用于增加重組蛋白分泌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中通過將蛋白表達(dá)在所述細(xì)胞中，增加所述重組蛋白穿過細(xì)胞壁的分泌的步驟，所述培養(yǎng)基含有表面活性聚合物和單價金屬離子的組合且具有至少0.32osmol/L的滲量，所述發(fā)明進(jìn)一步涉及用于所述方法的培養(yǎng)基和營養(yǎng)物混合物。
【專利說明】用于增加重組蛋白分泌的方法
[0001] 本發(fā)明涉及通過使用合適的表達(dá)方法優(yōu)化真菌或植物的重組表達(dá)系統(tǒng)。
[000引 已經(jīng)在許多出版物中描述了在植物中生產(chǎn)在ng/1至帖/1的濃度范圍內(nèi)的重組蛋 白。國際公開WO 01/25456 A2涉及一種在不裂解苔薛類植物（Moosen)組織或苔薛類植物 細(xì)胞的情況下生產(chǎn)在苔薛類植物中的蛋白的方法。此外提及，在培養(yǎng)基中使用PVP可W增 加生產(chǎn)力。作為例子，展示了VEGF^i (-種具有28 kDa的大小的小糖基化的同源二聚體） 的重組生產(chǎn)炬aur等人，Journal of Biotechnology 119 (2005): 332-342)。Baur等人 描述了使用PEG對苔薛類植物的瞬時轉(zhuǎn)化。用于生產(chǎn)VEGF的培養(yǎng)基不含有PVP或PEG。
[0003]Drake等人，Plant Mol. Biol. 52 (2003) : 233-241描述了在煙草植物組 織（即根）的培養(yǎng)物中抗體的重組表達(dá)。通過根分泌的過程分泌在微克沁g)范圍內(nèi)的抗 體?；诟置诘挠行е参锉磉_(dá)系統(tǒng)主要是毛狀根培養(yǎng)物，其可W通過用發(fā)根±壤桿菌 知rAizwenes)感染任意植物來刺激（Gaume等人，Plant Cell Rep. 21 (2003): 1188-1193)。
[0004]Komarnysky等人，Plant Physiology 124 (2000) : 927-933描述了通過吐水過 程分泌重組蛋白，其中隨葉子的吐水液體分泌出蛋白。每天的生產(chǎn)率在1嗦/g葉質(zhì)量的范 圍內(nèi)。
[0005]在Kwon等人，Biotechnology and Bioengineering 81 (7) (2003) : 870-875中 描述了用于重組表達(dá)異源蛋白的煙草息浮培養(yǎng)物。將經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的愈傷組織細(xì)胞用作用 于生產(chǎn)人IL-12的細(xì)胞系。作為細(xì)胞培養(yǎng)基的添加劑，對3種聚合物穩(wěn)定IL-12的性能進(jìn) 行了測試。PVP和PEG不具有作用。明膠導(dǎo)致IL-12的穩(wěn)定化，直至第5天起培養(yǎng)基中的蛋 白酶導(dǎo)致濃度降低。在Lee等人，Journal of Biotechnology 96 (2002): 205-211中描 述了類似的結(jié)果。
[0006]LaCount等人，Biotechnology Letters 19 (1) (1997) : 93-96描述了通過用PVP 處理W保護(hù)免于蛋白酶降解來穩(wěn)定化重組生產(chǎn)的抗體和GM-CSF。
[0007] Lee和Kim, Biotechnology Letters 24 (2002) : 1779-1783描述了Pluronic F-68和聚己二醇用于保護(hù)煙草息浮培養(yǎng)物中的細(xì)胞免受攬拌罐生物反應(yīng)器中的機(jī)械損傷 的用途。
[0008]Magnuson等人，Protein Expression and化rification 7, (1996) : 220-228描 述了在煙草細(xì)胞的息浮培養(yǎng)物中表達(dá)單克隆抗體的50 kDa重鏈。通過向培養(yǎng)基中添加PVP 使收率增加35倍。該歸因于蛋白的穩(wěn)定化W及阻止了在容器壁上的聚集和積累。66%的蛋 白存在于細(xì)胞質(zhì)中，30%存在于膜級分中，且僅4%存在于培養(yǎng)基中。盡管存在分泌信號序 列(其僅發(fā)送穿過細(xì)胞膜的信號)，但是認(rèn)為具有大于50 kDa的摩爾質(zhì)量的大蛋白過大，不 能穿過細(xì)胞壁。
[0009]Schuster等人，Biotechnol. J. 2 (2002) : 1-9描述了在苔薛類植物原生質(zhì)體 中生產(chǎn)抗體。增加與前述根據(jù)Baur等人的增強(qiáng)效率的轉(zhuǎn)化相組合，在3M-和W5-培養(yǎng)基的 混合物中培養(yǎng)，使收率從0. 1- 0. 5嗦/ml增加至8. 2嗦/ml。
[0010] Tsoi和Doran, Biotechnol. Appl. Biochem. 35 (2002) : 171- 180描述了不 同的表達(dá)培養(yǎng)基和它們對煙草細(xì)胞息浮培養(yǎng)物的抗體表達(dá)的影響。分泌的抗體的收率在 20-200嗦/50ml培養(yǎng)基之間。
[0011] US2010/035327Al涉及培養(yǎng)基的通用添加劑，其由水稻多糖和多膚制成。據(jù)推測 其會提高細(xì)胞產(chǎn)物的生長和分泌。但是，其中沒有提及通過細(xì)胞壁分泌的問題。
[0012] David等人，JournalofBiotechnology150 (1) (2010) : 115- 124 涉及在巨 大芽抱桿菌(公(即沒有細(xì)胞具有細(xì)胞壁）中重組生產(chǎn)抗體片段。
[0013]Baur等人，PlantBiotechnologyJournal3 (3) (2005) : 331- 340 描述了作 為表達(dá)系統(tǒng)的小立碗薛(只W及通過使用添加劑（PV巧和通過表達(dá)人血清白蛋白 增加的重組人生長因子（VEGF)的分泌。
[0014]Decker等人，BioprocessandBiosystems!Engineering,Jan. 31 (1) (2008): 3-9-般地討論了苔薛類植物生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)條件和植物特異性的糖工程。
[0015]Twyman等人，TrendsinBiotechnology21 (12) (2003) : 570- 578 解釋了植 物作為重組表達(dá)系統(tǒng)的用途。關(guān)于收率討論了轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、信號序列和mRNA穩(wěn)定性。
[0016] 盡管已知可用于在異源蛋白的重組生產(chǎn)中增加植物和植物細(xì)胞的生產(chǎn)力的方法， 但是植物系統(tǒng)的生產(chǎn)力仍然始終低于動物細(xì)胞的，例如建立的Cffi)表達(dá)系統(tǒng)。因此，總是需 要進(jìn)一步增加植物表達(dá)系統(tǒng)的生產(chǎn)力。此外，分泌型蛋白的生產(chǎn)是合乎需要的，由此不必破 壞生產(chǎn)細(xì)胞并且可W將其用于其它生產(chǎn)。
[0017] 因此，本發(fā)明的一個目的是，提供改進(jìn)的表達(dá)方法W及用于所述方法的試劑。
[0018] 本發(fā)明涉及一種在具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白的方法，所述方法包括下述 步驟；在培養(yǎng)基中通過在所述細(xì)胞中表達(dá)蛋白，分泌該重組蛋白穿過細(xì)胞壁，所述培養(yǎng)基含 有表面活性聚合物和單價金屬離子的組合且具有至少0.22osmol/L的滲量。本發(fā)明的其 它方面是該種培養(yǎng)基W及材料組合物。具體地，所述分泌步驟是分泌的增加。所述增加通 常相較于未經(jīng)處理的細(xì)胞。此外，本發(fā)明如在所附權(quán)利要求中所定義。在下文中描述了特 定實施方案和優(yōu)選的參數(shù)，它們可W彼此組合地提供。
[0019] 對于成功且廉價的生物藥物的生產(chǎn)而言需要成功的蛋白分泌W及增加的產(chǎn)物量 虹徑八至3/1]。此外，細(xì)胞壁由于它們的（大）分子結(jié)構(gòu)會充當(dāng)尺寸排阻過濾器。在植 物-或真菌細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白時，該事實會阻止大于90kDa的產(chǎn)物分泌進(jìn)培養(yǎng)基中，此 分泌對于進(jìn)一步加工而言是有利的。相反，所生產(chǎn)的蛋白，如果它們具有分泌信號膚，盡管 被運(yùn)輸穿過細(xì)胞膜，但隨后積累在質(zhì)外體空間中，即在位于細(xì)胞膜和植物細(xì)胞壁的外邊界 之間的隔室中。具有至少50kDa的較小蛋白的分泌也減少。本發(fā)明首先增加了蛋白的生 產(chǎn)量，并且此外W令人驚訝的方式促進(jìn)了該蛋白的分泌。根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的蛋白可W具有 任意大小。在較大蛋白的情況中產(chǎn)生特殊的優(yōu)點。因此，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的蛋白優(yōu)選大于 40kDa、大于 50kDa、大于 55kDa、大于 60kDa、大于 65kDa、大于 70kDa、大于 75kDa、大 于80kDa或大于85kDa、大于90kDa。所述蛋白也可W是該種蛋白的二聚體或異聚體。
[0020] 所述單價金屬離子優(yōu)選地選自堿金屬離子，諸如Li、化、K、化或Cs。特別優(yōu)選地， 所述單價金屬離子包含或是化離子。
[002。 優(yōu)選地，所述金屬離子，例如化離子，W至少20ml的濃度，特別優(yōu)選地W至少30 ml、至少40ml、至少50ml、至少60ml、至少70ml、至少80ml、至少90ml或至少100ml 的濃度存在于培養(yǎng)基中。優(yōu)選地，W該些濃度之一存在的金屬離子是軸。
[0022] 通過添加所述金屬離子導(dǎo)致滲量的增加。該促進(jìn)穿過細(xì)胞壁的分泌，但也引起對 細(xì)胞的顯著壓力，由此減緩或完全阻止或生長。蛋白的生產(chǎn)也減緩。優(yōu)選地，所述滲量為至 少 0. 33osmol/L、至少 0. 34osmol/L、至少 0. 35osmol/L、至少 0. 36osmol/L、至少 0. 37 osmol/L、至少0. 38osmol/L或至少0. 4osmol/L。具體地，所述滲量在0. 32osmol/L至 0. 6osmol/L、或 0. 35osmol/L至 0. 55osmol/L的范圍。
[0023] 表面活性聚合物涉及能夠降低液體的表面張力或兩相之間的界面張力、實現(xiàn)或促 進(jìn)分散體的形成或者充當(dāng)增溶劑的物質(zhì)。令人驚訝地，在滲量的情況下通過與金屬離子一 起使用該種聚合物，可W在具有細(xì)胞壁的細(xì)胞表達(dá)分泌型蛋白時出現(xiàn)顯著的產(chǎn)量提高。所 述聚合物尤其是非離子的水溶性表面活性聚合物。優(yōu)選地，所述聚合物對蛋白不具有變性 作用。例子是選自W下的聚合物或共聚物；聚離諸如聚焼基二醇、聚山梨醋或聚己帰化咯焼 麗、聚己帰醇，水溶性的纖維素衍生物諸如輕丙基纖維素、輕丙基甲基纖維素、駿甲基纖維 素或輕己基纖維素，己帰基化咯焼麗-己酸己帰醋共聚物（共聚維麗）、聚己酸己帰醋、部分 地水解的聚己帰醇、聚己帰醇-聚己二醇共聚物及其混合物。
[0024] 優(yōu)選地，所述聚合物中存在的撰基氧（O=Ri)和/或離氧巧i-o-ig的比例是聚合 物的分子量的至少1重量％。不限于特定理論，該樣的氧基團(tuán)在聚合物中似乎導(dǎo)致細(xì)胞的穩(wěn) 定化，使得具有高滲量的含鹽培養(yǎng)基被更好地耐受，并從而可W實現(xiàn)高的生產(chǎn)力。優(yōu)選地， 所述聚合物的撰基氧和離氧的比例為至少1. 5重量％、至少2. 5重量％、或至少5重量％，特 別優(yōu)選至少10重量％、至少15重量％、至少20重量％、至少25重量％。所述聚合物的撰基 氧和離氧的比例優(yōu)選在1重量％至50重量％之間，優(yōu)選在10重量％至42重量％之間，尤 其是在5重量％至38重量％之間，例如，在聚己二醇中36重量％(僅離氧）或如在PVP中 14. 5重量％ (僅撰基氧）。
[0025] 所述聚離優(yōu)選地是聚焼基二醇的聚合物或共聚物，例如聚己二醇（PEG)的聚合物 或共聚物，或聚丙二醇的聚合物或共聚物，或聚己帰-聚氧化丙帰共聚物。所述聚合的焼基 也可W是各個亞焼基的混合物，例如如在泊洛沙姆中。所述焼基優(yōu)選地選自Q-Cg亞焼基， 具體地選自〔2-八3-八4-、心八6-、(：7-亞焼基或其混合物。聚焼基二醇可^根據(jù)式[-1?-0-]。 來構(gòu)造，其中R代表焼基。端位上可W彼此獨立地提供OH基團(tuán)、醋-或離基團(tuán)。所述醋-或 離基團(tuán)可W彼此獨立地選自如已述及的Ci-Cs基團(tuán)，或選自更長的有機(jī)鏈，諸如Cg-CiSD它 們可W經(jīng)由連接基團(tuán)連接，所述連接基團(tuán)優(yōu)選Ci-Ci2-連接基團(tuán)，如芳基（例如在辛苯昔醇 (TritonX-100)或壬苯醇離中）。所述聚離或聚焼基二醇優(yōu)選地含有至少一個OH-基團(tuán)， 優(yōu)選至少2個OH-基團(tuán)。它們可W是端基。
[0026] 所述表面活性聚合物(例如PEG等)的分子量優(yōu)選為至少500Da、特別優(yōu)選地至少 1,000Da、至少 1,500Da、至少 2, 000Da、至少 3, 000Da、至少 4, 000Da、至少 6, 000Da、至 少8, 000Da、至少10, 000Da、至少20, 000Da、至少30, 000Da。特別優(yōu)選地，所述分子量 在 500Da至 2, 000, 000Da之間，優(yōu)選地在 1,000Da至 200, 000Da之間，或在 1,200Da 至80, 000Da之間。
[0027] 所述表面活性聚合物優(yōu)選地W至少0. 05重量％，特別優(yōu)選至少0. 08%、至少0. 1% 或至少1. 5%的濃度存在于培養(yǎng)基中（所有％數(shù)據(jù)W重量％給出）。
[0028] 在特定實施方案中，W息浮培養(yǎng)或水培、特別是W毛狀根培養(yǎng)來培養(yǎng)所述細(xì)胞。用 根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基處理分泌細(xì)胞，W增加它們的分泌活性。
[0029] 在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞的情況中，大都從細(xì)胞的質(zhì)外體空間分泌到培養(yǎng)基中。為了 分泌，任選地到質(zhì)外體空間中，所述蛋白通常與用于質(zhì)外體空間或用于分泌的信號序列一 起表達(dá)。合適的信號序列是本領(lǐng)域充分已知的，例如在上述的文獻(xiàn)中，并且可W根據(jù)本發(fā)明 使用。
[0030] 根據(jù)本發(fā)明的方法特別適合增加具有細(xì)胞壁的細(xì)胞的分泌。該樣的細(xì)胞可W選 自植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞或藻類細(xì)胞。本文中，"細(xì)胞"可W是指分離的細(xì)胞、單個細(xì)胞或在多 細(xì)胞生物體中的細(xì)胞。植物細(xì)胞可W是植物的單個細(xì)胞或在植物中或在植物組織中的細(xì) 胞。類似地，真菌細(xì)胞可W是單個細(xì)胞或在真菌中或在真菌組織中的細(xì)胞。藻類細(xì)胞優(yōu)選 地是綠色藻類細(xì)胞。組織可W例如選自初皮部、木質(zhì)部、葉肉、莖、葉、原植體、原絲體、綠絲 體（化loronema)、莖絲體、假根或配子巧。所述細(xì)胞可W包含原生質(zhì)體或?qū)嵸|(zhì)細(xì)胞、特別是 愈傷組織細(xì)胞或由其組成。
[0031] 在根據(jù)本發(fā)明的方法中待使用的細(xì)胞優(yōu)選地是植物細(xì)胞，優(yōu)選是苔薛類植物的 細(xì)胞，尤其是選自薛類植物化aubmoosen)和苔類植物化ebermoosen)，其中特別優(yōu)選使 用立碗薛屬（Physcomitrella)、葫蘆薛屬（F'unaria)、泥炭薛屬（S地a即um)和角齒薛屬 (Ceratodon) W及地錢屬（Marchantia)和Sphaeroca巧US的種。最優(yōu)選地，使用苔薛類植 物小立碗薛的細(xì)胞、植物或植物組織，諸如原絲體進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法。進(jìn)一步優(yōu)選的植 物是煙草、菜豆（Bohnen)或扁豆化insen)。優(yōu)選地，所述植物是水生植物，例如屬于浮萍屬 (Le皿a)、紫萍屬（Spirodela)、少根紫萍屬（Landoltia)、憲萍屬（Wolffia)或扁平無根萍屬 (Wolffiella)D
[0032] 根據(jù)本發(fā)明的一個進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案，在基本上不含糖、維生素和植物激素 或功能片段的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。合適的植物激素的例子是生長激素，例如生長素。
[0033] 優(yōu)選地，在光合自養(yǎng)生長條件下進(jìn)行根據(jù)本發(fā)明的方法。根據(jù)本發(fā)明的方法提供 完全分化的植物、植物細(xì)胞或藻類在可標(biāo)準(zhǔn)化的光合自養(yǎng)條件（即不需要添加糖、維生素和 植物激素等）下培養(yǎng)的可能性。
[0034] 其實當(dāng)然也可W使用糖、維生素或植物激素，尤其是在用于不能光合自養(yǎng)生長的 真菌細(xì)胞的培養(yǎng)基中。對真菌細(xì)胞而言，應(yīng)當(dāng)提供分解代謝的碳源。由于細(xì)胞的自養(yǎng)性能， 所述培養(yǎng)基可W不含蛋白。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基是滅菌的培養(yǎng)基，W減小感染的危險。還可 W給該培養(yǎng)基補(bǔ)充抗生素，W保護(hù)細(xì)胞免受侵襲該些細(xì)胞的病原體的危害。
[00巧]所述培養(yǎng)基的抑值優(yōu)選在3. 5-8. 5之間，特別優(yōu)選地在4-8之間或在4. 5-7之間 或在5-6. 5之間，特別是在5. 5-6之間。由此，將抑值優(yōu)化至最佳生長或表達(dá)條件。
[0036]為了最佳生長或增加的蛋白生產(chǎn)，該培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)含有各自的細(xì)胞的微量營養(yǎng)物， 尤其是礦物質(zhì)。該培養(yǎng)基優(yōu)選地包含；硝酸根離子，優(yōu)選W至少0.2ml的濃度，磯酸根離 子，優(yōu)選W至少0.05ml的濃度，硫酸根離子，優(yōu)選W至少0.02ml的濃度，巧離子，優(yōu)選W 至少0.1ml的濃度，鐘離子，優(yōu)選W至少0.1ml的濃度，或它們的組合。該培養(yǎng)基也可W 含有軸離子，優(yōu)選W至少20ml的濃度。
[0037] 在本發(fā)明的具體實施方案中，所述方法在所述（增加）重組蛋白在所述培養(yǎng)基中 分泌的步驟之前還包括另一個步驟。在該前一步驟中，使所述細(xì)胞在具有小于0.1osmol/ L的滲量的培養(yǎng)基中生長，尤其是沒有所提及的分泌（的增加），由此蛋白積累在細(xì)胞內(nèi)部 或在細(xì)胞的質(zhì)外體空間中。所述前一步驟特別促進(jìn)蛋白表達(dá)，即使在所述條件下沒有增加 分泌該些蛋白。通過如上所述的隨后的（增加）分泌的步驟，最后可在不破壞細(xì)胞的情況 下分泌和收獲增產(chǎn)的蛋白。通過該兩步法可使產(chǎn)量顯著增加。
[0038] 在該前一步驟中的培養(yǎng)基可W具有與分泌步驟中的培養(yǎng)基基本上相同的組 成-區(qū)別在于由于更低的金屬離子濃度而具有更低的滲量。優(yōu)選地，前一步驟中的培養(yǎng)基 含有-類似于或獨立于分泌步驟中的培養(yǎng)基的組成-硝酸根離子，優(yōu)選W至少0. 2ml的濃 度，磯酸根離子，優(yōu)選W至少0.05ml的濃度，硫酸根離子，優(yōu)選W至少0.02ml的濃度，巧 離子，優(yōu)選W至少0.1ml的濃度，鐘離子，優(yōu)選W至少0.1ml的濃度，或它們的組合。由此 能實現(xiàn)細(xì)胞的最佳生長。優(yōu)選地，軸離子的濃度為最大20ml,特別優(yōu)選最大15ml或最大 10mM。
[0039] 優(yōu)選地，在所述前一步驟中的培養(yǎng)基不含有表面活性聚合物，或W最大0.08重 量％或濃度0.Ol重量％或濃度0. 005重量％的濃度含有表面活性聚合物。
[0040] 在所述前一步驟中，該培養(yǎng)基還可W基本上不含糖、維生素和植物激素或其功能 片段，或者在替代實施方案中它可W含有該些物質(zhì)。該培養(yǎng)基可W是無菌的或含有抗生素。 在所述前一步驟中的培養(yǎng)基的抑值優(yōu)選在3-8之間，特別優(yōu)選地在3. 5-7之間，或在4-6. 5 之間，或在4. 1-6之間，特別是在4. 2-5. 5之間。
[0041] 優(yōu)選地，在前一步驟的培養(yǎng)基中和/或在分泌步驟中，用氣體處理細(xì)胞，尤其是用 空氣或氧氣。用于進(jìn)行氣體處理的氣體優(yōu)選地含有二氧化碳。該氣體中的二氧化碳的比例 優(yōu)選地在0-10體積％之間，特別優(yōu)選地在1-9體積％之間或在1. 5-8體積％之間，特別優(yōu) 選地在1. 7-5體積％之間。二氧化碳充當(dāng)植物的碳源，并且應(yīng)當(dāng)在光合自養(yǎng)條件下提供。
[0042] 在前一步驟中和/或在分泌步驟中的溫度優(yōu)選在IOC至3(TC之間，特別優(yōu)選地在 15C至26C之間。
[0043]W光子通量密度（WUE計）為單位測量的光福照優(yōu)選地是在1-3000之間，特 別是在100-2200之間。
[0044] 所述前一步驟可進(jìn)行2-30天的時間。在該時間內(nèi)，實現(xiàn)該重組蛋白的最佳生產(chǎn)。
[0045] 所述（增加）分泌的步驟可進(jìn)行至少2天的時間，優(yōu)選進(jìn)行3-120天。在該時間 內(nèi)，實現(xiàn)事先產(chǎn)生的或在該步驟中產(chǎn)生的重組蛋白的最佳分泌。
[0046]所述兩步法是基于植物細(xì)胞培養(yǎng)物的半連續(xù)培養(yǎng)，并且由向培養(yǎng)基中接種植物細(xì) 胞、用特定物理參數(shù)溫育和在該過程中添加一些培養(yǎng)基組分組成。在該方法的進(jìn)程中，通過 改變培養(yǎng)基條件，在給點的時間點將蛋白從質(zhì)外體空間分泌進(jìn)培養(yǎng)物上清液中。
[0047] 根據(jù)本發(fā)明的方法通常-但并非必然-開始于將細(xì)胞（例如0. 1 的干燥生物 質(zhì)）接種進(jìn)帶有培養(yǎng)基的合適生物反應(yīng)器系統(tǒng)（波浪反應(yīng)器、恒化器、管式反應(yīng)器、搖瓶等） 中，W及生產(chǎn)生物質(zhì)直至給定的細(xì)胞密度（例如1-3g^)。通過增加滲量，例如通過加入金 屬離子和所述聚合物（其中在大多數(shù)情況下，單獨的聚合物不會造成滲量的增加，并且經(jīng) 常甚至造成滲量的降低），開始分泌。經(jīng)該2個階段由細(xì)胞產(chǎn)生和表達(dá)蛋白。根據(jù)本發(fā)明 的方法的規(guī)?？蒞是任意縮放的，并且可W用在不同的反應(yīng)器和量中。可W是最小的生物 反應(yīng)器（微孔滴定板）、搖瓶、5L恒化器、100L管式反應(yīng)器和波浪生物反應(yīng)器（10L-500 L)。
[0048] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及如上所述的培養(yǎng)基，例如W至少0. 05重量％的量包含表面活性 聚合物和W至少20 ml的濃度包含單價金屬離子，并且具有至少0. 32 osmol/L的滲量。所 述培養(yǎng)基適合用于上述的方法，并且可W用在其中，尤其是在（增加）分泌的步驟中。
[0049] 所述培養(yǎng)基優(yōu)選地包含；硝酸根離子，優(yōu)選W至少0. 2ml的濃度，磯酸根離子，優(yōu) 選W至少0.05ml的濃度，硫酸根離子，優(yōu)選W至少0.02ml的濃度，巧離子，優(yōu)選W至少 0.1ml的濃度，鐘離子，優(yōu)選W至少0.1ml的濃度，或它們的組合。所述培養(yǎng)基優(yōu)選地包含 軸離子，優(yōu)選W至少40ml或至少60ml或至少80ml的濃度。
[0050] 本發(fā)明也涉及干燥的營養(yǎng)培養(yǎng)基混合物，其用于重構(gòu)如上所述的培養(yǎng)基。該營養(yǎng) 培養(yǎng)基混合物可W通過加入水產(chǎn)生所述培養(yǎng)基的上述量和濃度。因而，本發(fā)明也涉及通過 將所述成分溶解在水性溶劑、優(yōu)選水中來生產(chǎn)所述培養(yǎng)基的方法。
[0051] 通過下述附圖和實施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但是不應(yīng)限于本發(fā)明的該些具體實施 方案。
[0052]

【專利附圖】

【附圖說明】： 圖1顯示了通過化Cl增加的滲量和聚合物PEG對重組生產(chǎn)的抗體的分泌的協(xié)同效應(yīng)； 圖2顯示了由于促進(jìn)植物生長的礦物質(zhì)（硝酸巧）產(chǎn)生的額外的增加生產(chǎn)的效應(yīng)； 圖3顯示了不同的聚合物濃度的作用。
[00閲 實施例： 本發(fā)明提供了實現(xiàn)從植物培養(yǎng)物連續(xù)將重組蛋白分泌進(jìn)培養(yǎng)基中的方法。在所述方法 中，將生產(chǎn)植物浸沒在液體培養(yǎng)物中，在給定的礦質(zhì)培養(yǎng)基中光合自養(yǎng)地培養(yǎng)。所述培養(yǎng)基 對苔薛類植物的最佳營養(yǎng)供給進(jìn)行了優(yōu)化，但是本身不會造成重組生產(chǎn)的較大蛋白分泌進(jìn) 培養(yǎng)基中，所述蛋白首先積累在質(zhì)外體中，并且在分解苔薛類植物組織W后可W作為"細(xì)胞 內(nèi)的"測量。
[0054] 通過向培養(yǎng)基中添加滲透活性物質(zhì)（"分泌組分"），諸如化Cl和聚己二醇（PEG) 4000,可W消除蛋白的質(zhì)外體抑制。然后可觀察到積累的蛋白快速釋放到培養(yǎng)基中，和在進(jìn) 一步的培養(yǎng)進(jìn)程中新合成的蛋白的持續(xù)的和立即的分泌。
[00巧]實驗實施例；錐形瓶培養(yǎng)物中蛋白分泌的對比 將180ml無菌的Knop-或WMOl-培養(yǎng)基裝入500ml錐形瓶中，調(diào)節(jié)至抑4. 5-6 (2-(N-嗎晰代）己賴酸緩沖液，"MES")，并接種用勻質(zhì)機(jī)新鮮混合的產(chǎn)生試驗蛋白的重組 菌株的立碗薛原絲體的息浮培養(yǎng)物。接種密度為0. 1g干重八。將培養(yǎng)物W無菌的且可透 氣的方式密封，并用富集了 2%0)2的氣氛培養(yǎng)。在生長至1-3g/1的細(xì)胞密度W后，W無菌 濃縮物的形式加入分泌組分。在培養(yǎng)期間，定期測定參數(shù)培養(yǎng)物密度（g干重/1)、細(xì)胞內(nèi)的 和細(xì)胞外的IgG-滴度（mg/1)的。
[0056]結(jié)果： 生產(chǎn)了下述試驗蛋白： 表1;分泌的試驗蛋白

【權(quán)利要求】
1. 在具有細(xì)胞壁的細(xì)胞中生產(chǎn)重組蛋白的方法，所述方法包括在培養(yǎng)基中通過在所述 細(xì)胞中表達(dá)蛋白，分泌所述重組蛋白穿過細(xì)胞壁的步驟，所述培養(yǎng)基含有表面活性聚合物 和單價金屬離子的組合且具有至少0. 32osmol/L的滲量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述分泌從所述細(xì)胞的質(zhì)外體空間向培 養(yǎng)基中進(jìn)行。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是植物細(xì)胞、在植物中或 在植物組織中的細(xì)胞、真菌細(xì)胞或在真菌中的細(xì)胞、或藻類細(xì)胞，特別優(yōu)選是苔蘚類植物細(xì) 胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項所述的方法，其特征在于，在懸浮培養(yǎng)物中培養(yǎng)所述 細(xì)胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中的任一項所述的方法，其特征在于，所述金屬離子是堿金屬離 子，優(yōu)選鈉，和/或所述金屬離子以至少20mM的濃度存在于所述培養(yǎng)基中。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中的任一項所述的方法，其特征在于，所述表面活性聚合物是聚 烷基二醇，優(yōu)選聚乙二醇，和/或所述表面活性聚合物以至少〇. 05重量％的濃度存在于所 述培養(yǎng)基中。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中的任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基包含：硝酸根離 子，優(yōu)選以至少0.2mM的濃度，磷酸根離子，優(yōu)選以至少0.05mM的濃度，硫酸根離子，優(yōu)選 以至少0.02mM的濃度，鈣離子，優(yōu)選以至少0.1mM的濃度，鉀離子，優(yōu)選以至少0.1mM的 濃度，鈉離子，優(yōu)選以至少20mM的濃度，或它們的組合。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中的任一項所述的方法，其特征在于，在所述的在所述培養(yǎng)基中 分泌所述重組蛋白的步驟之前，使所述細(xì)胞在前一步驟中在具有小于0. 1 〇smol/L的滲量 的培養(yǎng)基中生長，尤其是沒有所述分泌，由此蛋白積累在所述細(xì)胞內(nèi)或在所述細(xì)胞的質(zhì)外 體空間中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述前一步驟中的培養(yǎng)基包含：硝酸根離 子，優(yōu)選以至少0.2mM的濃度，磷酸根離子，優(yōu)選以至少0.05mM的濃度，硫酸根離子，優(yōu)選 以至少0.02mM的濃度，鈣離子，優(yōu)選以至少0.1mM的濃度，鉀離子，優(yōu)選以至少0.1mM的 濃度，或它們的組合；和/或以最大20mM的濃度包含鈉離子。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述前一步驟中的培養(yǎng)基不包含所 述表面活性聚合物，或以最大0. 08重量％的濃度包含所述表面活性聚合物。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8-10中的任一項所述的方法，其特征在于，所述前一步驟進(jìn)行2-30 天的時間。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中的任一項所述的方法，其特征在于，所述分泌步驟進(jìn)行至少2 天、優(yōu)選3-120天的時間。
13. 適合用于根據(jù)權(quán)利要求1-12中的任一項所述的方法促進(jìn)分泌的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng) 基以至少0. 05重量％的量包含所述表面活性聚合物和以至少20mM的濃度的單價金屬離 子，且具有至少0.32osmol/L的滲量。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包含：硝酸根離子，優(yōu)選以至少0.2mM 的濃度，磷酸根離子，優(yōu)選以至少0.05mM的濃度，硫酸根離子，優(yōu)選以至少0.02mM的濃 度，鈣離子，優(yōu)選以至少0.1mM的濃度，鉀離子，優(yōu)選以至少0.1mM的濃度，鈉離子，優(yōu)選以 至少40mM的濃度，或它們的組合。
15.干燥的營養(yǎng)培養(yǎng)基混合物，其用于重構(gòu)根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的培養(yǎng)基。
【文檔編號】C12N5/00GK104379750SQ201380020538
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月17日
【發(fā)明者】W.喬斯特, M.克納彭伯格, D.克勞斯尼特澤, A.沙亞夫 申請人:格林諾瓦森生物技術(shù)股份有限公司