用于從衍生自多能干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離神經(jīng)元的細(xì)胞表面特征物的制作方法
【專利摘要】諸位發(fā)明人披露了提供用于直接從異質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物分離并純化神經(jīng)元的多種方法和系統(tǒng)。在多能干細(xì)胞中檢查了各種細(xì)胞粘附分子的表達(dá)。這些分子中的一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)變化與從非定向到神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。與針對(duì)CD200具有特異性的抗體相結(jié)合，使用針對(duì)這些分子的一種或多種抗體將使得能夠從細(xì)胞群體中識(shí)別并分離神經(jīng)元。
【專利說明】用于從衍生自多能干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中分離神經(jīng)元的細(xì) 胞表面特征物
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用 根據(jù)美國(guó)法典第35部分119(e)條，本申請(qǐng)要求在2012年5月16日提交的美國(guó)臨時(shí)專 利申請(qǐng)序列號(hào)為61/647, 951的申請(qǐng)日的優(yōu)先權(quán)，將該申請(qǐng)的披露內(nèi)容通過引用結(jié)合在此。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及用于分離神經(jīng)元的多種方法和組合物。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 人類胚胎干細(xì)胞（hESC)和人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（hiPSC)兩者都具有分化成多 種體細(xì)胞的能力。因而hESC和hiPSC的分化給醫(yī)療發(fā)展、藥物篩選、疾病模型、以及組織置 換提供了契機(jī)。然而，開發(fā)完善的條件來(lái)產(chǎn)生特定細(xì)胞類型的單純?nèi)后w對(duì)實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)至 關(guān)重要。存在若干神經(jīng)誘導(dǎo)方法，這些方法使用自發(fā)分化、化學(xué)誘導(dǎo)、或者小鼠基質(zhì)飼養(yǎng)細(xì) 胞來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞培養(yǎng)物形成神經(jīng)干細(xì)胞（NSC)。NSC可以通過人工分離與繁殖作為單層培養(yǎng) 延續(xù)很多代。原則上，這些細(xì)胞可以分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，為體內(nèi)和體外試驗(yàn)無(wú)限供給 細(xì)胞。令人遺憾的是這些方法的穩(wěn)健性會(huì)受到分離的NSC的批次間變異性的妨礙。此外， NSC的分化經(jīng)常導(dǎo)致變異的和異質(zhì)的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)以及未分化的細(xì)胞的培養(yǎng)物，其能夠 阻礙需要純化或者界定細(xì)胞群體的下游應(yīng)用，例如體內(nèi)試驗(yàn)、移植、以及微型陣列。針對(duì)該 問題的一個(gè)可能的解決方案是識(shí)別在NSC、神經(jīng)膠質(zhì)、以及神經(jīng)元上表達(dá)的細(xì)胞表面標(biāo)志物 從而界定和純化不同的細(xì)胞類型。
[0005] 已描述了細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)用于通過熒光激活細(xì)胞分選法（FACS)從來(lái)自多個(gè) 物種的胚胎和成人組織識(shí)別和分離許多神經(jīng)細(xì)胞類型。糖蛋白CD133在很多組織中是一種 已知的干/祖細(xì)胞標(biāo)志物，并且已經(jīng)被用于從人腦中分離NSC。碳水化物部分CD15,也被稱 為階段特異性胚胎抗原-1或者LeX，已經(jīng)被用于從小鼠腦室下區(qū)（SVZ)中分離NSC和放射 狀膠質(zhì)細(xì)胞。⑶184, 一種G蛋白偶聯(lián)受體，通過結(jié)合⑶15被成功地用于從小鼠胚胎前腦和 成體SVZ中分離NSC。⑶24是一種細(xì)胞粘附分子，其已經(jīng)被用于通過FACS從小鼠大腦中分 離NSC。另外，已經(jīng)使用神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的基因啟動(dòng)子-報(bào)告子從人類大腦組織分離出神 經(jīng)干細(xì)胞和神經(jīng)祖細(xì)胞。
[0006] 同樣地，通過FACS識(shí)別和分離hESC來(lái)源的神經(jīng)細(xì)胞也有了進(jìn)展。普路扎克 (Pruszak)等人（干細(xì)胞（Stem Cells) 25 :2257-2268, 2007)報(bào)告稱可以利用細(xì)胞表面標(biāo)志 物在不同發(fā)育階段測(cè)驗(yàn)分化成為神經(jīng)系的hESC培養(yǎng)物，并且可以使用CD56 (NCAM)的抗體 富集神經(jīng)元細(xì)胞。⑶1847⑶326-標(biāo)志物已經(jīng)被用于從分化中的hESC純化能夠分化成神經(jīng) 元的神經(jīng)祖細(xì)胞。另外，佩赫（Peh)等人（干細(xì)胞與發(fā)育（Stem Cells Dev) 18:269-282， 2009)報(bào)告了基于⑶133,⑶15和GCTM-2的表達(dá)，自hESC神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)物富集形成神經(jīng)球 的NSC。運(yùn)用類似的策略，戈萊比瓦斯卡（Golebiewska)等人（干細(xì)胞27 :1298-1308, 2009) 曾使用⑶133+/⑶457⑶3407人分化中的hESC中分離NSC。普路扎克等人（2009)論證了 ⑶24,⑶15和⑶29作為表面標(biāo)志物密碼的用途，用于從hESC神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)物分離不同細(xì) 胞群體，包括NSC，以及成神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)元的混合群體。
[0007] 袁（Yuan)等人（公共科學(xué)圖書館?綜合（PLoS One. )2011. 03. 02 ;6 (3) :el7540) 描述了基于細(xì)胞表面特征物通過FACS分離多能干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞（NSC)、神經(jīng)分化培養(yǎng) 物的方法，將其通過引用結(jié)合在此。這些方法被用于從hESC神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)物以及人類誘導(dǎo) 性多能干細(xì)胞（hiPSC)中分離一個(gè)為⑶1847⑶27Γ/⑶447⑶24+的NSC群體?；诩?xì)胞表 面特征物的方法還被用于富集來(lái)自多種常見神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)系統(tǒng)的NSC。袁等人還確定了細(xì) 胞表面特征物，用于從分離的NSC培養(yǎng)物的分離培養(yǎng)物中分離神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)。隨后，一 個(gè)為⑶1847⑶447⑶15低（LOW) /⑶24+的神經(jīng)元群體和一個(gè)為⑶184 7⑶44+的神經(jīng)膠質(zhì) 群體從分化中的NSC分離培養(yǎng)物中被純化。BD Stemflow?神經(jīng)細(xì)胞分離試劑盒（BD生物 科學(xué)公司（BD Biosciences)，圣何塞，加州）是一種被設(shè)計(jì)成允許從分化的NSC中分離衍 生自人類多能干細(xì)胞的神經(jīng)干細(xì)胞（NSC)或者神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的試劑盒。該方法與 像人工分離這樣的傳統(tǒng)方法截然相反，其降低了 NSC分離群之間的變異量，但是需要在神 經(jīng)元在培養(yǎng)物中分離和富集之前誘導(dǎo)和分離NSC。需要用于提供對(duì)衍生自異質(zhì)細(xì)胞群體的 神經(jīng)元的識(shí)別和分離，并且減少神經(jīng)元識(shí)別、分離和富集所涉及步驟的方法。
[0008] 概述
[0009] 本發(fā)明提供了用于從異質(zhì)群體細(xì)胞中分離或富集神經(jīng)元的多種細(xì)胞表面特征物， 方法和系統(tǒng)。這些方法可以用于從一組新細(xì)胞表面蛋白（細(xì)胞表面特征物）的表達(dá)模式中 識(shí)別神經(jīng)元。本方法使得能夠分離或富集來(lái)自不同類型的細(xì)胞培養(yǎng)物的神經(jīng)元，包括分化 中的多能干細(xì)胞（hPSC)的細(xì)胞培養(yǎng)物，例如人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC)和人類胚胎干 細(xì)胞（EPSC)，或者h(yuǎn)PSC衍生的神經(jīng)干細(xì)胞，以及已經(jīng)被基因轉(zhuǎn)導(dǎo)而轉(zhuǎn)分化成神經(jīng)元（誘導(dǎo) 神經(jīng)元）的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0010] 在一些實(shí)施例中，提供了一種在一個(gè)包含神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)物中區(qū)分 神經(jīng)元的方法，該方法包括用特異性結(jié)合到CD200的一個(gè)第一抗體和特異性結(jié)合到一個(gè)第 二蛋白的至少一個(gè)第二抗體接觸該細(xì)胞培養(yǎng)物，其中該第二蛋白選自下組，該組由以下各 項(xiàng)組成：HLA-A、HLA-B、HLA-C、（HLA-A、B、C)CD49f、CD151 和 CD340 或其任意組合；并且檢 測(cè)是^200+細(xì)胞的并且還展示出!11^-4、!11^-8、!11^-(：、^49廠^151和^340中的一個(gè)或 多個(gè)的低至陰性表達(dá)的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞培養(yǎng)物包括人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 (hiPSC)、人類胚胎干細(xì)胞（hEPSC)、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物、神經(jīng)干細(xì)胞、神經(jīng)上皮、神經(jīng)玫瑰 結(jié)、神經(jīng)祖細(xì)胞、或神經(jīng)嵴細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞培養(yǎng)物衍生自一個(gè)細(xì)胞異質(zhì)混合 物。⑶200+細(xì)胞可以是⑶200巾等以及⑶200?并且不是⑶200?。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞 培養(yǎng)物包括不經(jīng)歷一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞富集步驟的神經(jīng)玫瑰結(jié)。檢測(cè)細(xì)胞的步驟可以通過一個(gè) 流式細(xì)胞儀來(lái)進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，該第一和第二抗體是通過與一個(gè)熒光團(tuán)的直接接合 可檢測(cè)地和可辨別地標(biāo)記的，該熒光團(tuán)是例如異硫氰酸熒光素、別藻藍(lán)素、多甲藻素葉綠 素蛋白、藻紅素、菁藍(lán)5或BV421。神經(jīng)元可以通過分離或富集是⑶200 +#或⑶200s并且還 是HLA-A、B、C_，⑶49Γ，⑶15?；颌?40 _的細(xì)胞的細(xì)胞群體被分離或富集。在一些實(shí)施例 中，該在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中富集神經(jīng)元含量的方法包括在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)神經(jīng)分化 從而形成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)，用特異性結(jié)合到CD200的一個(gè)第一抗體和特異性結(jié)合到一個(gè) 第二蛋白的至少一個(gè)第二抗體接觸該細(xì)胞培養(yǎng)物，其中該第二蛋白選自下組，該組由以下 各項(xiàng)組成：HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151和⑶340,及其任意組合；并且流式細(xì)胞計(jì)數(shù) 地選擇是⑶200+細(xì)胞的并且還是HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151以及⑶340中的一個(gè) 或多個(gè)的陰性或低的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，從該神經(jīng)玫瑰結(jié)直接誘導(dǎo)神經(jīng)元形成。在一 些實(shí)施例中，是CD200+的細(xì)胞不是CD200 。在一些實(shí)施例中，該細(xì)胞培養(yǎng)物不經(jīng)歷一個(gè)神 經(jīng)干細(xì)胞富集步驟。該第一和第二抗體可以是通過與一個(gè)熒光團(tuán)的直接接合可檢測(cè)地和可 辨別地標(biāo)記的，該熒光團(tuán)是例如異硫氰酸熒光素、別藻藍(lán)素、多甲藻素葉綠素蛋白、藻紅素、 BV421或菁藍(lán)5。在一些實(shí)施例中，富集神經(jīng)元的含量包括用對(duì)于下組中的至少一個(gè)具有選 擇性的抗體接觸來(lái)自一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞，從而形成一個(gè)抗體-細(xì)胞復(fù)合物，該組由以 下各項(xiàng)組成：HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、和⑶340,其中這些抗體被附接到可以被 一個(gè)磁場(chǎng)吸引或排斥的一個(gè)表面上；并且通過向這些細(xì)胞施加一個(gè)磁場(chǎng)從該細(xì)胞培養(yǎng)物選 擇性地分離所述抗體-細(xì)胞復(fù)合物。該富集可以大于4倍。
[0011] 在一些實(shí)施例中，一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物與結(jié)合到⑶200的一個(gè)第一抗體和結(jié)合到 HLA-A，HLA-B或HLA-C的一個(gè)第二抗體（即HLA-A、B、C抗體）接觸，并且方法進(jìn)一步包括 將該細(xì)胞培養(yǎng)物與包括⑶49f、⑶151或⑶340的一個(gè)第三抗體接觸并且針對(duì)是⑶200+和 HLA-A、B、或C_，并且還是⑶49Γ、⑶15?；颌?40 _的細(xì)胞進(jìn)行選擇。在一些實(shí)施例中，描述 了一種用于從衍生自多能干細(xì)胞中分離或富集神經(jīng)元的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：特異性結(jié)合到 CD200的一個(gè)第一抗體；特異性結(jié)合到一種蛋白的至少一個(gè)第二抗體，該蛋白選自下組，該 組由以下各項(xiàng)組成：111^4、!11^-8、!11^-(：、^49廠^151和^340，及其任意組合 ；一個(gè)包含 神經(jīng)元的細(xì)胞培養(yǎng)物和一個(gè)流式細(xì)胞儀，該流式細(xì)胞儀被配置成用于分選是CD200+并且還 是HLA-A\HLA-B'HLA-(T、CD49r、CD15r和CD34(T中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞。該第一和第二 抗體可以是熒光標(biāo)記的抗體。在一些實(shí)施例中，該第二抗體可以是一種磁標(biāo)記的抗體。
[0012] 在一個(gè)實(shí)施例中，用于識(shí)別在神經(jīng)分化培養(yǎng)物中的神經(jīng)元的細(xì)胞表面標(biāo)志特征物 是⑶200的高效表達(dá)，例如⑶200++或者⑶200 s，這兩者在本文中可互換地使用以表明細(xì)胞 是⑶200+細(xì)胞并且具有高于平均⑶200信號(hào)的表達(dá)。在另一些實(shí)施例中，細(xì)胞可以通過排 除低效表達(dá)的CD200(CD200 is )細(xì)胞進(jìn)行選擇。在一些實(shí)施例中，用于識(shí)別神經(jīng)元的該細(xì)胞 表面標(biāo)志特征物是 HLA-A7HLA-B7HLA-C7CD15l7CD49f7CD3407CD200+。在一些實(shí)施例中， 描述了一種用于在一個(gè)細(xì)胞群體中識(shí)別神經(jīng)元的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括：特異性結(jié)合到CD200 的一個(gè)第一抗體；特異性結(jié)合到包括HLA-A、HLA-B、和HLA-C的一組蛋白中的至少一種上 的一個(gè)第二抗體；特異性結(jié)合到包括⑶49f、⑶151和⑶340的一組蛋白中的至少一種上的 一個(gè)第三抗體；一個(gè)細(xì)胞樣本；以及一個(gè)流式細(xì)胞儀，該流式細(xì)胞儀被配置成用于識(shí)別是 CD200+和 HLA-A、Β、(Γ，并且還是 0)49Γ、ΟΗ5Γ或 CD34(T的細(xì)胞。
[0013] 附圖簡(jiǎn)要說明
[0014] 圖1描述了現(xiàn)有技術(shù)中用于神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元富集的細(xì)胞分選法。
[0015] 圖2示出了描述該發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的步驟的流程圖。
[0016] 圖3闡明了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，是一種用于神經(jīng)元富集的細(xì)胞分選法，該方法 無(wú)需富集神經(jīng)干細(xì)胞（NSC)的中間步驟。
[0017] 圖4描述了一個(gè)流程圖，示出了一種免疫表型篩選途徑，該途徑用于識(shí)別一個(gè)用 來(lái)分離衍生自分化中的多能干細(xì)胞培養(yǎng)物中神經(jīng)元的細(xì)胞表面特征物。
[0018] 圖5A和B描述了在圖4的篩選途徑中識(shí)別出的細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物和候選細(xì)胞表面標(biāo) 志物的熒光譜。
[0019] 圖6闡明了用于識(shí)別神經(jīng)元的門控策略，用來(lái)進(jìn)行細(xì)胞分選。
[0020] 圖7示出了分選之前的神經(jīng)分化培養(yǎng)物的影像，闡明了細(xì)胞培養(yǎng)物的異質(zhì)性。
[0021] 圖8示出了使用本發(fā)明的細(xì)胞表面標(biāo)志特征物分選自異質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的神經(jīng)元 的影像。
[0022] 圖9A示出了被分選的神經(jīng)元針對(duì)神經(jīng)元的標(biāo)志物β -III微管蛋白以及NSC標(biāo)志 物巢蛋白被染色的影像，其示出了這些細(xì)胞純度高。圖9Β示出了分選之前和之后的被分選 的神經(jīng)元的培養(yǎng)物的半定量流分析。
[0023] 圖10A-D示出了一系列在已分化的神經(jīng)元的流式細(xì)胞術(shù)分析期間生成的2D圖和 直方圖。
[0024] 圖IlA-D示出了在熒光激活細(xì)胞分選之前和之后一系列在已分化的神經(jīng)元的流 式細(xì)胞術(shù)分析期間生成的2D圖。
[0025] 圖12Α-Ε示出了在磁損耗之前和之后一系列在已分化的神經(jīng)元的流式細(xì)胞術(shù)分 析期間生成的2D圖和影像。
[0026] 詳細(xì)說明
[0027] 諸位發(fā)明人披露了提供用于分離并純化直接衍生自任何異質(zhì)細(xì)胞群體（例如包 含神經(jīng)玫瑰結(jié)的培養(yǎng)物）的神經(jīng)元的多種方法和系統(tǒng)。該神經(jīng)玫瑰結(jié)可以衍生自多種干細(xì) 胞群體，諸如誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（hiPSC)、胚胎干細(xì)胞（hESC)、或者成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0028] 所述方法和系統(tǒng)以在多能干細(xì)胞、神經(jīng)玫瑰結(jié)、神經(jīng)上皮以及神經(jīng)元中檢查各種 細(xì)胞粘附分子的表達(dá)譜為基礎(chǔ)。所研宄的分子之中，已經(jīng)證明結(jié)合CD200的陽(yáng)性選擇可以 陰性選擇!11^4、!11^-8、!11^-(：、^49廠^340或者^151中的一個(gè)或多個(gè)以識(shí)別、分離或者 富集來(lái)自一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的一個(gè)神經(jīng)元群體。這些分子中的一個(gè)或多個(gè)的某些表達(dá)變化可 能與從非定向細(xì)胞到神經(jīng)定向細(xì)胞的進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施例中，與針對(duì)CD200的抗體 相結(jié)合，針對(duì)這些分子111^4、!11^-8、!11^-(：、^49廠^340或者^151的一種或多種抗體提 供來(lái)自多能干細(xì)胞的神經(jīng)分化培養(yǎng)物的神經(jīng)元的識(shí)別，分離和/或富集。針對(duì)HLA-A、HLA-B 以及HLA-C的抗體可以是一個(gè)單一抗體，其選擇性結(jié)合全部三種蛋白質(zhì)，統(tǒng)稱為HLA-A、B、 Co
[0029] 本領(lǐng)域已知的以及對(duì)理解和實(shí)踐本發(fā)明可能有所幫助的定義和其他信息，包括 科學(xué)試驗(yàn)報(bào)告以及試劑，提供在貫穿始終所引用的對(duì)比文件中，尤其是袁等人，"用于分 離神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)以及衍生自人類多能干細(xì)胞的神經(jīng)元的細(xì)胞表面標(biāo)志特征物 (Cell-Surface Marker Signatures For The Isolation of Neural Stem Cells， Glia and Neurons Derived from Human Pluripotent Stem Cells) "（公共科學(xué)圖書館?綜合 2011.03.02 ;6 (3) :el7540)，其中FACS和基于圖像的免疫表型分析采用細(xì)胞表面標(biāo)志物的 抗體對(duì)天然人類胚胎干細(xì)胞（hESC)識(shí)別所預(yù)期的細(xì)胞表面特征物以用于從分離的神經(jīng)干 細(xì)胞中分離神經(jīng)膠質(zhì)和神經(jīng)元。
[0030] 圖1描述出了袁等人描述的從干細(xì)胞中誘導(dǎo)和分離神經(jīng)元的現(xiàn)有技術(shù)方法的示 意圖。天然人類胚胎干細(xì)胞（hESC)群體通過用SMD抑制劑（例如：SB431542,頭蛋白）進(jìn) 行處理而被培養(yǎng)和處理從而誘導(dǎo)神經(jīng)玫瑰結(jié)形成。然后，在一個(gè)生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，用一組用于 識(shí)別和分離神經(jīng)干細(xì)胞（NSC)的標(biāo)志物將神經(jīng)干細(xì)胞要么人工地要么流式細(xì)胞計(jì)數(shù)地從 這些細(xì)胞中分離出來(lái)。經(jīng)過包含腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子（BDNF)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子（GNDF)的神經(jīng)元分化培養(yǎng)基處理后，所分選的NSC繁殖很多代并分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠 質(zhì)的混合培養(yǎng)物。隨后，一個(gè)CD184+/CD447CD15is/CD24+的神經(jīng)元群體和一個(gè)CD184+/CD44+ 的神經(jīng)膠質(zhì)群體從衍生自分離的NSC的培養(yǎng)物中被純化。
[0031] 圖2示出了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的步驟，其中使用流式細(xì)胞術(shù)方法可以識(shí)別和 分離定向形成神經(jīng)元的神經(jīng)祖細(xì)胞，并且無(wú)需純化和分離神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明的諸多方面 包括培養(yǎng)能夠進(jìn)行神經(jīng)分化（例如：多能干細(xì)胞（hiPSC)、人類胚胎干細(xì)胞（hESC)、或者成 纖維細(xì)胞培養(yǎng)物）的細(xì)胞100。通過本領(lǐng)域任何已知的方式，例如一種或多種SMAD抑制劑 處理、基質(zhì)源誘導(dǎo)活性、或者無(wú)血清類胚體體法，這些細(xì)胞可以被誘導(dǎo)形成神經(jīng)上皮，包括 神經(jīng)玫瑰結(jié)110。通過該方法或者其他方法形成的神經(jīng)上皮可以進(jìn)一步被處理以進(jìn)一步誘 導(dǎo)分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)、星形膠質(zhì)細(xì)胞等。從該異質(zhì)混合物中誘導(dǎo)神經(jīng)元分化的處理 可以包括在一個(gè)包含BDNF、⑶NF以及單磷酸腺苷（AMP)、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF)、纖維母 細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)的培養(yǎng)基中進(jìn)行孵育120。諸如神經(jīng)元的細(xì)胞可以通過與所選擇的標(biāo) 志物，例如：⑶200, HLA-A，HLA-B，HLA-C，⑶49f，⑶151，⑶340或其任意組合，抗體接觸進(jìn)行 識(shí)別和/或分離130。所述細(xì)胞可以通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定進(jìn)行選擇或者分離140。
[0032] 通常地，在本方法中有用的生物學(xué)標(biāo)志物是那些能夠告知響應(yīng)于神經(jīng)分化誘導(dǎo)的 神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)的狀態(tài)的，以及可以有利地用于衍生自一個(gè)細(xì)胞異質(zhì)群體的細(xì)胞培養(yǎng)物的標(biāo) 志物。能夠告知神經(jīng)元發(fā)育途徑狀態(tài)的生物學(xué)標(biāo)志物，以舉例但并非限制的方式，包括細(xì)胞 表面蛋白，例如⑶200, HLA-A，HLA-B，HLA-C，⑶49f，⑶151以及⑶340。生物學(xué)標(biāo)志物還包 括編碼或者另外能夠指示前述的蛋白標(biāo)志物的RNA和DNA分子。在一些實(shí)施例中，一個(gè)細(xì) 胞培養(yǎng)物中的神經(jīng)元可以通過檢測(cè)樣本中CD200的存在來(lái)進(jìn)行識(shí)別，例如通過與特異性結(jié) 合到CD200的熒光標(biāo)記的抗體進(jìn)行接觸。在某些實(shí)施例中，除一種或多種來(lái)自下組的標(biāo)志 物的存在之外，對(duì)CD200的存在進(jìn)行測(cè)量，該組包括HLA-A，HLA-B，HLA-C，CD49f，CD151和 ⑶340,及其組合，例如HLA-A，HLA-B和/或HLA-C。在一些實(shí)施例中，基于被歸類為⑶200+ 細(xì)胞的并且還是!1^^^、!11^-8^1^-(7、0)49廠、0)151 _或0)340沖的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞對(duì) 神經(jīng)元進(jìn)行選擇。在一些實(shí)施例中，選擇是⑶200+的細(xì)胞并且還是HLA-A _、HLA-B_、HLA-C_、 ⑶49Γ、⑶15Γ或⑶340 -中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞，其中⑶200 +是可以被歸類為⑶200 +以及 ⑶200?的細(xì)胞，但不包括⑶200?的細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，神經(jīng)元可以通過用特異性結(jié)合 到CD200的一個(gè)第一抗體和特異性結(jié)合到一個(gè)蛋白（其中該蛋白選自下組，該組由以下各 項(xiàng)組成：HLA-A、HLA-B或者HLA-C)的至少一個(gè)第二抗體，以及特異性結(jié)合到一個(gè)蛋白（其 中該蛋白選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：⑶49f，⑶151或者⑶340)的至少一個(gè)第三抗體 接觸一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物；以及通過檢測(cè)是CD200+，并且還是HLA-A_，HLA-B_，HLA-C_，以及還有 ⑶49Γ、⑶15?；颌?4(K中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行識(shí)別。神經(jīng)元還可以通過選擇是 CD200+細(xì)胞的并且具有可檢測(cè)出的但低效表達(dá)的HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151和 CD340中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。
[0033] 在某些情況下，通過檢測(cè)用探針（例如，抗體）染色的細(xì)胞染色強(qiáng)度，一個(gè)樣本中 的細(xì)胞通過細(xì)胞表面（例如，在一些情況下，一個(gè)樣本中的⑶200+細(xì)胞被識(shí)別）上的一種或 多種蛋白質(zhì)的表達(dá)水平來(lái)進(jìn)行識(shí)別，該探針對(duì)一種感興趣的細(xì)胞表面蛋白（例如，CD200， HLA-A，HLA-B，HLA-C，⑶49f，⑶151，⑶340等）具有特異性。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解 所陳述的表達(dá)水平反映細(xì)胞表面上的標(biāo)志蛋白的可檢測(cè)出量。一個(gè)對(duì)染色（例如，CD20(T) 陰性的細(xì)胞（標(biāo)志物特異性試劑的結(jié)合水平不可檢測(cè)地不同于同型匹配對(duì)照）仍然可以表 達(dá)微量的該標(biāo)志物和/或其中可以存在微量的染色強(qiáng)度，這并非是由于蛋白質(zhì)的存在（例 如，"背景"染色）。并且，雖然稱細(xì)胞對(duì)某一特定標(biāo)志物為"陽(yáng)性"（+)或者"陰性"是 本領(lǐng)域的常用做法，但實(shí)際的表達(dá)水平是數(shù)量性狀。細(xì)胞表面上的分子數(shù)量可以隨著若干 對(duì)數(shù)處理（log)而變化，但仍然可以被稱為"陽(yáng)性"。例如，此處使用的術(shù)語(yǔ)"CD200+"可以 包含術(shù)語(yǔ)⑶200 ?#和⑶200?，但是不包含術(shù)語(yǔ)⑶200?或者⑶200'
[0034] 可以通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)控細(xì)胞的染色強(qiáng)度，其中激光器檢測(cè)熒光染料的量化水 平（其與由特異性試劑（例如，抗體）結(jié)合的細(xì)胞表面標(biāo)志物量成比例）。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)、 或FACS還可以用于基于結(jié)合到特異性試劑的強(qiáng)度、及其他參數(shù)如細(xì)胞大小和光散射來(lái)分 出細(xì)胞群體。盡管染色的絕對(duì)水平可以隨著具體熒光染料和試劑制品而不同，但是可以將 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照。
[0035] 為了將分布標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照，將每個(gè)細(xì)胞記錄為具有具體染色強(qiáng)度的一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。 可以根據(jù)對(duì)數(shù)標(biāo)度顯示這些數(shù)據(jù)點(diǎn)，其中測(cè)量單元是任意染色強(qiáng)度。在一個(gè)實(shí)例中，在樣本 中最亮的染色細(xì)胞可以比未染色（即，"陰性"）細(xì)胞強(qiáng)度高多達(dá)4個(gè)對(duì)數(shù)。當(dāng)以此方式顯 示時(shí)，明顯的是落入染色強(qiáng)度的最高對(duì)數(shù)內(nèi)的細(xì)胞是"陽(yáng)性""高"）的，而在最低強(qiáng)度中 的那些是"陰性"或"低"的。"低"陽(yáng)性染色細(xì)胞具有比同型匹配對(duì)照更亮的染色水平，但 是其不像通常在群體中發(fā)現(xiàn)的較亮染色細(xì)胞那么強(qiáng)烈。從最低強(qiáng)度到最亮強(qiáng)度，細(xì)胞可以 是"陰性"、"低"、"中等"（即，中間）、或"高"的。"中等"或"高"的細(xì)胞被認(rèn)為是"陽(yáng)性" 的。在一些情況下，"++"用于指示"高"而" + "用于指示"中等"，但兩種強(qiáng)度水平都被認(rèn)為 是"陽(yáng)性"。
[0036] 一種替代對(duì)照可以在表面上使用底物或具有限定的密度和/或強(qiáng)度的標(biāo)志物的 底物，例如構(gòu)造珠 （fabricated bead)或細(xì)胞系，這為一個(gè)或多個(gè)強(qiáng)度水平提供陽(yáng)性對(duì)照。
[0037] 可以通過任何常規(guī)技術(shù)進(jìn)行生物標(biāo)志物的測(cè)量。生物標(biāo)志物分子的測(cè)量可以包括 例如指示存在、濃度、表達(dá)水平、或任何其他與標(biāo)志物分子相關(guān)聯(lián)的值的測(cè)量。針對(duì)測(cè)量生 物標(biāo)志物分子，各種光譜技術(shù)是可用的，包括UV、可見的、以及紅外光譜。焚光標(biāo)記、放射性 標(biāo)記、或其他可易于識(shí)別的和量化的標(biāo)記可以用于幫助標(biāo)志物分子的測(cè)量。結(jié)合細(xì)胞的標(biāo) 志物的表達(dá)水平可以通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)技術(shù)測(cè)量。已描述了細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)用于通過 成像技術(shù)（如熒光激活細(xì)胞分選法（FACS))從來(lái)自多個(gè)物種的胚胎和成人組織識(shí)別和分離 許多神經(jīng)細(xì)胞類型。在優(yōu)選實(shí)施例中，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)可以用于使用本發(fā)明的方法對(duì)細(xì)胞進(jìn) 行識(shí)別和分選。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)是用于通過在液體流中對(duì)其進(jìn)行懸浮和捕獲在每個(gè)細(xì)胞通過 激光束時(shí)從其發(fā)出的光來(lái)統(tǒng)計(jì)和檢查顯微粒子（如細(xì)胞）的技術(shù)?？梢栽诹魇郊?xì)胞計(jì)數(shù)中 利用經(jīng)常被稱為"分化群"(CD)分子的細(xì)胞表面分子來(lái)表征細(xì)胞群體。例如，在熒光激活細(xì) 胞分選中，使用了診斷抗體（用熒光團(tuán)標(biāo)記），該診斷抗體結(jié)合到呈現(xiàn)在所討論的細(xì)胞群體 上的表面分子（例如，CD分子）并且表示所討論的細(xì)胞群體的特性。此后，由激光束激活 熒光團(tuán)（附接到抗體）并且由流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)。以此方式，熒光標(biāo)記的抗體可以 用于檢測(cè)和分選顯示特異性CD分子（或CD分子集）的細(xì)胞。通過舉例而不是限制性方式 用于與此或任何其他檢測(cè)方法一起使用的熒光團(tuán)包括異硫氰酸熒光素、別藻藍(lán)素、多甲藻 素葉綠素蛋白、藻紅素、以及菁藍(lán)5、BB421或任何其他可以共價(jià)接合到抗體上的熒光團(tuán)。本 發(fā)明的系統(tǒng)可以包括一個(gè)流式細(xì)胞儀，一個(gè)針對(duì)CD200具有特異性的、可檢測(cè)地標(biāo)記的抗 體，針對(duì)HLA-A、HLA-B或HLA-C、⑶49f、⑶340或⑶151中的一個(gè)或任何組合具有特異性 的、可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體或多個(gè)抗體，以及包括神經(jīng)元的一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物，從而使得可以檢 測(cè)這些蛋白中的一種或多種。在此所描述的多種方法和系統(tǒng)中所使用的流式細(xì)胞儀可以被 配置成用于檢測(cè)來(lái)自熒光標(biāo)記的抗體的低的、中等的和高的信號(hào)。結(jié)合信號(hào)強(qiáng)度所使用的 的具體抗體可以提供用于識(shí)別神經(jīng)元的特異性模式識(shí)別，該神經(jīng)元衍生自可以包括異質(zhì)細(xì) 胞群體的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0038] 本發(fā)明的細(xì)胞表面標(biāo)志物與已知蛋白家族有關(guān)。糖蛋白CD200是由廣泛范圍的細(xì) 胞類型所表達(dá)的膜蛋白。HLA-A、HLA-B、HLA-C、（可互換地是HLA-A、B、C)是組成主要組織 相容性復(fù)合物（MHC)的HLA蛋白分子。在全部脊椎動(dòng)物中，MHC是由大的基因家族所編碼 的細(xì)胞表面分子。針對(duì)HLA-A、B、C的抗體是結(jié)合到或者HLA-A、HLA-B或者HLA-C的抗體。 MHC分子介導(dǎo)是免疫細(xì)胞的白細(xì)胞（也稱作白血細(xì)胞（WBC))與其他白細(xì)胞或體細(xì)胞的相互 作用。針對(duì)⑶49f的抗體結(jié)合到是整聯(lián)蛋白α鏈α6的ITGA6蛋白產(chǎn)物上。整聯(lián)蛋白是 由一條α鏈和一條β鏈組成的完整的細(xì)胞表面蛋白。針對(duì)CD340的抗體結(jié)合到受體酪氨 酸激酶的表皮生長(zhǎng)因子（EGF)受體家族的一個(gè)成員上。針對(duì)CD151的抗體結(jié)合到已知與整 聯(lián)蛋白和其他跨膜4超家族蛋白進(jìn)行復(fù)合的細(xì)胞表面糖蛋白上。
[0039] 圖3圖解說明了本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，其中將天然人類胚胎干細(xì)胞（hESC)群體以 與袁等人相似的方式由SFEB通過SMD抑制來(lái)誘導(dǎo)形成神經(jīng)玫瑰結(jié)。在一些實(shí)施例中，可能 包括神經(jīng)祖細(xì)胞或注定會(huì)形成神經(jīng)元的細(xì)胞的任何細(xì)胞培養(yǎng)物可以用本發(fā)明的多種方法 和系統(tǒng)進(jìn)行處理?？梢杂帽景l(fā)明的多種方法或系統(tǒng)組合的細(xì)胞類型包括人類誘導(dǎo)性多能干 細(xì)胞（hiPSC)、人類胚胎干細(xì)胞（hESC)、或成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物、神經(jīng)玫瑰結(jié)、神經(jīng)元和神經(jīng) 膠質(zhì)。如在圖3中，當(dāng)用于誘導(dǎo)的細(xì)胞是神經(jīng)玫瑰結(jié)，這些細(xì)胞可以用將誘導(dǎo)神經(jīng)分化（如 神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)的形成）的培養(yǎng)基（例如，BNDF、GNDF和/或dbcAMP)來(lái)處理。培養(yǎng)基 可以包括試劑如N2或B27或任何其他試劑或本領(lǐng)域已知用于誘導(dǎo)神經(jīng)分化的方案。在本 發(fā)明的多種方法和系統(tǒng)中不需要神經(jīng)干細(xì)胞的純化、分離或分開的中間步驟。在誘導(dǎo)分化 的處理之后，可以通過將細(xì)胞培養(yǎng)物與選擇性地結(jié)合到CD200的抗體接觸來(lái)識(shí)別和/或分 離神經(jīng)元。在一些實(shí)施例中，可以通過將細(xì)胞與選擇性地結(jié)合⑶200的抗體和選擇性地結(jié) 合HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任意組合的一個(gè)或多個(gè)抗體接觸來(lái)針對(duì) 神經(jīng)元進(jìn)行選擇。在一些實(shí)施例中，這些抗體是通過與一個(gè)熒光團(tuán)的直接接合可檢測(cè)地和 可辨別地標(biāo)記的。識(shí)別可以是通過可以區(qū)分熒光信號(hào)（例如，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)）的任何成像 技術(shù)。可以在神經(jīng)分化誘導(dǎo)之后的任何時(shí)間（如在20、25、30或40天之后）用本發(fā)明的多 種系統(tǒng)處理細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)確保識(shí)別和/或分離了神經(jīng)元。因?yàn)榭梢允÷訬SC分離的步驟， 該方法有益地降低了達(dá)到細(xì)胞培養(yǎng)物中已富集的神經(jīng)元群體的時(shí)間。
[0040] 本發(fā)明的多種方法和系統(tǒng)可以與常規(guī)細(xì)胞分出技術(shù)結(jié)合使用來(lái)制備神經(jīng)元富集 的細(xì)胞培養(yǎng)物。富集可以基于是⑶200+或⑶200 s的細(xì)胞或是⑶200+#和⑶200? (即，排 除是CD200?的細(xì)胞）的細(xì)胞的選擇。在一些實(shí)施例中，選擇標(biāo)準(zhǔn)可以基于選擇是CD200+或 CD200++并且還是 HLA-A、B、C 'CD49r、CD15r或 CD34(T的細(xì)胞群體，例如 CD200 ++/HLA-A、B、 Γ。選擇可以用任何手段如通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)細(xì)胞分選發(fā)生。在一些實(shí)施例中，是HLA-A、 B、C+、⑶49f+、⑶151+或⑶340 +的細(xì)胞可以從細(xì)胞樣本中磁性地分選出來(lái)。磁性選擇可以包 括將細(xì)胞培養(yǎng)物與針對(duì)HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任意組合具有選擇 性的抗體接觸，其中這些抗體被附接到可以被磁場(chǎng)（如磁珠）吸引或排斥的表面上。在一 些實(shí)施例中，本發(fā)明的針對(duì)標(biāo)志物具有特異性的抗體進(jìn)一步包括磁珠，如含鐵的金屬材料。 優(yōu)選地，盡管可以使用任何類型的磁珠，但是磁珠是超順磁性微粒子?？梢杂萌魏问侄螌⒋?珠附接到抗體上?？梢栽诳贵w結(jié)合到感興趣的標(biāo)志物之前、或在細(xì)胞-抗體復(fù)合物的形成 之后附接磁珠。在一些實(shí)例中，在復(fù)合物的形成之前附接磁珠。在其中細(xì)胞-抗體復(fù)合物 具有磁珠并且抗體針對(duì)HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任意組合具有特異 性的實(shí)施例中，從包括神經(jīng)元的細(xì)胞培養(yǎng)物分出這樣的復(fù)合物優(yōu)選地包括將細(xì)胞培養(yǎng)物與 磁場(chǎng)接觸，這樣使得具有磁珠的細(xì)胞-抗體復(fù)合物基本上通過磁場(chǎng)保留并且神經(jīng)元基本上 不通過磁場(chǎng)保留。磁場(chǎng)的實(shí)例可以是磁化的鋼絲絨或流式細(xì)胞儀中的磁場(chǎng)。然后可以通過 使用針對(duì)CD200具有選擇性的抗體針對(duì)剩余細(xì)胞進(jìn)行選擇性地分選。本發(fā)明還包括其中 將細(xì)胞培養(yǎng)物分出為基本上不具有針對(duì)HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151、⑶340或其任 意組合是陽(yáng)性的細(xì)胞的第一細(xì)胞群體和具有針對(duì)神經(jīng)元的已富集的群體的第二細(xì)胞群體 的實(shí)施例。然后可以針對(duì)CD200+或CD200 ++細(xì)胞對(duì)第二細(xì)胞群體進(jìn)行選擇以用于進(jìn)一步富 集。本發(fā)明的多種方法可以產(chǎn)出近似2、4、6或10倍的富集值。
[0041] 本發(fā)明的系統(tǒng)可以包括細(xì)胞培養(yǎng)物（包括神經(jīng)元或神經(jīng)祖細(xì)胞）、特異性結(jié)合到 CD200的抗體和被配置成用于分選是CD200+的細(xì)胞的流式細(xì)胞儀。本發(fā)明的多種系統(tǒng)還 可以包括特異性結(jié)合到至少一種蛋白的第二抗體，該蛋白選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成： HLA-A、HLA-B、HLA-C、⑶49f、⑶151或⑶340,其中該系統(tǒng)可以包括針對(duì)2種或更多種、3種 或更多種、4種或更多種、5種或更多種、包括所有6種這些蛋白具有特異性的抗體（例如， 包括針對(duì)這6種不同蛋白中的每種具有特異性的抗體的系統(tǒng)），其中流式細(xì)胞儀被配置成 用于分選是⑶200+并且是HLA-A、B、C '⑶49Γ、⑶15?；颌?40 -中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞。 在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的這些系統(tǒng)還可以包括特異性結(jié)合到至少一種蛋白的第三抗體， 該蛋白選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成：⑶49f、⑶151或⑶340,其中流式細(xì)胞儀被配置成 用于分選是⑶200+和HLA-A、B、C -并且是⑶49f '⑶15?；颌?40 -中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞。 本發(fā)明的其他系統(tǒng)包括針對(duì)從hPSC的神經(jīng)分化培養(yǎng)物和來(lái)自成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)性神經(jīng)元 培養(yǎng)物的神經(jīng)細(xì)胞類型分離或富集的試劑、試劑盒（kit)和測(cè)定。本發(fā)明的多種方法和系 統(tǒng)可以用于針對(duì)衍生自患者的細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞類型分析的診斷工具。用于篩選藥物（或 小分子）的神經(jīng)細(xì)胞類型的富集作為用于衍生自異質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物組合物（如神經(jīng)玫瑰結(jié)、 hPSC或患者的細(xì)胞）的神經(jīng)細(xì)胞類型的候選。以下非限制性實(shí)例進(jìn)一步展示了本發(fā)明。
[0042] 實(shí)例
[0043] 實(shí)例 1
[0044] 從維塞公司（WiCell)(麥迪遜（Madison)，威斯康辛州（WI))獲得的H9hESC的培 養(yǎng)物是擴(kuò)增的細(xì)胞，然后對(duì)其進(jìn)行如下分化：
[0045] 第1天：通過用分散酶處理制作類胚體（EB)并將其放置在包含 10 μ mY-27632 (Rock 抑制劑）、2· 5 μ m Dorsomorphin、10 μ m SB43152 的無(wú)血清替換物 (knock-out serum replacement) (KOSR)培養(yǎng)基（標(biāo)準(zhǔn)WiCelI hESC培養(yǎng)基 w/o bFGF)中。 使用了低粘附6孔板并且每孔加入4ml的培養(yǎng)基。
[0046] 第2天：移除了 Rock抑制劑并且將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包含2. 5 μ m Dorsomorphiru 10 μ m SB43152的KOSR培養(yǎng)基中。
[0047] 第 4/5 天：在 ITS 培養(yǎng)基（+2. 5 μ m Dorsomorphin+10 μ m SB43152)中將 EB 涂板 在基質(zhì)膠涂覆的板上。將4ml的EB涂板在孔中并且將IOml的ITS培養(yǎng)基加入到IOcm涂 覆的板中。每2-3天喂養(yǎng)EB。
[0048] 第10/11天：細(xì)胞培養(yǎng)基變化為ITS。
[0049] 第15/18+天：培養(yǎng)基變化為ITS培養(yǎng)基+20ng/ml FGF，持續(xù)24-48小時(shí)。觀察到 細(xì)胞死亡和神經(jīng)元分化。
[0050] 第 18/20 天：使用生命技術(shù)公司（Life Technologies) StemPro? EZPassage? 傳代工具將正方形切割成培養(yǎng)物。刮掉并將正方形壓成丸。一個(gè)IOcm的培養(yǎng)物被涂板到兩 個(gè)在D-MEM/F-12w/GlutamaxTM培養(yǎng)基中涂覆有聚鳥氨酸和層粘連蛋白的T150燒瓶中。培 養(yǎng)基還包含 Iym dbcAMP+10ng/ml BDNF+10ng/ml ⑶NF。
[0051] 第40天：對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行分選分析并分析。圖4描述了此處使用的神經(jīng)元分離免疫 表型發(fā)現(xiàn)工作流程。神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)物用BD Lyoplate?人類細(xì)胞表面標(biāo)志物篩板進(jìn)行染色來(lái) 針對(duì)表面標(biāo)志物進(jìn)行篩選，并且然后用S0X1、S0X2、PAX6和DCX后續(xù)染色來(lái)使用細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志 物針對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行篩選。最終，分析細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)群體來(lái)確定針對(duì)來(lái)自細(xì)胞異質(zhì)群 體的神經(jīng)元的新的細(xì)胞表面標(biāo)志物。2D圖（圖5A)示出了被識(shí)別為神經(jīng)元的DCX +Soxr和 DCX+Soxl+群體。將分化培養(yǎng)物分析為能夠分離/富集神經(jīng)元。圖5B中示出的四個(gè)直方圖示 出了在屏幕中識(shí)別的在神經(jīng)元上差異性表達(dá)的各種標(biāo)志物的采樣，如與其他群體相比較。
[0052] 在近似于20psi處用100 μ m噴嘴分選神經(jīng)元。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中染色并在基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中收集細(xì)胞。圖6示出了門控策略用于從神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)物分選神經(jīng)元。以從左上側(cè)順時(shí) 針方向?qū)⑸窠?jīng)門識(shí)別為以下：基于光散射的ΡΓ細(xì)胞、基于光散射的P2 +P3_單個(gè)細(xì)胞，并且 基于⑶200和HLA-A、B、C表達(dá)，P4被識(shí)別為神經(jīng)元。還具有示出了在神經(jīng)元門P4 (⑶200+7 HLA-A' HLA-B' HLA-(T)中細(xì)胞的CD340和CD184表達(dá)的2個(gè)附加圖。
[0053] 圖7和圖8示出了分選前和分選后兩天的培養(yǎng)物的光學(xué)顯微鏡圖像?；谕庥^， 在分選后圖像中成像的神經(jīng)元性質(zhì)非常純凈。在圖7中觀察到的圓環(huán)樣結(jié)構(gòu)是包含NSC的 神經(jīng)上皮。從神經(jīng)集開始，識(shí)別神經(jīng)元投影。
[0054] 圖9A示出了分選后7天的、已分選的CD200++/HLA-A' HLA-B' HLA-Γ的熒光顯微 鏡圖像。在96孔成像板中以約50, 000細(xì)胞/孔分選和涂板這些細(xì)胞并且在包含IX N2和 IX B27的D-MEM/F-12w/Glutamax?培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天。通過β微管蛋白染色來(lái)識(shí)別神經(jīng) 元，污染的"非神經(jīng)元"通過巢蛋白染色來(lái)識(shí)別并且所有細(xì)胞核通過DAPI染色來(lái)識(shí)別。
[0055] 在圖9Β中示出的2D圖說明了緊接在細(xì)胞分選之前和緊接在細(xì)胞分選之后的神經(jīng) 細(xì)胞培養(yǎng)物的分析。左上門由"非神經(jīng)元"組成，如通過巢蛋白++/DCF染色所看到。在右上 方的門由神經(jīng)元組成，如通過巢蛋白+/DCX +染色所看到。這些圖指示已分選的神經(jīng)元培養(yǎng) 物為大約60 %純凈。
[0056] 實(shí)例 2
[0057] 圖10A示出了細(xì)胞培養(yǎng)和分化過程的概述。從由維塞公司（麥迪遜，威斯康辛州） 獲得的細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增H9hESC。然后將它們進(jìn)行如下分化：
[0058] 第7天：通過用分散酶制作類胚體（EB)并將其放置在包含10 μ mY-27632 (Rock抑 制劑）、2·5μπι Dorsomorphin、以及 ΙΟμπι SB43152 的 KOSR 培養(yǎng)基（標(biāo)準(zhǔn) WiCell hESC 培 養(yǎng)基w/o bFGF)中。使用了低粘附6孔板并且每孔加入4ml的培養(yǎng)基。
[0059] 第8天：移除了 Rock抑制劑并且培養(yǎng)基變化為包含2· 5 μ m Dorsomorphin、10 μ m SB43152的KOSR培養(yǎng)基。
[0060] 第 10/11 天：在 ITS 培養(yǎng)基（+2. 5 μπι Dorsomorphin+10 μπι SB43152)中將 EB 涂 板在基質(zhì)膠涂覆的板上。將4ml的EB涂板在孔中并且將IOml的ITS培養(yǎng)基加入到IOcm 涂覆的板中。每2-3天喂養(yǎng)EB。
[0061] 第15/11天：細(xì)胞培養(yǎng)基變化為ITS。
[0062] 第20/23天：培養(yǎng)基變化為ITS培養(yǎng)基+20ng/ml FGF，持續(xù)24-48小時(shí)。觀察到 細(xì)胞死亡和神經(jīng)元分化。
[0063] 第 23/25 天：使用生命技術(shù)公司（Life Technologies) StemPro? EZPassage? 傳代工具將正方形切割成培養(yǎng)物。一個(gè)10cm的培養(yǎng)物被涂板到兩個(gè)在D-MEM/F-12w/ Glutamax?培養(yǎng)基中涂覆有聚鳥氨酸和層粘連蛋白的T150燒瓶中，該培養(yǎng)基包含IX N2和 IX B27 連同 Ιμπι dbcAMP+10ng/ml BDNF+10ng/ml ⑶NF。
[0064] 第45天：對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行分選分析并分析。
[0065] 用DCX和Soxl對(duì)神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)物進(jìn)行染色從而提供針對(duì)神經(jīng)元分化的細(xì)胞內(nèi)對(duì) 照。圖10B示出了說明門控策略的2D圖。將DCX +Soxr和DCX +Soxl+群體定義為神經(jīng)元。 在屏幕中被識(shí)別的標(biāo)志物的重疊直方圖在圖10C中示出。CD200被識(shí)別為針對(duì)神經(jīng)元的陽(yáng) 性標(biāo)志物。^^4、!11^-8、!11^-(：、^151、^340和^49€被識(shí)別為培養(yǎng)物中污染的細(xì)胞的陰 性標(biāo)志物。這些標(biāo)志物的差異性表達(dá)可以允許神經(jīng)元分離。識(shí)別用于分選的標(biāo)志物的組合 的⑶200與HLA-A、HLA-B、HLA-C或⑶340或⑶49f的共染色結(jié)果在圖10D中的2D圖上示 出。
[0066] 圖IlA-D示出了用于從神經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)物分選神經(jīng)元的門控分析的結(jié)果。圖IlA 所描繪的圖示出了用于基于光散射分選細(xì)胞的散射辨別來(lái)解釋雙重辨別確保分析了基于 光散射的單個(gè)細(xì)胞。CD200++/HLA-A7HLA-B7HLA-r圖用于基于CD200和HLA-A、HLA-B或 HLA-C表達(dá)識(shí)別神經(jīng)元并且確認(rèn)使用DCX/S0X2/Ki67分析。圖IlB描繪了分選之前的神經(jīng) 培養(yǎng)物的流式分析。通過DCX的表達(dá)和Sox2和Ki-67的缺乏表達(dá)（DCX+Sox2_ki67_)來(lái)識(shí) 別神經(jīng)元。圖IlC描繪了神經(jīng)培養(yǎng)物的細(xì)胞分選之后的CD200 ++/HLA-A7HLA-B7HLA-C^ 胞的流式分析。通過DCX的表達(dá)、Sox2和ΚΓ67的缺乏表達(dá)（DCX+Sox2_ki67)來(lái)識(shí)別神經(jīng) 元。圖IlD描繪了神經(jīng)培養(yǎng)物的細(xì)胞分選之后的⑶200+/HLA-A、B、C +細(xì)胞的流式分析。通 過DCX的表達(dá)和Sox2和Ki67的缺乏表達(dá)（DCX+/Sox27ki67〇來(lái)識(shí)別神經(jīng)元。
[0067] 實(shí)例 3
[0068] 如以上所描述誘導(dǎo)神經(jīng)元形成。用以下抗體：PE CD340、PE HLA-A、B、C和PE CD49f 接觸細(xì)胞培養(yǎng)物。然后使這些細(xì)胞經(jīng)受磁性損耗。接合到結(jié)合PE的抗體的磁性納米粒子用 于結(jié)合在細(xì)胞培養(yǎng)物上使用的PE接合的抗體。然后通過將其緊挨磁場(chǎng)放置從細(xì)胞溶液分 出磁性納米粒子。然后通過流式細(xì)胞計(jì)數(shù)和圖像分析來(lái)分析已富集的和已損耗的部分。在 圖12A和12B中示出在磁性損耗之前（12A)和之后（12B)的神經(jīng)培養(yǎng)物圖像分析。對(duì)神經(jīng) 培養(yǎng)物進(jìn)行解離、用接合的抗體染色并且將其涂板在96孔成像板上并培養(yǎng)7天。通過Tujl 的表達(dá)和巢蛋白和Ki67的缺乏表達(dá)（Tujl+/巢蛋白7ki67〇來(lái)識(shí)別神經(jīng)元。將核用DAPI 進(jìn)行染色。損耗的部分的流式分析（圖12C)示出了通過DCX的表達(dá)和Sox2和Ki-67的缺 乏表達(dá)識(shí)別的神經(jīng)元群體。示出了損耗之前（12D)和損耗之后（12E)的樣本的2個(gè)圖。通 過DCX的表達(dá)和Sox2和Ki67的缺乏表達(dá)（DCX+/S〇x27ki67_)來(lái)識(shí)別神經(jīng)元。數(shù)據(jù)分析指 示在包括神經(jīng)元與磁性標(biāo)記的針對(duì)PE⑶340、PEHLA-A、B、C和PE⑶49f具有特異性的抗 體的細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞損耗將導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物中神經(jīng)元的富集。
[0069] 在此提出的所有專利、專利出版物、和其他已出版的參考通過引用以其全文特此 結(jié)合，如同每個(gè)已在此通過引用單獨(dú)地和特別地結(jié)合。盡管描述了本發(fā)明的優(yōu)選說明性 實(shí)施例，但是將對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是可以在其中進(jìn)行各種變化和修改而不偏離本發(fā) 明，并且在所附權(quán)利要求書中旨在覆蓋所有落入本發(fā)明的真實(shí)精神和范圍內(nèi)的這樣的變化 和修改。
【權(quán)利要求】
1. 一種在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中區(qū)分神經(jīng)元的方法，該方法包括： 用特異性結(jié)合到CD200的一個(gè)第一抗體和特異性結(jié)合到一種蛋白的至少一個(gè)第二抗 體接觸該細(xì)胞培養(yǎng)物，該蛋白選自下組，該組由W下各項(xiàng)組成出LA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、 CD151 和 CD：MO ;并且 檢測(cè)是CD200+細(xì)胞的并且還展示出HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151和CD340中的 一個(gè)或多個(gè)的低至陰性表達(dá)的細(xì)胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物包括人類誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞化iPSC)、 人類胚胎干細(xì)胞化EPSC)、神經(jīng)崎細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞或其任意組合。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物衍生自一個(gè)細(xì)胞異質(zhì)群體。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物包括神經(jīng)玫瑰結(jié)。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物包括神經(jīng)上皮。 ^
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該些CD200 +細(xì)胞是CD200 *等（CD20〇med)和CD200? (CD20〇hish)。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物不經(jīng)歷一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞富集步驟。
8. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該檢測(cè)細(xì)胞的步驟通過一個(gè)流式細(xì)胞儀來(lái)進(jìn)行。
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中該第一和第二抗體是通過與一個(gè)巧光團(tuán)的直接接合 可檢測(cè)地和可辨別地標(biāo)記的。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中該巧光團(tuán)選自下組，該組由W下各項(xiàng)組成；異硫氯 酸巧光素、別藻藍(lán)素、多甲藻素葉綠素蛋白、藻紅素、菁藍(lán)5和BV421。
11. 如權(quán)利要求1所述的方法進(jìn)一步包括富集是CD200 ++細(xì)胞的并且還是HLA-A \ HLA-B-、HLA-C-、CD49f-、CD15廠或CD340 -中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞群體。
12. -種在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中富集神經(jīng)元的含量的方法，該方法包括： 在包括神經(jīng)上皮的一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)神經(jīng)分化從而形成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)； 用特異性結(jié)合到CD200的一個(gè)第一抗體和特異性結(jié)合到一種蛋白的至少一個(gè)第二抗 體接觸該細(xì)胞培養(yǎng)物，該蛋白選自下組，該組由W下各項(xiàng)組成出LA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、 CD151 和 CD：M0 ;并且 流式細(xì)胞計(jì)數(shù)地選擇是CD200+細(xì)胞的并且還是HLA-A -、HLA-日-、HLA-C-、CD49f-、 CD15廠或CD340 -中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中從神經(jīng)上皮直接誘導(dǎo)神經(jīng)元形成。
14. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中是CD200 +的細(xì)胞不是CD200 ? (CD20〇i?)。
15. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該細(xì)胞培養(yǎng)物不經(jīng)歷一個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞富集步驟。
16. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該第一和第二抗體是通過與一個(gè)巧光團(tuán)的直接接 合可檢測(cè)地和可辨別地標(biāo)記的。
17. 如權(quán)利要求16所述的方法，其中該巧光團(tuán)選自下組，該組由W下各項(xiàng)組成；異硫氯 酸巧光素、別藻藍(lán)素、多甲藻素葉綠素蛋白、藻紅素、BV421和菁藍(lán)5。
18. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中富集神經(jīng)元的含量包括 用對(duì)于下組中的至少一個(gè)具有選擇性的抗體接觸來(lái)自一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞，從而形 成一個(gè)抗體-細(xì)胞復(fù)合物，該組由W下各項(xiàng)組成出LA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151、和 CD340,其中該些抗體被附接到可W被一個(gè)磁場(chǎng)吸引或排斥的一個(gè)表面上；并且 通過向該些細(xì)胞施加一個(gè)磁場(chǎng)從該細(xì)胞培養(yǎng)物選擇性地分出所述抗體-細(xì)胞復(fù)合物。
19. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該第一和第二抗體是巧光標(biāo)記的單克隆抗體。
20. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該富集大于4倍。
21. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中該第二抗體結(jié)合到HLA-A、HLA-B或HLA-(T并且進(jìn) 一步包括將該第二細(xì)胞培養(yǎng)物與包括CD49f、CD151或CD340的一個(gè)第=抗體接觸；W及 針對(duì)是 CD200+和 HLA-A -、HLA-B-、或 HLA-C-，并且還是 CD49f-、CD151-或 CD340 -的細(xì)胞 進(jìn)行選擇。
22. -種用于從一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物分離或富集神經(jīng)元的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括： 特異性結(jié)合到CD200的一個(gè)第一抗體； 特異性結(jié)合到一種蛋白的一個(gè)第二抗體，該蛋白選自下組，該組由W下各項(xiàng)組成： HLA-A、HLA-B、HLA-C、CD49f、CD151 和 CD：M0 ; 包括神經(jīng)元的一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)物；W及 一個(gè)流式細(xì)胞儀，被配置成用于分選是CD200+和HLA-A -、HLA-B-、HLA-C-、CD49f-、 CD15廠或CD340 -中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞。
23. 如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中該第一和第二抗體是巧光標(biāo)記的抗體。
24. 如權(quán)利要求22所述的系統(tǒng)，其中該第二抗體是用一種含鐵的金屬材料標(biāo)記的。
25. -種用于在一個(gè)細(xì)胞群體中識(shí)別神經(jīng)元的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括： 特異性結(jié)合到CD200的一個(gè)第一抗體； 特異性結(jié)合到一種蛋白的一個(gè)第二抗體，該蛋白選自下組，該組由W下各項(xiàng)組成： HLA-A、HLA-B 和 HLA-C ; 特異性結(jié)合到一種蛋白的一個(gè)第=抗體，該蛋白選自下組，該組由W下各項(xiàng)組成： CD49f、CD151 和 CD：M0 ; 一個(gè)細(xì)胞樣本；W及 一個(gè)流式細(xì)胞儀，被配置成用于識(shí)別是CD200+和HLA-A-、HLA-擴(kuò)或HLA-C-中的一個(gè)或 多個(gè)、并且還是CD49f、CD15廠或CD340 -中的一個(gè)或多個(gè)的細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK104471073SQ201380019615
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月16日
【發(fā)明者】克里斯汀·T·卡森, 喬迪·馬丁, 杰森·G·維達(dá)爾 申請(qǐng)人:貝克頓·迪金森公司