乳酸的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種即使連續(xù)地生產(chǎn)也能夠維持乳酸的高生產(chǎn)率的、利用絲狀菌的乳酸的制造方法。本發(fā)明的乳酸的制造方法包括：在磷酸根離子濃度被控制在低于0.007質(zhì)量％、且包含碳源的液體培養(yǎng)基中，使用選自絲狀菌球和固定化絲狀菌中的1種以上的菌體，通過發(fā)酵而得到乳酸的第一發(fā)酵工序。
【專利說明】乳酸的制造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及乳酸的制造方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 真菌類中包含的米根霉（Rhizopus oryzae)等絲狀菌容易變成菌絲塊（球）。已 知若將這樣的球狀的絲狀菌用于乳酸的制造，則容易從發(fā)酵后的培養(yǎng)基分離生成物，且可 以進(jìn)行連續(xù)的制造（專利文獻(xiàn)1)。例如，有報(bào)告稱使用米根霉（Rhizopus oryzae)的菌球 并利用半間歇式反應(yīng)法，連續(xù)生產(chǎn)了乳酸25天（25個(gè)周期）（非專利文獻(xiàn)1)。
[0003] 另外，還有報(bào)告稱通過利用將磷酸根離子、鉀離子、鈉離子、鎂離子和鈣離子的濃 度分別控制在5?60mM、5?60mM、2?50mM、0. 5?9mM、0. 5?12mM的培養(yǎng)基來培養(yǎng)絲狀 菌，從而使絲狀菌的過度的漿化和過度的球化得到抑制，使?jié){與球的混合狀態(tài)得到維持，其 結(jié)果，不飽和脂肪酸的收率大幅提高（專利文獻(xiàn)2)。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0005] 專利文獻(xiàn)
[0006] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開平6-253871號(hào)公報(bào)
[0007] 專利文獻(xiàn)2 :國際公開第98/29558號(hào)
[0008] 非專利文獻(xiàn)
[0009] 非專利文獻(xiàn) 1 Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，38 卷 (2011)565-571


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供一種乳酸的制造方法，其包括：在磷酸根離子濃度被控制在低于 0.007質(zhì)量％、且包含碳源的液體培養(yǎng)基中，使用選自絲狀菌球和固定化絲狀菌中的1種以 上的菌體，通過發(fā)酵而得到乳酸的第一發(fā)酵工序。

【具體實(shí)施方式】
[0011] 本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，在包含碳源的液體培養(yǎng)基中，使用絲狀菌球或固定化絲狀菌，通 過發(fā)酵連續(xù)地制造乳酸，其結(jié)果，醇的生成經(jīng)時(shí)地增加，而乳酸的生產(chǎn)率降低。
[0012] 本發(fā)明在于提供一種即使連續(xù)地生產(chǎn)也能夠維持乳酸的高生產(chǎn)率的、利用絲狀菌 的乳酸的制造方法。
[0013] 本發(fā)明人等為了查明上述乳酸的生產(chǎn)率降低的主要原因而進(jìn)行了各種討論，結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，通過將包含碳源的液體培養(yǎng)基中的特定成分的濃度控制為低于規(guī)定值，從而可使絲 狀菌球或固定化絲狀菌的菌絲形態(tài)得到維持，即使連續(xù)地生產(chǎn)，也能夠維持乳酸的高生產(chǎn) 率。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明，可以提供下述的利用絲狀菌的乳酸的制造方法，對(duì)于該制造方法而 言，在維持絲狀菌球或固定化絲狀菌的菌絲形態(tài)的同時(shí)，即使連續(xù)地生產(chǎn)乳酸，也能夠維持 高生產(chǎn)率。
[0015] 本發(fā)明的乳酸的制造方法包括：在磷酸根離子濃度被控制在低于0. 007質(zhì)量％、 且包含碳源的液體培養(yǎng)基中，使用選自絲狀菌球和固定化絲狀菌中的1種以上的菌體（以 下，也簡(jiǎn)單稱為"菌體"），通過發(fā)酵而得到乳酸的第一發(fā)酵工序。
[0016] 作為用于本發(fā)明的絲狀菌，可以舉出屬于根霉（Rhizopus)屬、曲霉 (Aspergillus)屬、毛霉（Mucor)屬的微生物，其中，優(yōu)選根霉（Rhizopus)屬。具體來說， 優(yōu)選米根霉（Rhizopus oryzae)、米曲霉（Aspergillus oryzae)、黑曲霉（Aspergillus niger)、土曲霉（Aspergillus terreus)、東北毛霉（Mucor mandshuricus)，更優(yōu)選米根霉 (Rhizopus oryzae)〇
[0017] 本發(fā)明中，可以將絲狀菌以絲狀菌球或固定化絲狀菌的形態(tài)單獨(dú)使用，也可以作 為絲狀菌球和固定化絲狀菌的混合物加以使用。此處，本說明書中"球"是指，通過液體培 養(yǎng)菌絲自發(fā)地形成的數(shù)百yrn?數(shù)mm大小的菌絲塊。另外，"固定化絲狀菌"是指，被載體 保持或包埋的絲狀菌。
[0018] 絲狀菌球和固定化絲狀菌可以使用商業(yè)上購得的物質(zhì)，也可以使用通過以下工序 制備的物質(zhì)。
[0019](絲狀菌球的制備工序）
[0020] 絲狀菌球可以通過培養(yǎng)進(jìn)行制備。
[0021] 作為培養(yǎng)基，若為可以生長絲狀菌的液體培養(yǎng)基，則可以是合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng) 基和添加了天然成分的半合成培養(yǎng)基中的任一種。培養(yǎng)基中通常含有碳源、氮源、無機(jī)鹽 等，但可以適當(dāng)選擇各成分組成。另外，培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度可以適當(dāng)采用通常用于 培養(yǎng)絲狀菌的培養(yǎng)基的磷酸根離子濃度，并不要求低于0. 007質(zhì)量％。
[0022] 作為培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為20?40°C，更優(yōu)選為25?30°C。另外，培養(yǎng)基的 初始pH(25°C )優(yōu)選為3?7,更優(yōu)選為4?6。
[0023] 培養(yǎng)方法可以采用公知的方法。例如，將絲狀菌的孢子植菌到液體培養(yǎng)基后，使孢 子發(fā)芽而成為菌絲，由該菌絲形成菌體而使其菌球化。該培養(yǎng)通常在需氧條件下進(jìn)行。通 氣條件優(yōu)選為〇. 25?4vvm，更優(yōu)選為0. 5?2vvm。將絲狀菌的孢子植菌到液體培養(yǎng)基后， 培養(yǎng)期限優(yōu)選30分鐘?7天，更優(yōu)選0. 5?6天，進(jìn)一步優(yōu)選1?5天。另外，用于培養(yǎng)的 培養(yǎng)槽可以適當(dāng)采用以往公知的培養(yǎng)槽。具體來說，可以舉出通氣攪拌型培養(yǎng)槽、氣泡塔型 培養(yǎng)槽、流動(dòng)床培養(yǎng)槽等。
[0024] 培養(yǎng)后，絲狀菌球可以與培養(yǎng)液一起從培養(yǎng)槽中抽出，通過過濾、離心分離等簡(jiǎn)便 的操作來分離回收并用于下一工序，也可以在培養(yǎng)槽中留下絲狀菌球，在同一培養(yǎng)槽中進(jìn) 行下一工序。
[0025] 另外，本工序也可以進(jìn)一步分成2個(gè)以上的工序進(jìn)行。
[0026](固定化絲狀菌的制備工序）
[0027] 固定化絲狀菌可以通過培養(yǎng)來制備。
[0028] 培養(yǎng)方法可以采用公知的方法。例如，將絲狀菌的孢子植菌到存在絲狀菌固定化 用載體的液體培養(yǎng)基后，使孢子發(fā)芽而成為菌絲，由向載體內(nèi)捕捉到的菌絲來制備固定化 絲狀菌。作為絲狀菌固定化用載體的材質(zhì)，可以舉出氨基甲酸酯系聚合物、烯烴系聚合物、 二烯系聚合物、縮合系聚合物、硅酮系聚合物、氟系聚合物等。作為絲狀菌固定化用載體的 形狀，可以是平板狀、多層板狀、波形板狀、四面體狀、球狀、繩狀、網(wǎng)狀、圓柱狀、方格狀、圓 筒狀等中的任一種。作為絲狀菌固定化載體的形態(tài)，優(yōu)選發(fā)泡體、薄片體、片體、中空體、樹 脂成型體等，更優(yōu)選發(fā)泡體。另外，作為絲狀菌固定化用載體的尺寸，優(yōu)選為0. 1mm?l〇mm， 更優(yōu)選為〇· 5?5mm，進(jìn)一步優(yōu)選為0· 7?2mm。
[0029] 需要說明的是，作為用于絲狀菌的固定化的培養(yǎng)基和培養(yǎng)槽，可以使用與上述絲 狀菌球同樣的培養(yǎng)基和培養(yǎng)槽，另外，對(duì)于培養(yǎng)條件，也可以采用與上述絲狀菌球同樣的條 件。進(jìn)而，在培養(yǎng)后，固定化絲狀菌可以通過與絲狀菌球同樣的操作來分離回收并用于下一 工序，但也可以在培養(yǎng)槽中留下固定化絲狀菌，在同一培養(yǎng)槽中進(jìn)行下一工序。
[0030] 另外，本工序也可以進(jìn)一步分成2個(gè)以上的工序進(jìn)行。
[0031] 〈第一發(fā)酵工序〉
[0032] 本工序是使用菌體使碳源發(fā)酵來生產(chǎn)乳酸的工序。乳酸可以是L體、R體和外消 旋體中的任一種。
[0033] 本工序中使用的培養(yǎng)基若為包含碳源、且磷酸根離子濃度被控制在低于規(guī)定值的 液體培養(yǎng)基，則沒有特別限定，可以包含氮源、磷酸鹽以外的無機(jī)鹽、維生素等。另外，在所 使用的碳源中包含適合培養(yǎng)的濃度的上述營養(yǎng)源的情況下，也可以僅使用碳源。
[0034] 本工序中使用的培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度低于0. 007質(zhì)量％，但從維持絲狀菌 球的菌絲形態(tài)、并維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為0.006質(zhì)量％以下，更優(yōu)選為 0. 005質(zhì)量％以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 004質(zhì)量％以下，更進(jìn)一步優(yōu)選為0. 003質(zhì)量％以下。 另一方面，培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度的下限值沒有特別限定，可以為〇質(zhì)量％，即，可以 不含有磷酸根離子。需要說明的是，"磷酸根離子濃度為〇質(zhì)量％"是還包括利用酶比色法 測(cè)定培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度時(shí)為檢測(cè)限度以下的情況的概念。另外，作為磷酸根離子 濃度的范圍，為0?低于0. 007質(zhì)量％，優(yōu)選為0?0. 006質(zhì)量％，更優(yōu)選為0?0. 005質(zhì) 量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0?0. 004質(zhì)量％，更進(jìn)一步優(yōu)選為0?0. 003質(zhì)量％。優(yōu)選這樣的范 圍的理由未必明確，但本發(fā)明人等推測(cè)原因在于絲狀菌的過剩增殖被抑制而使菌絲形態(tài)得 到維持。需要說明的是，在本工序中使用的培養(yǎng)基中含有磷酸根離子的情況下，可以以磷酸 鹽的形態(tài)含有磷酸根離子。作為磷酸鹽的具體例，可以舉出與后述第二發(fā)酵工序中例示出 的磷酸鹽同樣的物質(zhì)。
[0035] 另外，在本工序中使用的培養(yǎng)基中包含碳源，作為碳源，可以舉出糖類。具體來說， 可以舉出葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖等。這些可以使用1種或組合使用2種以上。其中，從維 持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選葡萄糖、果糖。
[0036] 在本工序中，作為碳源，還可以使用含有這樣的糖類的糖液。具體來說，可以舉出 由淀粉得到的糖液、糖蜜（廢糖蜜）、由木質(zhì)纖維素系生物物質(zhì)得到的糖液。它們可以使用 1種或組合使用2種以上。此處，本說明書中"木質(zhì)纖維素系生物物質(zhì)"是指以纖維素、半纖 維素和木質(zhì)素為主要成分的生物物質(zhì)。作為木質(zhì)纖維素系生物物質(zhì)，具體例中，可以舉出稻 秸、谷殼、麥秸、蔗渣、椰子殼、玉米穗軸、雜草、木材以及由它們制造的紙漿和紙等。另外，作 為淀粉，可以舉出例如玉米等谷類、大豆等豆類的提取物，作為糖蜜，可以舉出例如源自于 甘蔗、甜菜等的糖蜜。
[0037] 從維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，培養(yǎng)基中的初始碳濃度優(yōu)選為1質(zhì)量％以 上，更優(yōu)選為3質(zhì)量％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5質(zhì)量％以上，并且優(yōu)選為40質(zhì)量％以下，更優(yōu) 選為30質(zhì)量％以下，進(jìn)一步優(yōu)選為20質(zhì)量％以下。另外，作為培養(yǎng)基中的初始碳濃度的范 圍，優(yōu)選為1?40質(zhì)量％，更優(yōu)選為3?30質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為5?20質(zhì)量％。
[0038] 本工序中使用的培養(yǎng)基中可以含有氮源。作為氮源，具體來說，可以舉出尿素、硝 酸銨、硝酸鉀、硝酸鈉等含氮化合物。從維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，培養(yǎng)基中的初始 氮濃度優(yōu)選為〇. 01?1質(zhì)量％，更優(yōu)選為〇. 02?0. 8質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 04?0. 6 質(zhì)量％。
[0039] 本工序中使用的培養(yǎng)基中可以含有硫酸鹽。作為硫酸鹽，具體來說可以舉出硫酸 鎂、硫酸鋅、硫酸鉀、硫酸鈉等。從維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，培養(yǎng)基中的初始硫酸離 子濃度優(yōu)選為0.001?〇. 1質(zhì)量％，更優(yōu)選為0.005?0.08質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0.01? 0. 04質(zhì)量％。
[0040] 本工序中使用的培養(yǎng)基中可以含有鎂鹽。作為鎂鹽，具體來說可以舉出硫酸鎂、硝 酸鎂、氯化鎂等。從維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，培養(yǎng)基中的初始鎂離子濃度優(yōu)選為 0?0. 5質(zhì)量％，更優(yōu)選為0. 001?0. 2質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 002?0. 1質(zhì)量％。
[0041] 本工序中使用的培養(yǎng)基中可以含有鋅鹽。作為鋅鹽，具體來說可以舉出硫酸鋅、 硝酸鋅、氯化鋅等。從維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，培養(yǎng)基中的初始鋅離子濃度優(yōu)選 為0?0. 1質(zhì)量％，更優(yōu)選為0. 00001?0. 01質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 00005?0. 005質(zhì) 量％。
[0042] 作為培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為20?40°C，更優(yōu)選為30?37°C。另外，從菌體的 生長、乳酸的生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，培養(yǎng)基的pH(25°C)優(yōu)選為2?7,更優(yōu)選為4?6。pH控 制可以使用氫氧化鈣、氫氧化鈉、碳酸鈣、氨等堿，硫酸、鹽酸等酸來進(jìn)行。
[0043] 培養(yǎng)方法可以適當(dāng)選擇厭氧條件和需氧條件中的任一種。需氧條件下的通氣條件 優(yōu)選為〇· 25?4vvm，更優(yōu)選為0· 5?2vvm。另外，用于培養(yǎng)的培養(yǎng)槽可以適當(dāng)采用以往公 知的培養(yǎng)槽，但從乳酸的生產(chǎn)速度的提高的觀點(diǎn)出發(fā)，可以優(yōu)選使用通氣攪拌型培養(yǎng)槽、氣 泡塔型培養(yǎng)槽和流動(dòng)床培養(yǎng)槽。
[0044] 本工序可以例如將菌體播種于上述條件的培養(yǎng)基來進(jìn)行。另外，還可以將制備工 序后的菌體留在培養(yǎng)槽，向其中加入上述條件的培養(yǎng)基來進(jìn)行。
[0045] 本工序可以采用間歇式、半間歇式和連續(xù)式中的任一種進(jìn)行，但從生產(chǎn)率提高的 觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選連續(xù)式。
[0046] 例如，采用半間歇式進(jìn)行時(shí)，可以將菌體與發(fā)酵液分離，向分離回收的菌體中加入 培養(yǎng)基來進(jìn)一步進(jìn)行發(fā)酵。另外，采用連續(xù)式進(jìn)行時(shí)，可以采用將一定量的培養(yǎng)基以一定速 度向發(fā)酵槽內(nèi)供給，同時(shí)抽出等量的發(fā)酵液的方法。這種情況下，為了使發(fā)酵槽內(nèi)的液面高 度保持恒定，可以通過液面?zhèn)鞲衅鞯葋砜刂埔好娓叨?。另外，也可以在發(fā)酵時(shí)僅供給碳源， 碳源的供給可以利用流速控制，也可以利用葡萄糖濃度控制。
[0047] 〈第二發(fā)酵工序〉
[0048] 在本發(fā)明中，從菌絲的活性化、維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，可以在第一發(fā)酵 工序后，進(jìn)行第二發(fā)酵工序。即，第二發(fā)酵工序是：當(dāng)?shù)谝话l(fā)酵工序中的乳酸的生產(chǎn)速度維 持率成為50?95%時(shí)，結(jié)束第一發(fā)酵工序，使用第一發(fā)酵工序中使用的菌體，在磷酸根離 子濃度為〇. 007質(zhì)量％以上且1質(zhì)量％以下、且包含碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵的工序。 [0049] 通過進(jìn)行本工序，能夠恢復(fù)由于長期發(fā)酵生產(chǎn)而降低的乳酸的生產(chǎn)率。基于本工 序的乳酸生產(chǎn)率恢復(fù)的機(jī)制未必明確，但可認(rèn)為其原因在于通過適度的磷酸供給使由于磷 的缺乏而活性降低的菌絲發(fā)生了再活化。
[0050] 從菌絲的活化、維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選在第一發(fā)酵工序中的乳酸 的生產(chǎn)速度維持率優(yōu)選為50%以上、更優(yōu)選為60%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為70%以上、且優(yōu)選 為95%以下、更優(yōu)選為90%以下、進(jìn)一步優(yōu)選為85%以下時(shí)進(jìn)行本工序。作為乳酸的生產(chǎn) 速度維持率的范圍，通常為50?95 %，但優(yōu)選為50?90 %，進(jìn)一步優(yōu)選為60?90 %，更進(jìn) 一步優(yōu)選為70?90 %，再進(jìn)一步優(yōu)選為70?85 %。
[0051] 此處，"乳酸的生產(chǎn)速度維持率"是指通過下述式（i)求得的值。
[0052] T [ % ] = Vt [g/L/h] /Vi [g/L/h] X 100 (i)
[0053] 〔式（i)中，T表示乳酸的生產(chǎn)速度維持率[% ]，Vt表示試樣的乳酸生產(chǎn)速度[g/ L/h]，Vi表示乳酸生產(chǎn)速度的管理值[g/L/h]?！?br> [0054] 需要說明的是，在式（i)中，乳酸生產(chǎn)速度[g/L/h]是指試樣中的乳酸濃度（g/L) 除以發(fā)酵時(shí)間（h)而得的值。另外，乳酸生產(chǎn)速度的管理值（Vi)是指根據(jù)第一發(fā)酵工序的 發(fā)酵液中的乳酸濃度與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系而規(guī)定的值。乳酸生產(chǎn)速度的管理值可以根據(jù)在實(shí) 際操作之前預(yù)先求出的發(fā)酵液中的乳酸濃度與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系決定，也可以根據(jù)實(shí)際操作 中取得的發(fā)酵液中的乳酸濃度與發(fā)酵時(shí)間的關(guān)系決定。這種情況下，可以參考由液體培養(yǎng) 基中的碳源所產(chǎn)生的乳酸濃度的理論值（g/L)。
[0055] 乳酸生產(chǎn)速度的管理值（Vi)根據(jù)制造規(guī)模等而不同，但例如優(yōu)選為0. lg/L/h以 上，更優(yōu)選為〇. 3g/L/h以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 5g/L/h以上，而且優(yōu)選為40g/L/h以下，更優(yōu) 選為30g/L/h以下，進(jìn)一步優(yōu)選為20g/L/h以下。作為乳酸生產(chǎn)速度的管理值（Vi)的范圍， 優(yōu)選為〇· 1?40g/L/h，更優(yōu)選為0· 3?30g/L/h，進(jìn)一步優(yōu)選為0· 5?20g/L/h。
[0056] 本工序可以在第一發(fā)酵工序結(jié)束后，將菌體與發(fā)酵液分離，將回收的菌體播種于 新制備的本工序的液體培養(yǎng)基來進(jìn)行，也可以在第一發(fā)酵工序結(jié)束后，向第一工序中使用 的液體培養(yǎng)基中添加磷酸根離子并調(diào)整到規(guī)定的磷酸根離子濃度來進(jìn)行。
[0057] 本工序中使用的培養(yǎng)基除了磷酸根離子濃度為0.007質(zhì)量％以上且0. 1質(zhì)量％以 下這點(diǎn)，與第一發(fā)酵工序中使用的液體培養(yǎng)基相同，若包含碳源，則可以包含氮源、磷酸鹽 以外的無機(jī)鹽、維生素等。另外，所使用的碳源中含有適合培養(yǎng)的濃度的上述營養(yǎng)源時(shí)，也 可以僅使用碳源。
[0058] 從菌絲的活性化、維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，本工序中使用的培養(yǎng)基中的 磷酸根離子濃度優(yōu)選為〇. 007質(zhì)量％以上，更優(yōu)選為0. 01質(zhì)量％以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 03 質(zhì)量％以上。另外，從維持菌體的形態(tài)的觀點(diǎn)出發(fā)，本工序中使用的培養(yǎng)基中的磷酸根離 子濃度優(yōu)選為〇. 1質(zhì)量％以下，更優(yōu)選為〇. 09質(zhì)量％以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 08質(zhì)量％以 下。作為培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度的范圍，優(yōu)選為〇. 007?0. 1質(zhì)量％，更優(yōu)選為0. 01? 0. 09質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 03?0. 08質(zhì)量％。
[0059] 本工序中使用的培養(yǎng)基中包含的磷酸根離子可以在培養(yǎng)基中以磷酸鹽的形態(tài)含 有。作為磷酸鹽，具體來說可以舉出磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等。
[0060] 作為本工序的培養(yǎng)條件，培養(yǎng)溫度優(yōu)選為20?40°C，更優(yōu)選為30?37°C。另外， 從菌體的生長、乳酸的生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，培養(yǎng)基的pH(25°C )優(yōu)選為2?7,更優(yōu)選為4? 6。pH控制可以使用氫氧化鈣、氫氧化鈉、碳酸鈣、氨等堿，硫酸、鹽酸等酸來進(jìn)行。
[0061] 培養(yǎng)方法可以適當(dāng)選擇厭氧條件和需氧條件中的任一種培養(yǎng)方法。需氧條件下的 通氣條件優(yōu)選為〇· 25?4vvm，更優(yōu)選為0· 5?2vvm。
[0062] 在本工序中，將滿足培養(yǎng)基的溫度為20°C以上且40°C以下、并且pH(25°C)為2以 上且7以下的條件的時(shí)刻作為本工序的開始時(shí)間。需要說明的是，在需氧條件下進(jìn)行時(shí)，將 在滿足上述條件的基礎(chǔ)上進(jìn)一步滿足通氣條件為〇· 25vvm以上且4vvm以下的條件的時(shí)刻 作為本工序的開始時(shí)間。
[0063] 本工序從菌絲的活性化、維持乳酸的高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)，在本工序開始后，優(yōu)選 繼續(xù)1小時(shí)以上，更優(yōu)選繼續(xù)12小時(shí)以上，進(jìn)一步優(yōu)選繼續(xù)24小時(shí)以上。另外，本工序從固 定化絲狀菌的形態(tài)維持的觀點(diǎn)出發(fā)，在本工序開始后，優(yōu)選在240小時(shí)以內(nèi)、更優(yōu)選在120 小時(shí)以內(nèi)、進(jìn)一步優(yōu)選在60小時(shí)以內(nèi)、更進(jìn)一步優(yōu)選在48小時(shí)以內(nèi)結(jié)束。作為本工序的發(fā) 酵時(shí)間，優(yōu)選為1?240小時(shí)，更優(yōu)選為12?120小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選為24?60小時(shí)，更進(jìn) 一步優(yōu)選為24?48小時(shí)。
[0064]〈第三發(fā)酵工序〉
[0065] 本發(fā)明中，在進(jìn)行第二發(fā)酵工序的情況下，從維持乳酸的更高生產(chǎn)率的觀點(diǎn)出發(fā)， 優(yōu)選在第二發(fā)酵工序后進(jìn)行第三發(fā)酵工序。即，第三發(fā)酵工序是使用第二發(fā)酵工序中使用 的菌體，在磷酸根離子濃度被控制在低于0. 007質(zhì)量％、且包含碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行 發(fā)酵的工序。
[0066] 第二發(fā)酵工序中使用的菌體可以在第二發(fā)酵工序結(jié)束后，將菌體與發(fā)酵液分離并 回收，另外，回收的菌體播種于新制備的本工序的液體培養(yǎng)基中即可。
[0067] 本工序中使用的液體培養(yǎng)基與第一發(fā)酵工序中使用的液體培養(yǎng)基相同，具體構(gòu)成 如上述第一發(fā)酵工序中的說明所述。
[0068] 第三發(fā)酵工序中，在乳酸的生產(chǎn)率降低的情況下，可以通過再次實(shí)施第二發(fā)酵工 序，使乳酸的生產(chǎn)率再活化。
[0069]〈菌體和發(fā)酵液的分離工序〉
[0070] 發(fā)酵工序后的菌體與發(fā)酵液的分離可以在發(fā)酵槽內(nèi)利用過濾器進(jìn)行固液分離，也 可以一次抽出到槽外，并供于液體旋流分離、過濾等固液分離，然后僅將菌體返回發(fā)酵槽 內(nèi)。
[0071] 〈從分離工序后的發(fā)酵液中回收乳酸的工序〉
[0072] 可以在將通過分離工序得到的發(fā)酵液濃縮后，利用晶析法、離子交換法、溶劑提取 法、使乳酸以堿土金屬鹽的形式析出后使析出物發(fā)生酸分解的方法、或者以乳酸酯的形式 蒸餾精制后進(jìn)行水解的方法等，從發(fā)酵液中分離并回收乳酸。
[0073] 關(guān)于上述的實(shí)施方式，本發(fā)明進(jìn)一步公開以下的乳酸的制造方法。
[0074] <1>
[0075] -種乳酸的制造方法，其包括：在磷酸根離子濃度被控制在低于0. 007質(zhì)量％、且 包含碳源的液體培養(yǎng)基中，使用選自絲狀菌球和固定化絲狀菌中的1種以上的菌體，通過 發(fā)酵而得到乳酸的第一發(fā)酵工序。
[0076] <2>
[0077] 上述〈1>所述的乳酸的制造方法，其具有：在上述第一發(fā)酵工序中，當(dāng)乳酸的生產(chǎn) 速度維持率優(yōu)選成為50?95%時(shí)，使用第一發(fā)酵工序中使用的上述菌體，在磷酸根離子濃 度為0. 007質(zhì)量％以上且1質(zhì)量％以下、且包含碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵的第二發(fā)酵 工序。
[0078] <3>
[0079] 上述〈2>所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸的生產(chǎn)速度維持率優(yōu)選為50% 以上，更優(yōu)選為60%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為70%以上，且優(yōu)選為90%以下，進(jìn)一步優(yōu)選為85% 以下。
[0080] <4>
[0081] 上述〈2>或〈3>所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸的生產(chǎn)速度維持率優(yōu)選為 50?90 %，更優(yōu)選為60?90 %，進(jìn)一步優(yōu)選為70?90 %，更進(jìn)一步優(yōu)選為70?85 %。
[0082] <5>
[0083] 上述〈2>?〈4>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸的生產(chǎn)速度維持 率優(yōu)選為通過下述式（i)求得的值。
[0084] T[% ] = Vt [g/L/h]/Vi [g/L/h] X 100 (i)
[0085] 〔式（i)中，T表示乳酸的生產(chǎn)速度維持率[% ]，Vt表示試樣的乳酸生產(chǎn)速度[g/ L/h]，Vi表示乳酸生產(chǎn)速度的管理值[g/L/h]。〕
[0086] <6>
[0087] 上述〈5>所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸生產(chǎn)速度的管理值優(yōu)選為0. lg/ L/h以上，更優(yōu)選為0. 3g/L/h以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 5g/L/h以上，且優(yōu)選為40g/L/h以下， 更優(yōu)選為30g/L/h以下，進(jìn)一步優(yōu)選為20g/L/h以下。
[0088] <7>
[0089] 上述〈5>或〈6>所述的乳酸的制造方法，其中，上述乳酸生產(chǎn)速度的管理值優(yōu)選為 0· 1?40g/L/h，更優(yōu)選為0· 3?30g/L/h，進(jìn)一步優(yōu)選為0· 5?20g/L/h。
[0090] <8>
[0091] 上述〈2>?〈7>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述第二發(fā)酵工序優(yōu)選繼 續(xù)1小時(shí)以上，更優(yōu)選繼續(xù)12小時(shí)以上，進(jìn)一步優(yōu)選繼續(xù)24小時(shí)以上，優(yōu)選在240小時(shí)以 內(nèi)結(jié)束，更優(yōu)選在120小時(shí)以內(nèi)結(jié)束，進(jìn)一步優(yōu)選在60小時(shí)以內(nèi)結(jié)束，更進(jìn)一步優(yōu)選在48 小時(shí)以內(nèi)結(jié)束。
[0092] <9>
[0093] 上述〈2>?〈8>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，將上述第二發(fā)酵工序進(jìn)行 優(yōu)選1?240小時(shí)，更優(yōu)選12?120小時(shí)，進(jìn)一步優(yōu)選24?60小時(shí)，更進(jìn)一步優(yōu)選24? 48小時(shí)。
[0094] <10>
[0095] 上述〈2>?〈9>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其在上述第二發(fā)酵工序后具 有：使用優(yōu)選第二發(fā)酵工序中使用的上述菌體，在磷酸根離子濃度被控制在低于〇. 007質(zhì) 量％、且包含碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵的第三發(fā)酵工序。
[0096] <11>
[0097] 上述〈1>?〈10>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其在上述第一發(fā)酵工序前優(yōu)選 具有：制備選自絲狀菌的菌球和固定化絲狀菌中的1種以上的菌體的制備工序。
[0098] <12>
[0099] 上述〈1>?〈11>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述絲狀菌優(yōu)選為根霉 (Rhizopus)屬。
[0100] <13>
[0101] 上述〈1>?〈12>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述絲狀菌優(yōu)選為米根 霉（Rhizopus · oryzae)〇
[0102] <14>
[0103] 上述〈1>?〈13>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述碳源優(yōu)選為糖類。
[0104] <15>
[0105] 上述〈14>所述的乳酸的制造方法，其中，上述糖類優(yōu)選為選自由淀粉得到的糖 液、糖蜜、以及由木質(zhì)纖維素系生物物質(zhì)得到的糖液中的1種以上。
[0106] <16>
[0107] 上述〈1>?〈15>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述第一發(fā)酵工序中使 用的液體培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度優(yōu)選為〇. 006質(zhì)量％以下，更優(yōu)選為0. 005質(zhì)量％以 下，進(jìn)一步優(yōu)選為〇. 004質(zhì)量％以下，更進(jìn)一步優(yōu)選為0. 003質(zhì)量％以下，再進(jìn)一步優(yōu)選為 〇質(zhì)量％。
[0108] <17>
[0109] 上述〈1>?〈15>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述第一發(fā)酵工序中使 用的液體培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度優(yōu)選為〇?低于〇. 007質(zhì)量％，更優(yōu)選為〇?〇. 006 質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0?0. 005質(zhì)量％，更進(jìn)一步優(yōu)選為0?0. 004質(zhì)量％，再進(jìn)一步優(yōu) 選為0?0. 003質(zhì)量％。
[0110] <18>
[0111] 上述〈1>?〈15>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述第一發(fā)酵工序中使 用的液體培養(yǎng)基中不包含磷酸根離子（磷酸根離子濃度為〇質(zhì)量％ )，或者在液體培養(yǎng)基中 包含磷酸根離子的情況下，優(yōu)選為0. 006質(zhì)量％以下，更優(yōu)選為0. 005質(zhì)量％以下，進(jìn)一步 優(yōu)選為0. 004質(zhì)量％以下，更進(jìn)一步優(yōu)選為0. 003質(zhì)量％以下。
[0112] <19>
[0113] 上述〈2>?〈18>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述第二發(fā)酵工序中使 用的液體培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度優(yōu)選為〇. 1質(zhì)量％以下，更優(yōu)選為〇. 09質(zhì)量％以下， 進(jìn)一步優(yōu)選為0. 08質(zhì)量％以下，且優(yōu)選為0. 007質(zhì)量％以上，更優(yōu)選為0. 01質(zhì)量％以上， 進(jìn)一步優(yōu)選為〇. 03質(zhì)量％以上。
[0114] <20>
[0115] 上述〈2>?〈19>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述第二發(fā)酵工序中使 用的液體培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度優(yōu)選為〇. 007?0. 1質(zhì)量％，更優(yōu)選為0. 01?0. 09 質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0. 03?0. 08質(zhì)量％。
[0116] <21>
[0117] 上述〈10>?〈20>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述第三發(fā)酵工序中使 用的液體培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度優(yōu)選為〇. 006質(zhì)量％以下，更優(yōu)選為0. 005質(zhì)量％以 下，進(jìn)一步優(yōu)選為〇. 004質(zhì)量％以下，更進(jìn)一步優(yōu)選為0. 003質(zhì)量％以下，再進(jìn)一步優(yōu)選為 〇質(zhì)量％。
[0118] <22>
[0119] 上述〈10>?〈20>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述第三發(fā)酵工序中使 用的液體培養(yǎng)基中的磷酸根離子濃度優(yōu)選為〇?低于〇. 007質(zhì)量％，更優(yōu)選為〇?〇. 006 質(zhì)量％，進(jìn)一步優(yōu)選為0?0. 005質(zhì)量％，更進(jìn)一步優(yōu)選為0?0. 004質(zhì)量％，再進(jìn)一步優(yōu) 選為0?0. 003質(zhì)量％。
[0120] <23>
[0121] 上述〈10>?〈20>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，上述第三發(fā)酵工序中使 用的液體培養(yǎng)基中不包含磷酸根離子（磷酸根離子濃度為〇質(zhì)量％ )，或者在液體培養(yǎng)基中 包含磷酸根離子的情況下，優(yōu)選為0. 006質(zhì)量％以下，更優(yōu)選為0. 005質(zhì)量％以下，進(jìn)一步 優(yōu)選為0. 004質(zhì)量％以下，更進(jìn)一步優(yōu)選為0. 003質(zhì)量％以下。
[0122] <24>
[0123] 上述〈1>?〈23>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，以液體培養(yǎng)基中的初始 碳濃度優(yōu)選為1質(zhì)量％以上、更優(yōu)選為3質(zhì)量％以上、進(jìn)一步優(yōu)選為5質(zhì)量％以上、且優(yōu)選 為40質(zhì)量％以下、更優(yōu)選為30質(zhì)量％以下、進(jìn)一步優(yōu)選為20質(zhì)量％以下，進(jìn)行上述第一發(fā) 酵工序、第二發(fā)酵工序和第三發(fā)酵工序中的1個(gè)以上的工序。
[0124] <25>
[0125] 上述〈1>?〈24>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，以液體培養(yǎng)基中的初始 碳濃度優(yōu)選為1?40質(zhì)量％、更優(yōu)選為3?30質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選為5?20質(zhì)量％，進(jìn)行 上述第一發(fā)酵工序、第二發(fā)酵工序和第三發(fā)酵工序中的1個(gè)以上的工序。
[0126] <26>
[0127] 上述〈1>?〈25>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，以液體培養(yǎng)基中的初始 氮濃度優(yōu)選為〇. 01?1質(zhì)量％、更優(yōu)選為〇. 02?0. 8質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選為0. 04?0. 6 質(zhì)量％，進(jìn)行上述第一發(fā)酵工序、第二發(fā)酵工序和第三發(fā)酵工序中的1個(gè)以上的工序。
[0128] <27>
[0129] 上述〈1>?〈26>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，以液體培養(yǎng)基中的初始 硫酸離子濃度優(yōu)選為〇. 001?〇. 1質(zhì)量％、更優(yōu)選為〇. 005?0. 08質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選為 0.01?0.04質(zhì)量％，進(jìn)行上述第一發(fā)酵工序、第二發(fā)酵工序和第三發(fā)酵工序中的1個(gè)以上 的工序。
[0130] <28>
[0131] 上述〈1>?〈27>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，以液體培養(yǎng)基中的初始 鎂離子濃度優(yōu)選為〇?〇. 5質(zhì)量％、更優(yōu)選為0. 001?0. 2質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選為0. 002? 0. 1質(zhì)量％，進(jìn)行上述第一發(fā)酵工序、第二發(fā)酵工序和第三發(fā)酵工序中的1個(gè)以上的工序。
[0132] <29>
[0133] 上述〈1>?〈28>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，以液體培養(yǎng)基中的初 始鋅離子濃度優(yōu)選為〇?〇. 1質(zhì)量％、更優(yōu)選為〇. 00001?〇. 01質(zhì)量％、進(jìn)一步優(yōu)選為 0. 00005?0. 005質(zhì)量％，進(jìn)行上述第一發(fā)酵工序、第二發(fā)酵工序和第三發(fā)酵工序中的1個(gè) 以上的工序。
[0134] <30>
[0135] 上述〈1>?〈29>中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，優(yōu)選采用向發(fā)酵槽內(nèi)以 一定速度供給一定量的液體培養(yǎng)基，同時(shí)將等量的發(fā)酵液抽出到發(fā)酵槽外的連續(xù)式，進(jìn)行 上述第一發(fā)酵工序、第二發(fā)酵工序和第三發(fā)酵工序中的1個(gè)以上的工序。
[0136] <31>
[0137] 用于乳酸產(chǎn)生的菌體的再活化方法，其包括：在磷酸根離子濃度被控制在低于 0. 007質(zhì)量％、且包含碳源的液體培養(yǎng)基中，使用選自絲狀菌球和固定化絲狀菌中的1種 以上的菌體，通過發(fā)酵而得到乳酸的第一發(fā)酵工序中，當(dāng)乳酸的生產(chǎn)速度維持率優(yōu)選成為 50?95%時(shí)，使用上述第一發(fā)酵工序中使用的上述菌體，在磷酸根離子濃度為0.007質(zhì) 量％以上且1質(zhì)量％以下、且包含碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵的第二發(fā)酵工序。
[0138] 實(shí)施例
[0139] 〈分析方法〉
[0140] [利用高效液相色譜法（HPLC)的各種成分的測(cè)定]
[0141] 用0. 0085當(dāng)量濃度的硫酸水溶液適當(dāng)稀釋發(fā)酵液，使用孔徑為0. 22 μ m的纖維素 乙酸酯制膜濾器（ADVANTEC公司制）進(jìn)行過濾，作為HPLC分析用樣品。HPLC的分析條件如 下。
[0142] ?色譜柱：ICS印 ICE-I0N-300
[0143] ?洗脫液：0. 0085當(dāng)量濃度硫酸、0. 4mL/min
[0144] ?檢測(cè)法：RI (HITACHI、L_249〇)
[0145] ?柱溫度：40 °C
[0146] ?注入液量：20 μ L
[0147] ?保持時(shí)間：40min
[0148] 該分析系統(tǒng)中的各成分的保持時(shí)間如下。
[0149] ?葡萄糖：16min
[0150] ?乳酸：23min
[0151] ?乙醇：34min
[0152] 〔培養(yǎng)例1〕
[0153] 〈絲狀菌球的制備〉
[0154] 〔孢子懸濁液的制備〕
[0155] 菌株使用由獨(dú)立行政法人制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)（National Institute of Technology and Evaluation(NITE))得到的絲狀菌 R.oryzae NBRC5384。對(duì)于絲狀菌，在 試管內(nèi)形成的斜面狀瓊脂培養(yǎng)基（Difco Potato Dextrose Agar、Becton，Dickinson and Company)上劃線/涂布菌體，在25°C下靜置培養(yǎng)，定期進(jìn)行繼代培養(yǎng)。在使用菌體時(shí)向菌體 增殖后的試管添加10mL的滅菌蒸饋水，然后用觸摸式攪拌機(jī)（touch mixer)攪拌4分鐘， 從而回收孢子，進(jìn)一步添加無菌的蒸餾水進(jìn)行稀釋，從而將調(diào)整到1 X 106sp〇reS/mL的液體 作為孢子懸濁液。
[0156] 〔絲狀菌的菌球化〕
[0157] 絲狀菌球的制備通過以下2個(gè)階段的培養(yǎng)進(jìn)行。
[0158] 第一階段的培養(yǎng)，對(duì)投入有60mL的PDB培養(yǎng)基（Difco Potato Dextrose Broth、 Becton，Dickinson and Company)的容積 200mT,的帶折流板維形瓶（baffled Erlermeyer flask)進(jìn)行滅菌，進(jìn)行植菌以使得利用上述方法所制備的孢子懸濁液成為1 X104個(gè)孢子/ mL，在27°C、100r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培養(yǎng)條件下進(jìn)行3天。
[0159] 第二階段的培養(yǎng)，對(duì)投入有形成菌球的培養(yǎng)基（葡萄糖（和光純藥工業(yè)公司制）10 質(zhì)量％、硫酸鎂七水合物0. 025質(zhì)量％、硫酸鋅七水合物0. 009質(zhì)量％、硫酸銨0. 1質(zhì)量％、 磷酸二氫鉀〇. 06質(zhì)量％ )2L的容積2L的氣升型發(fā)酵槽進(jìn)行滅菌，將第一階段的培養(yǎng)液 120mL植菌，并在27°C、以通氣速度lvvm供給空氣的條件下進(jìn)行1.5天。pH通過適當(dāng)添加 3N氫氧化鈉溶液來維持在pH (25 °C ) 6. 0。
[0160] 〔菌球的回收〕
[0161] 利用紗布過濾上述各階段中得到的絲狀菌球培養(yǎng)液1分鐘直至濾液的滴下停止 為止，得到濕潤狀態(tài)的絲狀菌球。第二階段中得到的菌球立即供于發(fā)酵性的評(píng)價(jià)。
[0162] 〔培養(yǎng)例2〕
[0163] 〔絲狀菌的載體固定化〕
[0164] 固定化絲狀菌的制備通過以下2個(gè)階段的培養(yǎng)進(jìn)行。
[0165] 第一階段的培養(yǎng)，對(duì)投入有30mL的固定化培養(yǎng)基（葡萄糖（和光純藥工業(yè)公司 制）5質(zhì)量％、硫酸鎂七水合物0. 025質(zhì)量％、硫酸鋅七水合物0. 009質(zhì)量％、尿素0. 2質(zhì) 量％、磷酸二氫鉀0.06質(zhì)量％ )、以及5個(gè)0.8mm見方聚氨酯發(fā)泡體（日清紡公司制、APG) 的100mL錐形瓶進(jìn)行滅菌，進(jìn)行植菌以使得利用與上述絲狀菌球同樣的方法所制備的孢子 懸濁液成為2X 104個(gè)孢子/mL，在35°C、200r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培養(yǎng)條件下進(jìn) 行1天。
[0166] 第二階段的培養(yǎng)，對(duì)投入有菌體增殖培養(yǎng)基（葡萄糖（和光純藥工業(yè)公司制）10 質(zhì)量％、硫酸鎂七水合物0. 025質(zhì)量％、硫酸鋅七水合物0. 009質(zhì)量％、尿素0. 1質(zhì)量％、磷 酸二氫鉀0. 06質(zhì)量％、碳酸鈣5質(zhì)量％ ) 100mL的容積500mL的錐形瓶進(jìn)行滅菌，將第一階 段中固定于載體的絲狀菌進(jìn)行植菌，在35°C、200r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培養(yǎng)條件 下進(jìn)行2天。
[0167] 〔固定化絲狀菌的回收〕
[0168] 通過紗布過濾上述各階段中得到的固定化絲狀菌培養(yǎng)液1分鐘直至濾液的滴下 停止為止，得到濕潤狀態(tài)的固定化絲狀菌。第二階段中得到的固定化絲狀菌立即供于發(fā)酵 性的評(píng)價(jià)。
[0169] 〔發(fā)酵例1〕
[0170] 〈發(fā)酵性的評(píng)價(jià)〉
[0171] 〔培養(yǎng)方法1〕
[0172] 向滅菌過的容積2L的氣升型發(fā)酵槽中添加乳酸發(fā)酵培養(yǎng)液2L，接著添加培養(yǎng)例1 中制備的絲狀菌球總量（濕潤狀態(tài)）。隨后立即進(jìn)行培養(yǎng)第〇小時(shí)的取樣，然后在35°C、以 通氣速度lvvm供給空氣的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。然后邊經(jīng)時(shí)進(jìn)行取樣，邊進(jìn)行14天培養(yǎng)。pH 通過適當(dāng)添加3N氫氧化鈉溶液而維持在pH (25 °C ) 6. 0。發(fā)酵時(shí)在發(fā)酵槽內(nèi)以2L/天的速度 連續(xù)地供給乳酸發(fā)酵培養(yǎng)液，同時(shí)將等量的發(fā)酵液抽出到發(fā)酵槽外。需要說明的是，邊通過 利用液面?zhèn)鞲衅鱽砜刂苹厥找河玫谋枚拱l(fā)酵液面保持恒定，邊進(jìn)行培養(yǎng)液的供給。培養(yǎng) 后，在利用設(shè)置于發(fā)酵液內(nèi)的燒結(jié)過濾器使絲狀菌球留在槽內(nèi)的狀態(tài)下，僅回收了發(fā)酵液。
[0173] 〔發(fā)酵例2〕
[0174] 〈發(fā)酵性的評(píng)價(jià)〉
[0175] 〔培養(yǎng)方法2〕
[0176] 向滅菌過的容積500mL的錐形瓶中添加乳酸發(fā)酵培養(yǎng)液100mL，接著添加培養(yǎng)例 2中制備的固定化絲狀菌總量（濕潤狀態(tài)）。隨后立即進(jìn)行培養(yǎng)第0小時(shí)的取樣，然后在 35°C、200r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培養(yǎng)條件下進(jìn)行2天。發(fā)酵結(jié)束時(shí)進(jìn)行了取樣。然 后，進(jìn)行固定化絲狀菌的回收，向添加了再次滅菌后的乳酸發(fā)酵培養(yǎng)液l〇〇mL的容積500mL 的錐形瓶中，添加回收的固定化絲狀菌，在35°C、200r/m(PRECI公司、PRXYg-98R)的培養(yǎng)條 件下進(jìn)行2天，回收了固定化絲狀菌。然后，重復(fù)進(jìn)行使用回收的固定化絲狀菌且基于同樣 操作的分批培養(yǎng)。
[0177] 〔評(píng)價(jià)方法〕
[0178] 利用發(fā)酵液的分析值，將（1)由糖向乳酸的轉(zhuǎn)化率（P[% ])、（2)由糖向乙醇的轉(zhuǎn) 化率（Q[% ])、（3)向在上述乙醇轉(zhuǎn)化中產(chǎn)生的二氧化碳的轉(zhuǎn)化率（R[% ])這3項(xiàng)作為評(píng) 價(jià)軸。各項(xiàng)的計(jì)算式示于表1和式（1)?（3)。需要說明的是，式中，將供給糖液的葡萄糖 濃度定義為h。另外，如式（4)所示，將利用中和劑的發(fā)酵液的稀釋率定義為S[-]。在使 用燒瓶的發(fā)酵中，利用在培養(yǎng)基中預(yù)先添加的碳酸鈣進(jìn)行中和，因此將稀釋率S設(shè)為1。
[0179] [表 1]
[0180]

【權(quán)利要求】
1. 一種乳酸的制造方法，其包括：在磷酸根離子濃度被控制在低于0. 007質(zhì)量％、且包 含碳源的液體培養(yǎng)基中，使用選自絲狀菌球和固定化絲狀菌中的1種以上的菌體，通過發(fā) 酵而得到乳酸的第一發(fā)酵工序。
2. 如權(quán)利要求1所述的乳酸的制造方法，其具有：當(dāng)?shù)谝话l(fā)酵工序中的乳酸的生產(chǎn)速 度維持率成為50?95%時(shí)，使用第一發(fā)酵工序中使用的所述菌體，在磷酸根離子濃度為 0. 007質(zhì)量％以上且1質(zhì)量％以下、且包含碳源的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵的第二發(fā)酵工序。
3. 如權(quán)利要求2所述的乳酸的制造方法，其在第二發(fā)酵工序后具有：使用第二發(fā)酵工 序中使用的所述菌體，在磷酸根離子濃度被控制在低于〇. 007質(zhì)量％、且包含碳源的液體 培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵的第三發(fā)酵工序。
4. 如權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其在第一發(fā)酵工序前具有：制 備選自絲狀菌球和固定化絲狀菌中的1種以上的菌體的制備工序。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，絲狀菌為根霉屬 (Rhizopus)〇
6. 如權(quán)利要求1?5中任一項(xiàng)所述的乳酸的制造方法，其中，碳源為糖類。
7. 如權(quán)利要求6所述的乳酸的制造方法，其中，糖類為從由淀粉得到的糖液、糖蜜、以 及由木質(zhì)纖維素系生物物質(zhì)得到的糖液中選擇的1種以上。
【文檔編號(hào)】C12P7/56GK104245948SQ201380020347
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年4月18日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月27日
【發(fā)明者】入江裕, 小山伸吾, 野場(chǎng)將宏, 浦川大樹, 中原聰志 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社