改進(jìn)了對革蘭氏陰性細(xì)菌的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的脫色的革蘭氏染色方法
【專利摘要】本文中提供將生物材料染色以用于檢測，且在一些例子中還鑒定微生物的目的的方法。使用慢作用脫色制劑，如一種包含1，2-丙二醇或乙二醇的脫色制劑來對細(xì)菌革蘭氏染色的方法可用于延長脫色步驟的時(shí)間，如此允許革蘭氏染色方法的自動化。還提供用于在顯微鏡載玻片上實(shí)施自動化革蘭氏染色的組合物和試劑盒。
【專利說明】改進(jìn)了對革蘭氏陰性細(xì)菌的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物的脫色的革 蘭氏染色方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開涉及，為了檢測微生物以及在一些例子中鑒定微生物的目的，而對生物材 料進(jìn)行染色的方法。更具體地，本公開涉及用于在顯微鏡載玻片上實(shí)施自動化革蘭氏染色 的方法、組合物和試劑盒。
[0002] 置量
[0003] 革蘭氏染色是一種公知的、普遍使用的微生物學(xué)技術(shù)，其用于微生物尤其是細(xì)菌 的檢測、分類和鑒定。革蘭氏染色的最常見方法涉及四個(gè)步驟：染色、捕獲、脫色和復(fù)染色。 組織學(xué)實(shí)驗(yàn)室中常用的革蘭氏染色已知是不穩(wěn)定的，特別是由于脫色步驟中的波動所致。 影響脫色步驟的變量包括溶劑強(qiáng)度、濃度、體積和暴露持續(xù)時(shí)間。在手動革蘭氏染色過程 中，脫色步驟常規(guī)使用醇或丙酮，且該步驟僅需數(shù)秒。然而，對于自動化染色過程，該脫色過 程發(fā)生得太快。本公開針對在自動化染色平臺上的革蘭氏染劑脫色的問題。
[0004] 概沭
[0005] 本文中提供了能自動進(jìn)行革蘭氏染色的方法、組合物和試劑盒。發(fā)明人已鑒定出 延長革蘭氏染色脫色步驟的組合物，其允許革蘭氏染色的自動化，例如，使用自動化的和/ 或計(jì)算機(jī)執(zhí)行的染色裝備來實(shí)現(xiàn)自動化。
[0006] 本文中提供了對樣品（如在顯微鏡載玻片上的樣品）進(jìn)行革蘭氏染色的方法。所 述方法可用于檢測和區(qū)分革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌。在一些例子中，所公開的革 蘭氏染色方法被用于檢測并非細(xì)菌的微生物，如酵母（例如假絲酵母（Candida)和隱球酵 母（Cryptococcus))。
[0007] 在具體的例子中，所述方法包括使樣品與慢作用脫色制劑（如一種包含1，2-丙二 醇或乙二醇的制劑）在足以從革蘭氏陰性細(xì)菌而非革蘭氏陽性細(xì)菌顯著除去初級染劑-捕 獲劑復(fù)合物的條件下接觸。所述樣品是先前與初級染劑（如結(jié)晶紫）和捕獲劑（如碘）接 觸過的樣品。在具體的例子中，所述方法包括革蘭氏染色過程的一個(gè)或多個(gè)另外的步驟， 如使所述樣品與初級染劑在足以將革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜 染色的條件下接觸；使所述樣品與捕獲劑在足以形成初級染劑-捕獲劑復(fù)合物的條件下接 觸；使所述樣品與復(fù)染劑在足以對已脫色的革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行染色的條件下接觸，或其 組合。
[0008] 本文還提供能充當(dāng)慢作用脫色制劑的組合物。在一個(gè)例子中，所述組合物包含至 少80%的慢作用脫色劑（如1，2_丙二醇或乙二醇）和不超過20%的快作用脫色劑（如 0. 1-20 %的快速作用脫色劑，例如乙醇或丙酮）。這類組合物可用作自動化革蘭氏染色中的 慢作用脫色制劑。
[0009] 本文還提供用于自動化革蘭氏染色的試劑盒。在一個(gè)例子中，所述試劑盒在容器 中包含慢作用脫色制劑，如包含至少80%或至少90%的慢作用脫色劑（如1，2-丙二醇或 乙二醇）和不超過20%的快作用脫色劑（如0. 1-20%或1-10%的快速作用脫色劑，例如乙 醇或丙酮）的制劑。在一些例子中，試劑盒可另外包含其他組分，如在容器中的一種或多種 初級染劑；在容器中的捕獲劑；在容器中的復(fù)染劑，顯微鏡載玻片，蓋玻片，其他染劑，和對 照載玻片。在具體的例子中，所述容器配置為與自動化革蘭氏染色平臺一起使用。
[0010] 本公開的前述和其他對象和特征將從下列詳細(xì)描述并參照附圖而變得更加明顯。
[0011] 附圖簡沭
[0012] 圖1是顯示用于自動化革蘭氏染色的例示性方法的流程圖。
[0013] 迸述
[0014] 提供對術(shù)語和方法的以下解釋以更好地描述本發(fā)明及指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員 實(shí)施本發(fā)明。除非上下文清楚地另外指示，單數(shù)形式"一個(gè)"、"一種"和"該"指一種或超過 一種。例如，術(shù)語"包含一個(gè)/ 一種標(biāo)本"包括單數(shù)或復(fù)數(shù)標(biāo)本，且視為等同于短語"包含至 少一種標(biāo)本"。除非上下文清楚地另外指示，術(shù)語"或"指所述備選要素中的單個(gè)要素或者指 兩個(gè)或更多個(gè)要素的組合。如本文中使用的，"包含"意指"包括"。如此，"包含A或B"意 指"包含A、B或A和B"，而不排除別的要素。
[0015] 除非另外解釋，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均具有與本公開所述領(lǐng)域中的 普通技術(shù)人員普遍理解的相同的含義。在有沖突的情況下，將以包括術(shù)語解釋的本說明書 為準(zhǔn)。微生物學(xué)中的常見術(shù)語和方法的解釋可見于Wistreich and Lechtman，Laboratory Exercises in Microbiology (微生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)室手冊），第 6 版，1988 和 Boyd，General Microbiology (微生物學(xué)概述），第2版，1988。
[0016] 本文中提到的所有公開出版物、專利申請、專利和其他參考文獻(xiàn)均通過提述完整 并入以用于所有目的。
[0017] 盡管可將類似或等同于本文中描述的抗體和材料的那些用于實(shí)踐或測試所公開 的技術(shù)，但下文描述了適宜的方法和材料。所述材料、方法和例子僅為例示性的且不意圖為 限制的。
[0018] 為了促進(jìn)對本公開的各實(shí)施方案的評述，提供了對特定術(shù)語的以下解釋：
[0019] 抗體（Ab):包含至少一個(gè)輕鏈或重鏈免疫球蛋白可變區(qū)，且特異性結(jié)合抗原（如 靶試劑）的表位的多肽?？贵w包括單克隆抗體、多克隆抗體、或抗體片段以及本領(lǐng)域已知的 其他抗體。在一些例子中，抗體特異于靶物，如具體細(xì)菌或細(xì)菌類型，如此可與本文中提供 的方法相伴進(jìn)行測定。
[0020] 抗體由重鏈和輕鏈構(gòu)成，它們各自具有可變區(qū)，稱為可變重鏈（VH)區(qū)和可變輕鏈 (VL)區(qū)。VH區(qū)和VL區(qū)一起負(fù)責(zé)結(jié)合抗體所識別的抗原。這包括完整的免疫球蛋白及本領(lǐng) 域公知的它們的變體和組成部分，如Fab'片段、F(ab) ' 2片段、單鏈Fv蛋白（"scFv"）和 被二硫鍵穩(wěn)定的Fv蛋白（"dsFv")。scFv蛋白是一種融合蛋白，其中免疫球蛋白的輕鏈可 變區(qū)和免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)由接頭結(jié)合，而在dsFv中，各個(gè)鏈經(jīng)突變引入了二硫鍵， 從而穩(wěn)定各個(gè)鏈的聯(lián)合。該術(shù)語還包括重組形式如嵌合抗體（例如人源化的鼠抗體）和異 偶聯(lián)抗體（如雙特異性抗體）。亦參見 Pierce Catalog and Handbook，1994-1995 (Pierce Chemical Co. , Rockford, IL) ;Kuby, Immunology,第 3 版，W. H. Freeman&Co. , New York, 1997。
[0021] "單克隆抗體"是由B淋巴細(xì)胞的單個(gè)克隆或由轉(zhuǎn)染了單個(gè)抗體的輕鏈和重鏈基因 的細(xì)胞所產(chǎn)生。單克隆抗體由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來產(chǎn)生，例如通過從骨髓瘤細(xì)胞 與免疫脾細(xì)胞制備雜合的抗體形成細(xì)胞來產(chǎn)生。這些融合的細(xì)胞及其子代稱作"雜交瘤"。 單克隆抗體包括人源化的單克隆抗體。
[0022] 細(xì)菌：在一些例子中，原核生物導(dǎo)致疾?。ú≡?。根據(jù)其細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)特征可 將細(xì)菌分類。例如，"革蘭氏陽性"細(xì)胞壁中多層厚厚的肽聚糖層染色呈紫色，而薄的"革蘭 氏陰性"細(xì)胞壁呈現(xiàn)粉色。通過將形態(tài)學(xué)和革蘭氏染色組合，可將大部分細(xì)菌歸屬至四個(gè)組 (革蘭氏陽性球菌、革蘭氏陽性桿菌、革蘭氏陰性球菌和革蘭氏陰性桿菌）。
[0023] 可利用公開的革蘭氏染色方法檢測的細(xì)菌的例子，包括但不限于：鮑曼不動 桿菌（Acinetobacter baumanii)、放線桿菌屬物種（Actinobacillus sp.)、放射菌 (Actinomycetes)、放線菌屬物種（Actinomyces sp.)(如伊氏放線菌（Actinomyces israelii)和內(nèi)氏放線菌（Actinomyces naeslundii))、氣單胞菌屬物種（Aeromonas sp.) (如嗜水氣單胞菌（八6!'011101^8 117(11'(^11；!_13)、維羅納氣單菌溫和生物變種（八61'011101188 veronii biovar sobria)(溫和產(chǎn)氣單胞菌（Aeromonas sobria)和豚鼠氣單胞菌 (Aeromonas caviae)、嗜吞嗤細(xì)胞無形體（Anaplasma phagocytophilum)、木糖產(chǎn)喊桿 菌（Alcaligenes xylosoxidans)、鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumanii)、伴放線 放線桿菌（Actinobacillus actinomycetemcomitans)、桿菌屬物種（Bacillus sp.) (如炭疽桿菌（Bacillus anthracis)、錯樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)、枯草芽孢桿 菌（Bacillus subtilis)、蘇蕓金桿菌（Bacillus thuringiensis)和嗜熱脂肪芽孢桿 菌（Bacillus stearothermophilus)、類桿菌屬物種（Bacteroides sp.)(如脆弱類桿 菌（Bacteroides fragilis)、巴爾通體菌屬物種（Bartonella sp.)(如桿狀巴爾通體 (Bartonella bacilliformis)和漢賽巴爾通體（Bartonella henselae)、雙歧桿菌屬物種 (Bifidobacterium sp·)、鮑特菌屬物種（Bordetella sp.)(如百日咳鮑特菌（Bordetella pertussis)、副百日咳鮑特菌（Bordetella parapertussis)和支氣管敗血性鮑特菌 (Bordetella bronchiseptica)、包柔氏螺旋體菌屬物種（Borrelia sp.)(如回歸熱包柔 體（Borrelia recurrentis)和伯氏包柔體（Borrelia burgdorferi))、布魯氏菌屬物種 (Brucella sp.)(如流產(chǎn)布魯氏菌（Brucella abortus)、犬布魯氏菌（Brucella canis)、 羊布魯氏菌（Brucella melintensis)和豬布魯氏菌（Brucella suis))、伯克霍爾德氏 菌屬物種（Burkholderia sp.)(如類鼻疽伯克氏菌（Burkholderia pseudomallei)和 洋蔥伯克氏菌（Burkholderia cepacia)、彎曲菌屬物種（Campylobacter sp.)(如空 腸彎曲菌（Campylobacter jejuni)、大腸彎曲菌（Campylobacter coli)、紅嘴區(qū)鳥彎曲 菌（Campylobacter lari)和胎兒彎曲菌（Campylobacter fetus))、二氧化碳嗤纖維 菌屬物種（Capnocytophaga sp.)、人心桿菌（Cardiobacterium hominis)、沙眼衣原 體（Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原體（Chlamydophila pneumoniae)、嬰| 鶴熱衣 原體（Chlamydophila psittaci)、梓檬酸桿菌屬物種（Citrobacter sp.)、貝納柯克斯 體（Coxiella burnetii)、棒狀桿菌屬物種（Corynebacterium sp.)(比如，牛棒桿菌 (Corynebacterium diphtheriae)、杰氏棒桿菌（Corynebacterium jeikeum)和棒狀桿菌 (Corynebacterium))、梭菌屬物種（Clostridium sp.)(如產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens)、又艮難梭菌（Clostridium difficile)、肉毒梭菌（Clostridium botulinum) 和破傷風(fēng)梭菌（Clostridium tetani))、侵蝕艾肯菌（Eikenella corrodens)、腸桿菌 屬物種（Enterobacter sp.)(如產(chǎn)氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes)、成團(tuán)腸桿 菌（Enterobacter agglomerans)、陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae)和大腸桿菌 (Escherichia coli)、包括條件性大腸桿菌（opportunistic Escherichia coli)，如腸產(chǎn) 毒性大腸桿菌（enterotoxigenic E. Coli)，腸侵襲性大腸桿菌（enteroinvasive E. Coli)、 腸致病性大腸桿菌（enteropathogenic E.Coli)、腸出血性大腸桿菌（enterohemorrhagic E. coli)、腸聚集性大腸桿菌（enteroaggregative E. Coli)和尿道致病性大腸桿菌 (uropathogenic E. coli)腸球菌屬物種（Enterococcus sp.)(如幾腸球菌（Enterococcus faecalis)和屎腸球菌（Enterococcus faecium)埃立克體屬物種（Ehrlichia sp.)(如 恰菲埃里希氏體（Ehrlichia chafeensia)和犬艾利希體（Ehrlichia canis))、豬丹毒 桿菌（Erysipelothrix rhusiopathiae)、優(yōu)桿菌屬物種（Eubacterium sp·)、土拉熱弗 朗西氏菌（Francisella tularensis)、具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum)、陰道 嗜血桿菌（Gardnerella vaginalis)、麻疫孿生球菌（Gemella morbillorum)、嗜血桿菌 屬物種（Haemophilus sp.)(如流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzae)、杜克雷嗜血 桿菌（Haemophilus ducreyi)、埃及嗜血桿菌（Haemophilus aegyptius)、副流感嗜血桿 菌（Haemophilus parainfluenzae)、溶血嗜血桿菌（Haemophilus haemolyticus)矛口副 溶血嗜血桿菌（Haemophilus parahaemolyticus)、螺桿菌屬物種（Helicobacter sp.) (如幽門螺桿菌（Helicobacter pylori)、同性戀螺桿菌（Helicobacter cinaedi)和芬 納爾螺桿菌（Helicobacter fennelliae))、金氏金氏菌（Kingella kingii)、克雷伯氏 菌屬物種（Klebsiella sp.)(如克雷白氏肺炎菌（Klebsiella pneumoniae)、肉芽腫桿 菌（Klebsiella granulomatis)和產(chǎn)酸克雷伯氏菌（Klebsiella oxytoca)，乳酸桿菌屬 物種（Lactobacillus sp·)、產(chǎn)單核細(xì)胞李斯特菌（Listeria monocytogenes)、問號鉤端 螺旋體（Leptospira interrogans)、嗜肺性軍團(tuán)病桿菌（Legionella pneumophila)、問 號鉤端螺方定體（Leptospira interrogans)、消化鏈球菌屬物種（Peptostreptococcus sp.)、粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis)、摩根氏菌屬物種（Morganella sp.)、 動彎桿菌屬物種（Mob iluncus sp.)、細(xì)球菌屬物種（Micrococcus sp.)、分枝桿菌屬 種（Mycobacterium sp.)(如麻風(fēng)分枝桿菌（Mycobacterium leprae)、結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacterium tuberculosis)、胞內(nèi)分枝桿菌（Mycobacterium intracellulare)、 鳥分枝桿菌（Mycobacterium avium)、牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis)和海分 枝桿菌（Mycobacterium marinum))、支原菌屬物種（Mycoplasm sp.)(如肺炎支 原體（Mycoplasma pneumoniae)、人支原體（Mycoplasma hominis)和生殖器支原 體（Mycoplasma genitalium))、諾卡氏菌屬物種（Nocardia sp.)(如星形諾卡氏菌 (Nocardia asteroides)、蓋爾森基興諾卡氏菌（Nocardia cyriacigeorgica)和巴西諾 卡氏菌（Nocardia brasiliensis))、奈瑟氏菌屬物種（Neisseria sp.)(如淋病奈瑟氏菌 (Neisseria gonorrhoeae)和腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis))、出血敗血性巴 斯德氏菌（Pasteurella multocidla)、類志賀氏鄰單胞菌（Plesiomonas shigelloides)、 普雷沃氏菌屬物種（Prevotella sp.)、卩卜啉單胞菌屬物種（Porphyromonas sp.)、產(chǎn)黑 素普雷沃氏菌（Prevotella melaninogenica)、變形菌屬物種（Proteus sp.)(如普通 變形菌（Proteus vulgaris)和奇異變形菌（Proteus mirabilis))、普羅威登斯菌屬物 種（Providencia sp.)(如產(chǎn)喊普羅威登斯菌（Providencia alcalifaciens)、雷氏普羅 威登斯菌（Providencia rettgeri)和斯氏普羅威登斯菌（Providencia stuartii))、綠 胺假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、短小棒狀桿菌（Propionibacterium acnes)、 馬紅球菌（Rhodococcus equi)、立克次體屬物種（Rickettsiasp.)(如立克氏立克 次體（Rickettsia rickettsii)、螨立克次體（Rickettsia akari)和普氏立克次體 (Rickettsia prowazekii)、恙蟲病東方體（Orientia tsutsugamushi)(學(xué)名：恙蟲病立克 次體（Rickettsia tsutsugamushi)和地方性斑疫傷寒立克次氏體（Rickettsia typhi)、 紅球菌屬物種（Rhodococcus sp.)、粘質(zhì)沙雷氏桿菌（Serratia marcescens)、嗜麥芽寡 養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia)、沙門氏菌屬物種（Salmonella sp.)(如 腸道沙門氏菌（Salmonella enterica)、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi)、副傷寒沙 門氏菌（Salmonella paratyphi)、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis)、豬霍亂沙 門菌（Salmonella cholerasuis)和鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium)、沙雷 氏菌屬物種（Serratia sp.)(如粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcesans)和液化沙雷氏菌 (Serratia liquifaciens)、志賀氏菌屬物種（Shigella sp.)(如志賀氏痢疾菌（Shigella dysenteriae)、弗氏志賀氏菌（Shigella flexneri)、波伊德志賀氏菌（Shigella boydii) 和宋內(nèi)志賀菌（Shigella sonnei)、葡萄球菌屬物種（Staphylococcus sp.)(如金黃色釀 胺葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis)、 溶血葡萄球菌（Staphylococcus hemolyticus)、腐生性葡萄球菌（Staphylococcus saprophyticus)、鏈球菌屬物種（Streptococcus sp.)(如肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)(例如氯霉素-抗性血清型4肺炎鏈球菌（chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae)、壯觀霉素-抗性血清型6B炎鏈球菌 (spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、鏈霉素-抗 性血清型 9V 月市炎鏈球菌（streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、紅霉素-抗性血清型 14肺炎鏈球菌（erythromycin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、奧普托欣-抗性血清型 14肺炎鏈球菌（optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、利福平-抗性血清型18C肺炎鏈球菌 (rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、四環(huán)素-抗 性血清型 19F 肺炎鏈球菌（tetracycline-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)、青霉素-抗性血清型 19F 肺炎鏈球菌（penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae)和甲氧節(jié)氨啼陡-抗性血清型23F肺炎鏈球菌 (trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、氣霉素-抗 性血清型 4 月市炎鏈球菌（chloramphenicol-resistant serotype 4 Streptococcus pneumoniae，e 4 Streptococcus pneumoniae)、壯觀霉素-抗性血清型6B肺炎鏈球菌 (spectinomycin-resistant serotype 6B Streptococcus pneumoniae)、鏈霉素-抗 性血清型 9V 月市炎鏈球菌（streptomycin-resistant serotype 9V Streptococcus pneumoniae)、奧普托欣-抗性血清型14肺炎鏈球菌（optochin-resistant serotype 14 Streptococcus pneumoniae)、利福平-抗性血清型18C肺炎鏈球菌 (rifampicin-resistant serotype 18C Streptococcus pneumoniae)、青霉素-抗性血清 型 19F 月市炎鏈球菌（penicillin-resistant serotype 19F Streptococcus pneumoniae) 或甲氧節(jié)氨啼陡-抗性血清型23F肺炎鏈球菌（trimethoprim-resistant serotype 23F Streptococcus pneumoniae)、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae)、變形鏈 球菌（Streptococcus mutans)、化胺性鏈球菌（Streptococcus pyogenes)、A 組鏈球菌 (Group A streptococci)、化胺性鏈球菌（Streptococcus pyogenes)、B 組鏈球菌屬（Group B streptococci)、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae)、C 組鏈球菌屬（Group C streptococci)、咽頰炎鏈球菌（Streptococcus anginosus)、類馬鏈球菌（Streptococcus equismilis)、D 組鏈球菌（Group D streptococci)、牛鏈球菌（Streptococcus bovis)、 F 組鏈球菌（Group F streptococci)和咽頰炎鏈球菌（Streptococcus anginosus)、G 組鏈球菌（Group G streptococci)、鼠咬熱螺旋體（Spirillum minus)、念珠狀鏈桿菌 (Streptobacillus moniliformi)、密螺旋體屬物種（Treponema sp.)(如品他病密螺旋體 (Treponema carateum)、細(xì)弱密螺旋體（Treponema petenue)、蒼白密螺旋體（Treponema pallidum)和地方性密螺旋體（Treponema endemicum)、Tropheryma whippelii、解服支原 體（Ureaplasma urealyticum)、韋榮球菌屬物種（Veillonella sp·)、弧菌屬物種（Vibrio sp.)(如霍亂弧菌（Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus)、嗜鹽弧 菌（Vibrio vulnificus)、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus)、嗜鹽弧菌（Vibrio vulnificus)、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus)、擬態(tài)弧菌（Vibrio mimicus)、霍氏弧菌 (Vibrio hollisae)、河流弧菌（Vibrio fluvialis)、梅氏弧菌（Vibrio metchnikovii)、 海魚弧菌（Vibrio damsela)和弗氏弧菌（Vibrio furnisii)、耶爾森氏菌屬物種 (Yersinia sp.)(如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌（Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶爾森氏菌 (Yersiniapestis)和假結(jié)核耶爾森氏菌（Yersinia pseudotuberculosis)和嗜麥芽黃單 胞菌（Xanthomonas maltophilia)等。
[0024] 接觸：直接的物理結(jié)合；包括固體形式和液體形式兩種。例如，接觸可在體外發(fā) 生于試劑（如革蘭氏染料中的一個(gè)成分）和樣品之間，所述樣品位于溶液中或一個(gè)表面上 (例如在顯微鏡載玻片上）。
[0025] 脫色劑（decolorizing agent):可從樣品（利如用初級染劑和捕獲劑染色的樣 品）中基本上去除初級染劑（例如結(jié)晶紫）和捕獲劑（例如碘）復(fù)合物的試劑，比如從革 蘭氏陰性細(xì)菌而非革蘭氏陽性細(xì)菌的細(xì)胞壁中基本上去除所述復(fù)合物的試劑。在一個(gè)例子 中，這樣的復(fù)合物稱作結(jié)晶紫-碘（cv-ι)復(fù)合物。在具體的例子中，脫色劑與含有初級染 劑-捕獲劑復(fù)合物（例如cv-ι復(fù)合物）的樣品一起孵育一段時(shí)間，所述時(shí)間足以從革蘭氏 陰性細(xì)胞而非革蘭氏陽性細(xì)胞中基本上去除（比如去除至少90%、至少95%或至少99% 的）所述復(fù)合物（且從而去除初級染劑）。
[0026] 脫色制劑（decolorizing formulation):組合物，包括一種或多種脫色劑。慢作 用脫色劑是需要更長的時(shí)間才能從革蘭氏陰性細(xì)胞中去除初級染劑-捕捉劑（例如，CV-I) 復(fù)合物（且從而去除初級染劑，例如，結(jié)晶紫）的一種試劑，所述時(shí)間例如是，允許自動化設(shè) 備完成脫色步驟、從而維持該自動化設(shè)備在完成所需脫色后將要發(fā)生另外的脫色作用（比 如使革蘭氏陽性細(xì)菌脫色）之前控制脫色步驟的完結(jié)的能力所需的時(shí)間。在一些例子中， 緩慢脫色的時(shí)間是至少30秒、至少60秒、至少120秒、或至少220秒，例如1至4分鐘，以 從革蘭氏陰性細(xì)菌中去除初級染劑-捕獲劑（例如CV-Ι)復(fù)合物。慢作用脫色劑的例子包 括1，2_丙二醇和乙二醇?？熳饔妹撋珓┦莾H需要短時(shí)間就能從革蘭氏陰性細(xì)胞中去除初 級染劑-捕獲劑（例如CV-Ι)復(fù)合物（且從而去除初級染劑，例如結(jié)晶紫）的一種試劑，所 述時(shí)間比如少于20秒、少于15秒、少于10秒、或少于5秒，例如1至2秒、1至5秒、1至10 秒或1至20秒。例子包括乙醇、丙酮、二乙醚、甲醚，乙醇與丙酮的共混物，以及乙醇與其他 醇類如甲醇或2-丙醇的共混物。
[0027] 檢測：為確定一種因素（如信號或具體生物，如革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細(xì)菌）是 否存在，例如具體細(xì)菌。在一些例子中，這可進(jìn)一步包括定量。例如，本文公開的方法和試 劑在具體例子中的應(yīng)用允許報(bào)告出較強(qiáng)和較弱的信號。
[0028] 革蘭氏陽性細(xì)菌：在革蘭氏染色過程中染色深藍(lán)色或紫色的細(xì)菌，且具有厚的肽 聚糖層。革蘭氏陽性細(xì)菌的例子包括：
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一種對樣品進(jìn)行革蘭氏染色的方法，包括： 使所述樣品與慢作用脫色制劑在足以從革蘭氏陰性細(xì)菌而非革蘭氏陽性細(xì)菌除去初 級染劑-捕獲劑復(fù)合物的條件下接觸，其中所述樣品事先已與初級染劑和捕獲劑接觸過。
2. 權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括： 使所述樣品與初級染劑在足以將革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁染色的 條件下接觸； 使所述樣品與捕獲劑在足以形成初級染劑-捕獲劑復(fù)合物的條件下接觸； 使所述樣品與復(fù)染劑在足以將脫過色的革蘭氏陰性細(xì)菌染色的條件下接觸；或 其組合。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中復(fù)染色在脫色的至少30秒后進(jìn)行。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中使所述樣品與所述慢作用脫色制劑接觸達(dá)至少30秒。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，進(jìn)一步包括將所述樣品加載到自動染色裝置中。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中使用壓縮空氣完成所述樣品與慢作用脫色制劑 的接觸。
7. 權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法，其中所述慢作用脫色制劑包含慢作用脫色劑和快作 用脫色劑。
8. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述脫色制劑包含至少80%的所述慢作用脫色 劑和不超過20%的所述快作用脫色劑。
9. 權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述慢作用脫色制劑包含1，2-丙二醇或乙二 醇。
10. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中從已知或懷疑有細(xì)菌感染的受試者獲得所述 樣品。
11. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述樣品是環(huán)境樣品或食物樣品。
12. 權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法，其中已經(jīng)、同時(shí)或?qū)⒁獙λ鰳悠吩谙嗤蚍珠_ 的載玻片上進(jìn)行一種或多種另外的測定法。
13. 權(quán)利要求12的方法，其中使所述樣品與針對特定細(xì)菌的一種或多種抗體接觸、與 另一種染劑接觸、或其組合接觸。
14. 權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)的方法，其中通過自動化染色裝備實(shí)施所述方法。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述自動化染色裝備是Ventana NexES Special Stainer 或 Ventana BenchMark Special Stainer。
16. 權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括檢測革蘭氏陽性細(xì)菌或 革蘭氏陰性細(xì)菌。
17. 權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是計(jì)算機(jī)執(zhí)行的方法。
18. -種使用自動染色裝備在載玻片上對細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色的方法，其中所述自動 染色裝備包含： 用于放置多個(gè)載玻片的轉(zhuǎn)盤式傳送工具，每個(gè)上面都有待染色的樣品 用于以預(yù)定速度旋轉(zhuǎn)所述轉(zhuǎn)盤式傳送工具的工具；和 在所述轉(zhuǎn)盤式工具旋轉(zhuǎn)期間指引和控制各個(gè)試劑加載到所述載玻片和樣品上的工具， 且其中所述方法包括： 將結(jié)晶紫試劑指引到轉(zhuǎn)盤式傳送工具中的載玻片上以使所述載玻片上的細(xì)菌與所述 結(jié)晶紫試劑接觸； 將水、水性緩沖液、或水性去污劑指引到轉(zhuǎn)盤式傳送工具中的載玻片上以從所述載玻 片洗去結(jié)晶紫試劑； 將碘試劑指引到轉(zhuǎn)盤式傳送工具中的載玻片上以使所述載玻片上的細(xì)菌與所述碘試 劑接觸； 將水、水性緩沖液、或水性去污劑指引到轉(zhuǎn)盤式傳送工具中的載玻片上以從所述載玻 片洗去碘試劑； 同時(shí)或分開地將慢作用脫色制劑和復(fù)染劑指引到轉(zhuǎn)盤式傳送工具中的載玻片上；并 將水、水性緩沖液、或水性去污劑指引到轉(zhuǎn)盤式傳送工具中的載玻片上以從所述載玻 片洗去混合試劑。
19. 一種組合物，包含至少80%的一種或多種慢作用脫色劑和不超過20%的一種或多 種快作用脫色劑。
20. 權(quán)利要求19的組合物，其中所述一種或多種慢作用脫色劑包含1，2-丙二醇、乙二 醇或其混合物。
21. -種用于自動化革蘭氏染色的試劑盒，包含： 在第一容器中的慢作用脫色制劑。
22. 權(quán)利要求21的試劑盒，進(jìn)一步包含： 在第二容器中的初級染色制劑； 在第三容器中的捕獲劑；和 在第四容器中的復(fù)染色制劑。
23. 權(quán)利要求21或22的試劑盒，其中所述容器配置為加載到自動化染色裝置中。
24. 權(quán)利要求23的試劑盒，其中所述自動化染色裝置是Ventana NexES Special Stainer 或 Ventana BenchMark Special Stainer。
25. 權(quán)利要求21-24中任一項(xiàng)的試劑盒，還包含一個(gè)或多個(gè)顯微鏡載玻片。
26. 權(quán)利要求21-25中任一項(xiàng)的試劑盒，還包含一個(gè)或多個(gè)對照載玻片。
27. 權(quán)利要求21-26中任一項(xiàng)的試劑盒，其中將所述各個(gè)容器的內(nèi)容物按照以下次序 接觸樣品：第二容器、第三容器、第一容器、第四容器；其中可同時(shí)使用兩個(gè)容器的內(nèi)容物。
【文檔編號】C12Q1/04GK104245955SQ201380020183
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年2月22日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月19日
【發(fā)明者】C.維德納, C.康諾利 申請人:文塔納醫(yī)療系統(tǒng)公司