選介質(zhì)中的酶，即固定化脂肪酶的再利用性 和穩(wěn)定性增強(qiáng)。
[0050] 如本發(fā)明中公開的油化學(xué)品的生產(chǎn)方法包括使包括基質(zhì)混合物的單相體系進(jìn)行 第一酶促水解以獲得部分水解產(chǎn)物，使部分水解產(chǎn)物經(jīng)過陽離子交換樹脂處理以獲得第一 產(chǎn)物，使第一產(chǎn)物進(jìn)行第二酶促水解以獲得第二產(chǎn)物，并通過蒸餾第一產(chǎn)物或第二產(chǎn)物將 油化學(xué)品/脂肪酸從所述產(chǎn)物中分離以獲得濃縮產(chǎn)物混合物并回收有機(jī)溶劑，通過離心或 提取方法、采用非極性水不溶性有機(jī)溶劑，從所述濃縮產(chǎn)物中回收游離的脂肪酸和甘油，其 中基質(zhì)混合物通過將脂肪、油或其混合物與水和極性有機(jī)溶劑混合來制備，其中酶被固定 化。
[0051] 公開于本說明書中的極性有機(jī)溶劑的使用允許形成脂肪和水的均質(zhì)混合物的，其 可通過脂肪酶起作用，從而在水解反應(yīng)完成時(shí)產(chǎn)生勻漿。
[0052] 本文公開的由脂肪生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二?；视?(DAG)和甘油的方法在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)進(jìn)行完全水解，并且可由第一酶促水解獲得的脂肪酸、 sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油來生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法 需要三個(gè)小時(shí)完成。因此，脂肪完全水解為脂肪酸和甘油可在少于6小時(shí)內(nèi)完成。
[0053] 涉及將來自脂肪的脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG) 和甘油水解為脂肪酸和甘油的本說明書公開的第二水解步驟允許產(chǎn)生幾乎無 sn-區(qū)域二 ?；视停―AG)的水解產(chǎn)物，僅有微量的該化合物存在于終產(chǎn)物中。觀察到的主反應(yīng)產(chǎn)物 為脂肪酸和甘油，其中水解產(chǎn)物中包括小于5%的sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)。
[0054] 本發(fā)明的實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū) 域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和水的均 質(zhì)混合物，并使均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，且其中該水解產(chǎn) 物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油。
[0055] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，所述方法包括 使包括脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的水解產(chǎn)物 用離子交換樹脂處理，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物 包括脂肪酸和甘油，和其中該混合物具有小于5%的單?；视停∕AG)。
[0056] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，所述方法 包括使包括脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的所述 水解產(chǎn)物用固體酸催化劑處理，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中 該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中所述混合物具有小于5%的單?；视停∕AG)。
[0057] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，所述方法包括使 包含脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的所述水解產(chǎn) 物用固體酸催化劑處理，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合 物包括脂肪酸和甘油，和其中所述混合物具有小于5%的單?；视停∕AG)，其中該固體酸 催化劑選自由沸石、粘土、陽離子酸離子交換樹脂、S04-氧化物、無定形混合氧化物和雜多 酸組成的組。
[0058] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，其中 水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油，其中 該脂肪為油。
[0059] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物，使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘 油，其中該脂肪為選自由蔬菜油、樹載油（tree borne oil)、微生物油、動(dòng)物源油、魚油、菌 麻油、橄欖油、芥子油、亞麻子油、芥花油、椰子油、芫荽油（coriander oil)、玉米油、棉花籽 油、榛子油、橄欖油、印楝油（neem oil)、棕櫚油、花生油、菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、 葵花籽油及其混合物組成的組的油。
[0060] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、 sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和水 的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，其中該水 解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油，其中該 脂肪選自由飽和脂肪、不飽和脂肪、羥基不飽和脂肪、羥基飽和脂肪、環(huán)氧脂肪、磷脂、蠟脂 及其混合物組成的組。
[0061] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，其 中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油， 其中該脂肪為脂肪酸基多元醇酯（fatty acid based polyol ester)。
[0062] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油 (MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，其 中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油， 其中該極性有機(jī)溶劑選自由叔丁醇、異戊醇、二丙酮醇、乙醇、丙醇和叔戊醇及其混合物組 成的組。
[0063] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，其 中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油， 其中該利用脂肪酶的酶促水解利用固定化脂肪酶進(jìn)行。
[0064] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，所述方法包括使 包含脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的水解產(chǎn)物用 離子交換樹脂處理，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包 括脂肪酸和甘油，和其中該混合物具有小于5%的單?；视停∕AG)，其中該利用脂肪酶的 酶促水解利用固定化脂肪酶進(jìn)行。
[0065] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘 油，其中該利用脂肪酶的酶促水解利用固定化在支持體上的固定化脂肪酶進(jìn)行，其中該支 持體的基材選自由聚苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、聚丙烯酸類、聚苯乙烯和聚甲基丙烯 酸酯組成的組。
[0066] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，所述方法 包括使包含脂肪酸的、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的水 解產(chǎn)物用離子交換樹脂處理，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該 混合物包括脂肪酸和甘油，和其中該混合物具有小于5%的單?；视停∕AG)，其中利用脂 肪酶的酶促水解利用固定化在支持體上的固定化脂肪酶進(jìn)行，其中該支持體的基材選自由 聚苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、聚丙烯酸類、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯組成的組。
[0067] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，所述方法包括使 包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油的水解產(chǎn)物用 離子交換樹脂處理，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包 括脂肪酸和甘油，和其中該混合物具有小于5%的單?；视停∕AG)，其中該離子交換樹脂 為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
[0068] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，所述方法包括使 包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的水解產(chǎn)物用 離子交換樹脂處理，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包 括脂肪酸和甘油，和其中該混合物具有小于5%的單?；视停∕AG)，其中該離子交換樹脂 為選自由磺化高分子樹脂、Indionl30、Indionl40、Indionl90、Indion770、DIAI0N(R) SK1B、 DIAI0N(R)SK104、DIAI0N(R)SK110、DIAI0N(R)SK112、DIAI0N(R)SK116、DIAI0N(R)PK208、 DIAI0N(R)PHK212、DIAI0N(R)PK216、DIAI0N(R)PK220、DIAI0N(R)PK228 和 DIAI0N(R)HPK25 組成的組的強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
[0069] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，其 中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油， 其中該利用脂肪酶的酶促水解在30°C至80°C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行。
[0070] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、 sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和水 的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和其中該 水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油，其中 該利用脂肪酶的酶促水解在50至65°C范圍內(nèi)的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選在60°C進(jìn)行。
[0071] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和其 中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油， 其中該方法產(chǎn)生脂肪向脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和 甘油的超過99 %的轉(zhuǎn)化率。
[0072] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘 油，其中該方法產(chǎn)生存在于脂肪中的TAGS(三?；视停┫蛑舅?、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油的超過99%的轉(zhuǎn)化率。
[0073] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘 油，其中該均質(zhì)混合物以1:4:0. 15至1:7:0. 5的比例包括脂肪、極性有機(jī)溶劑和水。
[0074] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、 sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和水 的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和其中該 水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油，其中 脂肪與極性有機(jī)溶劑的比例在1:4至1:7的范圍內(nèi)。
[0075] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘 油，其中脂肪與水的比例為1:0. 15至1:0. 5。
[0076] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，還提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油 (MAG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘 油，其中該利用脂肪酶的酶促水解在間歇式反應(yīng)器、連續(xù)式反應(yīng)器或半連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn) 行。
[0077] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、 sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和水 的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和其中該 水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油，其中 該利用脂肪酶的酶促水解以10至60分鐘的停留時(shí)間在連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。
[0078] 在發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，所述方法包 括使包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的水解產(chǎn) 物用離子交換樹脂處理，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合 物包括脂肪酸和甘油，和其中該混合物具有小于5%的單酰基甘油（MAG)，其中該利用脂肪 酶的酶促水解以10至150分鐘的停留時(shí)間在連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。
[0079] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶 劑和水的均質(zhì)混合物，并使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘 油，其中該利用脂肪酶的酶促水解以〇. 5小時(shí)至2小時(shí)的停留時(shí)間在間歇式或半連續(xù)式反 應(yīng)器中進(jìn)行。
[0080] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，所述方法包 括使包括脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的水解產(chǎn) 物用離子交換樹脂處理，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合 物包括脂肪酸和甘油，和其中該混合物具有5%的單?；视停∕AG)，其中該利用脂肪酶的 酶促水解以〇. 5小時(shí)至24小時(shí)的停留時(shí)間在間歇式或半連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。
[0081] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、 sn-區(qū)域二酰基甘油（DAG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和 水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和其中該 水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著進(jìn)行另 一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中該混合 物具有5 %的單酰基甘油（MAG)。
[0082] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油 (MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；和使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著 進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中 該混合物具有5%的單酰基甘油（MAG)，其中該脂肪為油。
[0083] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；和使用離子交換樹脂處理水解產(chǎn)物，接著進(jìn) 行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中所述混合物包括脂肪酸和甘油，和其中 該混合物具有5%的單?；视停∕AG)，其中該脂肪為選自由蔬菜油、樹載油、微生物油、動(dòng) 物源油、魚油、蓖麻油、橄欖油、芥子油、亞麻子油、芥花油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉花籽 油、榛子油、橄欖油、印楝油、棕櫚油、花生油、菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、葵花籽油及 其混合物組成的組的油。
[0084] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著 進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中所述混合物包括脂肪酸和甘油，和其 中該混合物具有5%的單?；视停∕AG)，其中該脂肪選自由飽和脂肪、不飽和脂肪、羥基 不飽和脂肪、羥基飽和脂肪、環(huán)氧脂肪、磷脂、蠟脂及其混合物組成的組。
[0085] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著 進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中 該混合物具有5%的單?；视停∕AG)，其中該脂肪為脂肪酸基多元醇酯。
[0086] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、 sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和 水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和其中該 水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著進(jìn)行另 一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中該混合 物具有5%的單酰基甘油（MAG)，其中該極性有機(jī)溶劑選自由叔丁醇、異戊醇、二丙酮醇、乙 醇、丙醇和叔戊醇，及其混合物組成的組。
[0087] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油 (MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理水解產(chǎn)物，接著進(jìn) 行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中該 混合物具有5%的單酰基甘油（MAG)，其中該利用脂肪酶的酶促水解利用固定化脂肪酶進(jìn) 行。
[0088] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理水解產(chǎn)物，接著進(jìn) 行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中該 混合物具有5%的單酰基甘油（MAG)，其中該利用脂肪酶的酶促水解利用固定化在支持體 上的固定化脂肪酶進(jìn)行，其中該支持體的基材選自由聚苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、聚 丙烯酸類、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯組成的組。
[0089] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油 (MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著 進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，其中該 混合物具有5%的單?；视停∕AG)，其中該離子交換樹脂為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
[0090] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、 sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī)溶劑 和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和其 中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著 進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其 中該混合物具有5%的單?；视停∕AG)，其中該離子交換樹脂為選自由磺化高分子樹 月旨、Indionl30、Indionl40、Indionl90、Indion770、DIAI0N(R)SK1B、DIAI0N(R)SK104、 DIAI0N(R)SK110、DIAI0N(R)SK112、DIAI0N(R)SK116、DIAI0N(R)PK208、DIAI0N(R)PHK212、 DIAI0N(R)PK216、DIAI0N(R)PK220、DIAI0N(R)PK228 和 DIAI0N(R)HPK25 組成的組的強(qiáng)酸性 陽離子交換樹脂。
[0091] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油 (MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；和使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著 進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中 該混合物具有5%的單酰基甘油（MAG)，其中利用脂肪酶的酶促水解在30°C至80°C范圍內(nèi) 的溫度下進(jìn)行。
[0092] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著 進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中 該混合物具有5%的單酰基甘油（MAG)，其中該利用脂肪酶的酶促水解在50至65°C范圍內(nèi) 的溫度下進(jìn)行，優(yōu)選在60°C進(jìn)行。
[0093] 本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理該水解產(chǎn)物，接著 進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中 該混合物具有5%的單?；视停∕AG)，其中該均質(zhì)混合物以1:4:0. 15至1:7:0. 5的比例 包括脂肪、極性有機(jī)溶劑和水。
[0094] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理水解產(chǎn)物，接著進(jìn) 行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中該 混合物具有5%的單?；视停∕AG)，其中脂肪與極性有機(jī)溶劑的比例在1:4至1:7的范圍 內(nèi)。
[0095] 在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视?(MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的方法，其中所述方法包括：制備脂肪、極性有機(jī) 溶劑和水的均質(zhì)混合物；使該均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和 其中該水解產(chǎn)物包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；并使用離子交換樹脂處理水解產(chǎn)物，接著進(jìn) 行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中該混合物包括脂肪酸和甘油，和其中該 混合物具有5%的單?；视停∕AG)，其中脂肪與水的比例為1:0. 15至1:0. 5。
[0096] 現(xiàn)將詳細(xì)描述本發(fā)明的方法。
[0097] 將脂肪、油或其混合物與水和極性有機(jī)溶劑混合，從而形成單相體系。由此形成的 該信號(hào)相體系（signal phase system)稱作均質(zhì)基質(zhì)混合物。由此獲得的均質(zhì)基質(zhì)混合物 可任選地通過穿過吸附劑填充床除去酶抑制劑，具體為脂肪酶抑制劑，來進(jìn)行預(yù)處理，從而 將抑制油中存在的成分的脂肪酶選擇性地吸附至吸附劑上。這些抑制劑成分如醛類、酮類 和磷脂等的去除確保固定化酶在隨后步驟中的重復(fù)利用，從而使得該方法節(jié)約成本。因此 利用或不利用預(yù)處理獲得的基質(zhì)混合物隨后通過在控制的溫度和停留時(shí)間下穿過固定化 酶的（一個(gè)或多個(gè)）第一填充床反應(yīng)器、或者固定化酶的填充床反應(yīng)器和吸附劑而水解。由 此獲得的水解混合物進(jìn)一步在控制的溫度和停留時(shí)間下穿過另一離子交換吸附劑填充床。 接著在控制的溫度和停留時(shí)間下穿過固定化酶的（一個(gè)或多個(gè)）第二填充床。從固定化酶 的（一個(gè)或多個(gè)）第一填充床反應(yīng)器或固定化酶的（一個(gè)或多個(gè)）第二填充床反應(yīng)器獲得 的所得產(chǎn)物如脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视秃透视褪褂贸Ｒ?guī)方 法如蒸餾、結(jié)晶以及吸附或色譜技術(shù)分離。
[0098] 在如上所述的預(yù)處理后如此獲得的均質(zhì)基質(zhì)混合物，隨后穿過一系列（一種或多 種）固定化脂肪酶的填充床反應(yīng)器和吸附劑，從而使用適當(dāng)?shù)墓潭ɑ冈诳刂频?0°C和 80°C之間的溫度和10至150分鐘的停留時(shí)間下實(shí)現(xiàn)期望的油的水解（66%至90% )。接 著在控制的20°C和80°C之間的溫度和5至60分鐘的停留時(shí)間下穿過固定化酶的（一個(gè)或 多個(gè)）第二填充床反應(yīng)器。從固定化酶的（一個(gè)或多個(gè)）第一填充床反應(yīng)器或固定化酶的 (一個(gè)或多個(gè)）第二填充床反應(yīng)器獲得的所得產(chǎn)物如脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)和 甘油使用常規(guī)方法如蒸餾、結(jié)晶以及吸附或色譜技術(shù)分離。
[0099] 本發(fā)明通過使部分水解的均質(zhì)混合物經(jīng)過離子交換樹脂，接著在控制的溫度和時(shí) 間條件下穿過任何其它的或與上述步驟中使用的相同的適當(dāng)制備（一種或多種）固定化 脂肪酶的另一填充床反應(yīng)器，實(shí)現(xiàn)了甘油三酯的超過99%的轉(zhuǎn)化率，游離脂肪酸的95%產(chǎn) 率。
[0100] 現(xiàn)有技術(shù)中記載的方法利用任何已知酶都不能實(shí)現(xiàn)接近100%的轉(zhuǎn)化率，并且實(shí) 現(xiàn)接近100%的轉(zhuǎn)化率，所需時(shí)間過長而不適合于商業(yè)應(yīng)用。相反，本發(fā)明中公開的水解方 法導(dǎo)致超過99%的甘油三酯水解，單相體系和固定化脂肪酶中游離脂肪酸產(chǎn)率為95%。 [0101] 本發(fā)明中公開的方法還可使用間歇式半連續(xù)或連續(xù)模式進(jìn)行。
[0102] 均質(zhì)基質(zhì)反應(yīng)混合物中加載4%酶的間歇式反應(yīng)導(dǎo)致99%的甘油三酯水解， 80-88%的游離脂肪酸和12-20%的單酸甘油酯。
[0103] 油水解用的半連續(xù)過程在由固定化脂肪酶組成的填充床反應(yīng)器中進(jìn)行，反應(yīng)時(shí)間 為12小時(shí)，導(dǎo)致99%的甘油三酯水解和88%的游離脂肪酸。
[0104] 利用固定化酶的具有9-15min停留時(shí)間的連續(xù)過程導(dǎo)致99%的甘油三酯水解，以 及33%的游離脂肪酸和66%的甘油二酯產(chǎn)率。
[0105] 利用連接有離子交換樹脂柱的固定化脂肪酶柱的油水解用的另一實(shí)施方案，在 90-120分鐘的停留時(shí)間內(nèi)水解了 99%的甘油三酯，并分別獲得66%和33%的游離脂肪酸 和單酸甘油酯產(chǎn)率。
[0106] 采用固定化脂肪酶、離子交換樹脂三聯(lián)柱的油水解用的連續(xù)法水解了 99%的甘油 三酯，并獲得95%的脂肪酸產(chǎn)率和5%的單酸甘油酯。
[0107] 從第一酶反應(yīng)器或最終酶反應(yīng)器中所得的產(chǎn)物蒸汽可通過方法如蒸餾、結(jié)晶和/ 或吸附或色譜技術(shù)分離成sn-區(qū)域MAG異構(gòu)體和游離脂肪酸。本發(fā)明的方法因而能夠產(chǎn)生 游離脂肪酸、sn-區(qū)域MAG異構(gòu)體以及甘油用于各種工業(yè)應(yīng)用。
[0108] 油脂中的次生化合物（minor compound)如液體氫過氧化物、磷脂、乳化劑、葉 綠素、類胡蘿卜素、脂質(zhì)聚合物、重金屬離子和甚至某些抗氧化劑對(duì)用于水解反應(yīng)的（一 種或多種）脂肪酶的穩(wěn)定性具有有害影響（Xu等人，Stability and Stabilization of Biocatalysts，Amsterdam:Elsevier Science, 1998, ρρ· 441-446)。因此必須通過用柱反應(yīng) 器中的吸附劑預(yù)處理來除去這些脂肪酶抑制成分。次生化合物的除去確保隨后采用的酶反 應(yīng)器的重復(fù)利用，從而使該方法節(jié)約成本。
[0109] 本發(fā)明中記載的油脂包括但不限于普通植物和動(dòng)物油脂以及加工的油脂，及它們 的混合物。它們的實(shí)例包括但不限于大豆油、蓖麻油、棉籽油、芥子油、亞麻子油、菜油、橄欖 油、玉米油、椰子油、紅花油、棕櫚油、橄欖油、山茶油（tsubaki oil)、山茶花油（sasanqua oil)、牛油（beef tallow)、豬油和魚油、婆羅脂（sal fat)、狹翅娑羅脂（illippe butter)、 燭果油脂（kokum butter)、乳木果油（shea butter)、莫那脂（mowrah fat)、藏欖脂 (phulwara butter)、婆羅洲脂（borneo tallow)和由其分饋的那些以及源自植物來源/動(dòng) 物來源/微生物來源（原核/真核）任何油。另外，油化學(xué)品如脂肪酸基多元醇酯，例如 季戊四醇四單蓖麻醇酸酯、三甲基丙烷油酸酯等可包括在內(nèi)作為油基原料用于酶促水解方 法。
[0110] 根據(jù)本發(fā)明的方法，用于本發(fā)明的固定化脂肪酶可為任何商購可得制劑，或特別 制備，并證明為適用于本發(fā)明。本文的制劑的適用性意味著穩(wěn)定且長壽命而使得該方法經(jīng) 濟(jì)。
[0111] 脂肪酶由微生物如疏綿狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces lanuginosus)、包括德氏根 霉（Rhizopus delemar)和白本根霉（Rhizopus japonicas)等的根霉屬（Rhizopus)、曲霉 屬（Aspergillus)、包括南極假絲酵母（Candida antarctica)等的假絲酵母屬（Candida) 和毛霉屬（Mucor)如（Mucor japonicus)生產(chǎn)。胰腺脂肪酶也可使用。這些脂肪酶可在市 場上獲得。也可使用在耶氏酵母菌株（Yarrowia spp.)中克隆并在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)的特 定脂肪酶。
[0112] 根據(jù)本發(fā)明的水解反應(yīng)中記載的極性有機(jī)溶劑為對(duì)脂肪酶呈惰性的極性有機(jī)溶 齊IJ。極性有機(jī)溶劑的實(shí)例包括但不限于叔丁醇、異戊醇、二丙酮醇、乙醇、丙醇和叔戊醇及上 述溶劑的不同組合。
[0113] 用于預(yù)處理油的吸附劑填充床的實(shí)例包括但不限于，Diaion"· HP2MG、HPA-75、 hpa-25、wkio 或 waii ;或Sepabeads? SP207 或 SP700。
[0114] 離子交換樹脂的實(shí)例包括但不限于磺化高分子樹脂例如但不限于，Indionl30、 140、190 或 770, Indion FFIP、NIP、GS 300/400, Indion 204、214、234、284/294、404、414; DIAI0N(R)SK1B、SK104、SK110、SK112、SK116、PK208、PHK212、PK216、PK220、PK228 和 HPK25。
[0115] 因此，公開于本發(fā)明的油和/或脂水解的方法采用混合油和/或脂、極性有機(jī)溶劑 和水以形成均質(zhì)基質(zhì)混合物的單相體系，其穿過填充床、包含（一種或多種）固定化脂肪酶 的連續(xù)或間歇式混合反應(yīng)器；吸附體系；和/或固體催化反應(yīng)器等一系列操作，從而獲得高 產(chǎn)率的包括游離脂肪酸、甘油和/或sn-區(qū)域MAG異構(gòu)體的油化學(xué)品。
[0116] 本發(fā)明人觀察到，當(dāng)進(jìn)行酶促水解時(shí)通過將油、脂或其混合物與水和極性有機(jī)溶 劑混合獲得的單相體系，油或脂的水解增加至>99%，以及不小于95%的游離脂肪酸和甘 油的產(chǎn)率。高產(chǎn)率和純度的油化學(xué)品如脂肪酸、甘油和/或sn-區(qū)域MAG異構(gòu)體在明顯短 的時(shí)間內(nèi)獲得。
[0117] 根據(jù)本發(fā)明中公開的方法，相互不可溶的油和水混合在極性有機(jī)溶劑中。將三種 組分混合以形成一定比例范圍內(nèi)的單相體系。這三種組分彼此之間的互溶度形成單相基質(zhì) 混合物的基礎(chǔ)。極性有機(jī)溶劑添加至油-水兩相體系是本發(fā)明公開的新方法，從而使用固 定化脂肪酶來進(jìn)行油水解.
[0118] 特異性和非特異性固定化脂肪酶的使用
[0119] 對(duì)來自南極假絲酵母的Novozym? 435 (Sigma Chemicals, L4777)脂肪酶 丙烯酸類樹脂和來自疏綿狀嗜熱絲孢菌的固定化脂肪酶(Immobilized Lipolase)K 100L(HypLIP) (Sigma Chemical Co. L0777)l，3-特異性脂肪酶用于本發(fā)明公開的水解反應(yīng) 進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0120] 極性有機(jī)溶劑，叔丁醇、異戊醇、二丙酮醇、乙醇、丙醇、叔戊醇，已用于評(píng)價(jià)反應(yīng)。 觀察到叔丁醇在兩種酶作用下產(chǎn)生最高的％轉(zhuǎn)化率。
[0121] 本發(fā)明的方法可外推至操作模式適當(dāng)變化的間歇式和連續(xù)式模式。此外，回收有 機(jī)溶劑，其可循環(huán)再利用。
[0122] 現(xiàn)描述本發(fā)明的適當(dāng)?shù)膶?shí)施方案。在討論特定構(gòu)造和設(shè)置的同時(shí)，應(yīng)理解的是，此 舉僅用于示例。相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員將意識(shí)到，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可使用其它 構(gòu)造和設(shè)置。同樣地，所附權(quán)利要求的精神和范圍不限于本文包含的優(yōu)選實(shí)施方案的記載。
[0123] 盡管已參考某些優(yōu)選實(shí)施方案相當(dāng)詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但其它實(shí)施方案也是可 行的。同樣地所附權(quán)利要求的精神和范圍不限于本文包含的優(yōu)選實(shí)施方案的記載。
[0124] 實(shí)施例
[0125] 現(xiàn)將利用實(shí)施例說明本公開，其意欲說明本公開的工作而不意欲暗示對(duì)本公開的 范圍的任何限制。除非另有說明，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所述 領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文公開的類似或相當(dāng)?shù)姆椒ê筒牧峡?用于實(shí)施本公開的方法和組合物，但本文仍記載了示例性方法、裝置和材料。
[0126] 實(shí)施例1
[0127] 間歇法-叔丁醇作為水解用溶劑
[0128] 1)油作為基質(zhì)：24小時(shí)內(nèi)?80-88%的轉(zhuǎn)化率
[0129] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0130] 在含有l(wèi)g不同的固定化脂肪酶的l〇〇ml反應(yīng)燒瓶中，將10g蓖麻油添加至叔丁 醇和水中（1:4:0. 15的比例），從而形成均質(zhì)反應(yīng)混合物?；|(zhì)混合物保持在60°C (對(duì)于 50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行）的定軌振蕩器上，并通過酸值監(jiān)測反應(yīng)24小時(shí)。在24小 時(shí)結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)獲得的甘油三酯轉(zhuǎn)化率為99%，而油向脂肪酸和單甘油酯的％轉(zhuǎn)化率分別 為 80-88 %和 12-20%。
[0131] b.脂肪酸和甘油的形成
[0132] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobi 1 i zod Lipolase? l〇〇L)、 Lipozyme? TL IM 酶（Immobilized Lipolase? 100L)、 Lipozyme? RM IM 酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌（Pseudomonas cepacia)的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì) 第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn)生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖 譜。圖3示出在間歇式條件下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得 的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％)。HypLIP當(dāng)與用于研究的任意其它酶制劑相比時(shí)示出高轉(zhuǎn)化初 始速率。
[0133] 2)脂肪作為基質(zhì)：24小時(shí)內(nèi)?70-80%的轉(zhuǎn)化率
[0134] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0135] 在含有l(wèi)g不同的固定化脂肪酶的100ml反應(yīng)燒瓶中，將10g三硬脂精 (tristrearin)添加至叔丁醇和水中（1:6:0. 15的比例），從而形成均質(zhì)反應(yīng)混合物?；|(zhì) 混合物保持在60°C (對(duì)于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行）的定軌振蕩器上，并通過酸值 監(jiān)測反應(yīng)24小時(shí)。在24小時(shí)結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)獲得的甘油三酯轉(zhuǎn)化率為99%，而油向脂肪酸和 單甘油酯的％轉(zhuǎn)化率分別為74%和26%。
[0136] b.脂肪酸和甘油的形成
[0137] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobilized Lipolase? l〇〇L)、 Lipozyme? TL IM 酶（Immobilized Lipolase? 100L)、Lipozyme? 冊頂酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì)第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn) 生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖譜。圖3示出在間歇式條件 下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％ )。 HypLIP與用于研究的任意其它酶制劑相比示出高轉(zhuǎn)化初始速率。
[0138] 3)油脂作為基質(zhì)：24小時(shí)內(nèi)?80-88%轉(zhuǎn)化率
[0139] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0140] 在含有l(wèi)g固定化脂肪酶（HypLIP)的100ml反應(yīng)燒瓶中，將10g棕櫚油和三硬脂 精（比例為1:1)添加至叔丁醇和水中（1:4:0.25的比例），從而形成均質(zhì)反應(yīng)混合物?；?質(zhì)混合物保持在60°C (對(duì)于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行）的定軌振蕩器上，并通過酸 值監(jiān)測反應(yīng)24小時(shí)。在24小時(shí)結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)獲得的甘油三酯轉(zhuǎn)化率為99%，而油向脂肪酸 和單甘油酯的％轉(zhuǎn)化率分別為84%和16%。
[0141] b.脂肪酸和甘油的形成
[0142] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobilized Lipolase? 100L) > Lipozyme? TL IM 酶（Immobilized Lipolase? 100L)、 Lipozyme? RM IM 酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì)第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn) 生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖譜。圖3示出在間歇式條件 下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％ )。 HypLIP與用于研究的任意其它酶制劑相比示出高轉(zhuǎn)化初始速率。
[0143] 間歇法-異戊醇作為水解用溶劑
[0144] 1)油作為基質(zhì)：24小時(shí)內(nèi)?65-70%轉(zhuǎn)化率
[0145] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0146] 在含有l(wèi)g固定化疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶（HypLIP)的100ml反應(yīng)燒瓶中，將10g 蓖麻油添加至異戊醇和水中（1:5:0. 15的比例），從而形成均質(zhì)反應(yīng)混合物?；|(zhì)混合物保 持在60°C (對(duì)于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行）的定軌振蕩器上，并通過酸值監(jiān)測反應(yīng) 24小時(shí)。在24小時(shí)結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)獲得的甘油三酯轉(zhuǎn)化率為99%，而油向脂肪酸和單甘油酯 的％轉(zhuǎn)化率分別為68 %和32%。
[0147] b.脂肪酸和甘油的形成
[0148] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobilized Lipolase⑧ l〇〇L)、 Lipozyme? TL 頂酶（Immobilized Lipo丨ase? 100L)、Lipozyme? rm IM 酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì)第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn) 生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖譜。圖3示出在間歇式條件 下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％ )。 HypLIP與用于研究的任意其它酶制劑相比示出高轉(zhuǎn)化初始速率。
[0149] 2)脂肪作為基質(zhì)：24小時(shí)?62-68%轉(zhuǎn)化率
[0150] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0151] 在含有l(wèi)g固定化脂肪酶（HypLIP)的100ml反應(yīng)燒瓶中，將10g三硬脂精添加至 異戊醇和水中（1:6:0.2的比例），從而形成均質(zhì)反應(yīng)混合物?；|(zhì)混合物保持在60°C (對(duì) 于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行）的定軌振蕩器上，并通過酸值監(jiān)測反應(yīng)24小時(shí)。在24 小時(shí)結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)獲得的甘油三酯轉(zhuǎn)化率為99%，而油向脂肪酸和單甘油酯的％轉(zhuǎn)化率分 別為64%和36%。
[0152] b.脂肪酸和甘油的形成
[0153] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobilized Lipolase?. 100L)、 Lipozyme? TL IM 酶（Immobilized Lipolase? i〇〇L)、Lipozyme? rm IM 酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì)第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn) 生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖譜。圖3示出在間歇式條件 下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％ )。 HypLIP與用于研究的任意其它酶制劑相比示出高轉(zhuǎn)化初始速率。
[0154] 3)油脂作為基質(zhì)：24小時(shí)內(nèi)?60-65%轉(zhuǎn)化率
[0155] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0156] 在含有l(wèi)g固定化脂肪酶（HypLIP)的100ml反應(yīng)燒瓶中，將10g棕櫚油和三硬脂 精添加至叔丁醇和水中（1:4:0.2的比例），從而形成均質(zhì)反應(yīng)混合物。反應(yīng)混合物保持在 60°C (對(duì)于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行）的定軌振蕩器上，并通過酸值監(jiān)測反應(yīng)24小 時(shí)。在24小時(shí)結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)獲得的甘油三酯轉(zhuǎn)化率為99%，而油向脂肪酸和單甘油酯的％ 轉(zhuǎn)化率分別為65 %和35%。
[0157] b.脂肪酸和甘油的形成
[0158] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobilizod Lip〇丨ase? l〇〇L)、 Lipozyme? TL 頂酶（Immobilized Lipolase? l〇〇L)、 Lipozyme? KM IM 酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì)第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn) 生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖譜。圖3示出在間歇式條件 下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％ )。 HypLIP與用于研究的任意其它酶制劑相比示出高轉(zhuǎn)化初始速率。
[0159] 將使用上述方法的油和/或脂的轉(zhuǎn)化率百分比與現(xiàn)有技術(shù)相比較。比較分析示于 表1。
[0160] 實(shí)施例2
[0161] 半連續(xù)法
[0162] 1)單柱：12小時(shí)內(nèi)?88%轉(zhuǎn)化率
[0163] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0164] 油水解用的連續(xù)法在60°C的由夾套式玻璃柱組成的填充床反應(yīng)器（PBR)中進(jìn)行。 對(duì)于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行。包含固定化在甲基丙烯酸酯支持體（50ml體積）上 的1，3特異性酶的PBR供給有包含蓖麻油、叔丁醇和水（比例為1:6:0. 15)的基質(zhì)混合物， 將其在磁力攪拌器的輔助下連續(xù)攪拌?；|(zhì)混合物通過PBR循環(huán)12小時(shí)。獲得的甘油三 酯轉(zhuǎn)化率為99%，而油向脂肪酸的％轉(zhuǎn)化率為88%，12%為未反應(yīng)的單甘油酯。形成產(chǎn)物 為脂肪酸、甘油和單甘油酯。圖4示出油水解用半連續(xù)法的示意圖。由本文所示示意圖可 獲得蓖麻油的99 %分解和88 %的游離脂肪酸產(chǎn)率（圖7)。觀察到蓖麻油水解產(chǎn)物如單蓖 麻醇酸酯與蓖麻油酸一起作為主產(chǎn)物。其它脂肪酸也可在圖譜中觀察到。
[0165] b.脂肪酸和甘油的形成
[0166] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobilized Lipolase? 100L)、 Lipozyme? TL 頂酶（Immobilized Lipolase? iool)、Lipozyme? rm 頂酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì)第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn) 生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖譜。圖3示出在間歇式條件 下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％ )。 HypLIP與用于研究的任意其它酶制劑相比示出高轉(zhuǎn)化初始速率。
[0167] 實(shí)施例3
[0168] 連續(xù)法
[0169] 1)單柱：〈10-15分鐘內(nèi)的30-33%轉(zhuǎn)化率
[0170] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0171] 油水解用連續(xù)法在60°C (對(duì)于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行）的由夾套式玻 璃柱組成的包含固定化在甲基丙烯酸酯支持體上的1，3特異性酶的填充床反應(yīng)器中進(jìn)行。 在上述實(shí)施例中描述的反應(yīng)混合物供給至PBR中，并將停留時(shí)間保持在9至15分鐘的范圍 內(nèi)。甘油三酯水解的產(chǎn)率超過99%，且觀察到游離脂肪酸為33%的產(chǎn)率。由此形成的二酰 基甘油可進(jìn)一步從脂肪酸分離（圖5)。
[0172] b.脂肪酸和甘油的形成
[0173] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobil i zod Lipolase? l〇〇L)、 Lipozyme? TL IM 酶（Immobilized Lipolase? i〇〇L)、Lipozyme? RM IM 酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì)第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn) 生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖譜。圖3示出在間歇式條件 下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％ )。 HypLIP與用于研究的任意其它酶制劑相比示出高轉(zhuǎn)化初始速率。
[0174] 2)單柱：15分鐘內(nèi)66-70 %轉(zhuǎn)化率
[0175] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0176] 油水解用連續(xù)法在60°C (對(duì)于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行）的由夾套式玻璃 柱組成的包含固定化在甲基丙烯酸酯支持體上的1，3特異性酶的填充床反應(yīng)器中進(jìn)行。在 上述實(shí)施例中描述的反應(yīng)混合物供給至PBR中，并將停留時(shí)間保持在15至20分鐘的范圍 內(nèi)。油水解的產(chǎn)率超過99 %，且游離脂肪酸的產(chǎn)率記錄為66 %。Sn-2單甘油酯和脂肪酸可 進(jìn)一步從脂肪酸分離（圖6)。
[0177] b.脂肪酸和甘油的形成
[0178] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobilized Lipolase? 100L)、 Lipozyme? TL IM 酶（Immobilized Lipolase? 100L)、 Lipozyme? 丨洲 IM 酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì)第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn) 生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖譜。圖3示出在間歇式條件 下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％)。 HypLIP與用于研究的任意其它酶制劑相比示出高轉(zhuǎn)化初始速率。
[0179] 實(shí)施例4
[0180] 單柱+重排用吸附劑：115分鐘內(nèi)66-70 %轉(zhuǎn)化率
[0181] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0182] 油水解用連續(xù)法在60°C (對(duì)于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行）的由夾套式玻 璃柱組成的包含固定化脂肪酶和吸附劑的填充床反應(yīng)器中進(jìn)行。在上述實(shí)施例中描述的 反應(yīng)混合物供給至固定化脂肪酶的第1PBR中15分鐘，接著在重排用吸附劑的第2PBR中 90-120分鐘（圖8)。這導(dǎo)致99%的甘油三酯水解，以及游離脂肪酸66-70%的產(chǎn)率，并包 含1/3-MAG和脂肪酸。觀察到蓖麻油水解產(chǎn)物如sn-l(3)單蓖麻醇酸酯作為主產(chǎn)物。蓖麻 油酸也在圖譜中觀察到（圖9)。
[0183] b.脂肪酸和甘油的形成
[0184] 用脂肪酶 HypLIP 酶（Indigenously immobilized Lipolase? 100L)、 Lipozyme? TL 頂酶（Immobilized Lipolase? 100L)、 Lipozyme? M 頂酶、 Novozym? 435酶和來自洋蔥假單胞菌的脂肪酶重復(fù)反應(yīng)，對(duì)第一酶促水解反應(yīng)之后產(chǎn) 生的產(chǎn)物起作用。圖1示出均質(zhì)介質(zhì)中蓖麻油水解百分比的圖譜。圖3示出在間歇式條件 下使用無溶劑和不同極性有機(jī)溶劑中的HypLIP，6小時(shí)后獲得的游離脂肪酸轉(zhuǎn)化率（％ )。 HypLIP與用于研究的任意其它酶制劑相比示出高轉(zhuǎn)化初始速率。
[0185] 實(shí)施例5
[0186] 雙柱+重排用吸附劑：140分鐘內(nèi)88-95 %轉(zhuǎn)化率
[0187] a.脂肪酸和單甘油酯的形成
[0188] 油水解用連續(xù)法在60°C的由夾套式玻璃柱組成的一系列填充床反應(yīng)器中進(jìn)行。對(duì) 于50°C和55°C，實(shí)驗(yàn)可類似地進(jìn)行。包含固定化在甲基丙烯酸酯支持體（50ml體積）上的 1，3特異性酶的第1PBR供給有如實(shí)施例la的反應(yīng)混合物。停留時(shí)間在3至100分鐘的范 圍內(nèi)。
[0189] b.脂肪酸和甘油的形成
[0190] 第1PBR的產(chǎn)物混合物供給至包含重排用吸附劑的第2PBR中（100ml體積），停留 時(shí)間在40至120分鐘的范圍內(nèi)。然后使來自第2PBR的產(chǎn)物蒸汽穿入包含固定化1，3特異 性酶的第3PBR中（25ml體積），停留時(shí)間在5至50分鐘的范圍內(nèi)。油水解用三步PBR方案 產(chǎn)生三?；视拖蛑舅岷透视偷耐耆D(zhuǎn)化。140分鐘的停留時(shí)間產(chǎn)生超過95%的游離脂 肪酸，所得產(chǎn)物即脂肪酸和甘油可進(jìn)一步分離（圖10)。
[0191] 表1 :使用脂肪酶的油水解的比較分析
[0192]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘 油的方法，其中所述方法包括制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和水的均質(zhì)混合物，且使所述均質(zhì)混 合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和其中所述水解產(chǎn)物包括脂肪酸、sn-區(qū) 域單?；视停∕AG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油。
2. -種用于生產(chǎn)脂肪酸和甘油的方法，其包括用離子交換樹脂處理權(quán)利要求1所述的 水解產(chǎn)物，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混合物，其中所述混合物包括脂肪 酸和甘油，和其中所述混合物具有小于5%的單?；视停∕AG)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂肪為油。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述油選自由蔬菜油、樹載油、微生物油、動(dòng)物源 油、魚油、蓖麻油、橄欖油、芥子油、亞麻子油、芥花油、椰子油、芫荽油、玉米油、棉花籽油、榛 子油、橄欖油、印楝油、棕櫚油、花生油、菜籽油、米糠油、紅花油、大豆油、葵花籽油及其混合 物組成的組。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂肪選自由飽和脂肪、不飽和脂肪、羥基不飽 和脂肪、羥基飽和脂肪、環(huán)氧脂肪、磷脂、蠟脂及其混合物組成的組。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂肪為脂肪酸基多元醇酯。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述極性有機(jī)溶劑選自由叔丁醇、異戊醇、二丙酮 醇、乙醇、丙醇和叔戊醇及其混合物組成的組。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述利用脂肪酶的酶促水解利用固定化的脂 肪酶進(jìn)行。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述脂肪酶固定化于支持體上，其中所述支持體 的基材選自由聚苯乙烯和二乙烯基苯的共聚物、聚丙烯酸類、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯 組成的組。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述離子交換樹脂為強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述離子交換樹脂選自由磺化高分子樹 月旨、Indionl30、Indionl40、Indionl90、Indion770、DIAI0N(R)SK1B、DIAI0N(R)SK104、 DIAI0N(R)SK110、DIAION(R)SK112、DIAION(R)SK116、DIAI0N(R)PK208、DIAION(R)PHK212、 DIAI0N(R)PK216、DIAI0N(R)PK220、DIAI0N(R)PK228 和 DIAION(R)HPK25 組成的組。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述利用脂肪酶的酶促水解在30°C至80°C的溫 度范圍內(nèi)進(jìn)行。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述利用脂肪酶的酶促水解在50至65°C的溫 度范圍內(nèi)進(jìn)行，優(yōu)選在60°C進(jìn)行。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法導(dǎo)致所述脂肪向脂肪酸、sn-區(qū)域單酰 基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘油的轉(zhuǎn)化率超過99%。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述均質(zhì)混合物以1:4:0. 15至1:7:0. 5的比例 包括脂肪、極性有機(jī)溶劑和水。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂肪與極性有機(jī)溶劑之比在1:4至1:7的范 圍內(nèi)。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述脂肪與水之比在1:0. 15至1:0. 5的范圍內(nèi)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述利用脂肪酶的酶促水解在間歇式反應(yīng)器、連 續(xù)式反應(yīng)器或半連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述利用脂肪酶的酶促水解以10至60分鐘的停 留時(shí)間在連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。
20. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述利用脂肪酶的酶促水解以10至150分鐘的 停留時(shí)間在連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述利用脂肪酶的酶促水解以0. 5小時(shí)至2小時(shí) 的停留時(shí)間在間歇式或半連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。
22. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述利用脂肪酶的酶促水解以0. 5小時(shí)至24小 時(shí)的停留時(shí)間在間歇式或半連續(xù)式反應(yīng)器中進(jìn)行。
23. -種用于生產(chǎn)脂肪酸、sn-區(qū)域單酰基甘油（MAG)、sn-區(qū)域二?；视停―AG)和甘 油的方法，其中所述方法包括： 制備脂肪、極性有機(jī)溶劑和水的均質(zhì)混合物； 使所述均質(zhì)混合物進(jìn)行利用脂肪酶的酶促水解以獲得水解產(chǎn)物，和其中所述水解產(chǎn)物 包括脂肪酸、MAG、DAG和甘油；和 使用離子交換樹脂處理所述水解產(chǎn)物，接著進(jìn)行另一利用脂肪酶的酶促水解以獲得混 合物，其中所述混合物包括脂肪酸和甘油，和其中所述混合物具有小于5%的單?；视?(MAG)。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK104245949SQ201380017976
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月30日
【發(fā)明者】A·M·拉里, A·A·歐達(dá)內(nèi)斯, R·N·瓦德伽馬, A·D·拜特, A·潘德, M·A·沃克 申請(qǐng)人:A·M·拉里