Ided納米結(jié)構(gòu)在核酸技術(shù)中的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及組合物，所述組合物包含具有已知特征的多孔性納米結(jié)構(gòu)和具有已知序列的核酸片段。本發(fā)明還提供了所述組合物的使用方法，例如用于DNA擴(kuò)增、檢測(cè)和DNA測(cè)序。
【專利說(shuō)明】IDED納米結(jié)構(gòu)在核酸技術(shù)中的用途
[0001] 巧關(guān)申請(qǐng)的簾叉引巧
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年2月19日申請(qǐng)的申請(qǐng)?zhí)枮?1/600,699的美國(guó)臨時(shí)專利的優(yōu) 先權(quán)，其通過(guò)引用整體并入本申請(qǐng)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明屬于核酸檢測(cè)和測(cè)序領(lǐng)域。
[0004]
[000引 目前的DNA檢測(cè)和測(cè)序技術(shù)主要是基于將DNA祀點(diǎn)置于襯底（例如網(wǎng)格或陣列） 上，W使得通過(guò)其在所述襯底上的位置對(duì)DNA的身份進(jìn)行識(shí)別。即使在使用納米球進(jìn)行DNA 測(cè)序的情況下，該些納米球仍只是作為DNA擴(kuò)增的運(yùn)載體，并且所述經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的DNA與納米 球仍被置于在圖形化的襯底上。
[0006] 因此，在本領(lǐng)域需要繼續(xù)開(kāi)發(fā)出用于DNA擴(kuò)增和檢測(cè)而不必需或不依賴襯底的新 方法。而且，當(dāng)前技術(shù)通常依賴于有限數(shù)量的用于DNA測(cè)序的可辨信號(hào)，例如僅利用4種不 同的英光顏色編碼4種單獨(dú)的核巧酸，如在利用合成技術(shù)的Illumina公司測(cè)序中和在太平 洋生物科學(xué)公司（Pacific Biosciences)的SMRT技術(shù)中。有時(shí)，所述檢測(cè)信號(hào)僅基于一種 類型的信號(hào)，例如來(lái)自454測(cè)序技術(shù)的焦磯酸測(cè)序的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。包括當(dāng)將電子信號(hào)用 于基于納米球的測(cè)序時(shí)和當(dāng)將抑變化用于離子激流技術(shù)中時(shí)，該些現(xiàn)有技術(shù)也只能一個(gè) 堿基一個(gè)堿基的對(duì)DNA進(jìn)行測(cè)序。因此，使通過(guò)更長(zhǎng)的堿基步長(zhǎng)進(jìn)行DNA測(cè)序成為可能的 方法可能對(duì)改善測(cè)序的準(zhǔn)確度、縮短測(cè)序時(shí)間、降低成本和增加通量大有禪益。
[0007] 發(fā)明概沐
[0008] 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及組合物，所述組合物包含具有已知特征的多孔性納米結(jié)構(gòu) 和具有已知序列的核酸片段。
[0009] 在某些實(shí)施方式中，所述多孔性納米結(jié)構(gòu)已在申請(qǐng)?zhí)枮?1/589,777的美國(guó)臨時(shí) 專利申請(qǐng)中被公開(kāi)（在本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)均整體并入本申請(qǐng)）。在某些實(shí)施方 式中，所述納米結(jié)構(gòu)包含至少一個(gè)嵌入于或者包被于低密度多孔性3-D結(jié)構(gòu)或包衣的核納 米粒子，其能夠攜帶或者在納米結(jié)構(gòu)中或表面結(jié)合至少一個(gè)有效載荷。
[0010] 在某些實(shí)施方式中，所述核納米粒子包括納米粒子或納米粒子簇。單一的核納米 粒子可W包括多個(gè)微型納米粒子或微型納米粒子簇。在簇中的納米粒子可W由相同組分或 不同組分制備。
[0011] 在某些實(shí)施方式中，所述核納米粒子包括例如超順磁性氧化鐵（SPI0)納米粒子 或非-SPI0納米粒子。所述非-SPI0納米粒子包括例如金屬納米粒子（例如金或銀納米粒 子）、金屬氧化物納米粒子、半導(dǎo)體納米粒子（例如具有單個(gè)或多個(gè)組分如CdSe/ZnS的量 子點(diǎn)、慘雜的無(wú)重金屬的量子點(diǎn)或其他半導(dǎo)體量子點(diǎn)）；聚合物納米粒子（例如由PLGA(聚 (乳酸共己醇酸）、PCL(聚己內(nèi)醋）、PEG(聚己二醇）或其他聚合物中的一種或組合制備的 粒子）；娃納米粒子；和非-SPI0磁性納米粒子（例如Mn化204、SAF和其他類型的磁性納 米粒子）。所述核納米粒子的直徑范圍為約1皿至約900皿（優(yōu)選尺寸為1-50皿、2-40皿、 5-20nm、Inm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、lOnm、1Inm、12nm、13nm、14nm、15nm、 16nm、17nm、18nm、19nm、20nm)。
[0012] 在某些實(shí)施方式中，所述核納米粒子具有球形、棒狀、四腳錐體、角錐體、多臂的、 納米管、納米線、納米纖維或納米板的形狀。
[0013] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)指密度至少比現(xiàn)有介孔材料（例 如孔徑范圍為2nm至50nm的介孔材料）低10多倍（例如10多倍、20多倍、30多倍、50多 倍、70多倍、100多倍、1000多倍、10, 000倍）的結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多 孔性3-D結(jié)構(gòu)具有<1. Og/cc(例如由0. Olmg/cc至lOOOmg/cc)的密度。在某些實(shí)施方式 中，所述密度由所述3-D結(jié)構(gòu)的干重除W該種3-D結(jié)構(gòu)在水溶液中的總體積確定。
[0014] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)域具有較高的多孔性。該種低密 度結(jié)構(gòu)進(jìn)一步指在結(jié)構(gòu)上具有至少40%至至少99. 9% (優(yōu)選50%至99. 9%)的空白空 間或空隙率的結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，至少80%的孔在孔隙半徑上具有的尺寸為Inm至 500nm。
[0015] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)是在透射電子顯微鏡下不能明 顯地觀察到或基本上不可見(jiàn)的結(jié)構(gòu)，例如即使當(dāng)所述低密度結(jié)構(gòu)的特征性尺寸在10多或 100多納米范圍內(nèi)時(shí)。
[0016] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)由含有娃的分子制備（例如娃 焼、有機(jī)娃焼、焼氧基娃焼、娃酸鹽及其衍生物）。例如，所述含有娃的分子可W是氨基-丙 基H甲氧基娃焼、琉基-丙基-H甲氧基娃焼、駿基-丙基-H甲氧基娃焼、氨基-丙基-H 己氧基娃焼、琉基-丙基-二己氧基娃焼、駿基-丙基-二己氧基娃焼、雙-巧-(二己氧基 娃基）丙基]-四硫化物、雙-巧-(H己氧基娃基）丙基]-二硫化物、氨基丙基H己氧基娃 焼、N-2-(氨基己基）-3-氨基丙基二甲氧基娃焼、己帰基二甲氧基娃焼、己帰基-二（2-甲 氧基己氧基）娃焼、3-甲基丙帰醜氧基丙基H甲氧基娃焼、2-(3, 4-環(huán)氧環(huán)己基）-己基H 甲氧基娃焼、3-環(huán)氧丙基-丙基二己氧基娃焼、3-異氛酸基丙基二己氧基娃焼、3-氛酸基丙 基H己氧基娃焼和娃酸軸。
[0017] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)與所述核納米粒子通過(guò)分子內(nèi) 相互作用（例如共價(jià)鍵、金屬鍵和/或離子鍵）或分子間相互作用（例如氨鍵和/或非共 價(jià)鍵）結(jié)合。
[0018] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的交聯(lián)涂層，其厚度范圍 為Inm至lOOOnm(例如Inm至500nm)。在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu) 的厚度是可控的，其能夠攜帶的有效載荷的數(shù)量也是可控的。其結(jié)果是，所述納米結(jié)構(gòu)當(dāng)作 為注射劑系統(tǒng)給藥進(jìn)入活體主體的血液時(shí)其能夠累積在疾病部位如腫瘤或炎癥病灶。在某 些實(shí)施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠攜帶或結(jié)合一個(gè)或多個(gè)有效載荷。在某些實(shí)施方式中， 所述納米結(jié)構(gòu)攜帶或結(jié)合的有效載荷包括但不限于可檢測(cè)劑（例如英光分子、化學(xué)發(fā)光分 子、生物發(fā)光分子、放射性同位素、MRI造影劑、CT造影劑、酶底物標(biāo)記和/或染色劑）、祀向 部分（例如抗體、抗原、配體、適體、膚、核酸、多核巧酸、多糖、糖、脂肪酸、類固醇、嚼巧和/ 或半抗原）、結(jié)合伴侶（例如抗原、抗體、受體、配體、DNA、RNA、膚、適體、生物素、親和素、鏈 霉親和素、凝集素、碳水化合物、蛋白A、抗體化、脫硫生物素和/或亞氨基生物素）、生物活 性劑（例如治療劑、蛋白、抗體、膚、核酸、酶、熱響應(yīng)分子、光響應(yīng)分子、電子響應(yīng)分子、磁響 應(yīng)分子、抑響應(yīng)分子、酶響應(yīng)分子和/或化合物）、藥物、治療劑、放射劑、化療劑、小分子藥 物、生物藥物（例如膚、蛋白、抗體、抗原、核酸、適體等）及其組合，其能夠用于成像、檢測(cè)、 研究、監(jiān)測(cè)、評(píng)估、篩選疾病、病情和/或相關(guān)的生物事件。在某些實(shí)施方式中，所述納米結(jié) 構(gòu)包括第一有效載荷和第二有效載荷。
[0019] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及組合物，所述組合物包含第一 IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)和 第一段核酸，其中所述核酸與所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合。
[0020] 在某些實(shí)施方式中，所述核酸是引物、探針或DNA片段。
[0021] 在某些實(shí)施方式中，所述組合物還包含磁性粒子，其中所述磁性粒子與所述第一 核酸的一端結(jié)合并且所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與所述第一核酸的另一端結(jié)合。
[0022] 在某些實(shí)施方式中，所述第一納米結(jié)構(gòu)是磁性的。
[0023] 在某些實(shí)施方式中，所述組合物還包含第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)和第二核酸，其 中所述第二核酸與所述第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合并且其與所述第一核酸互補(bǔ)，并且 其中所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)不是所述第一納米結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，所述第二納米結(jié) 構(gòu)是磁性的。
[0024] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及混合物，所述混合物包含第一 IDed納米結(jié)構(gòu)和第二 IDed納米結(jié)構(gòu)，其中所述第一 IDed納米結(jié)構(gòu)與第一核酸結(jié)合，并且所述第二IDed納米結(jié)構(gòu) 與第二核酸結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述第一和第二納米結(jié)構(gòu)均是磁性的。在某些實(shí)施 方式中，所述混合物還包含第H IDed納米結(jié)構(gòu)，其中所述第H IDed納米結(jié)構(gòu)與第H核酸結(jié) 合并且其與所述第一或第二核酸互補(bǔ)。在某些實(shí)施方式中，所述第H納米結(jié)構(gòu)是磁性的。
[0025] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在樣品或主體中檢測(cè)病情的方法，所述方法包括；將來(lái) 自所述樣品或所述主體的DNA片段與本申請(qǐng)所述的組合物雜交，并且檢測(cè)在所述IDed納米 結(jié)構(gòu)中雙鏈DNA的存在情況，所述雙鏈DNA的存在情況表明在所述樣品或主體中的病情的 存在情況。
[0026] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在樣品或主體中檢測(cè)病情的方法，所述方法包括；在溶 液中將來(lái)自所述樣品或所述主體的DNA片段與本申請(qǐng)所述的組合物雜交，將單鏈核酸內(nèi)切 酶加入所述溶液中，將所述溶液置于磁場(chǎng)中，并且檢測(cè)IDed納米結(jié)構(gòu)編碼信號(hào)的存在情 況，所述編碼信號(hào)的存在情況表明在所述樣品或主體中的病情的存在情況。
[0027] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及同時(shí)檢測(cè)溶液中的多種IDed納米結(jié)構(gòu)的編碼信號(hào)的方 法，所述方法包括；將源于溶液的光線通過(guò)微透鏡陣列導(dǎo)向光傳感器陣列，其中所述溶液含 有多種IDed納米結(jié)構(gòu)，并且處理所述光數(shù)據(jù)W鑒定溶液中的各種IDed納米結(jié)構(gòu)。
[0028] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及檢測(cè)表面上的多種IDed納米結(jié)構(gòu)的編碼信號(hào)的方法， 所述方法包括：將所述多種IDed納米結(jié)構(gòu)由溶液中聚集到所述表面上。在某些實(shí)施方式 中，所述聚集基于化學(xué)相互作用或基于磁性相互作用。在某些實(shí)施方式中，所述組合物的 IDed納米結(jié)構(gòu)在外加磁場(chǎng)存在的條件下被聚集為有序陣列的形式。
[0029] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及檢測(cè)核酸與檢測(cè)劑相互作用的方法，其中所述核酸與具 有第一編碼信號(hào)的第一 IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，并且所述檢測(cè)劑與具有第二編碼信號(hào) 的第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，所述方法包括；將所述第一 IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與所述 第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)接觸，并且檢測(cè)所述第一編碼信號(hào)與所述第二編碼信號(hào)的相互 作用。在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括將所述第一和所述第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)從 溶液中聚集到表面上。
[0030] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及形成擴(kuò)增的DNA序列的方法，所述方法包括：在存在模 板DNA及IDed納米結(jié)構(gòu)混合物的條件下延伸引物，其中各個(gè)IDed納米結(jié)構(gòu)與獨(dú)特的編碼 及兩個(gè)或H個(gè)相鄰核巧酸的獨(dú)特組合結(jié)合。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1對(duì)包含多個(gè)有效載荷（點(diǎn)）的多孔性納米結(jié)構(gòu)與致密納米結(jié)構(gòu)（黑色網(wǎng)狀物， 右圖）的示意性比較。
[003引圖2金核尺寸為約20nm和流體力學(xué)尺寸為約60nm的娃焼化的金納米粒子的示例 性透射電子顯微鏡（TEM)圖像。從TEM圖中未見(jiàn)含娃的涂層。
[0033] 圖3納米粒子核尺寸為約6nm和流體力學(xué)尺寸為約200nm的娃焼化的量子點(diǎn)的示 例性TEM圖像。TEM中無(wú)明顯可見(jiàn)的含娃涂層。
[0034] 圖4本領(lǐng)域公知的涂覆納米粒子的示例性TEM圖像，其中在TEM中明顯可見(jiàn)所述 涂層。
[003引圖5多孔性納米結(jié)構(gòu)的示例性TEM圖像，其中顯示了大核納米粒子的直徑。
[0036] 圖6對(duì)每個(gè)測(cè)序步長(zhǎng)為1個(gè)核巧酸（左圖）和每個(gè)測(cè)序步長(zhǎng)為2個(gè)核巧酸的DNA 編碼進(jìn)行比較的圖示。
[0037] 圖7利用IDed納米結(jié)構(gòu)檢測(cè)來(lái)自組織或生物樣品的DNA片段的圖示。
[0038] 圖8利用磁性IDed納米結(jié)構(gòu)檢測(cè)來(lái)自組織或生物樣品的DNA片段的圖示。
[0039] 圖9IDed納米結(jié)構(gòu)在英光顯微鏡下的圖像。所述IDed納米結(jié)構(gòu)包含了顯示紅色、 綠色和黃色的不同的英光分子。
[0040] 圖10利用IDed納米結(jié)構(gòu)檢測(cè)DNA鏈的雜交情況的圖示。對(duì)于IDed納米結(jié)構(gòu)而 言，ID和粒子上的DNA鏈能夠配對(duì)。所述ID信號(hào)直接對(duì)應(yīng)于特異性的DNA序列。例如，女口 果紅色和綠色I(xiàn)Ded納米結(jié)構(gòu)通過(guò)所述DNA雜交結(jié)合在一起，則在紅色粒子上所述DNA的已 知序列能夠用于推斷/檢測(cè)綠色粒子上的DNA序列。
[0041] 圖11使用IDed納米結(jié)構(gòu)的DNA雜交。（a)對(duì)照實(shí)驗(yàn)的圖像；不具有DNA寡聚物 的紅色和綠色納米結(jié)構(gòu)的混合物?；?-(m)DNA雜交結(jié)果；紅色和綠色I(xiàn)Ded納米結(jié)構(gòu)分別 與互補(bǔ)的DNA寡聚鏈綴合，并且成功的雜交表現(xiàn)為紅色和綠色I(xiàn)Ded納米結(jié)構(gòu)的結(jié)合。
[0042] 圖12為了進(jìn)行基于DNA雜交鑒定的檢測(cè)，可W將IDed英光磁性納米結(jié)構(gòu)散布在 磁性網(wǎng)格上。通過(guò)檢測(cè)在溶液中通過(guò)DNA雜交連接IDed英光磁性納米粒子而形成的所述 納米結(jié)構(gòu)，利用所述IDed英光磁性納米粒子來(lái)鑒定DNA的雜交。該些結(jié)構(gòu)在溶液中形成， 并且散布于使用磁性網(wǎng)格的2D表面上。通過(guò)使所述溶液流過(guò)所述磁性網(wǎng)格，將IDed英光 磁性納米粒子或納米結(jié)構(gòu)捕獲并散布在用于鑒定的表面上。（a)對(duì)照實(shí)驗(yàn)；混合不具有DNA 寡聚物的紅色和綠色I(xiàn)Ded磁性納米結(jié)構(gòu)，并且相應(yīng)地觀察到可W忽略不計(jì)的紅色和綠色 粒子結(jié)合在一起（黃色）?；?DNA雜交結(jié)果；紅色和綠色I(xiàn)Ded磁性納米結(jié)構(gòu)分別與互補(bǔ)的 DNA寡聚鏈綴合，并且在磁性網(wǎng)格上所述納米結(jié)構(gòu)更加緊密地堆積在一起，并顯示出黃色。
[0043] 圖13利用IDed磁性納米結(jié)構(gòu)檢測(cè)第一 DNA鏈和第二DNA鏈與第H DNA鏈雜交的 圖示，其中所述第一 DNA鏈與所述第H DNA鏈的第一部分雜交，并且所述第二DNA鏈與所述 第H DNA鏈的第二部分雜交。
[0044] 發(fā)明詳沐
[0045] 在對(duì)本申請(qǐng)進(jìn)行更加詳細(xì)的描述之前，應(yīng)理解本申請(qǐng)不限于所描述的特定實(shí)施方 式，并且其當(dāng)然是可W改變的。還應(yīng)理解本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述特定實(shí)施方式的 目的，并不旨在限制，因?yàn)楸旧暾?qǐng)的范圍僅由所附的權(quán)利要求限定。
[0046] 在提供數(shù)值范圍時(shí)，除非上下文另有明示，應(yīng)理解在該范圍的上限和下限之間的 精確到下限單位的十分之一的每個(gè)居間值，和在所述范圍內(nèi)的任何其他提及的數(shù)值或居間 值，都被包括在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)。該些更小范圍的上限和下限可W獨(dú)立地包括在更小的范 圍中，并且也被包括在本申請(qǐng)的范圍內(nèi)，除非所述范圍中任何特定排除的極限值。在所述 的范圍包括一個(gè)或兩個(gè)極限值時(shí)，排除一個(gè)或兩個(gè)極限值的范圍也被包括在本申請(qǐng)的范圍 內(nèi)。
[0047] 除非另有定義，本申請(qǐng)中使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有的含義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域一般 技術(shù)人員通常理解的含義相同。雖然與本申請(qǐng)中所述的方法和材料類似或等價(jià)的任何方法 和材料也可用于本申請(qǐng)的實(shí)踐或試驗(yàn)，但是W下描述優(yōu)選的方法和材料。
[004引在本說(shuō)明書中引用的所有出版物和專利都通過(guò)引用并入本申請(qǐng)，相當(dāng)于每篇出版 物或?qū)＠继貏e地和單獨(dú)地被指出通過(guò)引用并入，并且其通過(guò)引用并入本申請(qǐng)W披露和描 述與所引用的出版物有關(guān)的方法和/或材料。所引用的任何出版物均在本申請(qǐng)?zhí)峤蝗罩?公開(kāi)，但所述引用不應(yīng)理解為由于所述出版物是在先公開(kāi)而承認(rèn)本申請(qǐng)的發(fā)明不早于該些 公開(kāi)。而且，所提供的
【公開(kāi)日】可能不同于實(shí)際的
【公開(kāi)日】，其可能需要單獨(dú)確認(rèn)。
[0049] 本領(lǐng)域技術(shù)人員在閱讀本申請(qǐng)后將理解，本申請(qǐng)中所描述和解釋的各個(gè)實(shí)施方式 均具有獨(dú)立的組成和特性，在不脫離本申請(qǐng)范圍或主旨的前提下，可W容易地將其分離或 者與任意其他若干實(shí)施方式的特性組合。任何所述的方法均可W所敘述的事件順序或者邏 輯上可能的任何順序進(jìn)行。
[0050] 除非另有明示，本申請(qǐng)的實(shí)施方式將采用化學(xué)、固態(tài)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)、有機(jī)化學(xué)、物 理化學(xué)、分析化學(xué)、材料化學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、分子生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、藥理學(xué)、成像 等技術(shù)，其均在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)。在文獻(xiàn)中對(duì)該些技術(shù)進(jìn)行了充分闡述。
[0051] 在對(duì)本申請(qǐng)的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述前，除非另有明示，應(yīng)理解本申請(qǐng)不僅限于 特定材料、試劑、反應(yīng)原料、生產(chǎn)工藝等，其是可W改變的。還應(yīng)理解在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ) 僅用于說(shuō)明特定實(shí)施方式的目的，并不旨在限制?？蛇壿嬌峡赡艿牟煌樞驁?zhí)行本申 請(qǐng)中的步驟也是可能的。
[0052] 給出下述實(shí)施方式W便向本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員完整的披露和描述本申請(qǐng)所公 開(kāi)和要求保護(hù)的方法是如何進(jìn)行的W及探針是如何使用的。要努力確保數(shù)字的準(zhǔn)確度（例 如量、溫度等），但是應(yīng)考慮一些誤差和偏差。
[0053] 需要指出的是，如用于本說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中的，單數(shù)形式"一（a)"、" 一個(gè) (an)"和"該/所述（the)"包括復(fù)數(shù)主體，除非上下文另有明示。因此，例如"化合物"包 括多個(gè)化合物。在本說(shuō)明書和上文中的權(quán)利要求中，將對(duì)多個(gè)術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定義使其具有下述 含義W供參考，除非具有明顯相反的意圖。
[0054] 多孔性納米結(jié)構(gòu)
[0055] 本申請(qǐng)的一個(gè)方面涉及多孔性納米結(jié)構(gòu)，其包括被嵌入或涂覆低密度、多孔性3-D 結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)核納米粒子。
[0056] 本申請(qǐng)使用的核納米粒子包括但不限于超順磁性氧化鐵（SPIO)納米粒子和 非-SPI0納米粒子。
[0057] SPI0納米粒子是氧化鐵納米粒子，其為磁赤鐵礦（Y -Fe2〇3)或磁鐵礦（Fe3〇4)， 或由該兩相組成的納米粒子。SPIO可W使用適宜的方法合成并且W膠狀溶液的形式分 散在有機(jī)溶劑或水中。合成SPI0納米粒子的方法是本領(lǐng)域公知的（參見(jiàn)例如Modeza Mahmoudi 等，Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles:Synthesis,Surface Engineering, Cytotoxicity and Biomedical Applications, Nova Science Pub Inc 出 版，2011)。在一個(gè)實(shí)施方式中，可W通過(guò)濕化學(xué)合成方法制備SPIO納米粒子，所述方法 涉及在存在堿性介質(zhì)的條件下將化"和化鹽共沉淀。在合成過(guò)程中，可W引入氮?dú)釽 控制氧化，可W加入表面活性劑和適宜的聚合物W抑制團(tuán)聚或控制粒子尺寸，和/或可 W使用乳劑（如油包水微乳）W調(diào)節(jié)SPI0納米粒子的物理性質(zhì)（參見(jiàn)例如化nathan W. Gunn, The preparation and characterization of superparamagnetic nanoparticles for biomedical imaging and therapeutic application,ProQuest 出片反，2008)。在另一 個(gè)實(shí)施方式中，可W通過(guò)單獨(dú)使用五撰基鐵或與過(guò)渡態(tài)金屬撰基合物聯(lián)合熱解的方法產(chǎn)生 SPI0納米粒子，任選地在存在一種或多種表面活性劑（例如月桂酸和油酸）和/或氧化劑 (例如H甲胺-N-氧化物）的條件下W及在適宜溶劑中（例如二辛基離或十六焼）（參見(jiàn)例 如US專利申請(qǐng)20060093555)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，SPI0納米粒子還可W通過(guò)氣體沉積法 制備，所述方法涉及在含有不同濃度氧氣的氮?dú)夥障聦㈣F激光蒸發(fā)（參見(jiàn)Miller J.S.等， Magnetism:Nanosized magnetic materials, Wiley-VCH 出片反，2002)。
[0058] 在某些實(shí)施方式中，SPIO納米粒子是US專利申請(qǐng)US20100008862中所公開(kāi)的那 些。
[0059] 非-SPIO納米粒子包括例如金屬納米粒子（例如金或銀納米粒子（參見(jiàn)例如 Hiroki Hiramatsu,F.E.O.,Qiemistry of Materials 16, 2509-2511 (2004)))，半導(dǎo)體納米 粒子（例如具有單個(gè)或多個(gè)組分如CdSe/ZnS的量子點(diǎn)（參見(jiàn)例如M. Bruchez等，science 281, 2013-2016 (1998))、慘雜的無(wú)重金屬的量子點(diǎn)（參見(jiàn)例如Narayan Pra化an等，J. Am. chem.Soc. 129,3339-3347(2007))或其他半導(dǎo)體量子點(diǎn)）；聚合物納米粒子（例如由 PLGA(聚（乳酸共己醇酸）（參見(jiàn)例如 Minsoung 化ee 等，Adv. Mater. 23, H79-服3(2011))、 PCL (聚己內(nèi)醋）（參見(jiàn)例如 Marianne L油et 等，Chem. Soc. Rev. 38, ：M84-3504 (2009))、 PEG (聚己二醇）或其他聚合物中的一種或組合制備的粒子）；娃納米粒子；和 非-SPIO磁性納米粒子（例如胞化2〇4(參見(jiàn)例如Jae-Hyun Lee等，Nature Medicine 13, 95-99(2006))、合成反鐵磁性納米粒子（SAF)(參見(jiàn)例如A.化等，Angew. Qiem. Int. Ed. 48, 1620-1624(2009))和其他類型的磁性納米粒子）。
[0060] 可W使用本領(lǐng)域公知的適宜方法制備或合成非-SPIO納米粒子，例如溶膠-凝膠 合成法、油包水微乳法、氣體沉積法等。例如，金納米粒子可W通過(guò)使用還原劑如巧樣酸鹽 或丙麗二駿酸由氯金酸鹽溶液（HAuCL)還原制備。又例如，CdS半導(dǎo)體納米粒子可W在二 氧化娃粒子表面上由Cd(Cl〇4)2和NasS制備。又例如，II-VI半導(dǎo)體納米粒子可W在注入 熱配位溶劑后基于有機(jī)金屬試劑如二甲基領(lǐng)和H辛基砸化麟的高溫?zé)峤夂铣桑▍⒁?jiàn)例如 Gunter Schmid, Nanoparticles:From Theory to Application, John Wiley&Sons 出片反， 2011)。慘雜的無(wú)重金屬的量子點(diǎn)例如慘雜Mn的化Se量子點(diǎn)可W使用成核慘雜策略制備， 其中在高溫下形成小尺寸的MnSe納米簇作為核并且化Se層涂覆在核上。又例如，可W通 過(guò)在雙相溶劑系統(tǒng)中乳化聚合物制備聚合納米粒子，包括通過(guò)超聲或勻質(zhì)得到納米級(jí)的聚 合物小滴，并蒸發(fā)有機(jī)溶劑W獲得納米粒子。又例如，娃質(zhì)納米粒子可W由溶膠-凝膠合成 制備，其中在存在酸或堿催化劑的條件下在水和己醇的混合物中水解焼氧基娃前體（例如 TMOS或TEOS)，通過(guò)劇烈攬拌濃縮水解得到的單體，并收集所得到的二氧化娃納米粒子。又 例如，非-SPIO磁性納米粒子SAF可W在高真空下使用離子束沉積法制備，在無(wú)磁性空間層 (例如釘金屬）的兩側(cè)沉積鐵磁性層及化學(xué)蝕刻銅釋放層和保護(hù)性粗表面層，并且在除去 保護(hù)性層和選擇性蝕刻銅后能夠釋放SAF納米粒子。
[0061] 核納米粒子的尺寸范圍為尺寸為1皿至100皿（優(yōu)選尺寸為1-50皿、2-40皿、 5-20nm、lnm、2nm、3nm、4nm、5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、lOnm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、 16nm、17nm、18nm、19nm、20nm)。可W通過(guò)選擇適宜的合成方法和/或系統(tǒng)控制納米粒子的 尺寸。例如，為控制納米粒子的尺寸，可W在極性溶劑中進(jìn)行納米粒子的合成，所述極性 溶劑提供了能夠吸附在納米粒子表面上的離子種類，從而提供有助于穩(wěn)定納米粒子并且 抑制納米粒子生長(zhǎng)的靜電作用和粒子間的排斥力。又例如，可W在微異質(zhì)系統(tǒng)中合成納 米粒子，所述微異質(zhì)系統(tǒng)使得納米粒子在被束縛的腔或結(jié)構(gòu)域中劃分。該種微異質(zhì)系統(tǒng) 可W包括液晶、單和多層、直接膠束、反向膠束、微乳和囊泡。為獲得所需尺寸范圍內(nèi)的納 米粒子，可W適當(dāng)控制或改變合成條件W提供例如所需的溶液濃度或所需的腔范圍（詳 細(xì)的綜述可 W參見(jiàn)例女口 Vincenzo Liveri, Controlled synthesis of nanoparticles in microheterogeneous systems, Springer 出片反，2006)。
[0062] 核納米粒子的形狀可W是球形、立方形、棒狀（參見(jiàn)例如A.化等， Nano Letters, 7, 179-182(2007))、四腳錐形（參見(jiàn)例如 L. Manna 等，化1:腳6 Materials, 2, 382-385(2003))、角錐體、多臂的、納米管、納米線、納米纖維或納米板或任 意其他適宜的形狀。在制備過(guò)程中控制納米粒子形狀的方法是本領(lǐng)域公知的（參見(jiàn)例 女口 Waseda Y.等，Morphology control of materials and nanoparticles:advanced materials processing and characterization. Springer 出片反，2004)。例女口，當(dāng)由自下而 上的工藝（即由分子至納米粒子）制備納米粒子時(shí)，可W加入強(qiáng)烈吸附于特定晶面上的形 狀控制物控制所述粒子的生長(zhǎng)速率。
[0063] 單一核納米粒子可W包括單一納米粒子或者多個(gè)或微納米粒子簇(A.化等，J. Am. chem. Soc. 126, 10832-10833 (2004)，J. Ge 等，Angew. Qiem. Int. Ed. 46,似42-4345 (2007)， 化enda Lu等，Nano Letters 11,3404-3412(2011).)。所述微納米粒子可W是均質(zhì)的（例 如由相同組分/材料制備或者具有相同尺寸）或異質(zhì)的（例如由不同組分/材料制備或者 具有不同尺寸）。均質(zhì)微納米粒子簇指具有基本上相同的特性或特征或者由基本上相同的 材料組成的粒子集合。異質(zhì)微納米粒子簇指具有不同的特性或特征或者由基本上不同的材 料組成的粒子的混合物。例如，異質(zhì)微納米粒子可W包括在中也的量子點(diǎn)和附著于量子點(diǎn) 上的一些獨(dú)立的金（Au)納米晶體。在異質(zhì)納米粒子集合中不同的納米粒子最初彼此間不 相結(jié)合，但是能夠單獨(dú)地分別與低密度多孔性結(jié)構(gòu)結(jié)合。
[0064] 在某些實(shí)施方式中，所公開(kāi)的納米結(jié)構(gòu)包括多個(gè)嵌入于或包覆于低密度、多空性 3-D結(jié)構(gòu)的核納米粒子。例如，所述納米結(jié)構(gòu)包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、100 多或 1000 多個(gè)核納米粒子。
[0065] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)指密度遠(yuǎn)低于（例如10多倍、20 多倍、30多倍、50多倍、70多倍、100多倍）現(xiàn)有介孔納米粒子（例如具有的孔徑范圍為2nm 至 50nm 的介孔納米粒子）的結(jié)構(gòu)。（A. Vincent 等，J. Phys. Qiem. C, 2007, 111, 8291-8298， J. E. Lee 等，J. Am. Chem. Soc. , 2010, 132, 552-557. Y. - S, Lin 等，J. Am. Chem. Soc. , 2011, 133, 20444-20457, Z. Lu, Angew. Qiem. Int. Ed. , 2010, 49, 1862-1866.)
[0066] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)指密度<1. Og/cc (例如<100mg/ cc、<10mg/cc、<5mg/cc、<lmg/cc、<0. 5mg/cc、<0. 4mg/cc、<0. 3mg/cc、<0. 2mg/cc 或 <0. Img/ cc)(例如，由 0. Olmg/cc 至 lOmg/cc、由 0. Olmg/cc 至 8mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 5mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 3mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 Img/cc、由 0. Olmg/cc 至 Img/cc、由 0. Olmg/cc 至 0. 8mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 0. 5mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 0. 3mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 lOOOmg/ cc、由 0. Olmg/cc 至 915mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 900mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 800mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 700mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 600mg/cc、由 0. Olmg/cc 至 500mg/cc、由 0. Img/ cc 至 800mg/cc、由 0. Img/cc 至 700mg/cc、由 0. Img/cc 至 lOOOmg/cc、由 Img/cc 至 lOOOmg/ cc、由 5mg/cc 至 lOOOmg/cc、由 lOmg/cc 至 lOOOmg/cc、由 20mg/cc 至 lOOOmg/cc、由 30mg/ cc 至 lOOOmg/cc、由 30mg/cc 至 lOOOmg/cc、由 30mg/cc 至 900mg/cc、由 30mg/cc 至 800mg/ cc 或由 30mg/cc 至 700mg/cc)的結(jié)構(gòu)。
[0067] 可W使用本領(lǐng)域公知的多種方法確定3-D結(jié)構(gòu)的密度（參見(jiàn)例如Lowell, S. 等，Characterization of porous solids and powders:surface area, pore size and density, Springer 出版，2004)。不例性的方法包括化unauer Emmett Teller 炬ET) 法和氮比重瓶法（參見(jiàn)例如 Varadan V.K.等，Nanoscience and Nanotechnology in Elngineering,World Scientific出版,2010)。簡(jiǎn)言之，在邸T法中，將待測(cè)3-D結(jié)構(gòu)的干粉 置于通入氮?dú)夂偷獨(dú)獾臋z測(cè)室中，記錄溫度變化情況并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和外推W計(jì)算檢測(cè) 樣品的密度。在氮比重瓶法中，在待測(cè)3-D結(jié)構(gòu)的干粉中充入氮?dú)?，研究通過(guò)改變體積產(chǎn)生 的氮?dú)鈮篧提供密度?；诟煞蹣悠窚y(cè)定的密度不能反映3-D結(jié)構(gòu)的真實(shí)密度，因?yàn)樗?3-D結(jié)構(gòu)的密度極低，在干燥過(guò)程中其架構(gòu)容易崩塌，因此其與當(dāng)3-D結(jié)構(gòu)完全伸展時(shí)例如 就像當(dāng)3-D結(jié)構(gòu)在緩沖溶液中完全伸展時(shí)相比在孔隙度檢測(cè)中提供了小得很多的數(shù)值。
[0068] 在某些實(shí)施方式中，所述3-D結(jié)構(gòu)的密度可W使用3-D結(jié)構(gòu)的干質(zhì)量除W該種3-D 結(jié)構(gòu)在水溶液中的總體積確定。例如，可W分別確定具有或不具有3-D結(jié)構(gòu)的核粒子的干 質(zhì)量，該兩者之間的差值將是所述3-D結(jié)構(gòu)的總質(zhì)量。類似地，可W分別確定在水溶液中 具有和不具有3-D結(jié)構(gòu)的核粒子的體積，該兩者之間的差值將是在水溶液中核粒子上所述 3-D結(jié)構(gòu)的體積。
[0069] 在某些實(shí)施方式中，多孔性納米結(jié)構(gòu)在水溶液中能夠W多個(gè)包覆于3-D結(jié)構(gòu)的大 納米粒子的形式分散，在該種情況下，所述3-D結(jié)構(gòu)的總體積可W根據(jù)各個(gè)大納米粒子3-D 結(jié)構(gòu)的平均體積乘W大納米粒子的數(shù)量計(jì)算。
[0070] 對(duì)于各個(gè)大納米粒子而言，可W使用動(dòng)態(tài)光散射值L巧技術(shù)測(cè)定具有3-D結(jié)構(gòu)的 粒子的尺寸（例如半徑），不具有3-D結(jié)構(gòu)的粒子核的尺寸（例如半徑）可W在透射電子顯 微鏡燈EM)下測(cè)定，因?yàn)?-D結(jié)構(gòu)在TEM下基本上不可見(jiàn)。因此，可W通過(guò)從具有3-D結(jié)構(gòu) 的粒子的體積中減去不具有3-D結(jié)構(gòu)的粒子的體積獲得各個(gè)較大納米粒子中3-D結(jié)構(gòu)的體 積。
[0071] 可W使用任意適宜的方法計(jì)算針對(duì)給定核質(zhì)量的大納米粒子的數(shù)量。例如，各個(gè) 大納米粒子可W由在TEM下是可見(jiàn)的多個(gè)小納米粒子組成。在該種情況下，可W根據(jù)在TEM 下的檢測(cè)結(jié)果確定小納米粒子的平均尺寸和體積，小納米粒子的平均質(zhì)量可W通過(guò)已知的 核材料的密度乘W小粒子的體積確定。通過(guò)使用核質(zhì)量除W小納米粒子的平均質(zhì)量可W估 算小納米粒子的總數(shù)。對(duì)于各個(gè)大納米粒子而言，可W在TEM下確定其中小納米粒子的平 均數(shù)量。因此，針對(duì)給定核質(zhì)量的大納米粒子的數(shù)量能夠通過(guò)使用小納米粒子的總數(shù)除W 在各個(gè)大納米粒子中小納米粒子的平均數(shù)量估算。
[0072] 或者，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)指在結(jié)構(gòu)中具有40%-99.9% (優(yōu)選50%至 99. 9% )的空白空間或空孔隙的結(jié)構(gòu)，其中80%的孔具有尺寸為1皿至500皿的半徑。
[0073] 3-D結(jié)構(gòu)的孔隙度可W通過(guò)氣體/蒸汽吸附法確定。在該項(xiàng)技術(shù)中，通常氮?dú)?在其沸點(diǎn)被吸附于固體樣品上。可W使用在特定分壓下吸附的氣體的量通過(guò)化unauer、 Emmit和TelleHBET)氮?dú)馕?解吸附公式計(jì)算所述材料的特定表面積。通過(guò) Kelvin公式或改良的Kelvin公式，BJH公式計(jì)算孔徑（參見(jiàn)例如D. Niu等，J. Am. chem. Soc.132, 15144-15147(2010))。
[0074] 還可W通過(guò)壓隸法表征3-D結(jié)構(gòu)的孔隙度（參見(jiàn)例如Varadan V. K.等，如上所 述）。簡(jiǎn)言之，從3-D結(jié)構(gòu)中抽出氣體，然后將所述結(jié)構(gòu)浸入隸中。由于隸在室溫下不潤(rùn)濕， 因此施加外部壓力逐漸將隸壓入樣品中。通過(guò)監(jiān)測(cè)所應(yīng)用的各個(gè)壓力下逐漸增加的進(jìn)入隸 的體積，可W根據(jù)Washburn公式計(jì)算孔徑。
[0075] 或者，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)指具有下述材料性質(zhì)的結(jié)構(gòu)，即所述多孔性結(jié) 構(gòu)（除了核納米粒子W外）在透射電子顯微鏡下不能明顯地觀察到或基本通透，例如即使 當(dāng)所述3-D結(jié)構(gòu)的特征尺寸在10多或100多納米范圍內(nèi)。本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)"明顯地觀 察到"或"基本通透"指基于TEM下的3-D結(jié)構(gòu)圖像所述3-D結(jié)構(gòu)的厚度能夠容易地評(píng)估或 確定?？蒞采用本領(lǐng)域公知的方法觀察或測(cè)定納米結(jié)構(gòu)（例如涂覆或嵌入于低密度多空性 3-D結(jié)構(gòu)中的納米粒子）。例如，可W使用DLS法測(cè)定具有3-D結(jié)構(gòu)的納米結(jié)構(gòu)的尺寸（例 如半徑），可W在TEM下測(cè)定不具有3-D結(jié)構(gòu)的核粒子的尺寸（例如半徑）。在某些實(shí)施方 式中，利用DLS測(cè)定W 10多、100多納米范圍計(jì)的3-D結(jié)構(gòu)的厚度，但其不能在TEM下容易 地測(cè)定。例如，當(dāng)在透射電子顯微鏡（TEM)下觀察本申請(qǐng)中提供的納米結(jié)構(gòu)時(shí)，能夠識(shí)別納 米粒子，但是不能明顯地觀察到所述低密度多孔性3-D結(jié)構(gòu)或者不能基本通透（例如參見(jiàn) 圖2和3)。該能夠?qū)⒈旧暾?qǐng)中提供的納米結(jié)構(gòu)與現(xiàn)有技術(shù)中報(bào)道的那些（參見(jiàn)圖4)相區(qū) 分，所述納米結(jié)構(gòu)包括涂覆有交聯(lián)的和尺寸可調(diào)的3-D結(jié)構(gòu)的納米粒子，所述3-D結(jié)構(gòu)包括 介孔二氧化娃納米粒子或涂層（參見(jiàn)例如J. Kim等，J. Am. Chem. . Soc.，2006, 128, 688-689 ; J. Kim等，Angew. Chem. Int. Ed.，2008, 47, 8438-8441)。該種特征還表明本申請(qǐng)?zhí)峁┑牡兔?度多孔性3-D結(jié)構(gòu)與本領(lǐng)域公知的其他經(jīng)涂覆的納米粒子相比具有低得更多的密度和/或 較高的多孔性。
[0076] 可W通過(guò)負(fù)載不同分子的容量進(jìn)一步評(píng)估3-D結(jié)構(gòu)的孔隙度（參見(jiàn)例如Wang L.等，Nano Research 1,99-115(2008))。因?yàn)楸旧暾?qǐng)所提供的3-D結(jié)構(gòu)具有較低的密度， 因而按照設(shè)想與其他經(jīng)涂覆的納米粒子相比更多的有效載荷能夠與該3-D結(jié)構(gòu)結(jié)合（參見(jiàn) 例如圖1)。例如，當(dāng)3-D結(jié)構(gòu)負(fù)載有機(jī)英光團(tuán)如羅丹明時(shí)，一個(gè)納米粒子的3-D結(jié)構(gòu)能夠負(fù) 載超過(guò)1〇5個(gè)羅丹明分子。
[0077] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度結(jié)構(gòu)指能夠吸收或攜帶英光有效載荷的結(jié)構(gòu)，所 述英光有效載荷的英光強(qiáng)度是游離英光分子的至少100倍（例如至少150倍、200倍、250 倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍、550倍或600倍）?？蒞在與英光分子相同的激發(fā) 和發(fā)射波長(zhǎng)下對(duì)負(fù)載納米粒子的英光強(qiáng)度進(jìn)行定量。負(fù)載低密度結(jié)構(gòu)的英光強(qiáng)度顯示了所 述英光分子的有效載荷，還間接地反映了所述低密度結(jié)構(gòu)的孔隙度。
[0078] 在某些實(shí)施方式中，所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)由含有娃焼的或娃焼樣分子（例 如娃焼、有機(jī)娃焼、焼氧基娃焼、娃酸鹽及其衍生物）制備。
[0079] 在某些實(shí)施方式中，含有娃焼的分子包括有機(jī)娃焼，也將其稱為娃焼綴合劑。有機(jī) 娃焼的通式為RySiY<4_y>，其中R基團(tuán)是焼基、芳基或有機(jī)官能團(tuán)。Y基團(tuán)是甲氧基、己氧基 或己醜氧基。X是1、2或3。R基團(tuán)能夠具有特定功能如使有機(jī)娃焼分子與核納米粒子或 其他有效載荷的表面通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)相互作用結(jié)合。Y基團(tuán)是可水解的并且能夠形成與 另一個(gè)有機(jī)娃焼分子交聯(lián)的娃氧焼鍵。示例性的R基團(tuán)包括但不限于二硫化物焼基、氨基 焼基、琉基焼基、己帰基焼基、環(huán)氧焼基和甲基丙帰基焼基、駿基焼基基團(tuán)。在R基團(tuán)中的焼 基可W是甲帰基、己帰基、丙帰基等。示例性的Y基團(tuán)包括但不限于焼氧基如0CH3、0C2&和 OC2H4OCH3。例如，有機(jī)娃焼可W是氨基-丙基-H甲氧基娃焼、琉基-丙基-H甲氧基娃焼、 駿基-丙基-二甲氧基娃焼、氨基-丙基-二己氧基娃焼、琉基-丙基-二己氧基娃焼、駿 基-丙基-H己氧基娃焼、雙-巧-(H己氧基娃焼基）丙基]-四硫化物、雙-巧-(H己氧 基娃焼基）丙基]-二硫化物、氨基丙基H己氧基娃焼、N-2-(氨基己基）-3-氨基丙基H甲 氧基娃焼、己帰基H甲氧基娃焼、己帰基-H (2-甲氧基己氧基）娃焼、3-甲基丙帰醜氧基 丙基二甲氧基娃焼、2-(3, 4-環(huán)氧基環(huán)己基）-己基二甲氧基娃焼、3-縮水甘油離氧基-丙 基H己氧基娃焼、3-異氯基丙基H己氧基娃焼和3-氯基丙基H己氧基娃焼。
[0080] 所述3-D結(jié)構(gòu)與核納米粒子的相互作用通過(guò)1)分子內(nèi)相互作用如共價(jià)鍵（例如 Sigma鍵、Pi鍵、Delta鍵、雙鍵、H鍵、四鍵、五鍵、六鍵、3c - 2e、3c - 4e、4c - 2e、抓氨鍵、彎 曲鍵、偶極鍵、Pi反向鍵、共輛、超共輛、芳香性、哈普巧數(shù)和反鍵）、金屬鍵（例如在核納米 粒子中與金屬原子的馨合相互作用）或離子鍵（陽(yáng)離子n -鍵和鹽鍵），W及2)分子間相 互作用如氨鍵（例如二氨鍵、二氨復(fù)合物、低屏障氨鍵、對(duì)稱氨鍵）和非共價(jià)鍵（例如疏水 性、親水性、電荷-電荷或n -堆積相互作用，范德華力，倫敦分散力，機(jī)械鍵，團(tuán)鍵，親金作 用，插層，堆積，賭力和化學(xué)極性）。
[0081] 制備所述多孔性納米結(jié)構(gòu)的方法
[0082] 本申請(qǐng)的另一個(gè)方面涉及形成納米結(jié)構(gòu)的方法，所述納米結(jié)構(gòu)包括具有低密度、 多孔性3-D結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)核納米粒子。例如，所述納米結(jié)構(gòu)通過(guò)使用低密度、多孔性3-D 結(jié)構(gòu)涂覆或包裹一個(gè)或多個(gè)納米粒子W使得所述粒子位于或嵌入3-D結(jié)構(gòu)中形成。
[0083] 所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)通過(guò)含娃焼或娃焼樣分子的組裝或交聯(lián)使其沉積或 覆蓋核納米粒子表面形成?？蒞通過(guò)在核納米粒子表面的娃焼化過(guò)程制備低密度多孔性 3-D結(jié)構(gòu)。娃焼化過(guò)程包括例如在酸性或堿性條件下交聯(lián)含娃焼或娃焼樣分子（例如焼氧 基娃焼如氨基-丙基-H甲氧基娃焼、琉基-丙基-H甲氧基娃焼或娃酸軸）的步驟。
[0084] 在某些實(shí)施方式中，在交聯(lián)中使用酸性或堿性催化劑。示例性的酸性催化劑包括 但不限于質(zhì)子酸催化劑（例如硝酸、己酸和賴酸）和Lewis酸催化劑（例如H氣化測(cè)、H氣 化測(cè)單己胺復(fù)合物、H氣化測(cè)甲醇復(fù)合物化Cl3、AlCl3、ZnCl2和化化2)。示例性的堿性催化 劑包括胺或季胺化合物如四甲基氨氧化饋和氨氧化饋。
[0085] 娃焼化過(guò)程可W包括一個(gè)或多個(gè)階段，例如：引發(fā)階段，在此階段所述3-D結(jié)構(gòu)開(kāi) 始形成；生長(zhǎng)階段，在此階段娃質(zhì)結(jié)構(gòu)層易于在核納米粒子上形成并且形成更多；和/或結(jié) 束階段，在此階段所述3-D結(jié)構(gòu)即將完成（例如所述3-D結(jié)構(gòu)的外表面即將形成）。在娃焼 化過(guò)程中，可W在該過(guò)程的不同階段加入一種或多種含娃焼的分子。例如，在引發(fā)階段，可 W加入有機(jī)娃焼如氨基丙基H甲氧基娃焼或琉基丙基H甲氧基娃焼W便在核納米粒子表 面起始娃焼化。對(duì)于另一個(gè)例子，可W在娃焼化的生長(zhǎng)階段將具有更少焼氧基（例如僅2個(gè) 焼氧基）的娃焼分子加入反應(yīng)中。對(duì)于另一個(gè)例子，在娃焼化的結(jié)束階段，可W加入具有一 種或多種不同官能團(tuán)的有機(jī)娃焼分子。該些官能團(tuán)可W是氨基、駿基、琉基或麟酸鹽基團(tuán)， 其可W進(jìn)一步與其他分子綴合，例如親水性劑、生物活性劑、可檢測(cè)標(biāo)記、光響應(yīng)基團(tuán)、電子 響應(yīng)基團(tuán)、磁響應(yīng)基團(tuán)、酶促響應(yīng)基團(tuán)或抑響應(yīng)基團(tuán)，或者結(jié)合伴侶，W使得所述3-D結(jié)構(gòu) 在穩(wěn)定性、溶解度、生物相容性、進(jìn)一步綴合或衍生的能力或與有效載荷親和性方面得到進(jìn) 一步修飾。或者，所述官能團(tuán)還可W是易于與其他分子綴合的基團(tuán)（例如與生物活性劑、熱 響應(yīng)分子、光響應(yīng)分子、電子響應(yīng)分子、磁響應(yīng)分子、抑響應(yīng)分子、酶促響應(yīng)分子、可檢測(cè)標(biāo) 記或結(jié)合伴侶如生物素或親和素綴合的基團(tuán)）。
[0086] 為控制低密度娃質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，所述制備進(jìn)一步包括降低密度的操作如在反應(yīng)或 形成過(guò)程中引入空氣氣泡、增加反應(yīng)溫度、微波、超聲、潤(rùn)旋、搖動(dòng)/旋轉(zhuǎn)和/或調(diào)節(jié)反應(yīng)的 化學(xué)組成W調(diào)節(jié)娃焼分子的交聯(lián)度。不被理論所束縛，據(jù)信該些操作能夠有助于使得反應(yīng) 介質(zhì)均勻、分散良好并且促進(jìn)空腔或孔隙度增加的低密度多孔性3-D結(jié)構(gòu)的形成。
[0087] 在某些實(shí)施方式中，降低密度的操作包括超聲處理反應(yīng)或形成混合物。可W對(duì)在 娃焼化過(guò)程中超聲處理的條件（例如持續(xù)時(shí)間）進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇W便在所得到的低密度多 孔性3-D結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生所需的孔隙度。例如，可W在娃焼化過(guò)程的某一階段應(yīng)用超聲處理。 超聲在娃焼化階段中的持續(xù)時(shí)間可W持續(xù)例如至少1小時(shí)、1. 5小時(shí)、2小時(shí)、2. 5小時(shí)、3小 時(shí)、3. 5小時(shí)、4小時(shí)。在某些實(shí)施方式中，在娃焼化過(guò)程中的各階段均應(yīng)用超聲處理。
[008引在某些實(shí)施方式中，降低密度的操作包括向反應(yīng)中引入至少一種醇。在某些實(shí)施 方式中，所述醇具有至少3個(gè)（例如至少4個(gè)、至少5個(gè)或至少6個(gè)）碳原子。例如，所述 醇可W具有3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個(gè)或更多的碳原子。在某些實(shí)施方式中，所述醇可^ 是一元醇或多元醇。一元醇說(shuō)明性的例子包括丙醇、下醇、戊醇、己醇等。多元醇說(shuō)明性的 例子包括丙二醇、丙H醇、蘇糖醇、木糖醇等。在某些實(shí)施方式中，所述醇可W具有飽和的碳 鏈或不飽和的碳鏈。具有飽和碳鏈的醇可化學(xué)式表示。在某些實(shí)施方式中， n不低于3,或者不低于4,或者不低于5(例如n = 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多）。具 有不飽和碳鏈的醇在兩個(gè)碳原子之間具有雙鍵或H鍵。在某些實(shí)施方式中，所述醇可W是 環(huán)醇，例如環(huán)己醇、肌醇或薄荷醇。
[0089] 在某些實(shí)施方式中，所述醇具有直鏈碳鏈（例如n-丙醇、n- 了醇、n-戊醇、n-己 醇等）或支鏈碳鏈（例如異丙醇、異下醇、叔下醇等）。在某些實(shí)施方式中，所述醇的體積分 數(shù)為約30%至約70% (例如30%至約70%、約30%至約60%、約30%至約55%、約40% 至約70 %、約45 %至約70 %、約40 %至約60 % )。在某些實(shí)施方式中，所述醇的體積分?jǐn)?shù)為 50%左右（例如45%左右、46%左右、47%左右、48%左右、49%左右、50%左右、51 %左右、 52%左右、53%左右、54%左右、55%左右、56%左右、57%左右、58%左右、59%左右或60% 左右）。
[0090] 在某些實(shí)施方式中，降低密度的操作包括向反應(yīng)中引入空氣氣泡。在某些實(shí)施方 式中，所述空氣氣泡可W在反應(yīng)過(guò)程中不斷的存在?？蒞通過(guò)任何適宜的方法將空氣氣泡 引入反應(yīng)中，例如通過(guò)向反應(yīng)中通入氣泡或者通過(guò)向反應(yīng)混合物中引入氣體產(chǎn)生劑。
[0091] 還可W對(duì)其他實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化W提供形成所需的低密度多孔性3-D結(jié)構(gòu)的條 件。該種實(shí)驗(yàn)條件包括例如核納米粒子的濃度、催化劑的濃度、催化劑與核納米粒子的濃度 比、低密度娃質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的溫度或有機(jī)娃焼的分子結(jié)構(gòu)。
[0092] 在某些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括在多孔性結(jié)構(gòu)之中或其表面上引入一個(gè) 或多個(gè)官能團(tuán)。所述官能團(tuán)可W在交聯(lián)過(guò)程中形成多孔性結(jié)構(gòu)時(shí)引入，例如通過(guò)在交聯(lián)過(guò) 程中特別是在交聯(lián)過(guò)程的結(jié)束階段中通過(guò)加入含有該種官能團(tuán)的含娃化合物引入。所述官 能團(tuán)還可W在交聯(lián)產(chǎn)物形成后引入，例如通過(guò)化學(xué)修飾將官能團(tuán)引入交聯(lián)產(chǎn)物的表面。在 某些實(shí)施方式中，所述官能團(tuán)是多孔性結(jié)構(gòu)中固有的。
[0093] 所述官能團(tuán)作為多孔性結(jié)構(gòu)和有效載荷之間的連接。所述官能團(tuán)的例子包括但不 限于氨基，琉基，撰基，麟酸鹽，生物素，鏈霉親和素，親和素，輕基，焼基或其他疏水性分子， 聚己二醇或其他親水性分子W及光裂解、熱裂解或pH響應(yīng)連接基團(tuán)。
[0094] 在某些實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括純化所得到的納米結(jié)構(gòu)產(chǎn)物。所述純化 可W包括使用透析、切向流過(guò)濾、超濾或其組合。
[0095] 低密度多孔性3-D結(jié)構(gòu)的厚度，其直接與納米結(jié)構(gòu)的尺寸相關(guān)，能夠通過(guò)例如修 改含娃焼分子（例如H焼氧基娃焼或娃酸軸）的數(shù)量、反應(yīng)時(shí)間W及反應(yīng)步驟和該類反應(yīng) 參數(shù)之間的時(shí)間間隔被控制（例如從Inm至lOOOnm)。
[0096] 所述3-D結(jié)構(gòu)的厚度可W是約1至5皿厚。在某些實(shí)施方式中，所述厚度可W是 約1至10皿厚。在某些實(shí)施方式中，所述厚度可W是約1至20皿厚。在某些實(shí)施方式中， 所述厚度可W是約1至30皿厚。在某些實(shí)施方式中，所述厚度可W是約1至40皿厚。在 某些實(shí)施方式中，所述厚度可W是約1至50nm厚。在某些實(shí)施方式中，所述厚度可W是約1 至60nm厚。在某些實(shí)施方式中，所述厚度可W是約1至lOOnm厚。在某些實(shí)施方式中，所 述厚度可W是約1至500nm厚。在某些實(shí)施方式中，所述厚度可W是約1至lOOOnm厚。
[0097] 所述低密度、多孔性3-D結(jié)構(gòu)在核納米粒子表面上形成后，所述核納米粒子被嵌 入于3-D結(jié)構(gòu)中。所得到的納米結(jié)構(gòu)能夠具有的厚度（例如納米結(jié)構(gòu)的最長(zhǎng)尺寸或者如果 所述結(jié)構(gòu)是球形則為直徑）為約1至lOOOnmU至lOOnm或者1至lOnm。在另一個(gè)實(shí)施方式 中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有的直徑為約1至30nm。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠 具有的直徑為約500nm。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有的直徑為約lOOnm。 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有的直徑為約50nm。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述 納米結(jié)構(gòu)能夠具有的直徑為約30nm。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)能夠具有的直徑 為約lOnm。
[009引載荷
[0099] 在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{米結(jié)構(gòu)攜帶或與有效載荷結(jié)合。所述有效載 荷被納米結(jié)構(gòu)攜帶或結(jié)合，其包括但不限于可檢測(cè)劑、祀向部分、結(jié)合伴侶、生物活性劑、藥 物、治療劑、放射劑、化學(xué)劑、小分子藥物、生物藥（例如膚、蛋白、抗體、抗原、核酸、適體等） 及其任意組合，其能夠用于成像、檢測(cè)、研究、監(jiān)測(cè)、評(píng)估、篩選和/或疾病、病情或相關(guān)生物 學(xué)事件。有效載荷可w是物理吸入多孔性結(jié)構(gòu)中或通過(guò)本申請(qǐng)所公開(kāi)的官能團(tuán)與多孔性結(jié) 構(gòu)連接。
[0100] 可檢測(cè)劑可W是英光分子、化學(xué)發(fā)光分子、生物發(fā)光分子、放射性同位素、MRI造 影劑、CT造影劑、酶底物標(biāo)記和/或著色劑等。英光分子的例子包括但不限于英光化合物 (英光團(tuán)），其可W包括但不限于；1，5IAEDANS ;1，8-ANS ;4-甲基傘形麗；5-駿基-2, 7-二 氯英光素；5-駿基英光素巧-FAM) ;5-駿基蔡基英光素；5-駿基四甲基羅丹明（5-TAMRA); 5-FAM(5-駿基英光素）；5-HAT (輕基色胺）；5-輕基色胺（HAT) ;5-R0X (駿基-X-羅丹明）； 5-TAMRA(5-駿基四甲基羅丹明）；6-駿基羅丹明6G;6-CR 6G;6-J0E;7-氨基4-甲基香豆 素；7-氨基放線菌素 D (7-AAD) ;7-輕基-4-甲基香丑素；9-氨基-6-氯-2-甲氧基嚇巧； ABQ ;酸性品紅；ACMA (9-氨基-6-氯-2-甲氧基嚇巧）；嚇巧澄；嚇巧紅；嚇巧黃（acridine yellow);嚇巧黃（Acriflavin);富爾根氏嚇巧黃（Acriflavin Feulgen)SITSA;水母素 (發(fā)光蛋白）；AFPs -自體英光蛋白一（量子生物科技（Quantum Biotechnologies)); Alexa? Fluor 350 ； Alexa? Fluor 405 ；Alexa? Fluor 500 ；Alexa Fluor 430? ；Alexa Fluor 488?；Alexa Fluor 532? ；Alexa Fluor 546? ；Alexa Fluor 568? ；Alexa Fluor 594? ;Alexa Fluor 633? ;Alexa Fluor 647? ;Alexa Fluor 660? ;Alexa Fluor 680? ;茜 素絡(luò)合指示劑；茜素紅；別藻藍(lán)素（APC) ;AMC，AMCA-S ;AMCA(氨基甲基香豆素）；AMCA-X ; 氨基放線菌素 D ;氨基香豆素；氨基甲基香豆素（AMCA);苯胺藍(lán)；Ant虹ocyl stearate ; APC(別藻藍(lán)素）；APC-切7 ;APTRA-BTC ;APTS ;阿斯屈拉松（Astrazon)亮紅4G ;阿斯屈拉 松（Astrazon)澄R ;阿斯屈拉松（Astrazon)紅她；阿斯屈拉松（Astrazon)黃7GIX ;阿的 平；ATT〇-TAG?CBQCA ;ATT〇-TAG?FQ ;金胺；Auro地OS地ine G ;Auro地OS地ine ;BA0 9(雙氨 基苯基惡二哇）；BCECF (高抑）；BCECF (低抑）；硫酸黃連素；目?jī)?nèi)醜胺酶；Bimane ;雙苯甲 醜胺；雙苯甲醜胺（赫司特公司化oechst));雙-BTC;Blanco地or FFG;Blanco地or SV; B0B0?-1 ;B0B0?-3 ;氣測(cè)英 492/515 ;氣測(cè)英 493/503 ;氣測(cè)英 500/510 ;氣測(cè)英 505/515 ; 氣測(cè)英530/550 ;氣測(cè)英542/563 ;氣測(cè)英558/568 ;氣測(cè)英564/570 ;氣測(cè)英576/589 ;氣 測(cè)英581/591 ;氣測(cè)英630/650-X ;氣測(cè)英650/665-X ;氣測(cè)英665/676 ;氣測(cè)英F1 ;氣測(cè)英 FL ATP;氣測(cè)英in-神經(jīng)醜胺；氣測(cè)英R6G SE;氣測(cè)英TMR;氣測(cè)英TMR-X綴合物；氣測(cè)英 TMR-X，SE ;氣測(cè)英 TR ;氣測(cè)英 TR ATP ;氣測(cè)英 TR-X SE ;B0-PR0?-1 ;B0-PR0?-3 ;賴基亮黃 素炬rilliant Sul地oflavin)FF ;BTC ;BTC-5N ;巧黃綠素；巧黃綠素藍(lán)；深紅巧? ;綠巧； 綠巧-ICa"染料；綠巧-2Ca";綠巧-5N Ca";綠巧-C18Ca";澄巧；卡爾科弗盧爾英光增 白劑（Calcofluor White);駿基-X-羅丹明（5-R0X);瀑布藍(lán)（Cascade Blue?);瀑布黃 (Cascade Yellow);兒茶酷胺；CCF2佑eneBlazer商標(biāo)）；CFDA;葉綠素；色霉素 A;色霉素 A ;化-肥RF ;駿基英光素雙醋酸鹽（CM抑A);香豆素鬼筆環(huán)膚；C-藻青素；CPM甲基香豆素； CTC ;CTC 甲臓；Cy2? ;Cy3. 18 ;切3. 5? ;切3? ;C巧.18 ;切5. 5? ;C巧?;切7? ;環(huán) amp 氣傳感 器的娜1時(shí)；Dabcyl ;單賴醜；單賴醜胺；單賴醜尸胺；單賴醜氯；單賴醜畑陽(yáng)；單賴醜氣； DAPI ;Dapoxyl ;Dapoxyl 2 ;Dapoxyl 3' DCFDA ;DCFH (二氯二氨英光素二己酸醋）；DDA0 ; D皿（二氨羅丹明 123);二-4-ANEPPS;二-8-ANEPPS(未按照比例）；DiA(4-二-16-ASP); 二氯二氨英光素二己酸醋值CFH) ;DiD-親脂性示蹤劑；DiD值iIC18(5)) ;DIDS;二氨羅 丹明 123 值皿）；DiI 值 iIC18(3));二硝基酷；DiO 值 i0C18(3)) ;DiR;DiR 值 iIC18(7)); DM-NERF(高抑）；DNP ;多己胺；DTAF ;DY-630-NHS ;DY-635-NHS ;ELF 97 ;曙紅；赤薛紅；赤 薛紅口C;漠化己錠；己巧均二聚體-1巧thD-1)出uc虹ysin出ukoLi曲t;氯化館（III); EYFP ;快藍(lán)；FDA ;富爾根（副品紅）；FIF (甲酵誘導(dǎo)的英光）；FITC ;Flazo Orange ; Fluo-3 ;Flu〇-4 ;英光素（門TC);英光素二己酸醋；Fluoro-Emerald ;英光金（輕茂己 脈）；Fluor-Ruby;Fluor X;FM 1-43?;FM 4-46;Fura Red? (高抑）；Fura RecT7Flu〇-3; Fura-2 ;Fura-2/BCECF ;Genacryl Brilliant Red B ；Genacryl Brilliant Yellow lOGF ； Genaciyl Pink 3G;Genac;ryl Yellow 5GF;GeneBlazer(CCF2) ;Gloxalic Acid;粒狀 藍(lán)；血日 h 晰巧oechst 33258;Hoechst 33：M2;Hoechst ：M580;HPTS;輕基香豆素；輕茂 己脈（英光金）；輕色胺；Indo-1，高巧；Indo-1，低巧；剛巧二碳菁值iD);剛巧S碳菁 (DiR) ;Intrawhite Cf ;JC_1 ;J〇-J〇-l ;J〇-PR〇-l ;LaserPro ;Laurodan ;LDS751值NA) ;LDS 751(RNA);Leucophor PAF;Leuco地or SF;Leuco地or WS;麗絲胺羅丹明；麗絲胺羅丹明 B ;巧黃綠素/己錠均二聚體；IDLO-l ;L0-PR0-1 ;英光黃；Lyso示蹤藍(lán)；Lyso示蹤藍(lán)-白； Lyso示蹤綠；Lyso示蹤紅；Lyso示蹤黃；Lyso傳感器藍(lán)；Lyso傳感器綠；Lyso傳感器黃/ 綠；Mag 綠；蔡紅（根皮紅 B) ;Mag-Fura 紅；Mag-Fura-2 ;Mag-Fura-5 ;Mag-Ind〇-l ;鎮(zhèn)綠； 鎮(zhèn)澄；孔雀石綠；海藍(lán)；Maxilon brilliant Flavin 10GFF;Maxilon brilliant Flavin 8GFF ;血藍(lán)蛋白；甲氧基香豆素；線粒體示蹤綠FM ;線粒體示蹤澄；線粒體示蹤紅；光輝霉 素 ；Monobromobimane ;Monobromobimane(mBBr-GSH) ;Monochlorobimane ;MPS (甲基氯派若 寧二苯己帰）；NBD ;NBD胺；尼羅紅；Nitrobenzoxadidole ;去甲腎上腺素；核快紅；核黃； Nylosan化illiant lavin E8G;俄勒岡綠；俄勒岡綠488-X;俄勒岡綠?;俄勒岡綠"488; 俄勒岡綠"500 ;俄勒岡綠"514 ;太平洋藍(lán)；副醫(yī)薇胺（福爾根）；PBFI ;PE-切5 ;PE-切7 ; PerCP ;PerCP-切5. 5 ;PE-德克薩斯紅[Red 613];根皮紅 B (麥哥達(dá)拉紅）；Phorwite AR ; Phorwite 服 L;Phorwite Rev;Phorwite RPA;磯化氨 3R;光刻膠；藻紅蛋白 B[陽(yáng)];藻 紅蛋白即？6];口皿26 61徑1113);口皿67;口]\〇4;口〇111〇(3虹〇1116 81116 613〇1^;口0口0-1;口0口0-3; P0 - PR0-1 ;P0-PR0-3 ;禮草黃；普施安黃；楓化丙巧（PI) ;PYMP0 ;巧；派若寧；派若寧B ; Pyrozal化illiant Flavin 7GF;QSY 7;唾嚇因氮芥；紅613[PE-德克薩斯紅];試團(tuán)靈； RH 414 ;化od-2 ;羅丹明；羅丹明110 ;羅丹明123 ;羅丹明5GLD ;羅丹明6G ;羅丹明B ;羅 丹明B 200 ;羅丹明B額外的；羅丹明BB ;羅丹明BG;羅丹明綠；羅丹明化allicidine ; 羅丹明鬼筆環(huán)膚；羅丹明紅；羅丹明WT;攻瑰紅；R-藻青蛋白；R-藻紅蛋白（PE) ;S65A; S65C ;S65L ;S65T ;SBFI ;血清素 ；Sevron 亮紅 2B ;Sevron 亮紅 4G ;Sevron 亮紅 B ;Sevron 澄；Sevron黃L;SITS;S口S(禮草黃）；S口S(二苯己帰異硫代賴酸）；SNA化巧黃綠素； SNA化-1 ;SNA化-2 ;SNARF巧黃綠素；SNARF1 ;軸綠；光譜淺綠；光譜綠；光譜澄；光譜紅； SPQ(6-甲氧基-N-(3-硫代丙基）唾晰）；二苯己帰；硫代羅丹明B和C;硫代羅丹明額 夕hSYTO 11 ;SYT0 12 ;SYT0 13 ;SYT0 14 ;SYT0 15 ;SYT0 16 ;SYT0 17 ;SYT0 18 ;SYT0 20 ; SYTO 21 ；SYT0 22 ；SYT0 23 ；SYT0 24 ；SYT0 25 ；SYT0 40 ；SYT0 41 ；SYT0 42 ；SYT0 43 ； SYTO 44 ；SYT0 45 ；SYT0 59 ；SYT0 60 ；SYT0 61 ；SYT0 62 ；SYT0 63 ；SYT0 64 ；SYT0 80 ； SYTO 81 ;SYT0 82 ;SYT0 83 ;SYT0 84 ;SYT0 85 ;SYT0X 藍(lán)；SYTOX 綠；SYTOX 澄；四環(huán)素； 四甲基羅丹明（TRITC);德克薩斯紅?;德克薩斯紅-X?綴合物；硫代二撰基菁值iSC3); 喔嗦紅R ;喔哇澄；硫代黃素5 ;硫代黃素 S ;硫代黃素 TCN ;Thiolyte ;硫代喔哇澄； Tinopol CBS (Calcofluor White) ;TMR ;T0-PR0-1 ;T0-PR0-3 ;T0-PR0-5 ;T0T0-1 ;T0T0-3 ; 化王(：〇1〇1'牌-切5)^1?11'(：四甲基羅丹明異硫氯酸醋；真藍(lán)；真紅；叫化311*6;英光素軸6; Uvitex SFC ;WW 781 ;X-羅丹明；XRITC ;二甲苯澄；Y66F ;Y66H ;Y66W ;Y0-PR0-1 ;Y0-PR0-3 ; YOYO-1 ;Y0Y0-3 ;Sybr綠、喔哇澄（內(nèi)部馨合染料）、英光半導(dǎo)體納米粒子、銅系元素或其組 合。
[0101] 放射性同位素的例子包括 i23I、i24I、i25I、"il、35S、^、iuin、ii 2In、i4C、64Cu、67Cu、86Y、 呵、 9呼、1可11、2114*、18弔6、18恥、" 35111、21恥、叩、1中、2叫1、6屯3、" 7〔3和其他放射性同位素。
[0102] 酶底物標(biāo)記的例子包括英光素酶（例如蠻火蟲英光素酶和細(xì)菌英光素酶）、英光 素、2, 3-二氨駄嗦二麗、蘋果酸脫氨酶、脈酶、過(guò)氧化物酶如辣根過(guò)氧化物酶（HRP0)、堿性 磯酸酶、-半乳糖巧酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶（例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶 和葡萄糖-6-磯酸脫氨酶）、雜環(huán)氧化酶（如尿酸酶和黃嘿嶺氧化酶）、乳過(guò)氧化物酶、微過(guò) 氧化物酶等。
[010引祀向部分對(duì)目標(biāo)祀向位點(diǎn)（例如細(xì)胞、細(xì)胞組分、組織、蛋白、抗體、抗原、DNA、RNA 等）具有親和性。祀向部分的例子包括抗體（例如腫瘤表面抗原的抗體、細(xì)胞特異性抗原的 抗體或受體的抗體）、受體的配體（例如生長(zhǎng)因子、激素、細(xì)胞因子或神經(jīng)遞質(zhì)）、適體、膚、 抗原、核酸、多核巧酸、多糖、糖、脂肪酸、類固醇、嘿嶺、嚼巧、半抗原或其組合。
[0104] 結(jié)合伴侶的例子包括抗體、抗原、受體、配體、DNA、RNA、膚、適體、生物素、親和素、 鏈霉親和素、凝集素、碳水化合物、蛋白A、抗體化、脫硫生物素和亞氨基生物素。
[010引生物活性劑的例子包括治療劑、蛋白、抗體、膚、核酸、酶、熱應(yīng)答性分子、光應(yīng)答性 分子、電子應(yīng)答性分子、磁應(yīng)答性分子、抑應(yīng)答性分子、酶促應(yīng)答性分子和/或化合物。示例 性的治療劑包括但不限于局部麻醉劑、抗癒痛藥和抗梅厥劑、抗阿茲海默氏病藥、鎮(zhèn)痛藥、 抗痛風(fēng)、抗高血壓藥、抗也律失常藥、利尿藥、用于治療肝臟疾病的藥物、用于治療膜腺疾病 的藥物、抗組胺藥、抗變態(tài)反應(yīng)藥、糖皮質(zhì)激素藥、性激素藥和避孕藥、降血糖藥、抗骨質(zhì)疏 松藥、抗生素、賴胺類、唾諾麗類和其他合成抗菌藥、抗結(jié)核藥、抗病毒藥、抗腫瘤藥和免疫 調(diào)節(jié)劑。
[0106] 至于抗原或其抗體，目標(biāo)蛋白可W是任意一種或多種下述抗原包括但不限于；1) 白細(xì)胞標(biāo)記物如 CD2、CD3、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CDlla, b, c、CD13、CD14、CD18、CD19、CD20、 CD22、CD23、CD27及其配體、CD28及其配體B7. 1，B7. 2, B7. 3、CD29及其配體、CD30及其配 體、CD40 及其配體甜39、CD44、CD45 及其亞型、CDw52 (Campath 抗原）、CD56、CD58、CD69、 CD72、CTLA-4、LFA-1和TCR;2)組織相容性抗原如M肥I或II類、Lewis Y抗原、SLex、化巧、 SLea 和 SLeb ;3)整合素如 VLA-1、VLA-2、VLA-3、VLA-4、VLA-5、VLA-6 和 LFA-1 ;4)粘附分 子如Mac-1和pl50, 95 ;5)選擇素如k選擇素、P-選擇素和E-選擇素及其反受體VCAM-1、 ICAM-1、ICAM-2 和 LFA-3 ;6)白介素如比-1、比-2、比-3、比-4、比-5、比-6、比-7、比-8、 IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14 和 IL-15 ;7)白介素受體如 IL-1R、IL-2R、IL-4R、IL-5R、 比-6R、比-7R、比-8R、比-10R、比-11R、比-12R、比-13R、比-14R和比-15R ;8)趨化因子如 PF4、RANTES、MIP1. a、]\?^1、歴?-2、61'〇11、61'〇肖和比-8;9)生長(zhǎng)因子如1冊(cè)〇^6。目、1'甜、 VEGF/VPF、PT化P、EGF家族、FGF、PDGF家族、內(nèi)皮素和胃泌素釋放膚佑RP) ;10)生長(zhǎng)因子受 體如 TNF a R、RGF 目 R、TS皿、VEGFR/VPFR、FGFR、EGFR、PT化PR、PDGFR 家族、EP0-R、GCSF-R 及 其他造血受體；11)干擾素受體如IFN. a . R、IFN.目.R和IFN. Y . R ;12) Ig及其受體如I班、 FceRI和FCeRII ;13)腫瘤抗原如her2-neu、粘蛋白、CEA和內(nèi)皮唾液酸蛋白；14)過(guò)敏原如 屋塵峨抗原、1〇1 pi (草）抗原和漆酷；15)病毒蛋白如CMV糖蛋白B，H和gCIII、HIV-l包 膜糖蛋白、RSV包膜糖蛋白、HSV包膜糖蛋白、EBV包膜糖蛋白、VZV包膜糖蛋白、HPV包膜糖 蛋白、肝炎家族表面抗原；16)毒素如假單胞菌內(nèi)毒素和骨橋蛋白/尿橋蛋白、蛇毒和蜂毒； 17)血液因子如補(bǔ)體C3b、補(bǔ)體巧a、補(bǔ)體巧b-9、化因子、纖維蛋白原、纖維蛋白和髓銷相關(guān) 生長(zhǎng)抑制劑；18)酶如膽固醇醋轉(zhuǎn)移蛋白、膜結(jié)合基質(zhì)金屬蛋白酶和谷氨酸脫駿酶（GAD)和 19)雜項(xiàng)抗原包括神經(jīng)節(jié)巧脂GD3、神經(jīng)節(jié)巧脂GM2、LMP1、LMP2、嗜酸性粒細(xì)胞主要堿性蛋 白、嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白、PANCA、Amadori蛋白、IV型膠原、糖化脂質(zhì)、Y -干擾素、A7、 P-糖蛋白和化s(AFO-l) W及氧化型-LDL。
[0107] 在某些實(shí)施方式中，目標(biāo)蛋白可W是與抗原結(jié)合的抗體或其片段（抗原的非限制 性例子如上文所示）?？贵w或其片段可W是多克隆的、單克隆的動(dòng)物源（例如鼠源、家兔、駱 駝）、人源（例如全人源）、嵌合的、人源化、可變區(qū)、CDR、ScFv、雙特異性的、雙價(jià)抗體或具有 抗原結(jié)合能力的其他形式的抗體。
[010引可W在納米結(jié)構(gòu)形成過(guò)程中或之后引入有效載荷。例如，當(dāng)通過(guò)娃焼化過(guò)程形成 納米結(jié)構(gòu)時(shí)，可W將有效載荷（例如英光化合物）引入娃焼化系統(tǒng)中，W使得在娃焼化過(guò)程 中將所述有效載荷引入納米結(jié)構(gòu)中。對(duì)于另一個(gè)例子，可W在例如溶液、分散液、混息液、乳 劑等中將有效載荷與易于形成的納米結(jié)構(gòu)混合W便將所述有效載荷慘入納米結(jié)構(gòu)的多孔 性部分中或者使得所述有效載荷與納米結(jié)構(gòu)上的官能團(tuán)綴合。
[0109] 在某些實(shí)施方式中，至少一個(gè)有效載荷可W與所述多孔性結(jié)構(gòu)結(jié)合。例如，僅一組 有效載荷與所述多孔性結(jié)構(gòu)結(jié)合。對(duì)于另一個(gè)例子，第一個(gè)有效載荷和第二個(gè)有效載荷與 所述多孔性結(jié)構(gòu)結(jié)合。盡管有效載荷均選自下組可檢測(cè)劑、祀向部分、結(jié)合伴侶、生物活性 齊U、藥物、治療劑、放射劑、化學(xué)劑、小分子藥物、生物藥（例如膚、蛋白、抗體、抗原、核酸、適 體等）；但是第一有效載荷與第二有效載荷不同。例如，所述第一有效載荷是祀向劑，其使 得所述納米結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合至或與祀向位點(diǎn)（例如癌細(xì)胞）結(jié)合，W及所述第二有效載荷 是可檢測(cè)劑（用于診斷）或治療劑（用于治療）。
[0110] 在某些實(shí)施方式中，第一有效載荷與多孔性結(jié)構(gòu)在所述結(jié)構(gòu)的一個(gè)區(qū)域結(jié)合并且 第二有效載荷與多孔性結(jié)構(gòu)在所述結(jié)構(gòu)的另一個(gè)區(qū)域結(jié)合，W使得所述納米結(jié)構(gòu)可W是相 對(duì)于納米結(jié)構(gòu)中有效載荷的分布是具有方向的或定向的。該種位點(diǎn)選擇性修飾可W通過(guò)將 所述多孔性結(jié)構(gòu)沉積于襯底上，然后使用保護(hù)性聚合物層（如聚（3-己基-喔吩）（P3HT) 和聚（甲基丙帰酸甲醋））部分涂覆所述襯底來(lái)實(shí)現(xiàn)，在位點(diǎn)選擇性修飾完成后可W使用 某些溶劑如氯仿或化巧將所述護(hù)性聚合物層溶解。（Liu H.等，nano letters, 2004, vol 4.，2397-2401)。第二修飾可W在保護(hù)層被去除并且經(jīng)過(guò)修飾的納米結(jié)構(gòu)被暴露后使用不 同的有效載荷進(jìn)行進(jìn)一步的修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)。而且，可W將所述納米結(jié)構(gòu)沉積于與可裂解分 子鍵合的襯底上，例如光可裂解分子如光可裂解生物素胺響應(yīng)標(biāo)記試劑（WWW. ambergen. com)，然后在位點(diǎn)選擇性修飾后可W釋放所述納米結(jié)構(gòu)。此外，在與可裂解接頭分子結(jié)合的 襯底上，所述納米結(jié)構(gòu)能夠在第一位點(diǎn)選擇性修飾（SSM1)后被釋放。SSM1可W包括在下一 位點(diǎn)選擇性修飾步驟中用于將SSM1修飾的區(qū)域與襯底連接的官能團(tuán)和用于信號(hào)產(chǎn)生、藥 物或其他功能性目的的有效載荷。在SSM2中可W重復(fù)該過(guò)程。通過(guò)控制保護(hù)性聚合物層 的厚度，可W實(shí)現(xiàn)第3個(gè)、第4個(gè)或更多的位點(diǎn)選擇性修飾步驟W使得所述納米結(jié)構(gòu)具有多 個(gè)不同的有效載荷區(qū)域。 ?！璢由所沐流巧制各的產(chǎn)品
[0112]本申請(qǐng)的另一個(gè)方面涉及由本申請(qǐng)?zhí)峁┑娜我夥椒ㄖ苽涞募{米結(jié)構(gòu)。使用本申請(qǐng) 所描述的方法和/或本領(lǐng)域公知的常規(guī)方法，本申請(qǐng)制備的所述納米結(jié)構(gòu)可W被任選地分 離、純化、干燥或與一種或多種有效載荷結(jié)合。本申請(qǐng)制備的納米結(jié)構(gòu)可W進(jìn)一步針對(duì)3-D 結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，如所述3-D結(jié)構(gòu)的密度、孔隙度、表面積、厚度等。任選地，有效載荷也可W W如有效載荷的量或有效載荷的可檢測(cè)信號(hào)表征。
[011引 IDed納米結(jié)構(gòu)
[0114] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及組合物，所述組合物包含具有已知特征的多孔性納米結(jié) 構(gòu)和具有已知序列的核酸片段。在某些實(shí)施方式中，所述多孔性納米結(jié)構(gòu)已在申請(qǐng)?zhí)枮?61/589, 777的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)中被公開(kāi)（在本申請(qǐng)中引用的所有參考文獻(xiàn)均整體并入 本申請(qǐng)）。在某些實(shí)施方式中，所述多孔性納米結(jié)構(gòu)具有如本申請(qǐng)所公開(kāi)的特征。
[0115] 在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝私M合物，所述組合物包含第一 IDed多孔性納米 結(jié)構(gòu)和第一段核酸，其中所述核酸與所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合。在本申請(qǐng)中使用的術(shù) 語(yǔ)"IDed"指所述多孔性納米結(jié)構(gòu)與已知代碼或已知標(biāo)記結(jié)合，該使所述多孔性納米結(jié)構(gòu)能 夠被鑒定。在本申請(qǐng)中使用的"代碼"指能夠產(chǎn)生將一個(gè)IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與另一個(gè)相 區(qū)分的可檢測(cè)信號(hào)的分子。
[0116] 可W基于多路復(fù)用光學(xué)編碼系統(tǒng)對(duì)給定的納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征或鑒定，其已在Han 等，化1:山"6 Biotechnology, Vol. 19, pp:631-635 (2001)或申請(qǐng)?zhí)枮?10/185, 226 的美國(guó)專 利中公開(kāi)。簡(jiǎn)言之，將多色半導(dǎo)體量子點(diǎn)（孤）嵌入所述多孔性納米結(jié)構(gòu)中。各孤具有給定 的強(qiáng)度（在例如0-10的水平W內(nèi)）和給定顏色（波長(zhǎng)）。對(duì)于各單色代碼而言，所述多孔 性納米結(jié)構(gòu)具有不同的孤強(qiáng)度，該強(qiáng)度該取決于嵌入其中的孤數(shù)。如果使用多色（n色） 和多強(qiáng)度（m個(gè)強(qiáng)度水平）的孤，則所述多孔性納米結(jié)構(gòu)可具有獨(dú)特標(biāo)識(shí)或代碼的總數(shù)等于 m的n次幕減1 (mn-1)。此外，因?yàn)樗龆嗫仔越Y(jié)構(gòu)能夠與附加的有效載荷（例如英光有機(jī) 分子）結(jié)合，所W如果能夠得到Y(jié)個(gè)附加的英光顏色，則代碼的總數(shù)可W是YX (nf-1)。
[0117] 可選地或者附加地，給定IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)的鑒定可W基于與其結(jié)合的英光 有效載荷?？蒞將不同顏色的英光有效載荷嵌入所述多孔性納米結(jié)構(gòu)中，W便產(chǎn)生由不同 的英光顏色或信號(hào)編碼的不同IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)（參見(jiàn)例如圖9)。
[011引在某些實(shí)施方式中，所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)具有磁性性質(zhì)。磁性性質(zhì)能夠促進(jìn) 使用磁性相互作用操縱（例如分離或遞送）所述納米結(jié)構(gòu)。磁性IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)能 夠包含一個(gè)或一簇SIP0納米粒子作為核納米粒子。當(dāng)置于強(qiáng)磁場(chǎng)例如來(lái)自高場(chǎng)和/或高 梯度磁體的磁場(chǎng)時(shí)，所述磁性IDed納米結(jié)構(gòu)能夠被吸引至或磁性導(dǎo)向至祀向位點(diǎn)。例如， 可W將磁體（例如磁性網(wǎng)格）置于所述納米結(jié)構(gòu)的附近W吸引所述磁性納米結(jié)構(gòu)。
[0119] 在某些實(shí)施方式中，IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與至少一段核酸結(jié)合。所述核酸的片段 能夠與IDed多孔性結(jié)構(gòu)W非共價(jià)相互作用（例如氨鍵、離子鍵等）或共價(jià)相互作用結(jié)合。 在某些實(shí)施方式中，所述核酸結(jié)合至所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)上的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)?？?W使用如本申請(qǐng)所述的任意官能團(tuán)（例如氨基、駿基、琉基、麟酸醋基、生物素、抗生物素蛋 白鏈菌素、親和素、輕基、焼基或其他分子、接頭或基團(tuán)）。在某些實(shí)施方式中，所述核酸通過(guò) 抗生物素蛋白鏈菌素-生物素相互作用與所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合。例如，所述IDed 多孔性納米結(jié)構(gòu)在其表面上具有抗生物素蛋白鏈菌素，并且所述核酸與生物素綴合。將該 兩者組合后，生物素蛋白鏈菌素緊密地與親和素結(jié)合，W使得所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與 所述核酸的片段結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了一種能夠通過(guò)在所述IDed多孔 性納米結(jié)構(gòu)上的一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)（例如抗生物素蛋白鏈菌素、生物素、氨基、駿基、琉基、 麟酸醋基等）與核酸結(jié)合的IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)。所述核酸片段可W是適宜長(zhǎng)度的，例如 至少日、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或 更多的堿基。
[0120] 在某些實(shí)施方式中，所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與具有已知序列的核酸片段結(jié)合。 所述核酸可W是引物或序列探針或用于檢測(cè)的片段。
[0121] 在某些實(shí)施方式中，所述與核酸結(jié)合的IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)具有磁性性質(zhì)。
[0122] 在某些實(shí)施方式中，所述組合物還包括第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)和第二核酸，其 中所述第二核酸與所述第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合并且其與所述第一核酸互補(bǔ)，并且 其中所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)不是所述第一納米結(jié)構(gòu)。所述第一和第二IDed多孔性納米結(jié) 構(gòu)可W具有不同的編碼信號(hào)，W使得當(dāng)分離時(shí)能夠?qū)⑵浔舜藚^(qū)分開(kāi)。所述第一和所述第二 核酸能夠彼此雜交，W使得所述第一和所述第二Ided多孔性納米結(jié)構(gòu)之間能夠結(jié)合。
[0123] 在某些實(shí)施方式中，所述第一核酸可W是已知序列的探針，并且所述第二核酸可 W是樣品核酸。如果所述樣品核酸結(jié)合至所述探針，則所述第一和所述第二IDed納米結(jié)構(gòu) 能夠結(jié)合，其表現(xiàn)為所述第一和所述第二納米結(jié)構(gòu)編碼信號(hào)的共定位。因此，所述第一和所 述第二IDed納米結(jié)構(gòu)的結(jié)合表明所述樣品核酸與所述探針序列雜交或者包含所述探針序 列的互補(bǔ)序列。
[0124] 所述第一和所述第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)兩者之中任一個(gè)可W是磁性的?？蒞 應(yīng)用磁場(chǎng)W分離與所述第一和所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合的產(chǎn)物?？蒞對(duì)進(jìn)一步觀察所 述分離的產(chǎn)物的該兩種編碼信號(hào)，并且存在該兩個(gè)信號(hào)的共定位表明存在結(jié)合。
[01巧]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及包含第一 IDed納米結(jié)構(gòu)和第二IDed納米結(jié)構(gòu)的混合 物，其中所述第一 IDed納米結(jié)構(gòu)與第一核酸結(jié)合并且所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)與第二核酸 結(jié)合。在某些實(shí)施方式中，所述第一和第二納米結(jié)構(gòu)均是磁性的。在某些實(shí)施方式中，所述 混合物還包含第H IDed納米結(jié)構(gòu)，其中所述第H IDed納米結(jié)構(gòu)與第H核酸結(jié)合并且其與 所述第一或第二核酸互補(bǔ)。在某些實(shí)施方式中，所述第H納米結(jié)構(gòu)是磁性的。
[0126] 多個(gè)已知序列的探針可W分別與不同的IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，該樣一個(gè)ID對(duì)應(yīng)于 一個(gè)探針。樣品核酸可W與更多IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，然后與所述IDed納米結(jié)構(gòu)上的多個(gè) 探針混合。如果所述樣品核酸與任意的所述探針雜交，則所述IDed納米結(jié)構(gòu)相應(yīng)的編碼信 號(hào)能夠彼此關(guān)聯(lián)地被檢測(cè)。在該種方法中，所述樣品核酸能夠在一個(gè)反應(yīng)中針對(duì)不同的探 針被篩選。在某些實(shí)施方式中，任意或全部的所述IDed納米結(jié)構(gòu)可W是磁性的。例如，與 所述樣品核酸結(jié)合的所述IDed納米結(jié)構(gòu)可W是磁性的。在雜交反應(yīng)后，可W通過(guò)磁性相互 作用將所述樣品核酸分離，并且可W檢測(cè)編碼信號(hào)W鑒定與所述樣品核酸雜交的探針。
[0127] 在某些實(shí)施方式中，在US7, 910, 354中公開(kāi)的所述捕獲探針或多核巧酸多連體可 W沉積或連接或結(jié)合至所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)，并且用于形成擴(kuò)增的DNA簇。
[012引在某些實(shí)施方式中，所述探針可W與所述IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合或連接。在常規(guī)技術(shù) 中，使用一組四種英光顏色表示單個(gè)核巧酸的變化（參見(jiàn)圖6,現(xiàn)有技術(shù)，F(xiàn)-英光）。在本 發(fā)明中，由于所述納米結(jié)構(gòu)能夠與總數(shù)為YOif-l)的代碼結(jié)合，因此能夠制備具有4的指數(shù) 倍代碼的探針并且用于例如測(cè)序。如圖6所示，對(duì)于待檢測(cè)的兩個(gè)連續(xù)的核巧酸而言，16個(gè) (4X4) IDed納米結(jié)構(gòu)能夠與各探針結(jié)合并且均可W基于其上的編碼進(jìn)行檢測(cè)（N-IDed納 米結(jié)構(gòu)）。同樣地，可W通過(guò)使用64個(gè)不同編碼的IDed納米結(jié)構(gòu)對(duì)H個(gè)連續(xù)的核巧酸進(jìn)行 檢測(cè)。對(duì)于待檢測(cè)的Z數(shù)量的連續(xù)核巧酸而言，可W使用4Z個(gè)不同的IDed納米結(jié)構(gòu)，直到 4z<YX(mn-l)。在某些實(shí)施方式中，已知的核巧酸片段與IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合或連接。如圖 7所示，具有突變的DNA片段與所述IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，并且與來(lái)自主體或樣品（例如細(xì)胞 或組織或器官）的DNA片段接觸?？蒞進(jìn)一步使用單鏈DNA核酸內(nèi)切酶（例如S1核酸內(nèi) 切酶）處理雜交溶液。使用雙鏈DNA染料進(jìn)一步處理混合溶液。檢測(cè)在已知的IDed納米 結(jié)構(gòu)上雙鏈DNA的存在情況表明在所述主體或樣品中DNA的存在情況，從而表明與所述DNA 相關(guān)的病情（例如SNP或疾病病情）的存在情況。在對(duì)雙鏈DNA存在情況的檢測(cè)中，可W 在使雙鏈DNA變性的溫度下檢測(cè)所述樣品，并且在使雙鏈DNA穩(wěn)定的第二溫度下再次檢測(cè)， 不同的發(fā)射光表明在所述IDed納米結(jié)構(gòu)中存在雙鏈DNA。
[0129] 在某些實(shí)施方式中，與核酸片段結(jié)合的所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)還包含磁性粒 子，并且所述磁性粒子與所述核酸的一端結(jié)合而且所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與所述核酸 的另一端結(jié)合。所述磁性粒子能夠促進(jìn)所述核酸的操縱，并且所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)能 夠提供所述核酸的檢測(cè)或鑒定?？蒞使用適宜的方法制備該種不同綴合的核酸。在某些實(shí) 施方式中，所述核酸的各端均具有不同的官能團(tuán)，其使得能夠選擇性地綴合所述IDed多孔 性納米結(jié)構(gòu)或所述磁性粒子。在某些實(shí)施方式中，所述核酸的一端被綴合時(shí)另一端被保護(hù)， 然后再去保護(hù)W進(jìn)行進(jìn)一步的綴合。如圖8所示，探針片段（單鏈）在兩個(gè)末端上與IDed 納米結(jié)構(gòu)和磁性粒子（例如磁性納米結(jié)構(gòu)）連接并且與來(lái)自主體或樣品的片段雜交。然后 使用對(duì)單鏈DNA具有特異性的核酸內(nèi)切酶處理雜交混合物。如果所述探針片段與來(lái)自所述 樣品的片段雜交，則在存在所述核酸酶的條件下所述復(fù)合物是完好的。如果未發(fā)生雜交，貝U 所述探針片段被裂解并且所述IDed納米結(jié)構(gòu)與所述磁性粒子分離。然后使用磁場(chǎng)處理所 述混合物。對(duì)所述IDed納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)（如果存在雜交），并且所述編碼信號(hào)表明與所 述主體或所述樣品中的病情對(duì)應(yīng)的祀DNA的存在。如果不存在雜交，則僅會(huì)拉下未與IDed 納米結(jié)構(gòu)結(jié)合的所述磁性粒子，并且不能檢測(cè)到編碼。
[0130] 在某些實(shí)施方式中，多個(gè)引物或探針能夠與單一 IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合。例如，IDed 納米結(jié)構(gòu)攜帶一對(duì)引物并進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。可W對(duì)擴(kuò)增子的存在情況（例如通 過(guò)雙鏈DNA染料）進(jìn)行檢測(cè)和定量。如果在PCR混合物中使用了多重IDed納米結(jié)構(gòu)（均 具有一對(duì)引物），則可W進(jìn)行多重實(shí)時(shí)PCR，可W對(duì)各擴(kuò)增子的存在情況和量進(jìn)行檢測(cè)。
[0131] 本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)"雙鏈DNA染料"指（1)與DNA片段關(guān)聯(lián)并且（2)在雙鏈形 式存在時(shí)與在單鏈形式存在時(shí)發(fā)射不同波長(zhǎng)的英光染料。在存在雙鏈DNA時(shí)所述染料的 發(fā)射增加并且當(dāng)雙螺旋DNA解旋時(shí)其發(fā)射降低。示例包括但不限于，漠化己錠、Y0-PR0-1、 Hoechst 33258、SYBR Gold和SYBR Green I。雙鏈DNA嵌入染料不與引物或核酸模板共 價(jià)連接。漠化己錠是一種英光化學(xué)物質(zhì)，其嵌入雙鏈DNA片段中的堿基對(duì)之間，并且常用于 在凝膠電泳后檢測(cè)DNA。在254nm和366nm之間的紫外光的激發(fā)下，其在590nm發(fā)射英光。 DNA-漠化己錠復(fù)合物產(chǎn)生的英光比在存在單鏈DNA時(shí)的漠化己錠強(qiáng)約50倍。SYBR Green I在497皿下激發(fā)和在520皿下發(fā)射。與單鏈DM相比，與雙鏈DM結(jié)合后SYBR Green I的 英光強(qiáng)度增加超過(guò)100倍。作為SYBR Green I的替代的是分子探針有限公司（Molecular Probes Inc.)推行的 SYBR Gold。與 SYBR Green I 類似，在雙螺旋 DM 存在時(shí) SYBR Gold 的英光發(fā)射增強(qiáng)，并且當(dāng)雙鏈DM解旋時(shí)降低。但是，SYBR Gold的激發(fā)峰在495nm和發(fā)射 峰在537nm。據(jù)報(bào)道SYBR Gold似乎比SYBR Green I更加穩(wěn)定。Hoechst 33258是一種已 知的雙苯甲亞胺雙鏈DNA染料，其與DNA雙螺旋中富含AT的區(qū)域結(jié)合。化echst 33258在 350nm激發(fā)和在450nm發(fā)射。Y0-PR0-1在450nm激發(fā)和在550nm發(fā)射，據(jù)報(bào)道其是雙鏈DNA 特異性染料。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述雙鏈DNA染料是SYBR Green I。
[0132] 在某些實(shí)施方式中，探針能夠與第一 IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，并且樣品核酸能夠與第 二納米結(jié)構(gòu)結(jié)合。如圖10所示，所述第一和所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)在代碼上是不同的，例 如一個(gè)是紅色，另一個(gè)是綠色。所述第一探針-IDed納米結(jié)構(gòu)和所述第二樣品-IDed納米 結(jié)構(gòu)混合W進(jìn)行雜交。如果所述探針和所述樣品核酸彼此之間雜交，則可W檢測(cè)到所述第 一和所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)的結(jié)合或共定位。
[0133] 在某些實(shí)施方式中，當(dāng)所述第一探針和所述第二探針能夠與樣品核酸相應(yīng)的部分 雜交（例如所述第一探針與所述樣品的前一半雜交，并且所述第二探針與所述樣品的后一 半雜交）的情況下，第一探針能夠與第一 IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，并且第二探針能夠與第二 IDed納米結(jié)構(gòu)結(jié)合。如圖13所示，所述第一和所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)的編碼信號(hào)不同，例 如一個(gè)是紅色和另一個(gè)是綠色。如果所述樣品核酸存在，則所述第一和所述第二探針均能 夠與所述樣品核酸結(jié)合，從而會(huì)檢測(cè)到所述第一和所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)的結(jié)合或共定 位。
[0134] 在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明還提供了含有第一 IDed納米結(jié)構(gòu)和第二IDed納米結(jié) 構(gòu)的混合物，其中所述第一 IDed納米結(jié)構(gòu)具有第一編碼信號(hào)和所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)具 有第二編碼信號(hào)。在某些實(shí)施方式中，所述第一 IDed納米結(jié)構(gòu)具有磁性性質(zhì)，而所述第二 IDed納米結(jié)構(gòu)不具有。 。"引 檢測(cè)巧/或體巧方法
[0136] 在某些實(shí)施方式中，能夠同時(shí)使用和檢測(cè)如本申請(qǐng)所述的單一或多種IDed納米 結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地在混合物或溶液中。可W檢測(cè)與核酸、引物、探針或片段結(jié)合的所述IDed納米 結(jié)構(gòu)。
[0137] 本申請(qǐng)的另一個(gè)方面涉及在溶液中同時(shí)檢測(cè)多種IDed納米結(jié)構(gòu)的編碼信號(hào)的方 法，所述方法包括將源于溶液的光線通過(guò)微透鏡陣列導(dǎo)向光傳感器陣列，其中所述溶液含 有多種IDed納米結(jié)構(gòu)，并且處理所述光數(shù)據(jù)W鑒定溶液中的各種IDed納米結(jié)構(gòu)。所述方法 可W用于同時(shí)或?qū)崟r(shí)檢測(cè)溶液中的（不需要陣列或襯底）納米結(jié)構(gòu)或多種納米結(jié)構(gòu)的編碼 信號(hào)（強(qiáng)度和顏色）。例如，如在專利號(hào)為7,936, 392的美國(guó)專利中所公開(kāi)的，將光源透過(guò) 含有多種IDed納米結(jié)構(gòu)的溶液，并且利用光傳感器檢測(cè)透過(guò)光的值。然后通過(guò)成像裝置收 集光數(shù)據(jù)，并通過(guò)軟件進(jìn)行處理W促進(jìn)聚焦和光學(xué)校正。該樣，只需使光單次通過(guò)就可W記 錄關(guān)于所述IDed納米結(jié)構(gòu)的信息（例如顏色和強(qiáng)度），而無(wú)需在各焦平面上聚焦成像。同 樣的圖像計(jì)算也被用于顯微鏡中。在微觀環(huán)境下，通過(guò)將源于微透鏡陣列的光導(dǎo)向光傳感 器陣列W同時(shí)檢測(cè)來(lái)自溶液的由不同的方向射向不同位置的光，從而對(duì)溶液進(jìn)行成像。然 后對(duì)所述光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析W-次獲得在溶液中所述IDed納米結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)集（詳細(xì)信息參 見(jiàn)專利號(hào)為7, 723, 662的美國(guó)專利）。
[013引本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及一種在表面上檢測(cè)多種IDed納米結(jié)構(gòu)的編碼信號(hào)的方 法，所述方法將所述IDed納米結(jié)構(gòu)由溶液中聚集到所述表面上。所述聚集可W基于化學(xué)相 互作用，例如在所述IDed納米結(jié)構(gòu)和所述表面上相應(yīng)的官能團(tuán)之間形成共價(jià)鍵，或生物相 互作用，例如生物素-抗生物素蛋白鏈菌素相互作用，其通過(guò)在所述表面上制備適宜生物 分子的功能性陣列來(lái)實(shí)現(xiàn)。所述聚集還可W基于磁性相互作用。例如，可W將所述IDed納 米結(jié)構(gòu)與磁性粒子結(jié)合，所述磁性納米粒子在外加磁場(chǎng)下能夠被吸引。使用所述IDed納米 結(jié)構(gòu)的磁性內(nèi)容物與可磁化的或磁性的網(wǎng)格之間的相互作用還能夠W有序陣列的形式將 所述IDed納米結(jié)構(gòu)聚集于表面上。所述IDed納米結(jié)構(gòu)由溶液聚集至表面上能夠極大地改 善或促進(jìn)所述IDed納米結(jié)構(gòu)的檢測(cè)和/或定量。例如，所述IDed納米結(jié)構(gòu)在表面上的聚 集使得所述IDed納米結(jié)構(gòu)能夠在顯微鏡下的單一視野中成像和觀察，而相反的是，在溶液 中離散的IDed納米結(jié)構(gòu)可能難W在顯微鏡下成像或定量。
[0139] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及IDed納米結(jié)構(gòu)編碼信號(hào)的檢測(cè)。盡管將所述IDed納米 結(jié)構(gòu)置于襯底上并不是必需的（例如如本申請(qǐng)所述的基于溶液的檢測(cè)），但是可W將所述 IDed納米結(jié)構(gòu)置于襯底上（同樣的，可W將DNA納米球或其他常規(guī)納米粒子置于所述襯底 上），并且在所述IDed納米結(jié)構(gòu)置于襯底上之后再進(jìn)行檢測(cè)。在某些實(shí)施方式中，所述IDed 納米結(jié)構(gòu)能夠分布于磁性襯底上（例如磁性網(wǎng)格）。
[0140] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及形成擴(kuò)增的DNA序列的方法，所述方法包括在存在模板 DNA和IDed納米結(jié)構(gòu)混合物的條件下延伸引物，其中各個(gè)IDed納米結(jié)構(gòu)與獨(dú)特的代碼和兩 個(gè)或H個(gè)相鄰核巧酸的獨(dú)特組合結(jié)合。如圖6所示，可W使用一系列IDed納米結(jié)構(gòu)，并且 每個(gè)均代表核巧酸的獨(dú)特組合。通過(guò)與所述模板DNA配對(duì)，所述引物與所述核巧酸的組合 在所述IDed納米結(jié)構(gòu)上延伸，然后其編碼信號(hào)標(biāo)識(shí)所述獨(dú)特的組合，從而標(biāo)識(shí)模板DNA的 序列。
[0141] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在樣品或主體中檢測(cè)病情的方法，所述方法包括；將來(lái) 自所述樣品或所述主體的DNA片段與同核酸結(jié)合的所述組合物雜交，并檢測(cè)在所述IDed納 米結(jié)構(gòu)中雙鏈DNA的存在情況，其表明在所述樣品或主體中病情的存在情況。在某些實(shí)施 方式中，所述核酸包含已知的突變，所述突變與所述病情相關(guān)。例如，所述突變的存在可W 表明在所述樣品或所述主體中病情的存在，或者反之亦然?？蒞將所述核酸設(shè)計(jì)為在適宜 的溫度范圍下與含有所述突變的DNA選擇性配對(duì)，但是其不與缺乏所述突變的DNA配對(duì)。當(dāng) 用限制性內(nèi)切酶處理時(shí)，所述缺乏突變的未配對(duì)的樣品DNA和在所述納米結(jié)構(gòu)上也未配對(duì) 的核酸將被消化?？蛇x地或者附加地，可W使用雙鏈DNA染料檢測(cè)雙鏈雜交產(chǎn)物的存在情 況。
[0142] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及在樣品或主體中檢測(cè)病情的方法，所述方法包括；將來(lái) 自所述樣品或所述主體的DNA片段在溶液中與同核酸結(jié)合的所述組合物雜交，將單鏈核酸 內(nèi)切酶加入所述溶液中，將所述溶液置于磁場(chǎng)中，并檢測(cè)IDed納米結(jié)構(gòu)的存在情況或編碼 信號(hào)，其表明在所述樣品或主體中病情的存在情況。在某些實(shí)施方式中，所述核酸的一端與 磁性粒子結(jié)合，并且所述核酸的另一端與IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合。所述核酸還可W包含 與所述病情相關(guān)的已知的突變，并且能夠通過(guò)與具有（或不具有）所述突變的所述樣品DNA 選擇性配對(duì)，從而將其設(shè)計(jì)成表明在樣品DNA中所述突變的存在情況。在雜交后，所述核酸 內(nèi)切酶將消化在所述IDed納米結(jié)構(gòu)上未配對(duì)的核酸，W便將所述磁性粒子和所述IDed納 米結(jié)構(gòu)分離。當(dāng)置于磁場(chǎng)中時(shí)，結(jié)合或未結(jié)合所述IDed納米結(jié)構(gòu)表面上核酸的磁性粒子將 被分離，并且對(duì)所述IDed納米結(jié)構(gòu)編碼信號(hào)存在情況的檢測(cè)將表明所述核酸與所述樣品 DM的配對(duì)情況，W表明存在或不存在所述突變W及所關(guān)注的病情。
[0143] 本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及檢測(cè)核酸與檢測(cè)劑相互作用的方法，其中所述核酸與具 有第一編碼信號(hào)的第一 IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，并且所述檢測(cè)劑與具有第二編碼信號(hào) 的第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合。所述方法包括將所述第一 IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與所述 第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，并且檢測(cè)所述第一和所述第二編碼信號(hào)的相互作用。例 女口，如果所述核酸與所述檢測(cè)劑結(jié)合，則可W檢測(cè)到所述第一和所述第二編碼信號(hào)的共定 位。所述檢測(cè)劑可W是任意適宜的生物學(xué)或化學(xué)試劑，例如核酸、蛋白、膚、適體、化學(xué)化合 物、抗體等。在某些實(shí)施方式中，所述第一和所述第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)在溶液中接觸。 在某些實(shí)施方式中，所述方法還包括將所述第一和所述第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)由溶液 中聚集至表面上（例如通過(guò)使用磁性網(wǎng)格、磁體等）。
[0144] 在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{米結(jié)構(gòu)可W用于制備治療或診斷組合物。
[0145] 在某些實(shí)施方式中，所述納米結(jié)構(gòu)可W用于遞送一種或多種治療劑。例如，所述納 米結(jié)構(gòu)可W用于提供治療劑的所需的遞送（例如祀向遞送）和/或其所需的釋放（例如 緩釋和/或控釋）。所述納米結(jié)構(gòu)可W通過(guò)適宜的途徑（例如靜脈、腹腔、肌內(nèi)、皮內(nèi)、皮下 (sub州taneous)、透皮、皮下（subdermal)、頗內(nèi)、鼻內(nèi)、粘膜、化內(nèi)、陰道、口服、舌下、口腔或 鼻）遞送至主體。適于治療用途的納米結(jié)構(gòu)可W包括一種或多種治療劑，其作為結(jié)合的有 效載荷或作為綴合的分子（例如前藥）。任選地，為了祀向遞送，所述納米結(jié)構(gòu)可W進(jìn)一步 包括祀向部分。
[0146] 為了診斷用途，所述納米結(jié)構(gòu)還可W用在的樣品（例如體內(nèi)或離體）上。例如，可 W在適宜條件下將所述納米結(jié)構(gòu)用于或與樣品接觸，所述條件允許與在樣品中疑似存在的 其祀分子（例如針對(duì)某病情的生物標(biāo)記物、標(biāo)記物抗原、病原體和/或病毒基因序列）發(fā)生 預(yù)期的反應(yīng)（例如雜交、擴(kuò)增、親和結(jié)合、染色等）?？蒞檢測(cè)或測(cè)定所述反應(yīng)的存在情況 和/或程度，W提供存在或不存在所述祀分子和/或該種祀分子的量（例如濃度）的信息。 在該種診斷用途中使用的所述納米結(jié)構(gòu)可W包括能夠與目標(biāo)祀分子反應(yīng)的試劑。該種試劑 可W是結(jié)合伴侶如抗體、抗原、適體、核酸、探針、化學(xué)或其他適宜的試劑。該種試劑可W作 為有效載荷與所述納米結(jié)構(gòu)結(jié)合和/或與所述納米結(jié)構(gòu)綴合。任選地，所述納米結(jié)構(gòu)可W 進(jìn)一步包括可檢測(cè)標(biāo)記，其使得可W對(duì)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)。
[0147] 在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{米結(jié)構(gòu)可W用于制備用于在定性或定量檢測(cè) 中使用的試劑。例如，可W將所述納米結(jié)構(gòu)用于與待分析物接觸，并且從而使得能夠?qū)Υ?析物進(jìn)行鑒定和/或定量。所述待分析物可W是能夠被檢測(cè)的任意物質(zhì)，例如化學(xué)制品、 爆炸物（例如TNT)、藥物（例如可卡因、海洛因、大麻等）、有害物質(zhì)、金屬離子（例如重金 屬離子）、污染物、有機(jī)化合物、己醇、合成代謝類固醇、質(zhì)子、一氧化氮、血糖和代謝產(chǎn)物等。 所述待分析物可W是任意適宜的樣品形式，例如W生物樣本（例如尿、汗液、呼氣、頭發(fā)、唾 液和血液）、環(huán)境樣本（例如河水、±壤和空氣）或?qū)嶒?yàn)室樣本（例如溶于實(shí)驗(yàn)室的緩沖液 中）的形式。適于該種分析用途的所述納米結(jié)構(gòu)可W包含可檢測(cè)劑（例如作為有效載荷或 作為綴合分子），其使得能夠?qū)λ龃治鑫镞M(jìn)行鑒定和/或定量，并且該種可檢測(cè)劑可W 由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)針對(duì)所述待分析物公知的檢測(cè)方法適當(dāng)?shù)剡x擇出來(lái)。
[014引在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{米結(jié)構(gòu)可W用于制備用于在分子成像中使用 的試劑。例如，本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{米結(jié)構(gòu)可W在體內(nèi)或體外通過(guò)適宜的途徑（例如靜脈、動(dòng) 脈、口服、皮膚應(yīng)用、皮下、肌內(nèi)、腹腔）給予主體（例如哺乳動(dòng)物、人或其他動(dòng)物），隨后使用 適宜的裝置檢測(cè)如X-射線裝置、MRI裝置、CT裝置，或者用于光學(xué)成像、光學(xué)相干斷層掃描、 計(jì)算機(jī)斷層掃描或正電子發(fā)射斷層掃描的裝置對(duì)所述主體成像?？蒞對(duì)所產(chǎn)生的圖像進(jìn)行 進(jìn)一步分析W提供所給予的納米結(jié)構(gòu)在主體中或者在所述主體的目標(biāo)組織、器官或腔室中 的分布情況。用于分子成像的納米結(jié)構(gòu)可W攜帶有效載荷或與有效載荷結(jié)合，所述有效載 荷包括英光分子、生物發(fā)光分子、放射性同位素和/或其他適于用于成像或造影的試劑（關(guān) 于分子成像的綜述可 W參見(jiàn) Weissleder, R 等，Radiology, 219:316-333 (2001))。
[0149] 在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{米結(jié)構(gòu)可W用于制備用于分離、純化或富集 的試劑。例如，所述納米結(jié)構(gòu)可W用于與混合物接觸，所述混合物含有需要分離/純化/富 集的組分。所述目標(biāo)組分可W是，例如細(xì)胞（例如腫瘤細(xì)胞、表達(dá)特異性標(biāo)記物抗原的細(xì) 胞）、蛋白（例如抗體、抗體片段、抗原等）、核酸和化學(xué)化合物等。所述混合物可W是或來(lái) 源于，例如生物樣本（例如血液、血清、血漿、尿液、組織、細(xì)胞提取物、細(xì)胞裂解物）、合成的 化學(xué)產(chǎn)品、草藥或植物提取物等。所述納米結(jié)構(gòu)包括與目標(biāo)組分具有親和性的一種或多種 捕獲劑。例如，所述納米結(jié)構(gòu)可W攜帶例如抗原、抗體、互補(bǔ)的核酸分子、適體W及任意其他 適宜的結(jié)合伴侶或與其綴合?？蒞使用任意適宜的分離方法將具有捕獲于其上的目標(biāo)組分 的納米結(jié)構(gòu)與混合物的其余部分分離，例如通過(guò)過(guò)濾、離也、色譜（例如體積排阻色譜）、應(yīng) 用磁場(chǎng)（例如，針對(duì)包括磁性納米粒子的納米結(jié)構(gòu)）或應(yīng)用電場(chǎng)。任選地，由所述納米結(jié)構(gòu) 捕獲目標(biāo)組分是可逆的，W使得在分離/純化/富集后所述組分可W從納米結(jié)構(gòu)釋放。
[0150] 在某些實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑募{米結(jié)構(gòu)可W用于制備半導(dǎo)體。該種半導(dǎo)體可 W用于光發(fā)射裝置、光電器件、英光標(biāo)記、電極、光伏電池、光學(xué)傳感器和生物傳感器等。該 些應(yīng)用中的一些在 Schmid, G 等在 2011 由 John Wiley&Sons 出版的 NanoparticlesiRrom Theory to Application中進(jìn)行了詳細(xì)描述。 實(shí)施例
[0151] 實(shí)施例1具有低密度娃質(zhì)結(jié)構(gòu)的金和半導(dǎo)體量子點(diǎn)納米粒子的制備
[0152] 低密度娃質(zhì)結(jié)構(gòu)是用于制備生物相容性納米粒子的通用的和靈活的平臺(tái)。例如， 為了將金納米粒子慘入娃質(zhì)結(jié)構(gòu)中，可W使用在水溶液或有機(jī)溶液中合成的Au納米粒子。 簡(jiǎn)言之，在13k巧m下離也15min將Au沉淀于樣品瓶底部，然后加入娃焼分子如氨基丙基 H甲氧基娃焼和四甲基氨氧化胺（TMA0H)。使用更高級(jí)的醇如下醇或丙醇調(diào)節(jié)反應(yīng)溶劑。 然后在持續(xù)通入空氣氣泡條件下將樣品超聲幾小時(shí)，隨后加入陽(yáng)G-娃焼、琉基丙基H甲氧 基娃焼和氨基丙基H甲氧基娃焼，將樣品再超聲2-3小時(shí)。隨后，加入氯代H甲基娃焼、甲 醇和TMA0H或其他僅具有一個(gè)與娃原子連接的焼氧基的娃焼分子的混合物與已經(jīng)生長(zhǎng)的 娃質(zhì)結(jié)構(gòu)表面上存在的表面娃氧基反應(yīng)。經(jīng)過(guò)附加的超聲和老化后，通過(guò)離也過(guò)濾、離也、 透析或任意其他溶液交換方法收集具有高多孔性娃質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定的納米粒子并將其膽存 在生理緩沖溶液中。在TEM下觀察所得到的Au納米結(jié)構(gòu)，示例性的TEM圖像見(jiàn)圖2。所述 納米粒子的核尺寸為約20nm且流體力學(xué)尺寸為約60nm。娃質(zhì)涂層在TEM下不是明顯可見(jiàn) 的。
[0153] 實(shí)施例2具有低密度娃質(zhì)結(jié)構(gòu)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)納米粒子的制備
[0154] 作為另一個(gè)例子，還可W將單個(gè)納米晶或納米晶簇形式的半導(dǎo)體量子點(diǎn)慘入高多 孔性/低密度的娃質(zhì)結(jié)構(gòu)中。例如，通過(guò)加入甲醇然后離也可w將在有機(jī)溶劑如氯仿、甲苯 或己焼中的CdSe/ZnS納米粒子沉淀。然后將納米晶團(tuán)再分散于氨基丙基H甲氧基娃焼或 琉基丙基H甲氧基娃焼中。隨后，加入四甲基氨氧化饋。然后使用更高級(jí)的醇如下醇或丙 醇調(diào)整反應(yīng)溶劑。在將樣品超聲1-4小時(shí)并通入空氣氣泡后，隨后加入少量的氨基丙基H 甲氧基娃焼、琉基丙基H甲氧基娃焼、聚環(huán)氧己焼娃焼和水，然后將樣品再超聲1至4小時(shí)。 然后，加入氯代H甲基娃焼、甲醇和TMAOH或其他僅具有一個(gè)與娃原子連接的焼氧基的娃 焼分子的混合物。然后將該樣品再超聲1-4小時(shí)，隨后在緩慢振動(dòng)或振蕩下老化過(guò)夜。通 過(guò)離也過(guò)濾、離也、透析或任意其他溶液交換方法將所得到的具有低密度/高多孔性娃質(zhì) 結(jié)構(gòu)的納米粒子轉(zhuǎn)移至生理緩沖溶液中。在TEM下觀察所得到的CdSe/ZnS納米結(jié)構(gòu)的示 例性TEM圖像見(jiàn)圖3。所述納米粒子的核尺寸為約lOnm且流體力學(xué)尺寸為約200nm。娃質(zhì) 涂層在TEM下不是明顯可見(jiàn)的。
[0155] 實(shí)施例3低密度磁性粒子的制備和表征 引 磁巧名孔付納米結(jié)構(gòu)的制各:
[0157] 制備通過(guò)將多個(gè)小粒子聚集然后將其涂覆形成的磁性粒子。加入不利于產(chǎn)生分散 的納米粒子的溶劑如下醇或異丙醇W發(fā)生聚集，隨后在持續(xù)通入空氣氣泡條件下加入娃焼 化試劑W形成納米結(jié)構(gòu)。在TEM下觀察制備的磁性納米結(jié)構(gòu)（圖5)。如圖5所示，各個(gè)大 核納米粒子包括較小的納米粒子簇，并且涂層在TEM下基本上是不可見(jiàn)的。 。巧引 涂房密麼的表征:
[0159] 為計(jì)算涂層的密度，對(duì)涂層的干重和體積進(jìn)行表征。
[0160] 由于磁性粒子具有較高的磁性應(yīng)答，能夠使用磁鐵直接將其捕獲。該能夠產(chǎn)生用 于檢測(cè)物質(zhì)質(zhì)量的干粒子。如下所示對(duì)涂覆前后粒子的干重進(jìn)行定量。吸取200ul涂覆粒 子的溶液至已事先稱重的離也管中。將經(jīng)涂覆的磁性納米粒子捕獲至管壁的一側(cè)，并除去 上清液。使用水洗涂所捕獲的粒子。最后，在通風(fēng)樞內(nèi)干燥開(kāi)口的管中吸附至側(cè)壁的粒子。 測(cè)定包括干燥的經(jīng)涂覆粒子的管的質(zhì)量。通過(guò)從內(nèi)部具有干燥的經(jīng)涂覆粒子的管質(zhì)量中減 去管的質(zhì)量計(jì)算干燥的經(jīng)涂覆粒子的質(zhì)量。為測(cè)定涂覆前粒子的質(zhì)量，將與在經(jīng)涂覆的納 米粒子中相同量的磁性材料對(duì)應(yīng)的未經(jīng)涂覆的粒子，假定涂覆過(guò)程的產(chǎn)率為80%，捕獲于 管的側(cè)壁，并干燥。通過(guò)從內(nèi)部具有干燥的未經(jīng)涂覆粒子的管質(zhì)量中減去管的質(zhì)量測(cè)定涂 覆前粒子的干質(zhì)量。涂層的質(zhì)量等于干燥的經(jīng)涂覆粒子的質(zhì)量減去涂覆前粒子的干質(zhì)量。
[0161] 表 1
[0162]

【權(quán)利要求】
1. 一種組合物，所述組合物包含第一 IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)和第一段核酸，其中所述核 酸與所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述核酸是引物、探針或DNA片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物還包含磁性粒子，其中所述磁性粒子與 所述第一核酸的一端結(jié)合并且所述IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與所述第一核酸的另一端結(jié)合。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述第一納米結(jié)構(gòu)是磁性的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，所述組合物還包含第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)和第二 核酸，其中所述第二核酸與所述第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合并且其與所述第一核酸互 補(bǔ)，并且其中所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)不是所述第一納米結(jié)構(gòu)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述第二納米結(jié)構(gòu)是磁性的。
7. -種混合物，所述混合物包含第一 IDed納米結(jié)構(gòu)和第二IDed納米結(jié)構(gòu)，其中所述第 一 IDed納米結(jié)構(gòu)與第一核酸結(jié)合并且所述第二IDed納米結(jié)構(gòu)與第二核酸結(jié)合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的混合物，其中所述第一和第二納米結(jié)構(gòu)均是磁性的。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的混合物，所述混合物還包含第三IDed多孔性結(jié)構(gòu)，其中所述 第三IDed納米結(jié)構(gòu)與第三核酸結(jié)合并且其與所述第一或第二核酸互補(bǔ)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的混合物，其中所述第三納米結(jié)構(gòu)是磁性的。
11. 一種在樣品或主體中檢測(cè)病情的方法，所述方法包括： 將來(lái)自所述樣品或所述主體的DNA片段與權(quán)利要求1所述的組合物雜交，并且 檢測(cè)在所述IDed納米結(jié)構(gòu)中雙鏈DNA的存在情況，所述雙鏈DNA的存在情況表明在所 述樣品或主體中的病情的存在情況。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中在所述組合物中的所述核酸包含與所述病情相 關(guān)的已知的突變。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，所述方法還包括在檢測(cè)雙鏈DNA的存在情況以前，使 用單鏈DNA核酸內(nèi)切酶處理雜交產(chǎn)物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括使用雙鏈DNA染料處理雜交 產(chǎn)物。
15. -種在樣品或主體中檢測(cè)病情的方法，所述方法包括： 在溶液中將來(lái)自所述樣品或所述主體的DNA片段與權(quán)利要求3所述的組合物雜交， 將單鏈核酸內(nèi)切酶加入所述溶液中， 將所述溶液置于磁場(chǎng)中，并且 檢測(cè)IDed納米結(jié)構(gòu)編碼信號(hào)的存在情況，所述編碼信號(hào)的存在情況表明在所述樣品 或主體中的病情的存在情況。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中在所述組合物中的所述核酸包含與所述病情相 關(guān)的已知的突變。
17. -種同時(shí)檢測(cè)溶液中的多種IDed納米結(jié)構(gòu)的編碼信號(hào)的方法，所述方法包括： 將源于溶液的光線通過(guò)微透鏡陣列導(dǎo)向光傳感器陣列，其中所述溶液含有多種IDed 納米結(jié)構(gòu)，并且 處理所述光數(shù)據(jù)以鑒定溶液中的各種IDed納米結(jié)構(gòu)。
18. -種檢測(cè)表面上的多種IDed納米結(jié)構(gòu)的編碼信號(hào)的方法，所述方法包括： 將所述多種IDed納米結(jié)構(gòu)由溶液中聚集到所述表面上。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述聚集基于化學(xué)相互作用。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述聚集基于磁性相互作用。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述組合物的IDed納米結(jié)構(gòu)在外加磁場(chǎng)存在的 條件下被聚集為有序陣列的形式。
22. 根據(jù)權(quán)利要求17-21中任意一項(xiàng)所述的方法，其中至少一種所述IDed納米結(jié)構(gòu)與 至少一段核酸結(jié)合。
23. -種檢測(cè)核酸與檢測(cè)劑相互作用的方法，其中所述核酸與具有第一編碼信號(hào)的第 一 IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)結(jié)合，并且所述檢測(cè)劑與具有第二編碼信號(hào)的第二IDed多孔性納 米結(jié)構(gòu)結(jié)合，所述方法包括： 將所述第一 IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)與所述第二IDed多孔性納米結(jié)構(gòu)接觸，并且 檢測(cè)所述第一編碼信號(hào)與所述第二編碼信號(hào)的相互作用。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，所述方法還包括將所述第一和所述第二IDed多孔性 納米結(jié)構(gòu)從溶液中聚集到表面上。
25. -種形成擴(kuò)增的DNA序列的方法，所述方法包括： 在存在模板DNA及IDed納米結(jié)構(gòu)混合物的條件下延伸引物， 其中各個(gè)IDed納米結(jié)構(gòu)與獨(dú)特的編碼及兩個(gè)或三個(gè)相鄰核苷酸的獨(dú)特組合結(jié)合。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104395471SQ201380020179
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年2月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月19日
【發(fā)明者】付愛(ài)華, 朱堅(jiān) 申請(qǐng)人:納維基因股份有限公司