微生物菌株及其在動物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于改善水生動物性能的芽孢桿菌及乳酸桿菌菌株以及方法。本發(fā)明還公開了用于抑制或減緩水生動物中病原體生長的芽孢桿菌和乳酸桿菌菌株以及方法。NRRL B-5013420080415NRRL B-5051620110520NRRL B-5051020110513NRRL B-5054520110804NRRL B-5050820110513NRRL B-5050920110513NRRL B-5054420110804NRRL B-5054320110804NRRL B-5054220110804
【專利說明】微生物菌株及其在動物中的用途
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年4月12日提交的美國臨時專利申請?zhí)枮?1/623, 512和2012 年12月21日提交的美國臨時專利申請?zhí)枮?1/745, 324的權益，以上臨時專利申請的公開 內容以引用方式并入本文。

【技術領域】
[0003] 本發(fā)明屬水產養(yǎng)殖領域。更具體地說，本發(fā)明涉及有益于水生動物的芽孢桿菌和 乳酸桿菌菌株及這些菌株的使用方法。
[0004] 相關領域的說明
[0005] 水產養(yǎng)殖是一個越來越普遍的生產體系，它為人類日常飲食提供魚和甲殼類產 品。蝦類養(yǎng)殖已成為一個全球化產業(yè)，每年零售額達數十億美元。白對蝦（南美白對蝦 (Penaeusvannamei))是世界范圍內一種主要的水產養(yǎng)殖物種。奸農對改善水質、生產性能 和存活率的解決方案非常感興趣。
[0006] 此外,在亞洲和南美州部分地區(qū),病原體（如白斑綜合癥病毒（WSSv)和弧菌屬） 引起的疾病頻繁地大批摧毀蝦養(yǎng)殖行業(yè)。這些損失導致了數十億美元的經濟損失和生產力 的降低。因對食品安全和環(huán)境的關注，蝦類養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的使用正在減少。
[0007] 因此，水產養(yǎng)殖業(yè)迫切需要免用抗生素的解決方案來改善水質、生產性能、存活率 和對水生動物病原體的抵抗力。鑒于以上原因，提供有益于水生動物的芽孢桿菌和乳酸桿 菌菌株及使用這些菌株的方法很有必要。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008] 本發(fā)明的典型實施例見附圖。
[0009] 圖1是一幅示意圖，表示蝦從幼體期、后幼體期和幼年期的成長過程。
[0010] 圖2A表示后幼體期蝦對芽孢桿菌和乳酸桿菌組合物施用所作出響應后，蝦的存 活率、體增重（BWG)、長度和飼料攝取反應。
[0011] 圖2B是后幼體期蝦的圖片，表示蝦對芽孢桿菌和乳酸桿菌組合物施用所作出響 應后的蝦體尺寸。
[0012] 圖3表示幼蝦對芽孢桿菌和乳酸桿菌組合物施用所作出的存活率、體增重、飼料 轉化率和攝食量響應。
[0013] 圖4是圖片，表示施用過芽孢桿菌和乳酸桿菌組合物的蝦絨毛組織與沒有經兩者 中的任一組分處理的對照組的蝦絨毛組織的對比。
[0014] 圖5表示相比于未有兩者中的任一組分施用的對照組，施用過芽孢桿菌和乳酸桿 菌組合物的蝦的內臟中弧菌濃度。


【發(fā)明內容】

[0015] 本發(fā)明提供了分離的芽孢桿菌和乳酸桿菌菌株、包含此類芽孢桿菌和乳酸桿菌菌 株的組合物、向動物施用這些菌株的方法、包含該菌株的動物飼料或飼料添加劑以及生產 菌株的方法。
[0016] 在一個實施例中，該發(fā)明提供了一個或多個分離的芽孢桿菌菌株，該菌株選 自枯草芽孢桿菌（B.subtilis)、地衣芽孢桿菌（B.Iicheniformis)、短小芽孢桿菌 (B.pumilus)、凝結芽抱桿菌（B.coagulans)、解淀粉芽抱桿菌（B.amyloliquefaciens)、 嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stearothermophilus)、短芽孢桿菌（B.brevis)、嗜堿芽抱桿菌 (B.alkalophilus)、克勞氏芽孢桿菌（B.clausii)、耐鹽芽孢桿菌（B.halodurans)、巨大 芽孢桿菌（B.megaterium)、環(huán)狀芽胞桿菌（B.circulans)、燦爛芽孢桿菌（B.Iautus)、 蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis)和遲緩芽孢桿菌（B.Ientus)。在另一個實 施例中，該發(fā)明提供了一種或多種分離的乳酸桿菌菌株，該菌株選自瑞士乳酸桿菌 (L.helveticus)、食淀粉乳酸桿菌（L.amylovorus)、彎曲乳酸桿菌（L.curvatus)、纖維 二糖乳酸桿菌（L.cellobiosus)、降解淀粉類乳酸桿菌（L.amylolyticus)、消化乳酸桿 菌（L.alimentarius)、鳥乳酸桿菌（L.aviaries)、卷曲乳酸桿菌（L.crispatus)、彎曲 乳酸桿菌（Lcurvatus)、雞乳酸桿菌（L.gallinarum)、希氏乳酸桿菌（L.hilgardii)、 約氏乳酸桿菌（L.johnsonii)、克菲爾乳酸桿菌（L.kefiranofaecium)、高加索酸奶乳 酸桿菌（L.kefiri)、黏液乳酸桿菌（L.mucosae)、面包乳酸桿菌（L.panis)、戊糖乳酸 桿菌（L.pentosus)、橋乳酸桿菌（L.pontis)、玉米乳酸桿菌（L.zeae)、舊金山乳酸桿 菌（L.sanfranciscensis)、副干釀乳酸桿菌（L.paracasei)、干釀乳酸桿菌（L.casei)、 嗜酸乳酸桿菌（L.acidophilus)、布氏乳乳酸桿菌（L.buchnerii)、香腸乳酸桿菌 (L.farciminis)、鼠李糖乳酸桿菌（L.rhamnosus)、羅伊氏乳酸桿菌（L.reuteri)、發(fā)酵乳 酸桿菌（L.fermentum)、短乳酸桿菌（L.brevis)、乳酸乳桿菌（L.Iactis)、胚芽乳酸桿菌 (L.plantarum)、沙克乳酸桿菌（L.sakei)或唾液乳酸桿菌（L.salviarium)的菌株。
[0017] 在特定實施例中，該發(fā)明提供了一種或多種分離菌株，該菌株選自短小芽孢桿 菌（Bacilluspumilis)3064、枯草芽孢桿菌BS2084(NRRLB-50013)、枯草芽孢桿菌 BS15Ap4(ATCCPTA-6507)、枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5(NRRLB-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTPBS442(NRRLB-50542)、枯草芽孢桿菌AGTPBS521(NRRLB-50545)、枯草芽孢桿菌 AGTPBS918(NRRLB-50508)、枯草芽孢桿菌AGTPBS1013(NRRLB-50509)、枯草芽孢桿菌 119(NRRLB-50796)、枯草芽孢桿菌 3A-P4(ATCCPTA-6506)、枯草芽孢桿菌 22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢桿菌（BacillusIicheniformis) 842(NRRLB-50516)、枯草芽孢桿 菌BS27(NRRLB-50105)、地衣芽孢桿菌BL21(NRRLB-50134)、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)AGTPBS1068(NRRLB-50543)和枯草芽孢桿菌AGTPBS1069(NRRLB-50544)、香 腸乳酸桿菌（Lactobacillusfarcimins)CNCM-I-3699、鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698,及具備 它們的所有特點的菌株、它們的任何衍生物或變體、及它們的混合物。
[0018] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包含一種或多種分離 菌株，該菌株選自短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌BS2084(NRRLB-50013)、枯草芽孢 桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)、枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5(NRRLB-50510)、枯草芽孢桿 菌AGTPBS442(NRRLB-50542)、枯草芽孢桿菌AGTPBS521(NRRLB-50545)、枯草芽孢桿 菌AGTPBS918(NRRLB-50508)、枯草芽孢桿菌AGTPBS1013(NRRLB-50509)、短小芽孢桿 菌 119(NRRLB-50796)、枯草芽孢桿菌 3A-P4(ATCCPTA-6506)、枯草芽孢桿菌 22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢桿菌842(NRRLB-50516)、枯草芽孢桿菌BS27(NRRLB-50105)、地衣芽 孢桿菌BL21(NRRLB-50134)、短小芽孢桿菌AGTPBS1068(NRRLB-50543)以及枯草芽孢桿 菌AGTPBS1069(NRRLB-50544)、香腸乳酸桿菌（Lactobacillusfarcimins)CNCM-I-3699、 鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698,及具備它們的所有特點的菌株、它們的任何衍生物品或變體、 以及它們的混合物。
[0019] 在一些實施例中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含短小芽孢桿菌3064菌株、枯 草芽孢桿菌BS2084(NRRLB-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)菌株。 在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含短小芽孢桿菌119(NRRLB-50796)菌 株、枯草芽孢桿菌BS2084(NRRLB-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507) 菌株。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含枯草芽孢桿菌l〇13(NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢桿菌BS918(NRRLB-50508)菌株和枯草芽孢桿菌BS3BP5(ATCC PTA-50510)菌株。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含地衣芽孢桿 菌842(NRRLB-50516)菌株、枯草芽孢桿菌BS27(NRRLB-50105)菌株和地衣芽孢桿菌 BL21(ATCCPTA-50134)菌株。在其他實施例中，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含枯草芽孢 桿菌3A-P4(ATCCPTA-6506)菌株、枯草芽孢桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)菌株和枯草芽 孢桿菌 22C-P1 (ATCCPTA-6508)菌株。
[0020] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供了一種方法，包括給動物施用有效量的組合物， 該組合物包含一種或多種分離菌株，該分離菌株選自短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌 BS2084(NRRLB-50013)、枯草芽孢桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)、枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5(NRRLB-50510)、枯草芽孢桿菌AGTPBS442(NRRLB-50542)、枯草芽孢桿菌AGTP BS521(NRRLB-50545)、枯草芽孢桿菌AGTPBS918(NRRLB-50508)、枯草芽孢桿菌AGTP BS1013(NRRLB-50509)、短小芽孢桿菌 119(NRRLB-50796)、枯草芽孢桿菌 3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢桿菌 22C-P1(ATCCPTA-6508)、地衣芽孢桿菌 842(NRRLB-50516)、枯 草芽孢桿菌BS27(NRRLB-50105)、地衣芽孢桿菌BL21(NRRLB-50134)、短小芽孢桿菌AGTP BS1068(NRRLB-50543)以及枯草芽孢桿菌AGTPBS1069(NRRLB-50544)、香腸乳酸桿菌 (Lactobacillusfarcimins)CNCM-I-3699、鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698,及具備它們的所有 特點的菌株、它們的任何衍生物或變體、及它們的混合物。
[0021] 在一些實施例中，本文所述的方法包括給動物施用有效量的組合物，該組合物 包含短小芽孢桿菌3064菌株、枯草芽孢桿菌BS2084(NRRLB-50013)菌株和枯草芽孢 桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)菌株。在一些實施例中，本文所述的方法包括給動物施 用有效量的組合物，該組合物包含短小芽孢桿菌119(NRRLB-50796)菌株、枯草芽孢桿 菌BS2084(NRRLB-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)菌株。在一 些實施例中，本文所述的方法包括給動物施用有效量的組合物，該組合物包含枯草芽孢桿 菌1013(NRRLB-50509)菌株、枯草芽孢桿菌BS918(NRRLB-50508)菌株和枯草芽孢桿菌 BS3BP5(ATCCPTA-50510)菌株。在一些實施例中，本文所述的方法包括給動物施用有效量 的組合物，該組合物包含地衣芽孢桿菌842(NRRLB-50516)菌株、枯草芽孢桿菌BS27(NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢桿菌BL21(ATCCPTA-50134)菌株。在一些實施例中，本文所述的 方法包括給動物施用有效量的組合物，該組合物包含枯草芽孢桿菌3A-P4(ATCCPTA-6506) 菌株、枯草芽孢桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)菌株和枯草芽孢桿菌22C-P1(ATCC PTA-6508)菌株。
[0022] 任一本文所述的實施例中，相比未施用所述菌株的動物，在給動物施用時，所述菌 株在動物中或對動物產生至少一種如下益處：(a)存活率增加；(b)體增重增大（平均日體 增重和/或總體增重）；（c)攝食量增加；(d)長度增加；（e)飼料轉化率增加；（f)絨毛長 度和/或絨毛密度增加；（g)低鹽度抵抗力增加；(h)高鹽度抵抗力增加；（i)高溫抵抗力 增加；（j)低溫抵抗力增加；(k)福爾馬林抵抗力增加；（1)對病原體響應后，存活率增加或 (m)死亡率。本發(fā)明有益于動物抵抗應激和病原性感染。在一些實施例中，本發(fā)明針對病原 體提供了增大的存活率，所述病原體如白斑綜合癥病毒或弧菌屬細菌（例如：哈維氏弧菌 (Vibrioharveyi))。在其它實施例中，該發(fā)明提供了針對高溫或低溫、或者高鹽度或低鹽 度的增加的抵抗力。在某些實施例中，將動物暴露于高溫或低溫、高鹽度或低鹽度、白斑綜 合癥病毒或弧菌屬細菌。
[0023] 本文所述的任何實施例中，動物為蝦。在一些實施例中，這種蝦為幼體、后期幼 體或幼蝦。應用于本文所述實施例中的蝦包括所有品種和物種的蝦，包含但不限于（以 舉例的方式）濱對奸（Litopenaeus)屬奸、美對奸（Farfantepenaeus)屬奸和對奸屬 (Penaeus)的奸。對奸屬包括但不限于：細角對奸（Penaeusstylirostris)、南美白對蟲下 (Penaeusvannamei)、斑節(jié)對蟲下（Penaeusmonodon)、中國對蟲下（Penaeuschinensis)、西方 對蟲下（Penaeusoccidentalis)、加州對蟲下（Penaeuscaliforniensis)、短溝對奸（Penaeus semisulcatus)、斑節(jié)對蟲下（Penaeusmonodon)、食用對蟲下（Penaeusesculentu)、白對 蟲下（Penaeussetiferus)、日本對奸（Penaeusjaponicus)、褐對奸（Penaeusaztecus)、 桃紅對奸（Penaeusduorarum)、印度對奸（Penaeusindicus)和墨吉對奸（Penaeus merguiensis)。在特定環(huán)境中，該奸指南美白對蟲下。
[0024] 在某些實施例中，本文所述的菌株在動物身上施用時，相比未經處理的對照，所述 菌株使至少一種本文所述的益處改善至少2%。所提供菌株可以任意有效濃度來施用以改 善本文所述的至少一種益處。在一些實施例中，按照約IXIO5至約IXIO11CFU/動物/天 施用（一種或多種）菌株。
[0025] 在另一個實施例中，本發(fā)明提供一種動物飼料或飼料添加劑組合物，其包含一 種或多種分離菌株，該分離菌株選自短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌BS2084(NRRL B-50013)、枯草芽孢桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)、枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢桿菌AGTPBS442(NRRLB-50542)、枯草芽孢桿菌AGTPBS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢桿菌AGTPBS918(NRRLB-50508)、枯草芽孢桿菌AGTPBS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢桿菌 119(NRRLB-50796)、枯草芽孢桿菌 3A-P4(ATCCPTA-6506)、 枯草芽孢桿菌22C-P1(ATCCPTA-6508)、地衣芽孢桿菌842(NRRLB-50516)、枯草芽孢 桿菌BS27(NRRLB-50105)、地衣芽孢桿菌BL21(NRRLB-50134)、短小芽孢桿菌AGTPBS 1068(NRRLB-50543)以及枯草芽孢桿菌AGTPBS1069(NRRLB-50544)、香腸乳酸桿菌 (Lactobacillusfarcimins)CNCM-I-3699、鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698 及具有它們的所有 特點的菌株、以及它們的衍生物或變體、及它們的混合物。
[0026] 在一些實施例中，本發(fā)明提供一種動物飼料或飼料添加劑組合物，其包含短小 芽孢桿菌3064菌株、枯草芽孢桿菌BS2084(NRRLB-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCCPTA-6507)菌株。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種動物飼料或飼料添加劑組合 物，其包含短小芽孢桿菌119(NRRLB-50796)菌株、枯草芽孢桿菌BS2084(NRRLB-50013) 菌株和枯草芽孢桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)菌株。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種 動物飼料或飼料添加劑組合物，其包含枯草芽孢桿菌1013(NRRLB-50509)菌株、枯草芽孢 桿菌BS918(NRRLB-50508)菌株和枯草芽孢桿菌BS3BP5(ATCCPTA-50510)菌株。在一些 實施例中，本發(fā)明提供一種動物飼料或飼料添加劑組合物，其包含地衣芽孢桿菌842(NRRL B-50516)菌株、枯草芽孢桿菌BS27(NRRLB-50105)菌株和地衣芽孢桿菌BL21(ATCC PTA-50134)菌株。在一些實施例中，本發(fā)明提供一種動物飼料或飼料添加劑組合物，其包 含枯草芽孢桿菌3A-P4(ATCCPTA-6506)菌株、枯草芽孢桿菌BS15Ap4(ATCCPTA-6507)菌 株和枯草芽孢桿菌22C-P1(ATCCPTA-6508)菌株。在一些實施例中，本文所述的一種或多 種菌株在動物飼料或飼料添加劑組合物中的添加量為10-2000克/噸飼料。在一些實施 例中，本文所述的一種或多種菌株在動物飼料或飼料添加劑組合物中的添加量為50、100、 250、500或1000克/噸飼料。
[0027] 在一些實施例中，本發(fā)明提供一種產生一種或多種分離菌株的方法，所述分離 菌株選自短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌BS2084(NRRLB-50013)、枯草芽孢桿菌 BS15A4(ATCCPTA-6507)、枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5(NRRLB-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTPBS442(NRRLB-50542)、枯草芽孢桿菌AGTPBS521(NRRLB-50545)、枯草芽孢桿菌 AGTPBS918(NRRLB-50508)、枯草芽孢桿菌AGTPBS1013(NRRLB-50509)、短小芽孢桿菌 119(NRRLB-50796)、枯草芽孢桿菌 3A-P4(ATCCPTA-6506)、枯草芽孢桿菌 22C-P1(ATCC PTA-6508)、地衣芽孢桿菌842(NRRLB-50516)、枯草芽孢桿菌BS27(NRRLB-50105)、地衣芽 孢桿菌BL21(NRRLB-50134)、短小芽孢桿菌AGTPBS1068(NRRLB-50543)以及枯草芽孢桿 菌AGTPBS1069(NRRLB-50544)、香腸乳酸桿菌（Lactobacillusfarcimins)CNCM-I-3699、 鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698,及具有它們的所有特點的菌株、它們的衍生物或變體、及它們 的混合物，該方法包括（a)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含上述一種或多種菌株的培養(yǎng)物；和（b) 從該液體培養(yǎng)基中分離上述一種或多種菌株。在一些實施例中，該方法進一步包括凍干該 分尚菌株并將該凍干后的菌株添加至載體。在其它實施例中，該方法進一步包括在已分尚 了該菌株之后保留液體培養(yǎng)基，從而產生上清液。

【具體實施方式】
[0028] 在詳細闡明本發(fā)明實施例前，應當理解本發(fā)明的用途并不局限于下文提及或下圖 闡述的成分構造和安排細節(jié)。本發(fā)明也適用其他實施例，或者說它可以以各種方式被實施 或執(zhí)行。同樣應當理解，本文所述措辭和術語僅為介紹該發(fā)明，不能視為具有限制性。
[0029] 根據本發(fā)明，可以采用本領域技術內的常規(guī)分子生物學和微生物學。此類技術在 文獻中充分闡明° 參見：Sambrook,Fritsch&Maniatis,MolecularCloning:ALaboratory Manual,ThirdEdition(2001)ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpring Harbor，N.Y. (Sambrook,Fritsch和Maniatis《分子克隆：實驗手冊》第三版（2001)，紐約， 冷泉港實驗室，冷泉港實驗室出版社）。
[0030] 本公開中的數值范圍為近似值范圍，因此，除非另外說明，否則其中可包括數值范 圍外的值。數值范圍包含自下限值至上限值（含上限值和下限值）的所有數值，以一個單位 的增量，前提條件是任意下限值和上限值之間存在至少兩個單位的間距。舉例來說，如果一 個被列舉范圍為100-1，〇〇〇,旨在將所有的單個數值，如100、101、102等等，以及子范圍，如 100-144、155-170、197-200等等進行明確枚舉。對包含小于1的值的范圍、或者包含大于1 的分數（如，I. 1、1. 5等等）的范圍，一個單位應該被認為以0. 0001、0. 001、0. 01或0. 1為 宜。對包含小于10的個位數（如，1-5)的范圍，典型的一個單位應該為0.1。這些只是一 些特別提出的例子，所有處于所枚舉下限值和上限值之間可能的數值組合都被認為在本公 開中明確陳述。在其他方面，本公開中針對混合物中組分的相對量提供了數值范圍，并且在 方法中表述了各個溫度和其他參數范圍。
[0031] 本
【發(fā)明者】發(fā)現某些微生物菌株可用于改善水生動物的性能。此外，本
【發(fā)明者】發(fā)現 某些微生物菌株可用于抑制或減緩水生動物病原體的生長或者提高水生動物抗應激性。
[0032] 本文所述微生物菌株為對水生動物健康有益的芽孢桿菌和乳酸桿菌菌株?，F在將 說明可用于水生動物的優(yōu)選芽孢桿菌和乳酸桿菌菌株。該實例并非要將本發(fā)明限制于芽孢 桿菌和乳酸桿菌菌株僅對水生動物可用。
[0033] 在一個實施例中，芽孢桿菌和乳酸桿菌菌株可用于改善水生動物的性能。本文所 用的"性能"指的是下文所述的水生動物（如一種蝦）的一個或多個參數：(a)存活率增加； (b)體增重增大（平均日體增重和/或總體增重）；（C)攝食量增加；（d)長度增加；（e)飼料 轉化率，其包括飼料量：增重和增重：飼料兩者；(f)絨毛長度和/或絨毛密度增加；（g)低 鹽度抵抗力增加；(h)高鹽度抵抗力增加；（i)高溫抵抗力增加；（j)低溫抵抗力增加；(k) 福爾馬林抵抗力增加；（1)對病原體（如白斑綜合癥病毒和弧菌屬細菌）響應后，存活率增 加或（m)死亡率以及本領域已知的其他度量。
[0034]本文所用的，"性能上的改善"或"改善的性能"指至少一種性能定義下所列的參數 有改善。改善的性能相對于對照動物測量。本文所述對照動物為未施用芽孢桿菌和/或乳 酸桿菌組合物的動物（例如，蝦）。
[0035] 本申請?zhí)峁┝私o水生動物（例如蝦）施用有效量的一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿 菌菌株的方法。在一個實施例中，該方法改善了水生動物的性能。因此，對水產養(yǎng)殖者來說， 日常施用一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株，無論是單獨施用還是與其他芽孢桿菌或乳 酸桿菌菌株結合施用，或許是經濟的。這樣不僅可預防和治療疾病，而且還可改善性能。
[0036] 在另一個實施例中，施用一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株抑制或減緩病原性 微生物的生長。例如，施用一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌抑制或減緩白斑綜合癥病毒或 弧菌屬細菌的生長該方法也可能被用于目前還未感染此類病原體的水生動物，來減輕或預 防白斑綜合癥病毒或弧菌屬細菌相關疾病。通過抑制或減緩病原體的生長，本文所述水生 動物將驗證其在暴露于病原體時存活率的改善，或者，將如本文所述驗證性能的改善。
[0037] 在另一個實施例中，施用一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株可提高水生動物的 抗應激性。例如，施用一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株可提高水生動物的對高或低鹽 度、高或低溫、或者高或低福爾馬林暴露的抵抗力。通過增加動物的抗應激性，本文所述水 生動物將驗證在暴露于應激時存活率的改善，或者將驗證本文所述的性能的改善。
[0038] 還提供了給水生動物施用一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株的方法。這些方法 可包括給水生動物（例如：蝦）喂食一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株?？稍谟左w期、后 幼體期、幼年期或該動物成長過程中的任一階段喂食所述（一種或多種）菌株。
[0039]特別是芽孢桿菌菌株具有許多使其可用于被動物攝取的組合物的品質。比如，芽 孢桿菌菌株可產生胞外酶，如蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶。此外，芽孢桿菌菌株還可產生抗 微生物因子，如短桿菌肽、枯草菌素、桿菌肽和多粘菌素。而且，芽孢桿菌菌株屬產孢菌類， 因此很穩(wěn)定。此外，很多芽孢桿菌具有公認安全（GRAS)的狀態(tài)，也就是說，它們通常被認為 是安全的。芽孢桿菌物種是唯一公認安全的產孢菌類。
[0040] 本文所述的芽孢桿菌和乳酸桿菌菌株抑制或減緩水生動物中一種或多種病原 體的生長。例如，在本發(fā)明的范圍之內的病原體包括很多種專門感染海上養(yǎng)殖的病原 體。病原體包括病毒或細菌病原體，還有海藻類（例如鞭毛藻類）產生的毒素。這些病 原體包括，舉例說明但不限于，白斑綜合癥病毒（WSSv)、挑拉綜合征病毒（TSV)、對蝦黃頭 病毒（YHV)、弧菌物種（包括鰻弧菌（V.anguillarum)和海魚弧菌（V.ordalii)、殺鮭弧 菌（V.salmonicida)、哈維氏弧菌（Vibrioharveyi))、傳染性皮下及造血組織壞死病毒 (IHHN)和IHHNV的病原體和病毒、導致畸形綜合征的病原體或南美白對蝦矮的RDS、桿狀病 毒（BLV)、傳染性胰臟壞死病毒（IPNV)、比目魚桿狀病毒（HIRRV)、鯡魚腹水病毒（YaV)、條 紋鰺神經壞死病毒（SJNNV)、虹彩病毒（Irido)、嗜水氣單胞菌（Aeromonoshydrophila)、 殺鮭產氣單胞菌（Aeromonossalmonicida)、液化沙雷菌（Serratialiquefaciens)、魯 氏耶爾森菌I型（YersniaruckeritypeI)、傳染性鮭魚貧血病（USA)病毒、胰腺疾病 (F1D)、病毒性出血敗血癥（VHS)、鮭腎桿菌（Rennibacteriumsalmoninarum)、殺鮭產氣單胞 菌、嗜水氣單胞菌、巴斯德氏菌（Pasteurella)物種（包括殺魚巴斯德氏菌（Pasteurella piscicida))、耶爾森氏菌物種、鏈球菌物種、遲鈍愛德華菌（Edwardsiellatarda)以及 鮰愛德華菌（Edwardsiellaictaluria);這些病毒引發(fā)病毒性出血敗血癥、傳染性胰壞 死、鯉春病毒血癥、河鯰病毒、草魚出血性病毒、野田病毒科病毒（如：神經壞死病毒、傳 染性鮭魚貧血病毒）；以及Ceratomyxashasta寄生蟲、多子小瓜蟲（Ichthyophthirius multifillius)、鮭隱鞭蟲（Cryptobiasalmositica)、鮭魚海風（Lepeophtheirus salmonis)、四膜蟲（Tetrahymena)物種、車輪蟲（Trichodina)物種以及Epistylus物種、 鉤鞭藻毒素（dinoflagellatestoxins)，包括毒素引起的腹瀉性貝毒（DSP)、麻痹性貝毒 (PSP)、神經性貝毒（NSP)和魚毒，還有很多，它們都會引起水產養(yǎng)殖業(yè)的嚴重損害。在一個 實施例中，芽孢桿菌和乳酸桿菌菌株或本發(fā)明抑制或減緩水生動物中白斑綜合癥病毒或弧 菌屬細菌的生長。在另一個實施例中，芽孢桿菌和乳酸桿菌菌株或本發(fā)明抑制或減緩水生 動物中白斑綜合癥病毒或哈維氏弧菌的生長。許多芽孢桿菌菌株可以聯合使用，來控制各 種病原體（比如上述病原體）。
[0041] 已發(fā)現對本文所述用法有效的芽孢桿菌菌株包括但不限于，枯草芽孢桿菌、地衣 芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、短芽孢桿 菌、嗜堿芽抱桿菌、克勞氏芽孢桿菌、耐鹽芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、環(huán)狀芽胞桿菌、燦爛芽 孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌和遲緩芽孢桿菌菌株。至少有一些實施例中，這些芽孢桿菌菌株為 短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌BS2084、枯草芽孢桿菌BS15Ap4、枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTPBS442、枯草芽孢桿菌AGTPBS521、枯草芽孢桿菌AGTPBS918、枯 草芽孢桿菌AGTPBS1013、短小芽孢桿菌119、枯草芽孢桿菌3A-P4、枯草芽孢桿菌22C-P1、 地衣芽孢桿菌842、枯草芽孢桿菌BS27、地衣芽孢桿菌BL21和枯草芽孢桿菌AGTPBS1069。 至少有一些實施例中，該短小芽孢桿菌菌株是短小芽孢桿菌AGTPBS1068。在一個實施例 中，本發(fā)明所用芽孢桿菌菌株為短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌BS2084和枯草芽孢桿 菌BS15Ap4的組合。在另一個實施例中，本發(fā)明所用芽孢桿菌菌株為短小芽孢桿菌119、 枯草芽孢桿菌BS2084和枯草芽孢桿菌BS15Ap4的組合。在另一個實施例中，本發(fā)明所 用芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌BS1013、枯草芽孢桿菌BS918和枯草芽孢桿菌BS3BP5的 組合。在另一個實施例中，本發(fā)明所用芽孢桿菌菌株為枯草芽孢桿菌3A-P4、枯草芽孢桿菌 15A-P4和枯草芽孢桿菌22C-P1的組合。在另一個實施例中，本發(fā)明所用芽孢桿菌菌株為地 衣芽孢桿菌842、枯草芽孢桿菌BS27和地衣芽孢桿菌BL21的組合。
[0042]這些菌株目前由DaniscoUSA,Inc.ofWaukesha,Wisconsin(威斯康星州 沃基肖的丹尼斯克（美國）有限公司）保藏于AgriculturalResearchService CultureCollection(NRRL)，1815NorthUniversityStreet,Peoria, 111.,61604. (美國農業(yè)研究菌種保藏中心（NRRL);保藏中心地址：1815NorthUniversity Street,Peoria, 111.，61604)。原始保藏的日期和保藏編號如下：枯草芽孢桿菌AGTP BS3BP5 :2011 年 5 月 13 日，（NRRLB-50510);枯草芽孢桿菌AGTPBS442 :2011 年 8 月 4 日，（NRRLB-50542);枯草芽孢桿菌AGTPBS521 :2011 年8 月 4 日，（NRRLB-50545);枯草 芽孢桿菌AGTPBS918:2011年5月 13 日，（NRRLB-50508);枯草芽孢桿菌AGTPBS1013: 2011 年 5 月 13 日，（NRRLB-50509);短小芽孢桿菌AGTPBS1068 :2011 年 8 月 4 日，（NRRL B-50543);枯草芽孢桿菌AGTPBS1069 :2011年8月4日，（NRRLB-50544)?？莶菅挎邨U菌 BS2084(NRRLB-50013)于2007年3月8日保藏在美國農業(yè)研究菌種保藏中心。地址：1815 NorthUniversityStreet,Peoria, 111. ,61604。所有保藏行為按照《國際承認用于專利程 序目的的微生物保存布達佩斯條約》實施。
[0043]以下菌株由AgtechProducts,Inc.ofWaukesha,Wisconsin(威斯康星州沃基肖 的美國農業(yè)技術產品有限公司）保藏于AmericanTypeCultureCollection(ATCC) 10801 UniversityBlvd.,Manassas,VA20110(美國典型菌種保藏中心（ATCC);保藏中心地址： 10801UniversityBlvd. ,Manassas,VA20110)。原始保藏的日期和保藏編號如下：枯草芽 孢桿菌3A-P4 :2005年1月12日，（ATCCPTA6506);枯草芽孢桿菌BS15-AP4 :2005年1月 12 日，（ATCCPTA-6507);枯草芽孢桿菌 22C-P1 :2005 年 1 月 12 日，（ATCCPTA-6508)。
[0044] 地衣芽孢桿菌842由威斯康星州沃基肖的丹尼斯克（美國）有限公司保藏于美國 農業(yè)研究菌種保藏中心；日期和編號：2011年5月20日，（NRRLB-50516)?？莶菅挎邨U菌 BS27由威斯康星州沃基肖的美國農業(yè)技術產品有限公司保藏于美國農業(yè)研究菌種保藏中 心；日期和編號：2008年1月24日，（NRRLB-50105)。地衣芽孢桿菌BL21由威斯康星州沃 基肖的美國農業(yè)技術產品有限公司保藏于美國農業(yè)研究菌種保藏中心；日期和編號：2008 年4月 15 日，（NRRLB-50134)。短小芽孢桿菌BP119 由DuPontNutritionBiosciences ApSofCopenhagen,Denmark(丹麥哥本哈根的杜邦營養(yǎng)生物科學有限公司）保藏于美國 農業(yè)研究菌種保藏中心；日期和編號：2012年12月18日，（NRRLB-50796);同時可商購自 GenesisBiosciences(Lawrenceville,GA)(創(chuàng)世紀生物科學公司（喬治亞州，勞倫斯維 爾））。
[0045] 任何芽孢桿菌衍生物或變體同樣包括于并可用于本文所述并受權利要求保護的 方法中。在一些實施例中，具有短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌BS2084、枯草芽孢桿 菌BS15Ap4、枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTPBS442、枯草芽孢桿菌AGTP BS521、枯草芽孢桿菌AGTPBS918、枯草芽孢桿菌AGTPBS1013、短小芽孢桿菌119、枯草芽 孢桿菌3A-P4、枯草芽孢桿菌22C-P1、地衣芽孢桿菌842、枯草芽孢桿菌BS27、地衣芽孢桿菌BL21、短小芽孢桿菌AGTPBS1068以及枯草芽孢桿菌AGTPBS1069所有特點的菌株同樣包 括于并可用于本文所述并受權利要求保護的方法中。
[0046] 在某些實施例中，短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌BS2084、枯草芽孢桿菌BS15 Ap4、枯草芽孢桿菌AGTPBS3BP5、枯草芽孢桿菌AGTPBS442、枯草芽孢桿菌AGTPBS521、 枯草芽孢桿菌AGTPBS918、枯草芽孢桿菌AGTPBS1013、短小芽孢桿菌119、枯草芽孢桿菌 3A-P4、枯草芽孢桿菌22C-P1、地衣芽孢桿菌842、枯草芽孢桿菌BS27、地衣芽孢桿菌BL21、 短小芽孢桿菌AGTPBS1068以及枯草芽孢桿菌AGTPBS1069的任何衍生物或變體同樣包 括于并可用于本文所述并受權利要求保護的方法中。
[0047] 利用標準RAPD圖譜分析以及伴侶素60通用靶標（cpn60)和16SrDNA桑格測序的 方法，對比菌株短小芽孢桿菌3064和短小芽孢桿菌119(NRRLB-50796)的基因檔案?；?于5個復制樣品的RPAD帶型和cpn60和16SrDNA序列分析，短小芽孢桿菌3064與短小芽 孢桿菌119(NRRLB-50796)被確定為在遺傳上是等同的。因此，本文所用的短小芽孢桿菌 3064與短小芽孢桿菌119可互相交換使用。
[0048] 已被發(fā)現可用于本文所述用途的乳酸桿菌菌株包括但不限于，瑞士乳酸桿菌、食 淀粉乳酸桿菌、彎曲乳酸桿菌、纖維二糖乳酸桿菌、降解淀粉類乳酸桿菌、消化乳酸桿菌、鳥 乳酸桿菌、卷曲乳酸桿菌、彎曲乳酸桿菌、雞乳酸桿菌、希氏乳酸桿菌、約氏乳酸桿菌、克菲 爾乳酸桿菌、高加索酸奶乳酸桿菌、黏液乳酸桿菌、面包乳酸桿菌、戊糖乳酸桿菌、橋乳酸桿 菌、玉米乳酸桿菌、舊金山乳酸桿菌、副干酪乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌、嗜酸乳酸桿菌、布氏 乳酸桿菌、香腸乳酸桿菌、鼠李糖乳酸桿菌、羅伊氏乳酸桿菌、發(fā)酵乳酸桿菌、短乳酸桿菌、 乳酸乳桿菌、胚芽乳酸桿菌、沙克乳酸桿菌或唾液乳酸桿菌菌株。至少在一些實施例中，乳 酸桿菌菌株為香腸乳酸桿菌CNCM-I-3699、鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698或它們的組合。香腸 乳酸桿菌CNCM-I-3699與鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698都保藏于NationalMicro-organism CollectionofPasteurInstitute(CNCM,Paris)(法國巴斯德研究所國家菌物保藏中心） (巴黎，CNCM)。
[0049] 任何乳酸桿菌衍生物或變體同樣包括于并可用于本文所述并受權利要求保護的 方法中。在一些實施例中，具有香腸乳酸桿菌CNCM-I-3699或鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698 所有特點的菌株，同樣包括于并可用于本文所述并受權利要求保護的方法中。
[0050] 在某些實施例中，香腸乳酸桿菌CNCM-I-3699或鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698的任 何衍生物或變體同樣包括于并可用于本文所述并受權利要求保護的方法中。
[0051] 本文所用的，使用隨機擴增多態(tài)DNA聚合酶鏈式反應（RAPD-PCR)分析時，"變體" 與所公開菌株的基因序列至少有80%同一性?；蛐蛄型恍猿潭瓤梢杂胁町?。在一些 實施例中，使用隨機擴增多態(tài)DNA聚合酶鏈式反應（RAPD-PCR)分析時，該變體與所公開菌 株的基因序列至少有85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。隨機擴增多態(tài)DNA 聚合酶鏈式反應（RAPD-PCR)分析可用的6種引物包括如下：引物l(5'-GGTGCGGGAA-3'） (SEQIDNO: 1);引物 2 (5, -GTTTCGCTCC-3'）（SEQIDNO: 2);引物 3 (5, -GTAGACCCGT-3'） (SEQIDNO: 3);引物 4 (5, -AAGAGCCCGT-3'）（SEQIDNO: 4);引物 5 (5, -AACGCGCAAC-3'） (SEQIDN0:5);引物 6(5'-CCCGTCAGCA-3'）（SEQIDN0:6)。在進行RAPD分析時，可使 用為進行RAPD分析設計為預混料和預分裝反應的Ready-t〇-Go?RAPD分析珠（Amersham Biosciences,Sweden)(瑞典安瑪西亞生物科學公司）。
[0052]官接飼用微牛物的制各和飼喂
[0053]為制備本文所述的直接飼用微生物，菌株可在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。對于芽孢 桿菌菌株，其生長優(yōu)選至形成最高數量孢子的程度。在一個實施例中，菌株生長到其中產率 為至少IO7?IO9個菌落形成單位（CFU)/毫升培養(yǎng)物的光學密度（OD)。本發(fā)明中的菌株 通過細菌菌株的發(fā)酵作用產生。發(fā)酵作用通過放大種菌培養(yǎng)物開始。這涉及到反復無菌地 將培養(yǎng)物轉化為越來越大的體積，從而作為發(fā)酵作用的接種體，發(fā)酵作用通過包含蛋白質、 碳水化合物以及最佳生長所必需的礦物質的培養(yǎng)基在大不銹鋼發(fā)酵罐中進行。一種非限制 性的示例性培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯。在將接種體加入發(fā)酵容器中后，控制溫度和攪動 來達到最佳生長。一旦該培養(yǎng)物達到最大種群密度，通過從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離細胞來收獲 該培養(yǎng)物。收獲通常通過離心分離來實現。上清液可應用于本文所述方法中。然后確定該 培養(yǎng)物的計數。
[0054]至少在一些實施例中，細菌是顆粒狀的。至少在一些實施例中，細菌是凍干的。至 少在一些實施例中，細菌與載體混合在一起。然而，在使用菌株前不必將它們凍干。這些菌 株可與或不與防腐劑一起進行使用，也可以以濃縮、非濃縮或稀釋的形式使用。
[0055]然后可測定培養(yǎng)物計數。CFU或菌落形成單位指得自標準微生物平皿培養(yǎng)法的樣 本中活細胞計數。此術語來源于該現象，即：當把單個細胞接種到合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)時，該 細胞將在瓊脂培養(yǎng)基中生長并變成活菌落。因多個細胞可能產生為一個活細胞菌落，此術 語菌落形成單位更多用作計量單位，而不是細胞數目。
[0056]當與載體合并時，細菌計數是重要的。在一個實施例中，在生產組合物時，計數為 至少為1.0XIO6?1.0X1012CFU/g。然而，該計數可能在這些基礎數據上增加或者減少， 并且仍具有完整的效果。例如，組合物生產時，該計數可能至少為大約1.0Xl〇3、l. 0X104、 I.OX105、1·OX106、1·OX107、1·OX108、1·OX109、1·OX1010、1·OX10u、l.OX1012、 I. 0XΙΟ13、I. 0XIO14 或I. 0X1015CFU/g。
[0057]提供了一種本文所述的含有一種或多種菌株的組合物?？蓪⒃摻M合物作為直接飼 用微生物（DFM)飼喂給水生動物。一個或多個載體或其他成分可添加入DFM。DFM可呈現為 不同物質形態(tài)。例如，作為追肥（topdress)，或用于作為液體浸淋物使用的水溶性濃縮液， 或添加到代乳品、明膠膠囊或凝膠中。在追肥形式的一個實施例中，凍干的乳酸菌發(fā)酵產品 被添加至載體上，如乳清蛋白、麥芽糖糊精、蔗糖、右旋糖、石灰石（碳酸鈣）、稻殼、酵母培 養(yǎng)物、干淀粉，和/或硅鋁酸鈉。在當作液體浸淋物的水溶性濃縮液或代乳品補充物的一個 實施例中，凍干的乳酸菌發(fā)酵產品被添加至一種水溶性載體上，如乳清蛋白、麥芽糊精、蔗 糖、右旋糖、干淀粉、硅鋁酸鈉，并且添加液體來形成該浸淋物，或者添加至乳或代乳品的補 充物。在明膠膠囊形式的一個實施例中，凍干的乳酸菌發(fā)酵產品被添加至載體上，如乳清蛋 白、麥芽糖糊精、糖類、石灰石（碳酸鈣）、稻殼、酵母培養(yǎng)物、干淀粉和/或硅鋁酸鈉。在一 個實施例中，該乳酸菌和載體被可降解明膠膠囊包裹。在凝膠形式的一個實施例中，凍干的 乳酸菌發(fā)酵產品被添加至載體上，如植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨酯80、丙二醇、叔丁基 羥基茴香醚、檸檬酸、乙氧喹和/或人造色素，從而形成凝膠。
[0058] 所述（一種或多種）菌株可任選與添加劑（包括但不限于生長基質、酶、糖類、碳 水化合物、提取物和促生長的微量成分）的干燥制劑混合。糖類可包括：乳糖；麥芽糖；右 旋糖；麥芽糊精；葡萄糖；果糖；甘露糖；塔格糖；山梨糖；棉子糖；和半乳糖。單獨的或以組 合形式的糖的范圍為50-95%。提取物可包括酵母或干燥酵母發(fā)酵可溶物，范圍為5-50%。 生長基質可包括：胰蛋白酶解酪蛋白，范圍為5-25%;乳酸鈉，范圍為5-30%;以及吐溫80， 范圍為1-5%。碳水化合物可包括甘露醇、山梨醇、側金盞花醇和阿糖醇。單獨的或組合形 式的碳水化合物的范圍為5-50%。微量成分可包括：碳酸I丐，范圍為0. 5-5. 0%;氯化I丐，范 圍為0.5-5. 0% ;磷酸氫二鉀，范圍為0.5-5. 0% ;磷酸鈣，范圍為0.5-5. 0% ;錳蛋白，范圍 為 0· 25-1. 00% ;以及錳，范圍為 0· 25-1. 0%。
[0059] 這些培養(yǎng)物和載體（所使用的）可被加入到螺條混合機或槳式混合機并混合約15 分鐘，但混合時間可增加或減少。將各組分共混以使得產生培養(yǎng)物與載體的均勻混合物。最 終產物優(yōu)選為干燥可流動的粉末。所述（一種或多種）菌株可被添加到動物飼料或飼料預 混料，或添加到動物飲水中，或者以在本領域中所了解的其他途徑進行施用。動物用飼料中 可補充一種或多種本文所述菌株，也可補充本文所述組合物。
[0060] 菌株可能以有效量施用給動物，所述動物包括但不限于水生動物。水生動物包括： 脊椎動物、無脊椎動物、節(jié)肢動物、魚類、軟體動物，以舉例的方式，除了其它之外，包括但不 限于：奸（例如，南美白對奸、鹽水奸、淡水奸，等等）、蟹、牡販、扇貝、奸蛤、軟骨魚類（例 如，鱸魚、條紋鱸魚、羅非魚、鯰魚、海鯛、彩虹鱒魚、斑馬魚、紅鼓魚、大馬哈魚、鯉魚、鯰魚、 黃獅魚、鯉魚，等等）以及甲殼類動物。蝦包括所有品種和物種的蝦，以舉例的方式，包括但 不限于：濱對蝦屬蝦、美對蝦屬蝦和對蝦屬蝦。除其他以外，對蝦屬包括但不限于：細角對 蝦、南美白對蝦、斑節(jié)對蝦、中國對蝦、西方對蝦、加州對蝦、短溝對蝦、斑節(jié)對蝦、食用對蝦、 白對蝦、日本對蝦、褐對蝦、桃紅對蝦、印度對蝦和墨吉對蝦。
[0061] 本文所述芽孢桿菌和乳酸桿菌組合物可在水生動物生長的任一階段施用。在一些 實施例中，該組合物被施用于蝦成長的幼體期、后幼體期或幼年期。見例圖1。
[0062] 所謂"施用"指向水生動物引入本文所述至少一種菌株和/或來自至少一種菌株 的培養(yǎng)物的上清液的行為。在一些實施例中施用至少一種菌株指至動物胃腸道。施用方式 可為口服。該施用可特別地通過在將要飼喂動物的飼料中補充至少一種菌株來實施，添加 后的飼料之后將被動物攝取。該施用也可利用胃管或任何其他方法來實施，使得可直接將 至少一種菌株送入動物胃腸道。在一些實施例中，對動物施用一種或多種菌株是通過任何 簡便的方法完成的，包括將芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株添加到動物接觸或動物飲用的水中、 通過追肥、作為用于液體浸淋物的水溶性濃縮物、明膠膠囊或凝膠。芽孢桿菌菌株優(yōu)選作為 孢子施用。
[0063] 所謂"有效量"指DFM和/或上清液的量足以允許改善動物性能、或者抑制或減緩 本文所述病原體生長。改善的量可依本文所述進行測量，也可通過在本領域中已知的其它 方法測量?？赏ㄟ^提供任意涉及含DFM的飼料的手段來給動物施用這些有效量。DFM可以 以單劑量或多劑量來施用。
[0064] 至少在一些實施例中，與未處理的對照組相比，改善至少為2%。在某些實施例 中，改善至少為 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70%、75%、80%、85%、90% 或 95%。
[0065]可向動物施用單劑量或多劑量的有效量。所謂"至少一種菌株"，其意既指單一菌 株，又指包含至少兩個細菌菌株的菌株混合物。至少在一些實施例中，組合使用本文所述的 (一種或多種）菌株。所謂"至少兩種菌株的混合物"，其意指兩種、三種、四種、五種、六種 或甚至更多種菌株的混合物。在菌株的混合物的一些實施例中，比例可自1%變化至99%。 在某些實施例中，混合物中所用菌株的比例至少為5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。菌株的混合物的其 他實施例為25%至75%。菌株的混合物的另外的實施例是每種菌株大約為50%。當混合 物包含兩種以上菌株時，菌株可以基本上相等的比例或以不同比例存在于混合物中。
[0066] 例如，菌株可以不同比率組合，從而確定出改善動物性能或者抑制或減緩病原體 生長的最佳比率。當組合使用時，可使用以下示例性、非限制性比率：三種不同菌株每種 1/3 ;四種不同菌株每種1/4 ;五種不同菌株每種1/5 ;第一種菌株40%、第二種菌株40%、 第三種菌株20 % ;第一種菌株50 %、第二種菌株25 %、第三種菌株25 % ;第一種菌株70 %、 第二種菌株20%、第三種菌株10%。也可使用其它菌株組合。此外，具有50%更多CFU/克 的組合可用于提高飼喂給動物的微生物的數量。
[0067]在一些實施例中，當細菌被添加到動物飼料或動物飼料添加劑中時，添加的量為 每噸飼料至少10至20, 000克。該量可從該數量增加或減少，并任然具有完整的功效。例如， 該添加于飼料的細菌量可為每噸飼料10、25、50、100、200、300、400、500、750、1000、1500、 2000、2500、3000、4000、5000、10, 000、15, 000 或 20, 000 克。作為另外一種選擇，該量可為處 于50至20, 000克每噸飼料范圍中的任意量。
[0068] 在一些實施例中，該一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株被添加到動物飼料的比 率為至少I.OXIO1CFU/動物/天。在另一個實施例中，該一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿 菌菌株被添加到動物飼料的比率為至少1. 〇X1〇2、1. 〇X1〇3、1. 〇X1〇4、1. 〇X1〇5、1. 〇X1〇6、 I.OX107、1·OX108、1.OX109、1·OXιο10、ι·OX10u、l.OX1012、1·OX1013、1·OXIO14 或 I.OXIO15CFU/動物 / 天。
[0069] 在一些實施例中，該一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株被添加到動物飼料的比 率為至少LOXIO3CFu/克飼料。在另一個實施例中，該一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌 菌株被添加到動物飼料的比率為至少I.OXlO4U.OXlO5U.OXlO6U.OXlO7U. 0X108、 I.OXlO9U. 0X101CI、L0Χ10η、1·OXlO12U.OXlO13U.OXIO14 或I.OXIO15CFU/克飼料。在 一個具體實施例中，該芽孢桿菌或乳酸桿菌菌株被添加到動物飼料的比率為至少2XIO8至 2X109CFU/g。
[0070] 可將本文所給出的DFM按以下形式進行施用：，例如，作為含有菌株的培養(yǎng)溶液、 產生菌株的上清液或培養(yǎng)溶液的細菌產物。
[0071] 可通過多種方法中的一種給動物施用該DFM。例如，所述（一種或多種）菌株可能 以固體形式進行施用，可被分散進賦形劑、優(yōu)選水，可被直接飼喂給動物、可能以干燥形式 與飼料物理混合、也可以將所述（一種或多種）菌株形成溶液然后噴到飼料上。給動物施 用（一種或多種）菌株的方法被認為是在本領域技術人員的技術范圍內。
[0072] 當在與飼料組合使用時，該飼料可包含玉米、豆柏、副產品（如帶可溶物的干酒 糟）、稻殼、碳酸鈣、礦物油、海草粉、碎大豆、米糠、二氧化硅、丙酸鈣或維生素/礦物補充 劑。
[0073] 施用時間并不重要，只要本文所述的一種或多種性能特性有了改善，比如：（a)存 活率增加；(b)體增重增大（平均日體增重和/或總體增重）；（C)攝食量增加；（d)長度增 加；（e)飼料轉化率，其包括飼料：增重和增重：飼料兩者；（f)絨毛長度和/或絨毛密度增 加；（g)低鹽度抵抗力增加；(h)高鹽度抵抗力增加；（i)高溫抵抗力增加；（j)低溫抵抗力 增加；(k)福爾馬林抵抗力增加；（1)對病原體（如白斑綜合癥病毒和弧菌屬細菌）響應后， 存活率增加或（m)死亡率。在任何時間、有無飼料均可施用。但是，該芽孢桿菌或乳酸桿菌 組合物優(yōu)選在飼喂時一起或即將飼喂前施用。
[0074] 因此，至少在一些實施例中，至少一種細菌菌株的有效量的施用，是通過在用來飼 喂動物的飼料中補充至少一種細菌菌株的有效量來實現的。本文所用的"補充"意為將有 效量的本文提供的細菌直接摻入意欲用于動物的飼料的行為。因此，該動物在飼喂時也攝 取了本文所提供的細菌。
[0075] 用于動物的飼料包含至少一種本文所述的細菌菌株。
[0076] 至少在一些實施例中，提供了一種方法，所述方法包括以下步驟：將有效量的芽孢 桿菌或乳酸桿菌組合物、一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌組合物的組合、一種或多種來自 芽孢桿菌或乳酸桿菌組合物培養(yǎng)物的上清液、包含一種或多種芽孢桿菌或乳酸桿菌組合物 的飼料或它們的混合物施用給水生動物。該施用改善了本文所述的一種或多種性能特性， 例如：(a)存活率增加；(b)體增重增大（平均日體增重和/或總體增重）；（c)攝食量增加； (d)長度增加；（e)飼料轉化率，其包括飼料：增重和增重：飼料兩者；（f)絨毛長度和/或 絨毛密度增加；（g)低鹽度抵抗力增加；(h)高鹽度抵抗力增加；（i)高溫抵抗力增加；（j) 低溫抵抗力增加；(k)福爾馬林抵抗力增加；（1)對病原體（如白斑綜合癥病毒和弧菌屬細 菌）響應后，存活率增加或（m)死亡率。
[0077] 以下所提供實例僅為示例性的目的。本文所包括的實例僅為有助于更完整地理解 當前描述的發(fā)明。這些實例不以任何方式限制本文所述或受權利要求保護的本發(fā)明的范 圍。
[0078] SM
[0079]實例1
[0080] 芽孢桿菌與熱滅活的乳酸桿菌對后幼體期白對蟲下（南美白對蟲下）牛長件能的影響
[0081] 在本研究中,對動物的初始體重、最終體重、周體增重、攝食量、飼料轉化率（FCR)、 長度、存活率、肌肉內臟比率、肝胰腺色澤、畸形情況以及污垢程度進行測量。采用后幼體期 的凡納濱（Litopenaeusvannamei)白對奸。對下表1中顯示的每種處理進行了五次復測 (Bac=芽孢桿菌；HIL=熱滅活的乳酸桿菌。）在一個200升的玻璃缸中，每平方米奸數量 維持在大約300只。水溫維持在29°C，鹽度維持在25ppt。每天的換水量大約為20%。
[0082]表1
[0083]

【權利要求】
1. 一種包含一種或多種分離菌株的組合物，所述分離菌株選自短小芽孢桿菌3064、 枯草芽孢桿菌BS 2084 (NRRL B-50013)、枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽 孢桿菌 AGTP BS3BP5(NRRL B-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS442(NRRL B-50542)、枯草芽 孢桿菌 AGTP BS521(NRRL B-50545)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS918(NRRL B-50508)、枯草芽 孢桿菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢桿菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢桿菌 3A-P4 (ATCC PTA-6506)、枯草芽孢桿菌 22C-P1 (ATCC PTA-6508)、地衣芽孢桿菌 842 (NRRL B-50516)、枯草芽孢桿菌BS27(NRRL B-50105)、地衣芽孢桿菌BL21 (NRRL B-50134)、短小芽 孢桿菌 AGTP BS 1068 (NRRL B-50543)以及枯草芽孢桿菌 AGTP BS1069 (NRRL B-50544)、香 腸乳酸桿菌CNCM-I-3699和鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698、及具有它們的所有特點的菌株、它 們的任何衍生物或變體、以及它們的混合物。
2. 如權利要求1中所述的組合物，其中所述組合物包含短小芽孢桿菌3064菌株、枯草 芽孢桿菌BS 2084 (NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15 Ap4 (ATCC PTA-6507)菌株。
3. 如權利要求1中所述的組合物，其中所述組合物包含短小芽孢桿菌119(NRRL B-50796)菌株、枯草芽孢桿菌BS 2084 (NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15 Ap4 (ATCC PTA-6507)菌株。
4. 如權利要求1中所述的組合物，其中所述組合物包含枯草芽孢桿菌1013(NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢桿菌BS918 (NRRL B-50508)菌株和枯草芽孢桿菌BS3BP5 (ATCC PTA-50510)菌株。
5. 如權利要求1中所述的組合物，其中所述組合物包含地衣芽孢桿菌842 (NRRL B-50516)菌株、枯草芽孢桿菌BS27 (NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢桿菌BL21 (ATCC PTA-50134)菌株。
6. 如權利要求1中所述的組合物，其中所述組合物包含枯草芽孢桿菌3A-P4(ATCC PTA-6506)菌株、枯草芽孢桿菌BS15 Ap4 (ATCC PTA-6507)菌株和枯草芽孢桿菌 22C-P1 (ATCC PTA-6508)菌株。
7. -種包括給動物施用有效量的組合物的方法，所述組合物包含一種或多種分離菌 株，所述分離菌株選自短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌BS 2084 (NRRL B-50013)、枯草芽 孢桿菌 BS15 Ap4 (ATCC PTA-6507)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510)、枯草芽孢 桿菌 AGTP BS442 (NRRL B-50542)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS521 (NRRL B-50545)、枯草芽孢桿 菌 AGTP BS918 (NRRL B-50508)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS1013 (NRRL B-50509)、短小芽孢桿 菌 119 (NRRL B-50796)、枯草芽孢桿菌 3A-P4 (ATCC PTA-6506)、枯草芽孢桿菌 22C-P1 (ATCC PTA-6508)、地衣芽孢桿菌 842 (NRRL B-50516)、枯草芽孢桿菌 BS27 (NRRL B-50105)、地 衣芽孢桿菌BL21 (NRRL B-50134)、短小芽孢桿菌AGTP BS 1068 (NRRL B-50543)以及枯 草芽孢桿菌AGTP BS1069 (NRRL B-50544)、香腸乳酸桿菌CNCM-I-3699和鼠李糖乳桿菌 CNCM-I-3698、及具有它們的所有特點的菌株、它們的任何衍生物或變體、以及它們的混合 物。
8. 如權利要求7中所述的方法，其中在給所述動物施用后，相比于未施用所述菌株的 動物，所述菌株在所述動物中或對所述動物提供至少一種下述益處：(a)存活率增加；(b) 體增重增大（平均日體增重和/或總體增重）；（c)攝食量增加；（d)長度增加；（e)飼料轉 化率增加；(f)絨毛長度和/或絨毛密度增加；（g)低鹽度抵抗力增加；(h)高鹽度抵抗力增 加；（i)高溫抵抗力增加；（j)低溫抵抗力增加；(k)福爾馬林抵抗力增加；（1)對病原體響 應后存活率增加或（m)死亡率。
9. 如權利要求7或8中任一項所述的方法，其中所述動物為蝦。
10. 如權利要求7-9中任一項所述的方法，其中所述動物為幼體期蝦、后幼體期蝦或幼 蝦期的蝦。
11. 如權利要求7-10中任一項所述的方法，其中所述動物為南美白對蝦（Penaeus vannamei)〇
12. 如權利要求7-11中任一項所述的方法，其中，當給所述動物施用所述菌株后，相比 于對照組，所述菌株提供至少一種所述益處的至少2%的改善。
13. 如權利要求7-12中任一項所述的方法，其中所述（一種或多種）菌株的施用量為 約1 X 105至約1 X 10nCFU/動物/天。
14. 如權利要求7-13中任一項所述的方法，其中所述病原體為白斑綜合癥病毒或弧菌 屬細菌。
15. 如權利要求7-14中任一項所述的方法，其中所述病原體為白斑綜合癥病毒或哈維 氏弧菌。
16. 如權利要求7-15中任一項所述的方法，其中所述動物被暴露于高溫或低溫、高鹽 度或低鹽度、對蝦白斑綜合癥病毒、或弧菌屬細菌。
17. 如權利要求7-16中任一項所述的方法，其中所述組合物包含短小芽孢桿菌3064菌 株、枯草芽孢桿菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507) 菌株。
18. 如權利要求7-16中任一項所述的方法，其中所述組合物包含短小芽孢桿菌 119(NRRL B-50796)菌株、枯草芽孢桿菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。
19. 如權利要求7-16中任一項所述的方法，其中所述組合物包含枯草芽孢桿菌 1013 (NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢桿菌BS918(NRRL B-50508)菌株和枯草芽孢桿菌 BS3BP5(ATCC PTA-50510)菌株。
20. 如權利要求7-16中任一項所述的方法，其中所述組合物包含地衣芽孢桿菌 842(NRRL B-50516)菌株、枯草芽孢桿菌BS27(NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢桿菌 BL21(ATCC PTA-50134)菌株。
21. 如權利要求7-16中任一項所述的方法，其中所述組合物包含枯草芽孢桿菌 3A-P4(ATCC PTA-6506)菌株、枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株和枯草芽孢桿 菌 22C-P1(ATCC PTA-6508)菌株。
22. -種動物飼料或飼料添加劑組合物，包含一種或多種分離菌株，所述分離菌株選自 短小芽孢桿菌3064、枯草芽孢桿菌BS 2084 (NRRL B-50013)、枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS442 (NRRL B-50542)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS521 (NRRL B-50545)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS918 (NRRL B-50508)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS1013 (NRRL B-50509)、短小芽孢桿菌 119 (NRRL B-50796)、 枯草芽孢桿菌3A-P4(ATCC PTA-6506)、枯草芽孢桿菌22C-P1 (ATCC PTA-6508)、地衣芽孢 桿菌 842 (NRRL B-50516)、枯草芽孢桿菌 BS27 (NRRL B-50105)、地衣芽孢桿菌 BL21 (NRRL B-50134)、短小芽孢桿菌AGTP BS 1068(NRRL B-50543)和枯草芽孢桿菌AGTP BS1069(NRRL B-50544)、香腸乳酸桿菌CNCM-I-3699和鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698、以及具有它們的所有 特點的菌株、它們的任何衍生物或變體、以及它們的混合物。
23. 如權利要求22中所述的組合物，其中所述一種或多種菌株以10至2000克/噸飼 料的量補充到所述組合物中。
24. 如權利要求22或23中所述的組合物，其中所述組合物包含短小芽孢桿菌3064菌 株、枯草芽孢桿菌BS 2084(NRRL B-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507) 菌株。
25. 如權利要求22或23中所述的組合物，其中所述組合物包含短小芽孢桿菌119 (NRRL B-50796)菌株、枯草芽孢桿菌BS 2084(NRRLB-50013)菌株和枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株。
26. 如權利要求22或23中所述的組合物，其中所述組合物包含枯草芽孢桿菌 1013 (NRRL B-50509)菌株、枯草芽孢桿菌BS918(NRRL B-50508)菌株和枯草芽孢桿菌 BS3BP5(ATCC PTA-50510)菌株。
27. 如權利要求22或23中所述的組合物，其中所述組合物包含地衣芽孢桿菌842 (NRRL B-50516)菌株、枯草芽孢桿菌BS27 (NRRL B-50105)菌株和地衣芽孢桿菌BL21(ATCC PTA-50134)菌株。
28. 如權利要求22或23中所述的組合物，其中所述組合物包含枯草芽孢桿菌 3A-P4(ATCC PTA-6506)菌株、枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)菌株和枯草芽孢桿 菌 22C-P1(ATCC PTA-6508)菌株。
29. -種生產一種或多種分離菌株的方法，所述分離菌株選自短小芽孢桿菌3064、枯 草芽孢桿菌BS 2084 (NRRL B-50013)、枯草芽孢桿菌BS15 Ap4(ATCC PTA-6507)、枯草芽 孢桿菌 AGTP BS3BP5 (NRRL B-50510)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS442 (NRRL B-50542)、枯草芽 孢桿菌 AGTP BS521 (NRRL B-50545)、枯草芽孢桿菌 AGTP BS918 (NRRL B-50508)、枯草芽 孢桿菌AGTP BS1013(NRRL B-50509)、短小芽孢桿菌119(NRRL B-50796)、枯草芽孢桿菌 3A-P4 (ATCC PTA-6506)、枯草芽孢桿菌 22C-P1 (ATCC PTA-6508)、地衣芽孢桿菌 842 (NRRL B-50516)、枯草芽孢桿菌BS27 (NRRL B-50105)、地衣芽孢桿菌BL21 (NRRL B-50134)、短小芽 孢桿菌 AGTP BS 1068 (NRRL B-50543)和枯草芽孢桿菌 AGTP BS1069 (NRRL B-50544)、香腸 乳酸桿菌CNCM-I-3699和鼠李糖乳桿菌CNCM-I-3698、以及具有它們的所有特點的菌株、它 們的任何衍生物或變體、以及它們的混合物，所述方法包括：(a)在液體培養(yǎng)基中生長包含 所述一種或多種菌株的培養(yǎng)物；和（b)從所述液體培養(yǎng)基中分離所述一種或多種菌株。
30. 如權利要求29中所述的方法，還包括凍干所述分離菌株并將所述凍干的菌株添加 到載體上。
31. 如權利要求29或30中所述的方法，還包括在分離出所述菌株后，保留所述液體培 養(yǎng)基以產生上清液。
【文檔編號】C12R1/225GK104411182SQ201380019276
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2013年4月12日 優(yōu)先權日:2012年4月12日
【發(fā)明者】S·弗勞爾, C·克羅姆 申請人:杜邦營養(yǎng)生物科學有限公司