乳酸的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種提高了乳酸生產(chǎn)能力的根霉屬菌以及使用該菌制造乳酸的方法。一種提高根霉屬菌的乳酸脫氫酶活性的方法、以及使用該根霉屬菌的菌絲體制造乳酸的方法，其中，包含使根霉屬菌的孢子在特定條件下在含有表面活性劑的培養(yǎng)液中發(fā)芽，獲得菌絲體。
【專利說明】乳酸的制造方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種乳酸的制造方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 作為生物降解性塑料材料而受到關(guān)注的聚乳酸（poly-lactic acid、PLA)的原料 的乳酸是由來自植物的原料，通過生物學(xué)的生產(chǎn)法而獲得的。因此，PLA被稱為不增加大氣 中的C0 2量的材料（碳中和材料）。乳酸中存在光學(xué)異構(gòu)體的D-體和L-體，為了控制作為 塑料材料的聚乳酸的特性，需要光學(xué)純度高的乳酸。
[0003] -直以來，作為生物學(xué)的乳酸生產(chǎn)方法，已知有將乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、 乳球菌屬(Lactococcus)等乳酸菌在厭氧環(huán)境下培養(yǎng)，使之乳酸發(fā)酵的方法（非專利文獻(xiàn) 1)。進(jìn)一步，作為特異地生產(chǎn)L-乳酸的方法，已知有培養(yǎng)作為絲狀菌的根霉屬(Rhizopus) 的方法（專利文獻(xiàn)1?3)。使用根霉屬菌生產(chǎn)乳酸雖然具有獲得光學(xué)純度高的乳酸，可以 用比較簡(jiǎn)單的培養(yǎng)基組成進(jìn)行培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)，但是，在生產(chǎn)速度方面還不能令人滿意。
[0004] 在絲狀菌的培養(yǎng)中，為了控制接種量，通常通過用斜面培養(yǎng)基等固體培養(yǎng)基使之 充分增殖來形成孢子，通過少量的表面活性劑使該孢子分散于無菌水等中，以每單位培養(yǎng) 基為一定量的孢子數(shù)量的方式進(jìn)行接種來進(jìn)行（例如專利文獻(xiàn)2和4)。另外，作為通常的 絲狀菌的培養(yǎng)法，已知有固體培養(yǎng)或者液體培養(yǎng)。使用了根霉屬的物質(zhì)生產(chǎn)中，主要使用液 體培養(yǎng)，此時(shí)菌體形態(tài)為纖維狀、塊狀或者顆粒狀等各種形態(tài)來利用（非專利文獻(xiàn)2、專利 文獻(xiàn)2?5)。
[0005] 使用了根霉屬菌的乳酸生產(chǎn)中，為了提高其生產(chǎn)能力，對(duì)培養(yǎng)基條件、培養(yǎng)條件等 進(jìn)行了各種研究（非專利文獻(xiàn)3、專利文獻(xiàn)3、4、6)。非專利文獻(xiàn)4中發(fā)現(xiàn)了乳酸生產(chǎn)能力 與乳酸脫氫酶（LDH)活性相關(guān)，通過基因重組技術(shù)將LDH導(dǎo)入米根霉(Rhizopus oryzae) 中使之高度表達(dá)，從而成功地提高了乳酸生產(chǎn)能力。然而，不依靠基因重組而使根霉屬菌的 LDH活性提高的方法還不明確。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開昭51-12990號(hào)公報(bào)
[0009] 專利文獻(xiàn)2 :日本特開2000-037196號(hào)公報(bào)
[0010] 專利文獻(xiàn)3 :日本特開2006-246846號(hào)公報(bào)
[0011] 專利文獻(xiàn)4 :日本特開平6-253871號(hào)公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)5 :日本特開平9-077803號(hào)公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn)6 :美國(guó)專利第4564594號(hào)公報(bào)
[0014] 非專利文獻(xiàn) 1 :Enzyme and Microbial Technology (2000) vol. 26:87-107
[0015] 非專利文獻(xiàn)2 :生物工程學(xué)會(huì)刊（2000)第78卷第12號(hào)：487-493
[0016] 非專利文獻(xiàn) 3 :Applied Biochemistry and Biotechnology (1999) vol. 78:401-407
[0017] 非專利文獻(xiàn) 4 :Appl ied Microbiology and Biotechnology (2004) vol.64:237-242


【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 即，本發(fā)明提供一種提高根霉屬菌的乳酸脫氫酶活性的方法，所述方法為包括下 述工序（A1)的提高根霉屬菌的乳酸脫氫酶活性（LDH)的方法，
[0019] (A1)使根霉屬菌的孢子在含有0. 01% (w/v)以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中 發(fā)芽，獲得菌絲體的工序，
[0020] 該表面活性劑是選自山梨糖醇酐脂肪酸酯、Ρ0Ε山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩 爾數(shù)為5以下的Ρ0Ε烷基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至 少1種。
[0021] 另外，本發(fā)明提供一種提高了乳酸生產(chǎn)能力的根霉屬菌的生產(chǎn)方法，所述方法包 括通過上述本發(fā)明的LDH活性提高方法來獲得提高了乳酸脫氫酶活性的根霉屬菌。
[0022] 另外，本發(fā)明提供通過上述生產(chǎn)方法獲得的根霉屬菌。
[0023] 另外，本發(fā)明提供一種乳酸的制造方法，所述乳酸的制造方法包括下述工序（A1) 和（B)，
[0024] (A1)使根霉屬菌的孢子在含有0. 01% (w/v)以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中 發(fā)芽，獲得提高了乳酸脫氫酶活性的菌絲體的工序；和
[0025] (B)將獲得的菌絲體進(jìn)一步在第3培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲得乳酸的工序，
[0026] 該表面活性劑是選自山梨糖醇酐脂肪酸酯、Ρ0Ε山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩 爾數(shù)為5以下的Ρ0Ε烷基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至 少1種。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明涉及提高根霉屬菌的乳酸脫氫酶（LDH)活性或者乳酸生產(chǎn)能力的方法，使 用該方法獲得的提高了 LDH活性或者乳酸生產(chǎn)能力的根霉屬菌，以及使用該根霉屬菌高效 制造乳酸的方法。
[0028] 本發(fā)明人們對(duì)于不依靠人工的基因重組技術(shù)而提高根霉屬菌的乳酸生產(chǎn)能力的 方法進(jìn)行了探討。其結(jié)果，本發(fā)明人們發(fā)現(xiàn)，在特定的條件下使孢子在含有表面活性劑的培 養(yǎng)基中發(fā)芽，成長(zhǎng)為菌絲體的根霉屬菌展現(xiàn)了高的LDH活性，進(jìn)一步具有高的乳酸生產(chǎn)能 力。另外，本發(fā)明人們發(fā)現(xiàn)，可以通過培養(yǎng)該根霉屬菌，高效地制造乳酸。
[0029] 由本發(fā)明獲得的根霉屬菌的菌體具有高的LDH活性，還提高了乳酸生產(chǎn)能力。通 過培養(yǎng)該菌體，可以高效地制造乳酸。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種提高根霉屬菌的LDH活性的方法。LDH是將丙 酮酸變換為乳酸的酶，有報(bào)告稱LDH活性高的根霉屬菌能生產(chǎn)出更多的乳酸。由本發(fā)明獲 得的根霉屬菌具有高的LDH活性或高的乳酸生產(chǎn)能力，作為乳酸制造用的根霉屬菌有用。
[0031] 作為上述本發(fā)明的供給提高LDH活性的方法的根霉屬菌，例如可以列舉天生具 有LDH活性的根霉屬菌、以及天生具有乳酸生產(chǎn)能力的根霉屬菌。從提高LDH活性、提高 乳酸生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)出發(fā)，作為供給本發(fā)明的方法的優(yōu)選的根霉屬菌，可以列舉米根霉 (Rhizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)、華根霉(Rhizopus chinensis)、黑 根霉(Rhizopus nigricans)、東京根霉(Rhizopus tonkinensis)、小壽麥曲根霉(Rhizopus tritici)等。進(jìn)一步，供給本發(fā)明的提高LDH活性的方法的根霉屬菌，天生LDH活性或者 乳酸生產(chǎn)能力沒有或者較弱，也可以是人工施加了提高LDH活性或者乳酸生產(chǎn)能力的變化 的根霉屬菌。作為這樣的根霉屬菌的例子，可以列舉向乳酸生產(chǎn)能力低的根霉（Rhizopus) 屬菌株中導(dǎo)入了 IdhA基因的根霉（Rhizopus)屬菌株。上述列舉的根霉屬菌中，從LDH活 性和乳酸生產(chǎn)能力的提高性的觀點(diǎn)、獲取性的觀點(diǎn)出發(fā)，進(jìn)一步優(yōu)選為米根霉(Rhizopus oryzae)。作為優(yōu)選的米根霉(Rhizopus oryzae)菌株，可以列舉保藏并登記在作為菌株保 存機(jī)構(gòu)的（獨(dú)）制品評(píng)價(jià)技術(shù)基礎(chǔ)機(jī)構(gòu)的生物遺傳資源中心（NBRC)中的米根霉(Rhizopus orvzae)的 NBRC 4707、NBRC 4785、NBRC 5384、以及 NBRC 5418。除了 NBRC 以外，這些菌株 可以從獨(dú)立行政法人理化學(xué)研究所生物資源中心（Riken BRC)等購(gòu)得。
[0032] 本發(fā)明的提高LDH活性的方法包括：使希望提高LDH活性或者乳酸生產(chǎn)性的上述 列舉的根霉屬菌的孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中發(fā)芽，獲得 菌絲體的工序（以下，稱為"工序（A1) "。）。
[0033] 供給工序（A1)的根霉屬菌雖然優(yōu)選全部為孢子，但也可以包含菌絲。根霉屬菌的 孢子可以通過例如，將含有上述列舉的根霉屬菌的孢子懸濁液接種在培養(yǎng)基中靜置培養(yǎng)， 經(jīng)目視確認(rèn)菌絲成長(zhǎng)和孢子形成之后，將培養(yǎng)物懸濁于含有表面活性劑的液體中，靜置之 后，將上清液作為孢子懸濁液回收來進(jìn)行制備。回收的孢子懸濁液中的孢子數(shù)量可以在顯 微鏡觀察下使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（hemocytometer)等計(jì)數(shù)。孢子懸池液可以經(jīng)適當(dāng)稀釋調(diào)節(jié) 至所期望的孢子數(shù)。
[0034] 在工序（A1)中，將上述獲得的孢子懸濁液接種至第1培養(yǎng)液中培養(yǎng)，使孢子發(fā)芽 并獲得菌絲體。培養(yǎng)液中接種的根霉屬菌的孢子數(shù)優(yōu)選為IX 1〇2?5X104個(gè)-孢子/mL-培 養(yǎng)液、進(jìn)一步優(yōu)選為5X102?1X10 4個(gè)-孢子/mL-培養(yǎng)液、更優(yōu)選為1X103?1X104 個(gè)-孢子/mL-培養(yǎng)液。對(duì)于工序（A1)中使用的孢子發(fā)芽用的第1培養(yǎng)液，可以利用市售 的培養(yǎng)基，例如、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（以下稱為PDB培養(yǎng)基，例如Becton, Dickinson and Company制造）、Luria_Bertani培養(yǎng)基（以下稱為L(zhǎng)B培養(yǎng)基"Daigo"，例如日本制藥制造）、 營(yíng)養(yǎng)肉湯（Nutrient Broth)(以下稱為NB培養(yǎng)基，例如Becton, Dickinson and Company制 造）、沙氏培養(yǎng)基（SabouraucT s Culture)(以下稱為SB培養(yǎng)基，例如0X0ID制造）等。根 據(jù)需要，從發(fā)芽率和菌體繁殖的觀點(diǎn)出發(fā)，可以在工序（A1)所使用的第1培養(yǎng)液中適當(dāng)添 加作為碳源的葡萄糖、木糖等單糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等低聚糖、或者淀粉等多糖；甘油、檸 檬酸等生物成分；作為氮源的硫酸銨、尿素等、氨基酸等；作為其他無機(jī)物的鈉、鉀、鎂、鋅、 鐵、磷酸等各種鹽類。單糖、低聚糖、多糖以及甘油的優(yōu)選濃度為〇. 1?30% (w/v)、檸檬酸 的優(yōu)選濃度為〇. 01?10% (w/v)、硫酸銨、尿素以及氨基酸的優(yōu)選濃度為0. 01?1% (w/ v)、無機(jī)物的優(yōu)選濃度為〇. 0001?〇. 5 % (w/v)。
[0035] 進(jìn)一步，在工序（A1)中使用的第1培養(yǎng)液含有選自山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙 烯（Ρ0Ε)山梨糖醇酐脂肪酸酯、氧化乙烯（E0)平均加成摩爾數(shù)為5以下的聚氧乙烯（Ρ0Ε) 烷基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少1種的表面活性 齊U。在這些表面活性劑的存在下，通過將根霉屬菌從孢子培養(yǎng)為菌絲體，可以提高菌的LDH 活性和乳酸生產(chǎn)能力。上述表面活性劑中，從提高LDH活性和乳酸生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)、抑制培 養(yǎng)中的發(fā)泡的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為選自山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯、E0平均 加成摩爾數(shù)為20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、E0平均加成摩爾數(shù)為5以下的聚 氧乙烯月桂基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、以及E0平均加成摩爾數(shù)為10的聚氧乙烯辛 基苯基醚中的至少1種，進(jìn)一步優(yōu)選為選自山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯、 E0平均加成摩爾數(shù)為4的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、E0平均加成摩爾數(shù)為3或4的 聚氧乙烯月桂基醚、以及烯基琥珀酸鹽中的至少1種，更優(yōu)選為山梨糖醇酐單月桂酸酯。
[0036] 上述表面活性劑可以購(gòu)入市場(chǎng)品。作為具體例子，作為山梨糖醇酐單月桂酸酯，可 以列舉RHE0D0L (注冊(cè)商標(biāo)）SP-L10、RHE0D0L (注冊(cè)商標(biāo)）SUPER SP-L10 (都是花王制造）； 作為山梨糖醇酐單油酸酯，可以列舉RHE0D0L (注冊(cè)商標(biāo)）SP-010V ;作為E0平均加成摩爾 數(shù)為20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯，可以列舉RHE0D0L(注冊(cè)商標(biāo)）TW-L106、 RHE0D0L(注冊(cè)商標(biāo)）SUPER TW-L120(都是花王制造）；作為E0平均加成摩爾數(shù)為5以 下的聚氧乙烯月桂基醚，可以列舉EMULGEN(注冊(cè)商標(biāo)）103、EMULGEN(注冊(cè)商標(biāo)）104P、 EMULGEN (注冊(cè)商標(biāo)）106(都是花王制造）；作為脫氧膽酸鹽，可以列舉脫氧膽酸鈉（和光純 藥工業(yè)制造）；作為烯基琥珀酸鹽，可以列舉LATEMUL (注冊(cè)商標(biāo)）ASK (花王制造）；作為聚 氧乙烯烷基苯基醚，可以列舉TRITON(注冊(cè)商標(biāo)）X-100(MP Biomedicals公司）等。
[0037] 在工序（A1)中使用的第1培養(yǎng)液中，添加選自上述表面活性劑中的至少一種即 可。該第1培養(yǎng)液中的上述表面活性劑的濃度，從提高LDH活性和乳酸生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)出 發(fā)，作為培養(yǎng)液中的最終濃度為0.01% (w/v)以上，優(yōu)選為0.05% (w/v)以上，進(jìn)一步優(yōu)選 為0.1% (w/v)以上，更優(yōu)選為0.2% (w/v)以上。另外，從同樣的觀點(diǎn)出發(fā)，該表面活性劑 在培養(yǎng)液中的最終濃度優(yōu)選小于2.5% (w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選小于1.5% (w/v)，更優(yōu)選小于 1.0% (w/v)，進(jìn)一步更優(yōu)選小于0.8% (w/v)。進(jìn)一步，工序（A1)中使用的培養(yǎng)液中的上述 表面活性劑的濃度，從提高LDH活性和乳酸生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)出發(fā)，作為培養(yǎng)液中的最終濃 度優(yōu)選為0.01 % (w/v)以上且小于2.5% (w/v)，進(jìn)一步優(yōu)選為0.05% (w/v)以上且小于 1.5% (w/v)，更優(yōu)選為0.1% (w/v)以上且小于1.0% (w/v)，進(jìn)一步更優(yōu)選為0.2% (w/v) 以上且小于0. 8% (w/v)。
[0038] 在工序（A1)中，使用含有上述表面活性劑的第1培養(yǎng)液來培養(yǎng)上述根霉屬菌。培 養(yǎng)按照通常的順序進(jìn)行即可。例如，向包含含有該表面活性劑的第1培養(yǎng)液的培養(yǎng)容器中 接種根霉屬菌孢子，一邊以優(yōu)選為80?250rpm、進(jìn)一步優(yōu)選為100?170rpm進(jìn)行攪拌，一 邊在25?42. 5°C的培養(yǎng)溫度控制下培養(yǎng)優(yōu)選為24?120小時(shí)、進(jìn)一步優(yōu)選為48?72小 時(shí)。供給培養(yǎng)的第1培養(yǎng)液的量可以根據(jù)培養(yǎng)容器進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，例如，在200mL容積的帶 有擋板的燒瓶的情況下，為50?100mL左右即可；在500mL容積的帶有擋板的燒瓶的情況 下，為100?300mL左右即可。通過該培養(yǎng)，根霉屬菌孢子發(fā)芽，成長(zhǎng)為菌絲體。
[0039] 本發(fā)明的提高LDH活性的方法，從提高LDH活性和乳酸生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu) 選進(jìn)一步包括：進(jìn)一步培養(yǎng)工序（A1)所獲得的菌絲體，使之增殖的工序（以下，稱為"工序 (A2)"。）。工序（A2)中使用的增殖用的培養(yǎng)液（以下，稱為"第2培養(yǎng)液"。）不特別限定， 只要是普通使用的含有葡萄糖的無機(jī)培養(yǎng)液即可，例如可以列舉含有7. 5?30%葡萄糖、 0. 05?2 %硫酸銨、0. 03?0. 6%磷酸二氫鉀、0. 01?0. 1 %硫酸鎂?七水合物、0. 005? 0. 05%硫酸鋅?七水合物、以及3. 75?20%碳酸鈣（以上濃度都是％ (w/v))的培養(yǎng)液等， 優(yōu)選可以列舉含有10%葡萄糖、0. 1 %硫酸銨、0. 06%磷酸二氫鉀、0. 025%硫酸鎂?七水合 物、0. 009%硫酸鋅?七水合物、以及5. 0%碳酸鈣（以上濃度都是％ (w/v))的培養(yǎng)液。第 2培養(yǎng)液的量可以根據(jù)培養(yǎng)容器進(jìn)行適當(dāng)調(diào)節(jié)，例如，在500mL容積的帶有擋板的燒瓶的情 況下，可以為50?300mL、優(yōu)選為100?200mL。在此培養(yǎng)液中，將工序（A1)中培養(yǎng)的根霉 屬菌菌絲體以作為濕重量為1?6g-菌體/100mL-培養(yǎng)基、優(yōu)選為3?4g-菌體/100mL-培 養(yǎng)基的方式進(jìn)行接種，一邊以100?300rpm、優(yōu)選為170?230rpm進(jìn)行攪拌，一邊在25? 42. 5°C的培養(yǎng)溫度控制下培養(yǎng)12?120小時(shí)、優(yōu)選為24?72小時(shí)。
[0040] 工序（A2)中使用的第2培養(yǎng)液沒有必要含有在涉及第1培養(yǎng)液時(shí)列舉的表面活 性劑，但是也可以含有。第2培養(yǎng)液中的該表面活性劑的濃度，從提高LDH活性和乳酸生產(chǎn) 能力的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為工序（A1)中使用的第1培養(yǎng)液中的該表面活性劑濃度的五分之一 以下、進(jìn)一步優(yōu)選為十分之一以下、更優(yōu)選為二十分之一以下。例如，工序（A2)中使用的第 2培養(yǎng)液中的表面活性劑的濃度，從提高LDH活性和乳酸生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)出發(fā)，作為培養(yǎng)液 中的最終濃度優(yōu)選為0.2% (w/v)以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0.15% (w/v)以下，更優(yōu)選為0.1% (w/v)以下，更優(yōu)選為0.05% (w/v)以下，更優(yōu)選為0.01% (w/v)以下。
[0041] 由上述工序（A1)或者工序（A2)獲得的根霉屬菌的菌絲體優(yōu)選具有顆粒形狀。進(jìn) 一步，如果一個(gè)一個(gè)的顆粒明顯獨(dú)立，為表面光滑，且粒徑在0. 5?5mm左右，并且相互具有 大致均勻的形狀的顆粒，則在后述的乳酸制造過程中容易操作，并且即使重復(fù)使用形狀也 難以破壞，因此，更優(yōu)選之?？梢酝ㄟ^改變培養(yǎng)的時(shí)間、溫度、培養(yǎng)中的攪拌速度等來形成所 期望的大小或外觀的顆粒。然而，在本發(fā)明的方法中，不一定需要將菌絲體顆?；硗?，不 一定需要調(diào)節(jié)顆粒的大小或外觀。
[0042] 接下來，將由上述工序（A1)或者工序（A2)獲得的菌絲體作為提高了 LDH活性的 根霉屬菌回收。菌絲體的回收方法不特別限制，可以通過傾斜法、過濾、離心分離等通常的 方法進(jìn)行。
[0043] 由以上的本發(fā)明的提高根霉屬菌的LDH活性的方法獲得的根霉屬菌因?yàn)樘岣吡?LDH活性，因此具有更高的乳酸生產(chǎn)能力。因此，作為本發(fā)明的其它的實(shí)施方式，可以提供一 種包括上述工序（A1)、優(yōu)選進(jìn)一步包括上述工序（A2)的提高根霉屬菌的乳酸生產(chǎn)能力的 方法。
[0044] 通過本發(fā)明的提高根霉屬菌的LDH活性的方法，可以獲得提高了 LDH活性和乳酸 生產(chǎn)能力的根霉屬菌體。該根霉屬菌在效率良好地制造乳酸方面有用。因此，作為本發(fā)明 的另一個(gè)實(shí)施方式，提供一種提高了 LDH活性或者乳酸生產(chǎn)能力的根霉屬菌的生產(chǎn)方法， 該方法包括通過進(jìn)行上述工序（A1)、優(yōu)選進(jìn)一步進(jìn)行上述工序（A2)來獲得提高了 LDH活性 或者乳酸生產(chǎn)能力的根霉屬菌菌絲體。作為本發(fā)明的另外其它的實(shí)施方式，提供一種通過 進(jìn)行上述工序（A1)、優(yōu)選進(jìn)一步進(jìn)行上述工序（A2)而獲得的提高了 LDH活性或者乳酸生產(chǎn) 能力的根霉屬菌。
[0045] 此外，在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種進(jìn)一步包括培養(yǎng)通過上述工序（A1)、優(yōu) 選進(jìn)一步通過工序（A2)而獲得的根霉屬菌的菌絲體的工序（以下，稱為"工序（B)"。）的 乳酸的制造方法。該本發(fā)明的乳酸的制造方法中，可以培養(yǎng)按照上述的順序獲得的提高了 LDH活性或者乳酸生產(chǎn)能力的根霉屬菌的菌絲體，使該菌生產(chǎn)乳酸，之后回收生產(chǎn)的乳酸。
[0046] 在工序（B)中使用的乳酸生產(chǎn)用培養(yǎng)液（以下、稱為"第3培養(yǎng)液"。）是含有葡 萄糖等碳源、硫酸銨等氮源以及各種金屬鹽等的可以生產(chǎn)乳酸的培養(yǎng)液即可。作為該工序 (B)中使用的第3培養(yǎng)液，例如可以列舉含有7. 5?30 %葡萄糖、0. 05?2 %硫酸銨、0. 03? 0. 6%磷酸二氫鉀、0. 01?0. 1 %硫酸鎂?七水合物、0. 005?0. 05%硫酸鋅?七水合物、以 及3. 75?20%碳酸鈣（濃度都是％ (w/v))的培養(yǎng)液，優(yōu)選可以列舉含有12. 5%葡萄糖、 0. 1 %硫酸銨、0. 06%磷酸二氫鉀、0. 025%硫酸鎂?七水合物、0. 009%硫酸鋅?七水合物、 以及5.0%碳酸鈣（濃度都是％ (w/v))的培養(yǎng)液。
[0047] 工序（B)中使用的第3培養(yǎng)液的量可以根據(jù)培養(yǎng)容器進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，例如，在 200mL容積的三角燒瓶的情況下，為20?80mL左右即可；在500mL容積的三角燒瓶的情況 下，為50?200mL左右即可。在該第3培養(yǎng)液中，將上述的提高了 LDH活性或者乳酸生產(chǎn)能 力的根霉屬菌體以作為濕重量為l〇g?90g-菌體/100mL-培養(yǎng)液、優(yōu)選為15g?50g-菌 體/100mL-培養(yǎng)液的量方式進(jìn)行接種，一邊以100?300rpm、優(yōu)選為170?230rpm進(jìn)行攪 拌，一邊在25?45°C的培養(yǎng)溫度控制下培養(yǎng)4小時(shí)?24小時(shí)、優(yōu)選為6小時(shí)?12小時(shí)。
[0048] 在工序（B)中使用的第3培養(yǎng)液中不需要含有第1培養(yǎng)液中所涉及的上述列舉的 表面活性劑,但也可以含有。第3培養(yǎng)液中的該表面活性劑的濃度，從提高LDH活性和乳酸 生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選為工序（A1)中使用的第1培養(yǎng)液中的表面活性劑濃度的五分之 一以下、進(jìn)一步優(yōu)選為十分之一以下、更優(yōu)選為二十分之一以下。例如，工序（B)中使用的 培養(yǎng)液中的表面活性劑的濃度，從提高LDH活性和乳酸生產(chǎn)能力的觀點(diǎn)出發(fā)，作為培養(yǎng)液 中的最終濃度優(yōu)選為0.2% (w/v)以下、進(jìn)一步優(yōu)選為0.15% (w/v)以下、更優(yōu)選為0.1% (w/v)以下、更優(yōu)選為0.05% (w/v)以下、更優(yōu)選為0.01% (w/v)以下。
[0049] 通過從上述第3培養(yǎng)液中回收培養(yǎng)上清液，可以獲得乳酸?？梢愿鶕?jù)需要可以通 過傾斜法、膜分離、離心分離、電滲析法、離子交換樹脂的利用、蒸餾、鹽析等方法、或者這些 的組合，將該培養(yǎng)液中的乳酸以乳酸鹽回收之后，從回收的乳酸鹽中將乳酸單離或者精制。 通過以上的順序，可以以高純度并且高收率制造 L-乳酸。
[0050] 供上述乳酸制造的根霉屬菌體可以為了乳酸制造而反復(fù)使用。即，從回收了乳酸 后的第3培養(yǎng)液中回收該菌體，再次用與上述同樣的第3培養(yǎng)液對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，由此可以再 次制造乳酸。
[0051] 本發(fā)明的乳酸的制造方法可以是交替地進(jìn)行菌的培養(yǎng)、培養(yǎng)液內(nèi)積蓄的乳酸的回 收以及培養(yǎng)液的更替的分批式方法，也可以是間歇地或連續(xù)地更替一部分培養(yǎng)液，并同時(shí) 進(jìn)行菌的培養(yǎng)和培養(yǎng)液中的乳酸的回收的半分批式或者連續(xù)的方法。
[0052] 另外，本發(fā)明作為例示的實(shí)施方式，包含以下的成分、制造方法、用途或者方法。但 是，本發(fā)明不受這些實(shí)施方式所限定。
[0053] 〈1> 一種提高根霉屬菌的乳酸脫氫酶活性的方法，其中，所述方法包括使根霉屬菌 的孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中發(fā)芽，獲得菌絲體的工序。
[0054] 〈2> -種生產(chǎn)提高了乳酸脫氫酶活性的根霉屬菌的方法，其中，所述方法包括使根 霉屬菌的孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中發(fā)芽，獲得菌絲體的 工序。
[0055] 〈3>-種提高根霉屬菌的乳酸生產(chǎn)能力的方法，其中，所述方法包括使根霉屬菌的 孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中發(fā)芽，獲得菌絲體的工序。
[0056] 〈4> 一種生產(chǎn)提高了乳酸生產(chǎn)能力的根霉屬菌的方法，其中，所述方法包括使根霉 屬菌的孢子在含有0.01% (w/v)以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中發(fā)芽，獲得菌絲體的工 序。
[0057] 〈5>上述〈1>?〈4>中，上述方法優(yōu)選進(jìn)一步包括使獲得的菌絲體在第2培養(yǎng)液中 增殖的工序。
[0058] 〈6>-種根霉屬菌，其中，是通過使根霉屬菌的孢子在含有0.01 % (w/v)以上的表 面活性劑的第1培養(yǎng)液中發(fā)芽，獲得菌絲體而生產(chǎn)的。
[0059] 〈7>-種根霉屬菌，其中，是通過使根霉屬菌的孢子在含有0.01 % (w/v)以上的表 面活性劑的第1培養(yǎng)液中發(fā)芽，使獲得的菌絲體在第2培養(yǎng)液中增殖而生產(chǎn)的。
[0060] 〈8> -種乳酸的制造方法，其中，所述方法包括以下的工序，
[0061] (A1)使根霉屬菌的孢子在含有0. 01% (w/v)以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中 發(fā)芽，獲得提高了乳酸脫氫酶活性的菌絲體的工序；和
[0062] (B)將獲得的菌絲體在第3培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲得乳酸的工序。
[0063] 〈9> 一種乳酸的制造方法，其中，所述方法包括以下的工序，
[0064] (A1)使根霉屬菌的孢子在含有0. 01% (w/v)以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中 發(fā)芽，獲得提高了乳酸脫氫酶活性的菌絲體的工序；
[0065] (A2)使工序（A1)中獲得的菌絲體在第2培養(yǎng)液中增殖的工序；以及
[0066] (B)將工序（A2)獲得的菌絲體在第3培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲得乳酸的工序。
[0067] 〈10>上述〈8>?〈9>中，上述方法優(yōu)選進(jìn)一步包括將生產(chǎn)的乳酸回收的工序。
[0068] 〈11>上述〈1>?〈10>中，上述表面活性劑優(yōu)選為選自山梨糖醇酐脂肪酸酯、Ρ0Ε 山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩爾數(shù)為5以下的Ρ0Ε烷基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、 以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少一種，
[0069] 進(jìn)一步優(yōu)選為選自山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯、E0平均加成摩 爾數(shù)為20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、E0平均加成摩爾數(shù)為5以下的聚氧乙 烯月桂基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、以及E0平均加成摩爾數(shù)為10的聚氧乙烯辛基苯 基醚中的至少1種，
[0070] 更優(yōu)選為選自山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯、E0平均加成摩爾數(shù) 為4的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、E0平均加成摩爾數(shù)為3或4的聚氧乙烯月桂基醚、 以及烯基琥珀酸鹽中的至少1種，
[0071] 尤其優(yōu)選為山梨糖醇酐單月桂酸酯。
[0072] 〈12>上述〈1>?〈11>中，上述第1培養(yǎng)液中的上述表面活性劑的濃度，作為該培 養(yǎng)液中的最終濃度優(yōu)選為0.01% (w/v)以上，進(jìn)一步優(yōu)選為0.05% (w/v)以上，更優(yōu)選為 0.1 % (w/v)以上，進(jìn)一步更優(yōu)選為0.2 % (w/v)以上，而且優(yōu)選小于2.5 % (w/v)，進(jìn)一步優(yōu) 選小于1.5 % (w/v)，更優(yōu)選小于1.0 % (w/v)，進(jìn)一步更優(yōu)選小于0.8 % (w/v)，或者，
[0073] 作為培養(yǎng)液中的最終濃度優(yōu)選為0. 01% (w/v)以上且小于2. 5 % (w/v)，進(jìn)一步優(yōu) 選為0.05 % (w/v)以上且小于1.5 % (w/v)，更優(yōu)選為0.1 % (w/v)以上且小于1.0% (w/ v)，進(jìn)一步更優(yōu)選為0.2% (w/v)以上且小于0.8% (w/v)。
[0074] 〈13>上沭〈1>?〈12>中，上沭根霉屬菌優(yōu)選為米根霉（Rhizopus oryzae) > j#.一 步優(yōu)選選自米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC 4707、米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC 4785、 米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC 5384 以及米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC 5418。
[0075] 〈14〉上述〈5>、〈7>以及〈9>?〈13〉中，第2培養(yǎng)液中的表面活性劑的濃度優(yōu)選 為0.2 % (w/v)以下，進(jìn)一步優(yōu)選為(λ 15% (w/v)以下，更優(yōu)選為(λ 1% (w/v)以下，更優(yōu)選 為0.05% (w/v)以下，更優(yōu)選為0.01% (w/v)以下。
[0076] 〈15>上述〈8>?〈14>中，第3培養(yǎng)液中的表面活性劑的濃度優(yōu)選為0· 2% (w/v) 以下，進(jìn)一步優(yōu)選為0.15 % (w/v)以下，更優(yōu)選為0.1 % (w/v)以下，更優(yōu)選為0.05 % (w/ v)以下，更優(yōu)選為0.01% (w/v)以下。
[0077] 〈16>上述〈1>?〈15>中，根霉屬菌的孢子在第1培養(yǎng)液中以下述條件進(jìn)行培養(yǎng)。
[0078] 攪拌：優(yōu)選為80?250rpm、進(jìn)一步優(yōu)選為100?170rpm
[0079] 溫度：優(yōu)選為25?42. 5 °C
[0080] 時(shí)間：優(yōu)選為24?120小時(shí)、進(jìn)一步優(yōu)選為48?72小時(shí)
[0081] 〈17>上述〈5>、〈7>以及〈9>?〈16>中，菌絲體在第2培養(yǎng)液中以下述條件進(jìn)行 培養(yǎng)。
[0082] 攪拌：優(yōu)選為100?300rpm、進(jìn)一步優(yōu)選為170?230rpm
[0083] 溫度：優(yōu)選為25?42. 5 °C
[0084] 時(shí)間：優(yōu)選為12?120小時(shí)、進(jìn)一步優(yōu)選為24?72小時(shí)
[0085] 〈18>上述〈8>?〈17>中，菌絲體在第3培養(yǎng)液中以下述條件進(jìn)行培養(yǎng)。
[0086] 攪拌：優(yōu)選為100?300rpm、進(jìn)一步優(yōu)選為170?230rpm、
[0087] 溫度：優(yōu)選為25?45 °C
[0088] 時(shí)間：優(yōu)選為4小時(shí)?24小時(shí)、進(jìn)一步優(yōu)選為6小時(shí)?12小時(shí)
[0089] 實(shí)施例
[0090] 以下展示實(shí)施例來更具體地說明本發(fā)明。
[0091] 制造例1孢子懸濁液的制備法
[0092] 將由作為菌株保存機(jī)構(gòu)的Riken BRC(理研生物資源中心）獲得的米根霉 (Rhizopus orvzae) TCM14625 株(=NBRC 5384)的孢子懸濁凍結(jié)保存樣品（_80°C )在 PDA 培養(yǎng)基（Difco Potato Dextrose Agar，Becton, Dickinson and Company 制造）中接種 1 鉬環(huán)，在30°C下靜置培養(yǎng)7?10日。經(jīng)目視確認(rèn)菌絲成長(zhǎng)和伴隨孢子形成的菌絲末端的黑 色化，向其中加入生理鹽水30?40mL，將菌絲和孢子一并使用鉬環(huán)移至50mL容積的帶蓋離 心管（Greiner制造），在管內(nèi)劇烈混合。將混合后的孢子懸池液用3GP100圓筒漏斗形玻璃 過濾器（柴田科學(xué)制造）過濾，將其作為孢子液。孢子液中的孢子數(shù)用生理鹽水適當(dāng)稀釋， 用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（血球計(jì)算盤，D = l/50mm · l/400mm2)測(cè)定。
[0093] 制造例2菌絲體的制備
[0094] 向200mL容積的帶有擋板的三角燒瓶（旭硝子制造）中加入未添加有或以最終濃 度為0. 5% (w/v)添加有下述記載的表面活性劑的80mL PDB培養(yǎng)基，將制造例1中制備的 米根霉(Rhizopus oryzae)的孢子懸池液以成為1 X 103個(gè)-孢子/mL_培養(yǎng)基的方式進(jìn)行 接種，然后，在27°C下以170rpm攪拌培養(yǎng)3天。因?yàn)榫z體殘留于過濾器上，所以將上述培 養(yǎng)物用預(yù)先殺菌處理過的網(wǎng)眼大小為250μπι的不銹鋼篩（As One制造）過濾，在過濾器上 回收菌體。
[0095] 表面活性劑
[0096] 山梨糖醇酐單月桂酸酯：RHE0D0L (注冊(cè)商標(biāo)）SP-L10 (花王）
[0097] 山梨糖醇酐單油酸酯：RHE0D0L (注冊(cè)商標(biāo)）SP-010V (花王）
[0098] 聚氧乙烯（3)月桂基醚：EMULGEN (注冊(cè)商標(biāo)）103 (花王）
[0099] 聚氧乙烯（4)月桂基醚：EMULGEN (注冊(cè)商標(biāo)）104P (花王）
[0100] 聚氧乙烯（5)月桂基醚：EMULGEN (注冊(cè)商標(biāo)）106 (花王）
[0101] 聚氧乙烯（6)月桂基醚：EMULGEN (注冊(cè)商標(biāo)）108(花王）
[0102] 聚氧乙烯（4)山梨糖醇酐單月桂酸酯：RHE0D0L (注冊(cè)商標(biāo)）TW-L106(花王）
[0103] 聚氧乙烯（20)山梨糖醇酐單月桂酸酯：RHE0D0L(注冊(cè)商標(biāo)）TW-L120(花王）
[0104] 脫氧膽酸鈉（和光純藥工業(yè)）
[0105] 烯基琥珀酸鉀鹽（28% ) :LATEMUL (注冊(cè)商標(biāo)）ASK (花王）
[0106] 聚氧乙烯（10)辛基苯基醚：TRITON(注冊(cè)商標(biāo)）X-100(MP Biomedicals)
[0107] (表面活性劑的名稱中的"聚氧乙烯"后接的0內(nèi)的數(shù)字表示E0的平均加成摩爾 數(shù)。）
[0108] 制造例3菌絲體的增殖
[0109] 在500mL容積的三角燒瓶?jī)?nèi)供給有無機(jī)培養(yǎng)液100mL(組成：10%葡萄糖、0. 1%硫 酸銨、0. 06%磷酸二氫鉀、0. 025%硫酸鎂?七水合物、0. 009%硫酸鋅?七水合物、5. 0%碳 酸鈣、濃度都是％ (w/v))中接種回收的菌體3.0?4.0g(濕重量），在27°C下以220rpm攪 拌培養(yǎng)約40小時(shí)。接下來，將用上述無機(jī)培養(yǎng)液進(jìn)行過培養(yǎng)的培養(yǎng)物用預(yù)先殺菌處理過的 不銹鋼網(wǎng)式過濾固定器（MILLIP0RE制造）過濾，在過濾器上回收菌體。進(jìn)一步，在該過濾 固定器上用l〇〇mL的生理鹽水將菌體洗滌。用于洗滌的生理鹽水經(jīng)抽吸抽濾除去。獲得的 菌體用于以下的LDH活性評(píng)價(jià)以及乳酸發(fā)酵生產(chǎn)能力評(píng)價(jià)。
[0110] 試驗(yàn)例1 LDH活性評(píng)價(jià)-1
[0111] 將在制造例3中獲得的根霉屬菌的濕菌體6. 0g接種于在200mL容積的三角燒瓶 內(nèi)供有乳酸生產(chǎn)評(píng)價(jià)用無機(jī)培養(yǎng)液40mL(組成：8. 0%葡萄糖、0. 1%硫酸銨、0. 06%磷酸二 氫鉀、0. 025 %硫酸鎂?七水合物、0. 009 %硫酸鋅?七水合物、5. 0 %碳酸鈣、濃度都是％ (w/ v))，在35°C下以170rpm進(jìn)行攪拌培養(yǎng)。將根霉屬菌體的攪拌培養(yǎng)進(jìn)行4. 5小時(shí)，使用預(yù) 先殺菌處理過的不銹鋼網(wǎng)式過濾固定器（MILLIP0RE制造）過濾菌體，在過濾器上回收菌 體。進(jìn)一步，在該過濾器固定器上用100mL的生理鹽水將菌體洗滌。用于洗滌的生理鹽水 經(jīng)抽吸過濾除去。將獲得的菌體〇.3g回收于3mL粉碎管（安井器械制造），放入3mL用金 屬錐（安井器械制造），蓋上蓋后使用液氮冷凍。將冷凍的3mL粉碎管提供于多珠振蕩器 (Multi-Beads Shocker)(安井器械制造），在1700rpm下將菌體破碎10秒。之后，添加0. 1M Tris-HCl (pH7. 5) lmL，用多珠振蕩器以1700rpm處理10秒。將處理液在15000rpm、4°C的條 件下離心分離5分鐘，將獲得的上清液作為菌體提取液。
[0112] LDH活性為將丙酮酸變換為乳酸的活性，是要求NADH作為輔酶的酶反應(yīng)。將適當(dāng) 稀釋的菌體提取液10 μ L與150 μ L的反應(yīng)液（組成：0. 1M Tris-HCl、700 μ M NADH)混合。 在30°C下靜置5分鐘。向其中添加預(yù)先加熱至30°C的20mM丙酮酸鈉溶液40 μ L，使酶反應(yīng) 開始。通過測(cè)定該反應(yīng)液的340nm的吸光度，可以測(cè)定LDH活性（參照非專利文獻(xiàn)4)。1U 定義為1分鐘內(nèi)生產(chǎn)1 μ mol的NAD+的酶量。另外，蛋白質(zhì)濃度的測(cè)定以BSA為標(biāo)準(zhǔn)，使用 T Protein Assay Dye Reagent Consentrate(Bio-Rad)〇
[0113] 將結(jié)果不于表1中。結(jié)果以未添加表面活性劑時(shí)的LDH活性為100時(shí)的相對(duì)值表 示。用添加了山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯、E0平均加成摩爾數(shù)為20以下 的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、E0平均加成摩爾數(shù)為5以下的聚氧乙烯月桂基醚、脫 氧膽酸鈉、烯基琥珀酸鹽、或者E0平均加成摩爾數(shù)為10的聚氧乙烯辛基苯基醚的培養(yǎng)基由 孢子制備成菌絲體的根霉屬菌體，與用沒有添加表面活性劑的培養(yǎng)基由孢子制備成菌絲體 的根霉屬菌（對(duì)照）相比較，具有高的LDH活性。另外，用添加了 E0平均加成摩爾數(shù)為6 的聚氧乙烯月桂基醚的培養(yǎng)基由孢子制備成菌絲體的根霉屬菌體，與用沒有添加表面活性 劑的培養(yǎng)基由孢子制備成菌絲體的根霉屬菌（對(duì)照）相比較，確認(rèn)了其LDH活性稍微降低。
[0114] [表 1]
[0115]

【權(quán)利要求】
1. 一種乳酸的制造方法，其中， 為包括下述工序（A1)和（B)的乳酸的制造方法， (A1)使根霉屬菌的孢子在含有0. Olw/v%以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中發(fā)芽，獲 得提高了乳酸脫氫酶活性的菌絲體的工序；和 (B)將獲得的菌絲體進(jìn)一步在第3培養(yǎng)液中培養(yǎng)，獲得乳酸的工序， 該表面活性劑為選自山梨糖醇酐脂肪酸酯、P0E山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩爾數(shù) 為5以下的P0E烷基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少一 種。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中， 上述第3培養(yǎng)液中的上述表面活性劑的濃度為0. 2W/v%以下。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其中， 上述第1培養(yǎng)液中的上述表面活性劑的濃度為〇. Olw/ν%以上且小于2. 5w/v%。
4. 如權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 上述表面活性劑是選自山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯、E0平均加成摩 爾數(shù)為20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、E0平均加成摩爾數(shù)為5以下的聚氧乙 烯月桂基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、以及E0平均加成摩爾數(shù)為10的聚氧乙烯辛基苯 基醚中的至少一種。
5. 如權(quán)利要求1?4中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 在上述工序（A1)和工序（B)之間進(jìn)一步包括下述工序（A2)， (A2)使工序（A1)中獲得的菌絲體在第2培養(yǎng)液中增殖的工序。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其中， 上述第2培養(yǎng)液中的上述表面活性劑的濃度為0. 2W/v%以下。
7. 如權(quán)利要求1?6中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 上述根霉屬菌是米根霉(Rhizopus oryzae)。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其中， 上述米根霉(Rhizopus oryzae)選自米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC4707、米根 霉(Rhizopus oryzae)NBRC 4785、米根霉(Rhizopus oryzae)NBRC 5384、以及米根霉 (Rhizopus oryzae)NBRC 5418。
9. 一種提高根霉屬菌的乳酸脫氫酶活性的方法，其中， 為包括下述工序（A1)的提高根霉屬菌的乳酸脫氫酶活性的方法， (A1)使根霉屬菌的孢子在含有0. Olw/v%以上的表面活性劑的第1培養(yǎng)液中發(fā)芽，獲 得菌絲體的工序， 該表面活性劑是選自山梨糖醇酐脂肪酸酯、P0E山梨糖醇酐脂肪酸酯、E0加成摩爾數(shù) 為5以下的P0E烷基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、以及聚氧乙烯烷基苯基醚中的至少一 種。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其中， 上述第1培養(yǎng)液中的上述表面活性劑的濃度為〇. 〇lw/v%以上且小于2. 5w/v%。
11. 如權(quán)利要求9或10所述的方法，其中， 上述表面活性劑是選自山梨糖醇酐單月桂酸酯、山梨糖醇酐單油酸酯、E0平均加成摩 爾數(shù)為20以下的聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯、E0平均加成摩爾數(shù)為5以下的聚氧乙 烯月桂基醚、脫氧膽酸鹽、烯基琥珀酸鹽、以及E0平均加成摩爾數(shù)為10的聚氧乙烯辛基苯 基醚中的至少一種。
12. 如權(quán)利要求9?11中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 在上述工序（A1)之后進(jìn)一步包括下述工序（A2)， (A2)使工序（A1)中獲得的菌絲體在第2培養(yǎng)液中增殖的工序。
13. 如權(quán)利要求12所述的方法，其中， 上述第2培養(yǎng)液中的上述表面活性劑的濃度為0. 2W/v%以下。
14. 如權(quán)利要求9?13中任一項(xiàng)所述的方法，其中， 上述根霉屬菌是米根霉(Rhizopus oryzae)。
15. 如權(quán)利要求14所述的方法，其中， 上述米根霉(Rhizopus oryzae)選自米根霉(Rhizopus oryzae) NBRC4707、米根 霉(Rhizopus oryzae)NBRC 4785、米根霉(Rhizopus oryzae)NBRC 5384、以及米根霉 (Rhizopus oryzae)NBRC 5418。
16. -種提高了乳酸生產(chǎn)能力的根霉屬菌的生產(chǎn)方法，其中， 包括通過權(quán)利要求9?15中任一項(xiàng)所述的方法獲得提高了乳酸脫氫酶活性的根霉屬 菌。
17. -種通過權(quán)利要求16所述的方法生產(chǎn)的根霉屬菌。
【文檔編號(hào)】C12R1/845GK104245918SQ201380020857
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2013年4月4日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月19日
【發(fā)明者】壺井雄一, 高橋史員, 西村祐美, 澤田和久 申請(qǐng)人:花王株式會(huì)社