甘蔗桿狀病毒(scbv)增強(qiáng)子及其在植物功能基因組學(xué)中的用途
【專利摘要】對(duì)新的增強(qiáng)子序列的鑒定在植物功能基因組學(xué)中具有重大的效用。已經(jīng)鑒定了甘蔗桿狀DNA病毒(SCBV)轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。該增強(qiáng)子可以用于增加從基因啟動(dòng)子及在激活標(biāo)簽化實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)錄速率。當(dāng)將4列SCBV增強(qiáng)子置于玉米醇脫氫酶最小啟動(dòng)子截短形式的上游時(shí)，觀察到轉(zhuǎn)錄中有10倍的增加。描述了使用SCBV轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子的方法，以及包含一個(gè)或多個(gè)該增強(qiáng)子拷貝的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、構(gòu)建體、細(xì)胞、組織和微生物。
【專利說明】甘蔗桿狀病毒（SCBV)增強(qiáng)子及其在植物功能基因組學(xué)中 的用途
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年2月29日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)No. 61/605, 147的權(quán)益， 將其通過提述完整并入本文。
[0003] 領(lǐng)域
[0004] 本公開涉及植物分子生物學(xué)和遺傳工程學(xué)領(lǐng)域，并且具體地，涉及可用于調(diào)控 (例如增強(qiáng)）植物中基因表達(dá)和/或蛋白質(zhì)生成的多核苷酸分子。
[0005] 共同研究協(xié)議的相關(guān)方
[0006] 本申請(qǐng)描述且要求保護(hù)基于Agrigenetics公司、Mycogen公司、Exelixis植物科 學(xué)公司、和Exelixis公司之間的聯(lián)合研究協(xié)議開發(fā)的特定主題，其生效期為2007年9月4 曰。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] -直以來都需要指導(dǎo)、控制或以其他方式調(diào)節(jié)可轉(zhuǎn)錄核酸（例如轉(zhuǎn)基因）表達(dá)的 遺傳調(diào)節(jié)元件，例如用在經(jīng)遺傳工程改造的生物體諸如植物中。遺傳調(diào)節(jié)元件通常包括5' 非翻譯序列諸如含有轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)（一個(gè)或多個(gè)）、增強(qiáng)子/沉默子元 件、TATA盒和CAAT盒的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)，連同3'聚腺苷酸化序列、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、翻譯起始和 終止信號(hào)、剪接供體/受體序列等等。
[0009] 為了遺傳工程學(xué)的目的，遺傳調(diào)節(jié)元件通常包含在表達(dá)載體或其它經(jīng)工程改造的 構(gòu)建體中以調(diào)節(jié)可操作地連接于該調(diào)節(jié)元件的轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。以此種方式使用的啟動(dòng)子的 公知的例子是 CaMV35S 啟動(dòng)子（Nagy 等于：Biotechnology in plant science:relevance to agriculture in the eighties. Zaitlin等Academic Press, Orlando, 1985)、玉米泛素 啟動(dòng)子（Ubi ;Christensen&Quail, Transgenic Research 5:213, 1996)和Emu啟動(dòng)子（Last 等，Theor. Appl. Genet. 81581，1991)，不過還有許多其它啟動(dòng)子也是普通技術(shù)人員已知 的。類似地，已經(jīng)從各種來源分離出用在遺傳工程學(xué)中的增強(qiáng)子；這些包括花椰菜花葉病毒 (35S CaMV)增強(qiáng)子、玄參花葉病毒（FMV)增強(qiáng)子、花生褪綠條紋病花椰菜花葉病毒（PClSV) 增強(qiáng)子、或紫茉莉（mirabilis)花葉病毒（MMV)增強(qiáng)子。
[0010] 一直以來都需要鑒定出可以用來控制與其可操作地連接的序列（例如在異源核 酸分子諸如載體和其它經(jīng)工程化改造的構(gòu)建體中）的表達(dá)的遺傳調(diào)節(jié)元件，諸如增強(qiáng)子 域。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 本公開描述了新的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其包含增強(qiáng)子域和在該增強(qiáng)子域的增強(qiáng)控制下的 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域。所述增強(qiáng)子域包含串聯(lián)排列的多個(gè)（例如2-4個(gè)或更多個(gè)）拷貝的天然但以 前未得到識(shí)別的SCBV增強(qiáng)子。本公開的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)（啟動(dòng)子）相比于缺乏該增強(qiáng)子域的 啟動(dòng)子提供了增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)例中，公開了一種嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其包含顯示在SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中的SCBV增強(qiáng)子元件的一個(gè)或多個(gè)拷貝；和與其可操作地 連接的包含RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和mRNA啟動(dòng)位點(diǎn)的啟動(dòng)子，其中當(dāng)目的核苷酸序列在所述 嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)性控制下轉(zhuǎn)錄時(shí)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量相比于用包含所述啟動(dòng)子、但不包 含所述SCBV增強(qiáng)子序列的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)所獲得的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量增加。
[0013] 還提供了包含所描述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和待轉(zhuǎn)錄的DNA序列的DNA構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí) 例中，DNA構(gòu)建體包含所公開的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)，其可操作地連接于可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，后 者可操作地連接于3'轉(zhuǎn)錄終止多核苷酸分子。該DNA構(gòu)建體為待轉(zhuǎn)錄DNA序列的增強(qiáng)的 轉(zhuǎn)錄提供條件。還公開了用所公開的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或組織（諸如雙 子葉植物或單子葉植物、植物細(xì)胞或組織）。還提供了可以從所公開的轉(zhuǎn)基因植物衍生的植 物種子、果實(shí)、葉、根、芽、花、插條、和其它可用在有性或無性繁殖中的繁殖材料、包含F(xiàn)l雜 交種的后代植物、雄性不育植物和所有其它植物及植物產(chǎn)物。本文中還提供了所公開的轉(zhuǎn) 基因植物、植物細(xì)胞或組織的生成方法。
[0014] 從下面援引附圖展開的詳述中，能夠更清楚地了解本公開的前述特征和其它特 征。
[0015] 附圖簡(jiǎn)述
[0016] 圖1顯示了 SCBV啟動(dòng)子的序列（對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)AJ277091. 1的位 置 6758-7596, "Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate Ireng Maleng"，通過提述將其以于2010年4月15日呈現(xiàn)在網(wǎng)上的形式完整并入本文）；該序列 也顯示在SEQ ID NO: 1中。在本研究中界定的增強(qiáng)子序列從-222延伸至-503,并且在本圖 中加有下劃線（對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 1的位置337-位置618)。
[0017] 圖2A和2B例示了對(duì)SCBV啟動(dòng)子的分析結(jié)果。圖2A顯示了與螢光素酶（LUC)報(bào)告 基因融合的SCBV啟動(dòng)子片段，所述各啟動(dòng)子片段含有自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-839bp、-576bp 和-333bp至轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)下游106bp的序列。圖2B顯示了用上文質(zhì)粒和UBI::⑶S報(bào)告 構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化的HiII細(xì)胞的LUC/GUS活性比的直方圖。結(jié)果顯示，含有自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上 游_576bp起的序列的啟動(dòng)子片段所具有的活性是含有起始位點(diǎn)上游839bp的啟動(dòng)子片段 的60%。相比之下，含有自起始位點(diǎn)上游-333bp起的序列的啟動(dòng)子片段所具有的活性僅為 全長啟動(dòng)子（自轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-839bp起）的10%。由此可見,牽涉啟動(dòng)子活性的序列 位于-333bp的上游。
[0018] 圖3例示了本文中描述的SCBV增強(qiáng)子元件增強(qiáng)了從玉米Adhl啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄。將 從-503至-222的SCBV啟動(dòng)子序列的1、2和4個(gè)拷貝克隆到截短的玉米Adhl啟動(dòng)子上游， 融合至螢火蟲螢光素酶基因。為了比較，將4個(gè)拷貝的MMV增強(qiáng)子序列、2個(gè)拷貝的MMV增 強(qiáng)子和2個(gè)拷貝的SCBV啟動(dòng)子克隆到截短的玉米Adhl啟動(dòng)子上游并融合到螢火蟲螢光素 酶基因。將這些構(gòu)建體與UBI::⑶S報(bào)告構(gòu)建體一起轟擊到玉米Hi-II懸浮細(xì)胞中。含有 1、2和4個(gè)拷貝的SCBV增強(qiáng)子的構(gòu)建體的活性分別是沒有任何增強(qiáng)子的截短的Adhl構(gòu)建 體轟擊的細(xì)胞的活性的超過5倍、6倍和10倍。4X MMV構(gòu)建體的活性是截短的Adhl構(gòu)建 體活性的2. 5倍，且2X MMV 2X SCBV構(gòu)建體的活性是截短的Adhl構(gòu)建體活性的6倍。
[0019] 圖4顯示相比于非轉(zhuǎn)基因（W)對(duì)照植物，轉(zhuǎn)基因（T)植物中4XSCBV整合位點(diǎn)附近 ("側(cè)翼基因"）轉(zhuǎn)錄本的累積，其使用逆轉(zhuǎn)錄和PCR(RT-PCR)分析。顯示管家基因 GAPDH的 水平以用于比較。4XSCBV增強(qiáng)子導(dǎo)致其整合處附近基因轉(zhuǎn)錄本的累積增加；這種在轉(zhuǎn)錄本 累積的增加可能緣于轉(zhuǎn)錄速率的增加。
[0020] 圖5顯示含有4XSCBV: :LfKCS3啟動(dòng)子融合物的PDAB3892,該啟動(dòng)子融合物用來驅(qū) 動(dòng)擬南芥中的構(gòu)巢曲霉?；o酶A △ 9去飽和酶轉(zhuǎn)基因。
[0021] 圖6顯示含有LfKCS3啟動(dòng)子的PDAB1757,該啟動(dòng)子用來驅(qū)動(dòng)擬南芥中的構(gòu)巢曲霉 ?；o酶A Λ 9去飽和酶轉(zhuǎn)基因。
[0022] 圖7顯示含有Pv菜豆蛋白啟動(dòng)子的pDAB1759,該啟動(dòng)子用來驅(qū)動(dòng)擬南芥中的構(gòu)巢 曲霉?；o酶A Λ 9去飽和酶轉(zhuǎn)基因。
[0023] 圖8顯示含有擬南芥泛素10啟動(dòng)子的pDAB9381，該啟動(dòng)子用來驅(qū)動(dòng)擬南芥中的黃 色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因。
[0024] 圖9顯示含有構(gòu)建體轉(zhuǎn)基因插入的轉(zhuǎn)基因植物的飽和脂肪酸表型降低的百分比。
[0025] 序列表
[0026] 如37C. F. R. 1. 822中定義的，對(duì)核苷酸堿基使用標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫且對(duì)氨基酸使用三 字母碼來顯示下面序列表中列出的核酸和/或氨基酸序列。每個(gè)核酸序列僅顯示了一條 鏈，但應(yīng)理解對(duì)被展示的鏈的任何提述也包括其互補(bǔ)鏈。核酸序列（在序列表或本文其它 地方中）以標(biāo)準(zhǔn)的5' -3'方向呈現(xiàn)，蛋白質(zhì)序列以標(biāo)準(zhǔn)的氨基（N)末端至羧基（C)末端方 向呈現(xiàn)。
[0027] SEQ ID NO: 1顯示了 SCBV啟動(dòng)子的核酸序列（對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào)AJ277091. 1 的位置 6758_7596，"Sugarcane bacilliform IM virus complete genome, isolate Ireng Maleng"，通過提述將其在2010年4月15日呈現(xiàn)在網(wǎng)上的形式完整并入本文）。本文中描 述的增強(qiáng)子元件是從SEQ ID NO: 1的位置337至位置618。
[0028] SEQ ID NO: 2顯示來自pDAB3892的構(gòu)巢曲霉?；o酶A Λ 9去飽和酶植物轉(zhuǎn)錄單 元（PTU)的核酸序列。
[0029] SEQ ID NO: 3顯示來自pDAB3892的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU的核酸序列。
[0030] SEQ ID NO:4顯示來自pDAB1757的構(gòu)巢曲霉?；o酶ΑΛ 9去飽和酶PTU的核酸 序列。
[0031] SEQ ID NO: 5顯示來自pDAB1757的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU的核酸序列。
[0032] SEQ ID NO:6顯示來自pDAB1759的構(gòu)巢曲霉酰基輔酶ΑΛ 9去飽和酶PTU的核酸 序列。
[0033] SEQ ID NO: 7顯示來自pDAB1759的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU的核酸序列。
[0034] SEQ ID NO:8顯示來自pDAB9381的黃色熒光蛋白PTU的核酸序列。
[0035] SEQ ID NO:9顯示來自pDAB9381的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU的核酸序列。
[0036] SEQ ID NO: 10顯示使用水解探針測(cè)定來擴(kuò)增pat進(jìn)行分子確認(rèn)的正向引物的核酸 序列。
[0037] SEQ ID NO: 11顯示使用水解探針測(cè)定來擴(kuò)增pat進(jìn)行分子確認(rèn)的反向引物的核酸 序列。
[0038] SEQ ID NO: 12顯示使用水解探針測(cè)定來擴(kuò)增pat進(jìn)行分子確認(rèn)的探針的核酸序 列。
[0039] SEQ ID NO: 13顯示使用水解探針測(cè)定來擴(kuò)增TAFFII進(jìn)行分子確認(rèn)的正向引物的 核酸序列。
[0040] SEQ ID NO: 14顯示使用水解探針測(cè)定來擴(kuò)增TAFFII進(jìn)行分子確認(rèn)的反向引物的 核酸序列。
[0041] SEQ ID NO: 15顯示使用水解探針測(cè)定來擴(kuò)增TAFFII進(jìn)行分子確認(rèn)的探針的核酸 序列。
[0042] 發(fā)明詳述
[0043] I.縮寫
[0044] 3，UTR3'-非翻譯區(qū)
[0045] 5，UTR5' -非翻譯區(qū)
[0046] Adhl醇脫氫酶1
[0047] LfKCS 3Lesquerella fendleri KCS 啟動(dòng)子
[0048] asRNA 反義 RNA
[0049] cDNA 互補(bǔ) DNA
[0050] dsRNA 雙鏈 RNA
[0051] GAPDH甘油醛3-磷酸脫氫酶
[0052] KB千字節(jié)
[0053] kbp千喊基對(duì)
[0054] LUC螢光素酶
[0055] miRNA 微小 RNA
[0056] nt核苷酸
[0057] ORF開放閱讀框
[0058] PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)
[0059] PAT膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶
[0060] RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄及 PCR
[0061] SCBV甘鹿桿狀病毒
[0062] siRNA 小干擾 RNA
[0063] ssRNA 單鏈 RNA
[0064] Tm熱解鏈點(diǎn)
[0065] UTR非翻譯區(qū)
[0066] II.術(shù)語
[0067] 除非另外指出，依照常規(guī)用法來使用技術(shù)術(shù)語?？梢栽谝韵鲁霭嫖镏邪l(fā)現(xiàn)分子 生物學(xué)中常見術(shù)語的定義：Benjamin Lewin, Genes V，由 Oxford University Press 出 版，1994(ISBN 0-19-854287-9) ;Kendrew 等（編），The Encyclopedia of Molecular Biology,由 Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9);和 Robert A. Meyers (編),Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference,由 VCH Publishers, Inc.出版，1995 (ISBN1-56081-569-8)。
[0068] 為了幫助評(píng)估本發(fā)明的各種實(shí)施方案，提供了對(duì)特定術(shù)語的下列解釋：
[0069] 5'和/或3' ：稱核酸分子（諸如DNA和RNA)具有"5'端"和"3'端"，因?yàn)閷?核苷酸以使得一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸根經(jīng)由磷酸二酯鍵以某一方向附著于其鄰位 的3'氧的方式反應(yīng)來生成多核苷酸。因此，當(dāng)多核苷酸一端的5'磷酸未連接于單核苷酸 戊糖環(huán)的3'氧時(shí)，將其稱為"5'端"。當(dāng)多核苷酸另一端的3'氧未連接于另一單核苷酸戊 糖環(huán)的5'磷酸時(shí)，將其稱為"3'端"。不過內(nèi)部核酸序列也可以稱為具有5'端和3'端，盡 管一個(gè)單核苷酸戊糖環(huán)的5'磷酸根附著于其鄰位的3'氧。
[0070] 在線性或環(huán)狀核酸分子中，離散的內(nèi)部元件被稱為"下游"或3'元件的"上游"或 5'端。對(duì)于DNA，該術(shù)語反映了轉(zhuǎn)錄沿著DNA鏈以5' -3'方向進(jìn)行。指導(dǎo)所連接基因的轉(zhuǎn) 錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件一般位于編碼區(qū)的5'端或上游。不過，增強(qiáng)子元件即使位于啟動(dòng) 子元件和編碼區(qū)的3'端也可以施加其影響。轉(zhuǎn)錄終止和多聚腺苷酸化信號(hào)位于編碼區(qū)的 3'端或下游。
[0071] 農(nóng)藝性狀：植物的屬性，所述屬性包括但不限于，植物形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生長和發(fā) 育、產(chǎn)量、營養(yǎng)增加、疾病或害蟲抗性、或環(huán)境或化學(xué)耐受性，都是農(nóng)藝性狀。"改善的農(nóng)藝性 狀"指在農(nóng)藝性狀中可測(cè)量的改進(jìn)，所述農(nóng)藝性狀包括但不限于產(chǎn)量增加，包括在無脅迫條 件下的產(chǎn)量增加和環(huán)境脅迫條件下的產(chǎn)量增加。脅迫條件可以包括，例如干旱、陰蔽、真菌 性疾病、病毒性疾病、細(xì)菌性疾病、昆蟲侵襲、線蟲侵襲、冷溫暴露、熱暴露、滲透脅迫、減少 的氮養(yǎng)分可得性、減少的磷營養(yǎng)可得性和高植物密度。"產(chǎn)量"可以受到許多特性影響，包 括但不限于，植物高度、莢果數(shù)目、莢果在植物上的位置、節(jié)間數(shù)目、莢果破碎的發(fā)生率、籽 粒大小、結(jié)瘤和氮固定的效率、營養(yǎng)物同化的效率、對(duì)生物和非生物脅迫的抗性、碳同化、植 物體系結(jié)構(gòu)、對(duì)倒伏的抗性、種子萌發(fā)百分比、幼苗活力、和幼態(tài)性狀。產(chǎn)量還可以受到下列 因素的影響：萌發(fā)（包括在脅迫條件下的萌發(fā)）效率、生長速率（包括在脅迫條件下的生長 速率）、穗數(shù)目、每穗的種子數(shù)目、種子大小、種子組成（淀粉、油、蛋白質(zhì)）和種子填充的屬 性。增加的產(chǎn)量可能起因于對(duì)關(guān)鍵的生物化學(xué)化合物諸如氮、磷和碳水化合物的改善的利 用，或起因于對(duì)環(huán)境脅迫諸如冷、熱、干旱、鹽、和害蟲或病原體攻擊的改善的應(yīng)答。在本公 開中使用的重組DNA也可以用于提供這樣一種植物，其具有改善的生長和發(fā)育，并且作為 植物生長調(diào)節(jié)物的經(jīng)修飾的表達(dá)或?qū)?xì)胞周期或光合作用途徑進(jìn)行修飾的結(jié)果，具有最終 增加的產(chǎn)量。農(nóng)藝性狀以及在植物中改變這類性狀的其他例子已在本文中提供并且/或者 會(huì)被本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到。
[0072] 改變：如本文中使用的這個(gè)術(shù)語，多核苷酸（例如由本發(fā)明的核酸編碼的多肽）中 的改變包含多核苷酸序列中的任何缺失、插入和點(diǎn)突變。在此定義中包含對(duì)編碼多肽的基 因組DNA序列的改變。類似地，術(shù)語"改變"可以用于指多肽序列中的缺失、插入和其它突 變。
[0073] 改變生成或表達(dá)水平：相比于生成或表達(dá)的對(duì)照水平，變化（通過增加或降低）核 酸分子或氨基酸分子（例如811?嫩、1^1?嫩、1111?嫩、基因、多肽、肽）的生成或表達(dá)水平。
[0074] 擴(kuò)增：當(dāng)用于指核酸時(shí)，它指增加樣品或標(biāo)本中核酸分子拷貝數(shù)的技術(shù)。擴(kuò)增的 一個(gè)例子是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中使從受試者收集的生物學(xué)樣品與一對(duì)寡核苷酸引物在允 許引物與樣品中的核酸模板雜交的條件下接觸。所述引物在合適的條件下延伸，與模板解 離，然后重新退火、延伸并解離以擴(kuò)增核酸的拷貝數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，可以通過電泳、限制 內(nèi)切酶切割樣式、寡核苷酸雜交或連接、和/或核酸測(cè)序，來表征體外擴(kuò)增的產(chǎn)物。體外 擴(kuò)增技術(shù)的其它例子包括鏈置換擴(kuò)增（參見美國專利5, 744, 311);無轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增（參 見美國專利6, 033, 881);修復(fù)鏈反應(yīng)擴(kuò)增（參見WO 90/01069);連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增（參 見EP-A-320308);缺口填充連接酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增（參見美國專利 5,427,930);偶聯(lián)的連接 酶檢測(cè)和PCR(參見美國專利6, 027, 889);和NASBA?無 RNA轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增（參見美國專利 6, 025, 134)。
[0075] 反義、有義和反基因：DNA具有兩條反向平行鏈，稱為正鏈的5' 一 3'鏈，和稱為負(fù) 鏈的3' 一 5'鏈。由于RNA聚合酶以5' 一 3'方向添加核酸，DNA的負(fù)鏈在轉(zhuǎn)錄期間充當(dāng) RNA的模板。由此，RNA轉(zhuǎn)錄本將具有與負(fù)鏈互補(bǔ)并等同于正鏈（除了 U被T取代）的序 列。
[0076] 反義分子是與RNA或DNA的正鏈特異性可雜交或特異性互補(bǔ)的分子。有義分子是 與DNA的負(fù)鏈特異性可雜交或特異性互補(bǔ)的分子。反基因分子是針對(duì)DNA靶物的反義或有 義分子。反義RNA (asRNA)是與有義（編碼的）核酸分子互補(bǔ)的RNA分子。
[0077] 反義抑制：該術(shù)語指一類基于基因表達(dá)（例如宿主細(xì)胞基因組或病原體諸如病毒 的基因組的表達(dá)）的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核或細(xì)胞器抑制的基因調(diào)節(jié)，所述抑制是由于細(xì)胞中與 所翻譯的mRNA的至少一部分互補(bǔ)的RNA分子的存在。
[0078] cDNA(互補(bǔ)DNA):缺少內(nèi)部非編碼區(qū)段（內(nèi)含子）和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列的DNA片段。 cDNA還可以含有負(fù)責(zé)相應(yīng)RNA分子中翻譯控制的非翻譯區(qū)（UTRs)。通常在實(shí)驗(yàn)室中通過 自細(xì)胞或其它樣品所提取的信使RNA的逆轉(zhuǎn)錄來合成cDNA。
[0079] 嵌合的或嵌合體：兩個(gè)或更多個(gè)不同的多核苷酸或多肽分子部分的融合的產(chǎn)物。 例如，短語"嵌合序列"和"嵌合基因"指自至少兩個(gè)異源部分衍生的核苷酸序列。嵌合序 列可以包含DNA或RNA。
[0080] 嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)：一組指導(dǎo)與其可操作地連接的核酸的轉(zhuǎn)錄的核酸控制或調(diào)節(jié)序 列，該組是由不同的多核苷酸來源裝配而成。例如，如本文中描述的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以通 過對(duì)已知的啟動(dòng)子或其它多核苷酸分子的操作而生成。嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可以將一種或多種 增強(qiáng)子域與一種或多種啟動(dòng)子組合，例如，通過將第一天然啟動(dòng)子的異源增強(qiáng)子域與具有 其自身調(diào)節(jié)元件的部分或完整集合的第二啟動(dòng)子融合物。本公開例示地提供了這類嵌合轉(zhuǎn) 錄調(diào)節(jié)區(qū)，其含有融合（即可操作地連接）至植物中有活性的啟動(dòng)子的至少一個(gè)SCBV增強(qiáng) 子域。
[0081] 構(gòu)建體：自任意來源衍生的能夠進(jìn)行基因組整合或自主復(fù)制的任何重組多核苷酸 分子，諸如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復(fù)制的多核苷酸分子、噬菌體、或線性或環(huán)狀的單鏈或雙 鏈DNA或RNA多核苷酸分子，其包含其中已經(jīng)可操作地連接一種或多種可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸 分子的多核苷酸分子。
[0082] 對(duì)照植物：不含有賦予（例如）轉(zhuǎn)基因植物中增強(qiáng)或改變的農(nóng)藝性狀的重組DNA 的植物，例如在為了鑒定轉(zhuǎn)基因植物中增強(qiáng)或改變的農(nóng)藝性狀時(shí)，它被用作比較的基線。合 適的對(duì)照植物可以是用于生成轉(zhuǎn)基因植物的親本系的非轉(zhuǎn)基因植物，或至少對(duì)于所檢查的 特定性狀為非轉(zhuǎn)基因的植物（換言之，對(duì)照植物可能經(jīng)過工程改造而含有其它異源序列或 重組DNA分子）。由此，對(duì)照植物在一些情況下可以是包含空載體或標(biāo)志基因，但不含有測(cè) 試植物中的重組DNA，或不含有測(cè)試植物中的全部重組DNA的轉(zhuǎn)基因植物品系。
[0083] 共抑制：與內(nèi)源基因具有實(shí)質(zhì)同源性的外來（異源）基因的表達(dá)，其產(chǎn)生對(duì)該外來 基因和內(nèi)源基因兩者的表達(dá)的抑制。
[0084] DNA(脫氧核糖核酸）：DNA是包含大多數(shù)生物體（一些病毒具有包含核糖核酸 (RNA)的基因）的遺傳材料的長鏈聚合物。DNA聚合物中的重復(fù)單元是4種不同的核苷酸， 其中每一種都包含結(jié)合至附著有磷酸根基團(tuán)的脫氧核糖的4種堿基腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧 啶和胸腺嘧啶之一。核苷酸的三聯(lián)體（稱為密碼子）編碼多肽中的每個(gè)氨基酸或終止信號(hào)。 術(shù)語"密碼子"也用于DNA序列所轉(zhuǎn)錄的mRNA中的3個(gè)核苷酸的相應(yīng)的（以及互補(bǔ)的）序 列。
[0085] 除非另外說明，任何對(duì)DNA分子的提述都包含該DNA分子的反向互補(bǔ)體。除了在 本文中需要單鏈性的情況外，雖然書面上僅描述了 DNA分子的一條鏈，但涵蓋了雙鏈DNA分 子的兩條鏈。
[0086] 去飽和酶：如本文中使用的術(shù)語"去飽和酶"指可以使一種或多種脂肪酸去飽和 (即，導(dǎo)入雙鍵）以生成感興趣的脂肪酸或前體的多肽。植物可溶性脂肪酸去飽和酶可以區(qū) 域特異性方式（regiospecifically)將雙鍵導(dǎo)入飽和的?；鵄CP底物中。?；鵆oA去飽和 酶以區(qū)域特異性方式將雙鍵導(dǎo)入飽和的脂肪?；o酶A底物中。該反應(yīng)涉及通過二電子還 原的二鐵中心的分子氧的活化，該二鐵中心由形成去飽和酶體系結(jié)構(gòu)中心的四螺旋束進(jìn)行 配位。在一些實(shí)施方案中特別感興趣的是?；o酶ΑΛ 9去飽和酶。
[0087] 脂肪酸：如本文中使用的術(shù)語"脂肪酸"指具有不同鏈長例如從大約C12到C22的 長鏈脂肪酸（鏈烷酸），不過更長或更短鏈長的脂肪酸也是已知的。脂肪酸的結(jié)構(gòu)由符號(hào) x:yAz表示，其中"X"為特定脂肪酸中的碳（C)原子總數(shù)，并且"y"為在從該脂肪酸的羧基 端計(jì)數(shù)的位置" z "的碳鏈中的雙鍵數(shù)目。
[0088] 編碼：如果一種多核苷酸分子在其天然狀態(tài)或當(dāng)通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的方 法對(duì)其進(jìn)行操作時(shí)，可以被轉(zhuǎn)錄生成用于多肽或其片段的mRNA和/或翻譯生成多肽或其片 段，則稱該多核苷酸編碼該多肽。反義鏈?zhǔn)沁@類核酸的互補(bǔ)體，并且可以從其推導(dǎo)出編碼序 列。
[0089] 增強(qiáng)子域：一種順式作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件（又稱為順式元件），其賦予對(duì)基因表達(dá) 的總體控制的一個(gè)方面。增強(qiáng)子域可以起著結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子（其為調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的反式作用蛋白 因子）的作用。一些增強(qiáng)子域結(jié)合超過一種轉(zhuǎn)錄因子，并且轉(zhuǎn)錄因子可以與超過一種增強(qiáng) 子域以不同的親和力相互作用?？梢酝ㄟ^許多技術(shù)來鑒定增強(qiáng)子域，包括缺失分析（從啟 動(dòng)子的5'端或內(nèi)部刪除一個(gè)或多個(gè)核苷酸）；使用DNase I足跡法的DNA結(jié)合蛋白分析、甲 基化干擾、電泳遷移率改變測(cè)定、通過連接介導(dǎo)的PCR的體內(nèi)基因組足跡法、和其它常規(guī)測(cè) 定；或通過使用常規(guī)的DNA序列比較方法與已知的順式元件基序進(jìn)行DNA序列比較?？梢?對(duì)增強(qiáng)子域的精細(xì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步研究，其通過對(duì)一個(gè)或多個(gè)核苷酸的誘變（或取代）或 通過其它常規(guī)方法?？梢酝ㄟ^化學(xué)合成或通過從包含這類元件的啟動(dòng)子分離來獲得增強(qiáng)子 域，并且可以加以額外的側(cè)翼核苷酸來合成它們，所述側(cè)翼核苷酸含有有用的限制酶位點(diǎn) 來協(xié)助后續(xù)操作。
[0090] (基因）表達(dá)：DNA分子到轉(zhuǎn)錄的RNA分子的轉(zhuǎn)錄。更一般地，將基因的編碼信息 轉(zhuǎn)換成在細(xì)胞中存在且運(yùn)行的結(jié)構(gòu)的過程。表達(dá)的基因包括那些笠錄成πιΜΔ然后翻譯成 蛋白質(zhì)的，以及那些轉(zhuǎn)錄成_但不翻譯成蛋白質(zhì)的（例如siRNA、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA和核糖體RNA)。 由此，靶序列（諸如基因或基因的啟動(dòng)子區(qū)）的表達(dá)可能導(dǎo)致mRNA、蛋白質(zhì)或兩者的表達(dá)。 可以抑制或增強(qiáng)（降低或增加）靶序列的表達(dá)。可以將基因表達(dá)描述為與時(shí)間、空間、發(fā)育 或形態(tài)學(xué)性質(zhì)以及定量或定性指征有關(guān)。
[0091] 基因調(diào)節(jié)活性：多核苷酸影響可操作連接的、可轉(zhuǎn)錄或可翻譯的多核苷酸分子的 轉(zhuǎn)錄或翻譯的能力。分離的具有基因調(diào)節(jié)活性的多核苷酸分子可以提供可操作連接的、可 轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的時(shí)間或空間的表達(dá)、或調(diào)控其表達(dá)水平和速率。分離的具有基因調(diào) 節(jié)活性的多核苷酸分子可以包含啟動(dòng)子、內(nèi)含子、前導(dǎo)序列或3'轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。
[0092] 基因沉默：基因沉默指由于但不限于在基因組（DNA)水平上的效應(yīng)（諸如染色質(zhì) 重構(gòu)），或經(jīng)由對(duì)轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性或翻譯的影響在轉(zhuǎn)錄后水平上的效應(yīng)所導(dǎo)致的基因表達(dá)的 缺乏（或降低）。目前的證據(jù)表明RNA干擾（RNAi)是牽涉轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后基因沉默的主要過 程。
[0093] 由于RNAi在轉(zhuǎn)錄和/或轉(zhuǎn)錄后水平上施加其影響，據(jù)信RNAi可以用于特異性地 抑制來自同一基因的可變轉(zhuǎn)錄本。
[0094] 異源的：一種類型的序列，其通常（例如在野生型序列中）不在另一序列鄰近處 發(fā)現(xiàn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該序列來自與另一序列不同的遺傳來源，諸如病毒或生物體或物 種。
[0095] 雜交：寡核苷酸及其類似物通過互補(bǔ)堿基之間的氫鍵雜交，所述氫鍵包括 Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氫鍵。一般而言，核酸由含氮堿基組成，所述堿 基為嘧啶（胞嘧啶（C)、尿嘧啶（U)和胸腺嘧啶（T))或嘌呤（腺嘌呤（A)和鳥嘌呤（G))。 這些含氮堿基在嘧啶和嘌呤之間形成氫鍵，并且嘧啶對(duì)嘌呤的鍵合被稱為堿基配對(duì)。更具 體地，A會(huì)與T或U鍵合，而G會(huì)與C鍵合。在RNA分子中，G還會(huì)與U鍵合?；パa(bǔ)指在兩條 不同的核酸序列或同一核酸序列的兩個(gè)不同區(qū)域之間發(fā)生的堿基互補(bǔ)。
[0096] 導(dǎo)致特定嚴(yán)格程度的雜交條件會(huì)根據(jù)選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交的核酸序列 的組成和長度而變化。一般地，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度（特別是Na+濃度） 會(huì)決定雜交的嚴(yán)格性。關(guān)于得到特定嚴(yán)格程度所需要的雜交條件的計(jì)算由Sambrook等 (編），Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版，1-3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989，第 9 章和第 11 章論述，其通過提述并入 本文。
[0097] 以下是一組例示性的雜交條件，且并不意圖為限制的。
[0098] 非常高的嚴(yán)格件（檢測(cè)出具有90%序列同一件的序歹Il )
[0099] 雜交：5x SSC在65°C達(dá)16小時(shí)
[0100] 清洗兩次：2x SSC各在室溫（RT)達(dá)15分鐘
[0101] 清洗兩次：0· 5x SSC各在65°C達(dá)20分鐘
[0102] 高嚴(yán)格件（檢測(cè)Hi具有80%序列同一件或?qū)徃叩男虼鮅l )
[0103] 雜交：5x-6x SSC 在 65°C -70°C達(dá) 16-20 小時(shí)
[0104] 清洗兩次：2x SSC各在RT達(dá)5-20分鐘
[0105] 清洗兩次：lx SSC各在55°C -70°C達(dá)30分鐘
[0106] 低嚴(yán)格件（檢測(cè)出具有軺討50%序列同一件的序列）
[0107] 雜交：6x SSC 在 RT 至 55°C達(dá) 16-20 小時(shí)
[0108] 清洗至少兩次：2x-3x SSC各在RT至55 °C達(dá)20-30分鐘。
[0109] 處于順式：指示兩條序列處于RNA或DNA的同一片段上。
[0110] 處于反式：指示兩條序列處于RNA或DNA的不同片段上。
[0111] 工業(yè)用農(nóng)作物：其生長主要供人或動(dòng)物消耗，或用在工業(yè)過程（例如作為用于制 造的脂肪酸的來源或用于生產(chǎn)醇的糖的來源）中的農(nóng)作物。會(huì)理解的是，在許多情況中可 以消耗植物或從該植物生成的產(chǎn)物（例如甜料、油、面粉或粗磨粉（meal));由此，工業(yè)用農(nóng) 作物的一個(gè)子集是食物農(nóng)作物。食物農(nóng)作物的例子包括但不限于，玉米/谷物、大豆、稻、小 麥、油菜（oilseed rape)、棉花、燕麥、大麥和馬鈴薯植物。在本文中列出了工業(yè)用農(nóng)作物 (包含食物農(nóng)作物）的其它例子。
[0112] 干擾或抑制（靶序列的表達(dá)）：該短語指小RNA (諸如siRNA或miRNA)或其它分子 可測(cè)量地降低攜帶靶序列的分子的表達(dá)和/或穩(wěn)定性的能力。靶序列可以包括DNA序列， 諸如基因或基因的啟動(dòng)子區(qū)，或RNA序列，諸如mRNA。"干擾或抑制"表達(dá)涵蓋了基因或序列 的終產(chǎn)物例如編碼的蛋白質(zhì)或受靶序列影響的蛋白質(zhì)、核酸、其它生物分子的表達(dá)或功能、 或生物學(xué)功能的降低，并且由此包括mRNA轉(zhuǎn)錄本或其它靶序列的量或壽命的降低。在一些 實(shí)施方案中，小RNA或其它分子指引著染色質(zhì)修飾，其抑制靶序列的表達(dá)。將該短語理解為 是相對(duì)的，且并不需要對(duì)序列的絕對(duì)抑制（阻抑）。因此，在某些實(shí)施方案中，干擾或抑制靶 序列的表達(dá)需要的是，隨著小RNA或其它分子（諸如編碼一種或多種小RNA的載體或其它 構(gòu)建體）的應(yīng)用，該序列以比應(yīng)用前低至少5%、低至少10%、低至少15%、低至少20%、低 至少25%、或甚至降低了更多的水平表達(dá)。因此，在一些特定的實(shí)施方案中，小RNA或其它 分子的應(yīng)用使靶序列的表達(dá)降低了約30 %、約40 %、約50 %、約60 %、或更多。在特定的實(shí) 例中，在小RNA或其它分子特別有效的情況下，表達(dá)降低了 70%、80%、85%、90%、95%、或 甚至更多。
[0113] 分離的："分離的"生物學(xué)組分（諸如核酸、肽或蛋白質(zhì)）是已經(jīng)從該組分所天然 存在的生物體細(xì)胞中的其它生物學(xué)組分（例如其它染色體和染色體外的DNA和RNA、和蛋白 質(zhì)）實(shí)質(zhì)性分開的、分開產(chǎn)生的、或純化出來的。因此，已經(jīng)"分離的"核酸、肽和蛋白質(zhì)包 含通過標(biāo)準(zhǔn)的純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)制 備的核酸、肽和蛋白質(zhì)以及化學(xué)合成的核酸。
[0114] 代謝組：?jiǎn)我坏纳矬w、樣品、組織、細(xì)胞或其它分開的任意部分中存在的相對(duì)低 分子量分子（代謝物）的全數(shù)。舉例而言，代謝組可以包括代謝中間物、激素和其它信號(hào)傳 導(dǎo)分子和次級(jí)代謝物。代表性的代謝組包括在生物學(xué)樣品諸如植物、植物部分、或植物樣 品、或其懸浮液或提取物中發(fā)現(xiàn)的代謝物的全數(shù)。這類分子的例子包括但不限于：酸和有 關(guān)化合物；單、雙和三羧酸（飽和的、不飽和的、脂肪族和環(huán)狀的、芳基的、烷芳基的）；醛酸、 酮酸；內(nèi)酯形式；赤霉素；脫落酸；醇、多羥基化合物、衍生物和有關(guān)化合物；乙醇、苯甲醇、 甲醇；丙二醇、甘油、葉綠醇；肌醇、糠醇、薄荷醇；醛、酮、醌、衍生物和有關(guān)化合物；乙醛、丁 醛、苯甲醛、丙烯醛、糠醛、乙二醛；丙酮、丁酮；蒽醌；碳水化合物；單糖、二糖、三糖；生物 堿、胺和其它堿；吡啶（包括煙堿酸、煙酰胺）；嘧啶（包括胞嘧啶、胸腺嘧啶）；嘌呤（包括 鳥嘌呤、腺嘌呤、黃嘌呤/次黃嘌呤、細(xì)胞分裂素（kinetin));吡咯；喹啉（包括異喹啉）；嗎 啡喃、托烷、cinchonan ;核苷酸、寡核苷酸、衍生物和有關(guān)化合物；鳥苷、胞苷、腺苷、胸苷、 肌苷；氨基酸、寡肽、衍生物和有關(guān)化合物；酯；酚和有關(guān)化合物；雜環(huán)化合物和衍生物；批 咯、四吡咯（類咕啉和卟吩/卟啉，有或無金屬離子）；黃酮類化合物；噴哚；脂類（包括脂 肪酸和甘油三酯）、衍生物和有關(guān)化合物；類胡蘿卜素、八氫番茄紅素；以及固醇、類異戊二 烯，包括廠（terpene)。
[0115] 微小RNA (miRNA):小的非編碼RNA基因產(chǎn)物，長度約21個(gè)核苷酸且發(fā)現(xiàn)于各種生 物體包括動(dòng)物和植物中。miRNA在結(jié)構(gòu)上類似于siRNA，但它們是自miRNA基因衍生的高度 組織化的、形成折回的前體轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生的。miRNA基因的初始轉(zhuǎn)錄本形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其由多 域RNAseIII樣的核酸酶DICER和DROSHA(動(dòng)物中）或DICER-LIKE1 (DCLl ;植物中）加工 以得到miRNA雙鏈體。成熟的miRNA在雙鏈體解旋后被并入到RISC復(fù)合物中。植物miRNA 與其RNA靶物以完美或近乎完美的互補(bǔ)性相互作用。
[0116] 核苷酸：術(shù)語核苷酸包括但不限于，包含連接至糖的堿基的單體，諸如嘧啶、嘌呤 或其合成的類似物，或者包含連接至氨基酸的堿基的單體，如在肽核酸（PNA)中的。核苷酸 是寡核苷酸/多核苷酸中的一種單體。核苷酸序列指寡核苷酸/多核苷酸中的堿基序列。
[0117] DNA的主要核苷酸是脫氧腺苷5'-三磷酸（dATP或A)、脫氧鳥苷5'-三磷酸（dGTP 或G)、脫氧胞苷5' -三磷酸（dCTP或C)、和脫氧胸苷5' -三磷酸（dTTP或T)。RNA的主要 核苷酸是腺苷5' -三磷酸（ATP或A)、鳥苷5' -三磷酸（GTP或G)、胞苷5' -三磷酸（CTP 或C)、和尿苷5' -三磷酸（UTP或U)。肌苷也是可以整合到DNA或RNA中的核苷酸中的一 種堿基（分別為dITP或ITP)。
[0118] 產(chǎn)油物種（植物的）：在特定器官中（主要在種子中）產(chǎn)生并儲(chǔ)存三酰甘油的 植物物種。這類物種包括但不限于，大豆（Glycine max)、油菜籽和油菜（諸如Brassica napus、Brassica rapa 和 Brassica campestris)、向日葵(Helianthus annus)、棉花 (Gossypium hirsutum)、玉米（玉蜀黍(Zea mays))、可可(Theobroina cacao)、紅花 (Carthamus tinctorius)、油椰(Elaeis guineensis)、椰樹(Cocos nucifera)、亞麻 (Linum usitatissimuin)、菌麻（Ricinus commiunis)和花生（Arachis hypogaea) 〇
[0119] 寡核苷酸：寡核苷酸是通過磷酸二酯鍵結(jié)合的、長度介于約6-約300個(gè)核苷酸之 間的多個(gè)核苷酸。寡核苷酸類似物指發(fā)揮著類似于寡核苷酸的功能但具有非天然存在部分 的化合物。例如，寡核苷酸類似物可以含有非天然存在的部分，諸如改變的糖部分或糖間 連接，諸如硫代磷酸寡脫氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能性類似物可以結(jié)合RNA或 DNA。
[0120] 可操作地連接：該術(shù)語指組件特別是核苷酸序列的并置，從而使組件的正常功能 可以得到實(shí)施。由此，當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄兄糜谂c第二核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，第一核酸序 列與第二核酸序列是可操作地連接的。例如，若啟動(dòng)子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)，則該啟 動(dòng)子與該編碼序列是可操作地連接的。一般地，可操作地連接的DNA序列是連續(xù)的，且在必 須連接兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)時(shí)，可操作地連接的DNA序列位于同一閱讀框中。"可操作地連接" 于調(diào)節(jié)序列的編碼序列指核苷酸序列的一種配置，其中編碼序列可以在該調(diào)節(jié)序列的調(diào)節(jié) 性控制（例如轉(zhuǎn)錄和/或翻譯控制）下表達(dá)。
[0121] ORF(開放閱讀框）：編碼氨基酸而無終止密碼子的一系列核苷酸三聯(lián)體（密碼 子）。這些序列通?？煞g成肽。
[0122] 百分比序列同一性：當(dāng)將參照（"查詢"）多核苷酸分子的線性多核苷酸序列與 測(cè)試（"受試"）多核苷酸分子（或其互補(bǔ)鏈）進(jìn)行最佳聯(lián)配（具有合適的核苷酸插入、 缺失、或缺口，其總共少于沿比較窗口參照序列的20% )時(shí)，前者與后者相比其中等同核 苷酸的百分比。用于對(duì)齊比較窗口的最佳序列比對(duì)是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的，并且可 以使用工具來進(jìn)行，諸如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的 同源性比對(duì)算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法。優(yōu)選地，利用這些算法的計(jì)算 機(jī)化執(zhí)行諸如 GAP、BESTFIT、FASTA 和 TFASTA(作為 GCG? Wisconsin 包 ? (Accelrys Inc.，Burlington, Mass.)的部分可獲）來實(shí)施這類比較。測(cè)試序列和參照序列對(duì)齊區(qū)段的 "同一性分?jǐn)?shù)"是兩條對(duì)齊序列間共有的等同組分?jǐn)?shù)目除以參照序列區(qū)段中的總組分?jǐn)?shù)目 (即完整的參照序列或參照序列的較小的限定部分）。百分比序列同一性由同一性分?jǐn)?shù)乘 以100代表。一個(gè)或多個(gè)多核苷酸序列可以與全長多核苷酸序列或其部分比較，或與更長 的多核苷酸序列比較。實(shí)質(zhì)性百分比序列同一性是至少約80%的序列同一性、至少約90% 的序列同一性、或甚至更高的序列同一性，諸如約98%或約99%的序列同一性。
[0123] 植物：任何植物或其后代。該術(shù)語還包括植物的部分，包含種子、插條、塊莖、果實(shí)、 花等。在各個(gè)實(shí)施方案中，該術(shù)語植物指栽植的植物物種，諸如玉米/谷物、棉花、油菜、向 日葵、大豆、高粱、苜蓿、小麥、稻、生成果實(shí)和蔬菜的植物、以及草坪和觀賞性植物物種。如 本文中使用的，術(shù)語植物細(xì)胞指植物的結(jié)構(gòu)和生理單元，其由原生質(zhì)體和周圍細(xì)胞壁組成。 如本文中使用的，術(shù)語植物器官指植物的獨(dú)特且明顯分化的部分，諸如根、莖、葉或胚。
[0124] 更一般地，術(shù)語植物組織指在植物體內(nèi)或培養(yǎng)物中的任何植物組織。該術(shù)語包括 完整的植物、植物細(xì)胞、植物器官、原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)物或任何組織成結(jié)構(gòu)和功能性單元 的植物細(xì)胞組。
[0125] 多核苷酸分子：來源于基因組或合成的單鏈或雙鏈DNA或RNA ;即分別的脫氧核糖 核苷酸或核糖核苷酸堿基的聚合物，其從5'端（上游）向3'端（下游）閱讀。
[0126] 多肽分子：一種聚合物，其中的單體是通過酰胺鍵結(jié)合在一起的氨基酸殘基。當(dāng)氨 基酸是α -氨基酸時(shí)，可以使用L-光學(xué)異構(gòu)體或D-光學(xué)異構(gòu)體，
[0127] 優(yōu)選L-異構(gòu)體。如用于本文的，術(shù)語多肽或蛋白質(zhì)涵蓋任何氨基酸序列且包括經(jīng) 修飾的序列諸如糖蛋白。術(shù)語多肽特定地意圖涵蓋天然存在的蛋白質(zhì)以及那些重組或合成 生成的。
[0128] 轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS):-種基因沉默形式，其中在轉(zhuǎn)錄后發(fā)生抑制機(jī)制。這可 能導(dǎo)致特定RNA祀物的穩(wěn)定態(tài)水平降低或?qū)Ψg的抑制（Tuschl, ChemBiochem, 2:239-245 ，2001)。在文獻(xiàn)中，術(shù)語RNA干擾（RNAi)和轉(zhuǎn)錄后共抑制經(jīng)常用于指示轉(zhuǎn)錄后的基因沉默。
[0129] 啟動(dòng)子：通過識(shí)別并結(jié)合例如RNA聚合酶II和其它蛋白質(zhì)（反式作用轉(zhuǎn)錄因子） 來啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄，指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的一組核酸控制序列。啟動(dòng)子包括在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)附近的必要 核酸序列，諸如在聚合酶II型啟動(dòng)子情況下的TATA元件。在最小程度上，啟動(dòng)子通常包括 至少一個(gè)RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)且還可以包括一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因 子的占據(jù)而調(diào)控轉(zhuǎn)錄。在本文中描述了啟動(dòng)子的代表性例子（和可以裝配以產(chǎn)生啟動(dòng)子的 元件）。可以通過啟動(dòng)子的時(shí)間、空間、或發(fā)育表達(dá)模式對(duì)其進(jìn)行定義。
[0130] 植物啟動(dòng)子是在植物細(xì)胞中有功能的天然或非天然的啟動(dòng)子。
[0131] 組織特異性、受發(fā)育調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子包括-伴大豆球蛋白7Sa啟動(dòng)子和種子特異性 啟動(dòng)子。可用于在種子質(zhì)體中優(yōu)先表達(dá)的植物功能性啟動(dòng)子包括來自參與油料種子中脂肪 酸生物合成的蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子和來自植物貯藏蛋白的啟動(dòng)子。此類啟動(dòng)子的實(shí)例包括來自 諸如菜豆蛋白、油菜籽蛋白、玉米醇溶蛋白、大豆胰蛋白酶抑制劑、ACP、硬脂酰ACP去飽和 酶、和油質(zhì)蛋白的可轉(zhuǎn)錄核酸分子序列的5'調(diào)節(jié)區(qū)。組織特異性啟動(dòng)子的另一個(gè)實(shí)例是凝 集素啟動(dòng)子，其對(duì)于種子組織是特異性的。
[0132] 蛋白質(zhì)：由基因表達(dá)且由氨基酸構(gòu)成的生物學(xué)分子，例如多肽。
[0133] 原生質(zhì)體：分離的沒有細(xì)胞壁的植物細(xì)胞，其具有被轉(zhuǎn)化和/或再生成細(xì)胞培養(yǎng) 物或全植物的潛力。
[0134] 純化的：術(shù)語"純化的"不要求絕對(duì)純度，而意圖是一個(gè)相對(duì)的術(shù)語。因此，例如純 化的融合蛋白制備物是其中融合蛋白相比于其生成環(huán)境中（例如在細(xì)胞中或在生化反應(yīng) 室中）的蛋白質(zhì)更富集的。優(yōu)選地，純化融合蛋白的制備物從而使該融合蛋白代表制備物 總蛋白含量的至少50%。
[0135] 重組：重組核酸分子具有非天然存在的序列或通過將兩個(gè)分開的其它序列區(qū)段人 工組合而產(chǎn)生的序列。經(jīng)常通過化學(xué)合成，或者更普遍地，通過對(duì)分離的核酸區(qū)段的人工操 作（例如通過遺傳工程改造技術(shù)）來完成該人工組合。
[0136] 類似地，重組蛋白是由重組核酸分子編碼的重組蛋白質(zhì)。
[0137] 可調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子：其活性受到某介質(zhì)（agent)調(diào)節(jié)（直接或間接地）的啟動(dòng)子，所 述介質(zhì)諸如轉(zhuǎn)錄因子、化學(xué)化合物、環(huán)境條件或核酸分子。
[0138] 調(diào)節(jié)基因表達(dá)：通過增加或降低影響基因表達(dá)的介質(zhì)的表達(dá)、生成或活性來控制 基因表達(dá)的過程。所述介質(zhì)可以是蛋白質(zhì)諸如轉(zhuǎn)錄因子，或者是核酸分子諸如miRNA或 siRNA分子，當(dāng)與基因或其上游調(diào)節(jié)序列或由該基因編碼的mRNA接觸時(shí)，其增加或降低基 因表達(dá)。
[0139] 調(diào)節(jié)性序列或元件：這些術(shù)語一般指一類多核苷酸分子（諸如DNA分子，具有DNA 序列），其影響或控制可操作地連接的、可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄或翻譯及由此的基因 表達(dá)。該術(shù)語包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、前導(dǎo)區(qū)、內(nèi)含子、基因座控制區(qū)、邊界元件/絕緣子、沉默 子、基質(zhì)附著區(qū)（也稱為支架附著區(qū)）、阻遏子、轉(zhuǎn)錄終止子（又稱為轉(zhuǎn)錄終止區(qū)）、復(fù)制起 點(diǎn)、著絲粒、和減數(shù)分裂重組熱點(diǎn)。啟動(dòng)子是在基因5'端附近的DNA序列，其充當(dāng)RNA聚合 酶的結(jié)合位點(diǎn)，并且從此處啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子是升高從啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄水平的控制元件，其通 常不依賴于增強(qiáng)子的取向或與啟動(dòng)子間的距離。基因座控制區(qū)（LCR)賦予其所連接的基因 組織特異性的或在時(shí)間上受調(diào)節(jié)的表達(dá)。LCR不依賴于其相對(duì)于基因的位置，但依賴于拷貝 數(shù)而發(fā)揮功能。據(jù)信它們發(fā)揮著打開核小體結(jié)構(gòu)從而使其它因子可以結(jié)合至DNA的功能。 LCR還可以影響復(fù)制時(shí)間安排和起點(diǎn)使用。絕緣子（也稱為邊界元件）是通過阻斷周圍染 色質(zhì)的影響來阻止基因轉(zhuǎn)錄活化（或失活）的DNA序列。沉默子和阻遏子是抑制基因表達(dá) 的控制元件；它們不依賴于其取向或與基因的距離而作用于基因。基質(zhì)附著區(qū)（MAR，也稱 為支架附著區(qū)）是結(jié)合核支架的DNA內(nèi)的序列。它們可以影響轉(zhuǎn)錄，可能通過將染色體分 開到調(diào)節(jié)域中。據(jù)信MAR介導(dǎo)染色體中更高級(jí)的、成環(huán)的結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄終止子是RNA聚合酶 從模板釋放的基因鄰近內(nèi)的區(qū)域。復(fù)制起點(diǎn)是在細(xì)胞分裂的DNA合成或復(fù)制階段期間，開 始DNA復(fù)制過程的基因組區(qū)。減數(shù)分裂重組熱點(diǎn)是在減數(shù)分裂期間比平常更經(jīng)常地重新組 合的基因組區(qū)。調(diào)節(jié)區(qū)中的特定核苷酸可以發(fā)揮多種功能。例如，特定的核苷酸可以是啟 動(dòng)子的一部分并且參與對(duì)轉(zhuǎn)錄激活子蛋白的結(jié)合。
[0140] 在細(xì)胞中（例如在植物或植物細(xì)胞中）發(fā)揮功能的分離的調(diào)節(jié)元件可用于經(jīng)由例 如遺傳工程改造來修飾植物表型。
[0141] RNA :由磷酸二酯鍵連接的核糖核酸單體的、通常為線性的聚合物。天然存在的 RNA分子分成三個(gè)通常的類，信使RNA (編碼蛋白質(zhì)的mRNA)、核糖體RNA (rRNA，核糖體組 分）、和轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA，在蛋白質(zhì)合成期間負(fù)責(zé)將氨基酸單體轉(zhuǎn)移到核糖體的分子）。信使 RNA包括異核RNA(hnRNA)和結(jié)合膜的多核糖體RNA(附著于粗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）。總RNA指所有類 型的RNA分子的異質(zhì)混合物。
[0142] RNA干擾（RNAi):牽涉小RNA (包括miRNA和siRNA)的基因沉默機(jī)制經(jīng)常被稱為 屬于廣義術(shù)語RNAi。RNAi的天然功能包括保護(hù)基因組免受移動(dòng)遺傳元件諸如轉(zhuǎn)座子和病 毒的侵襲，和調(diào)節(jié)基因表達(dá)。
[0143] RNA干擾導(dǎo)致生物體內(nèi)基因表達(dá)的失活或受到抑制。RNAi可以由兩種通常途徑之 一觸發(fā)。第一，其可以由小干擾RNA(siRNA，通常長度為?21個(gè)核苷酸并且以各3'端有2 個(gè)未配對(duì)核苷酸的dsRNA雙鏈體形式投遞）的直接細(xì)胞投遞觸發(fā)，該小干擾RNA與作為抑 制靶物的RNA具有序列互補(bǔ)性。第二，RNAi可以由其中從所設(shè)計(jì)、表達(dá)的各種類型的基因體 內(nèi)形成siRNA的數(shù)種方法之一觸發(fā)。這些基因通常表達(dá)形成分子內(nèi)或分子間雙鏈體的RNA 分子（dsRNA)，其由天然的酶（DICER或DCL)加工以形成siRNA。在一些情況下，這些基因 表達(dá)形成"發(fā)夾"的RM轉(zhuǎn)錄本，其具有完美或近乎完美的堿基配對(duì)；一些不完美的形成發(fā) 夾的轉(zhuǎn)錄本產(chǎn)生特定類型的小RNA，稱為微小RNA (miRNA)。在任一種通用方法中，siRNA (或 miRNA)充當(dāng)"指引序列"來指導(dǎo)RNA降解酶（稱為RISC)切割靶RNA或使其沉默。在一些情 況下，將誘導(dǎo)RNAi的基因整合到轉(zhuǎn)基因生物體的基因組中是有益的。一個(gè)例子是經(jīng)修飾以 通過誘導(dǎo)RNAi的轉(zhuǎn)基因來抑制特定基因的植物。在大多數(shù)目前所實(shí)踐的方法中，在轉(zhuǎn)基因 植物中通過表達(dá)dsRNA(分子內(nèi)的或發(fā)夾，或分子間的，其中兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本退火以形成dsRNA) 的轉(zhuǎn)基因來觸發(fā)RNAi。
[0144] RNA沉默：用于指示基于RNA的基因沉默或RNAi的通用術(shù)語。
[0145] 序列同一性：兩條核酸序列或兩條氨基酸序列之間的相似性表述為序列之間的相 似性或稱為序列同一性。序列同一性經(jīng)常以百分比同一性（或相似性或同源性）衡量；百 分比越高，兩條序列就越相似。當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)齊時(shí)，雙特異性融合蛋白的同源物會(huì)擁有 相對(duì)高的序列同一性程度。
[0146] 用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域中公知的。各種程序和比對(duì)算法記載 于：Smith 和 Waterman (Adv.Appl.Math.2:482, 1981) ;Needleman 和 Wunsch(J.Mol. Biol.48:443, 1970) ;Pearson 和 Lipman (PNAS.USA 85:2444,1988) ;Higgins 和 Sharp (Gene, 73:237_244, I988) ;Higgins 和 Sharp(CABK)S 5:15I-I53, I989) ;Corpet 等 (Nuc. Acids Res.16:10881-90,1988) ;Huang 等（Comp. Appls Biosci.8:155-65, 1992); 和 Pearson 等（Methods in Molecular Biology 24:307-31,1994)。 Altschul 等（Nature Genet.，6:119-29, 1994)提供了對(duì)序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)考量。
[0147] 可以使用比對(duì)工具 ALIGN(Myers 和 Miller, CABIOS 4:11-17, 1989)或 LFASTA (Pearson 和 Lipman, 1988)來實(shí)施序列比較（Internet Program. O 1996, W. R. Pearson 和 the University of Virginia, "fasta20u63" 版本 2.0u63,發(fā)布日 1996 年 12月）。ALIGN將完整的序列彼此間進(jìn)行比較，而LFASTA比較區(qū)域的局部相似性。這些比 對(duì)工具及其相應(yīng)教程可在網(wǎng)絡(luò)上http://biology. ncsa. uiuc. edu處獲得。
[0148] 所公開的雙特異性融合蛋白的直向同源物（Ortholog)通常表征為使用設(shè)置為缺 省參數(shù)的ALIGN，具有與雙特異性融合蛋白的氨基酸序列的全長比對(duì)計(jì)算出的超過75 %的 序列同一性。當(dāng)用該方法評(píng)估時(shí)，與參照序列具有甚至更高的相似性的蛋白質(zhì)會(huì)顯示增加 的百分比同一性，諸如至少80%、至少85%、至少90%、至少92%、至少95%、或至少98% 的序列同一性。另外，可以在公開的融合蛋白的一個(gè)或兩個(gè)結(jié)合域的全長上比較序列同一 性。在此情況下，百分比同一性基本上類似于就全長序列同一性所論述的百分比同一性。
[0149] 當(dāng)對(duì)完整序列的顯著小于全部的部分的序列同一性進(jìn)行比較時(shí)，同源物在10-20 個(gè)氨基酸的小窗口上通常會(huì)擁有至少80%的序列同一性，并且根據(jù)其與參照序列的相似 性，可能具有至少85 %、至少90 %、至少95 %、或至少99 %的序列同一性。可以使用LFASTA 來測(cè)定這類小窗口上的序列同一'I"生；可以在萬維網(wǎng)地址biology, ncsa. uiuc. edu上發(fā)現(xiàn)方 法。本領(lǐng)域中的技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)這些序列同一性范圍的提供僅用于指引；在給出的范圍外 能夠獲得非常顯著的同源物是完全可能的。本公開不僅提供了上文所描述的肽同源物，還 提供了編碼這類同源物的核酸分子。
[0150] 兩種核酸分子緊密相關(guān)的另一指示是這兩種分子在嚴(yán)格條件下彼此雜交。嚴(yán)格條 件是序列依賴性的，并且在不同的環(huán)境參數(shù)下不同。一般地，嚴(yán)格條件選擇為比特定序列在 限定的離子強(qiáng)度和PH處的熱解鏈點(diǎn)（Tm)低約5°C至20°C。1' 111是50%的靶序列與完美匹 配的探針雜交時(shí)的溫度（在限定的離子強(qiáng)度和PH下）。核酸雜交條件和嚴(yán)格性的計(jì)算可以 在 Sambrook 等（于 Molecular Cloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York,1989)和 Tijssen(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology第I部分，第2章，Elsevier, New York, 1993)中發(fā)現(xiàn)。在嚴(yán)格條件下與公開的雙 特異性融合蛋白序列雜交的核酸分子通常會(huì)基于完整的融合蛋白編碼序列、完整結(jié)合域、 或編碼序列的其它選擇部分在〇. 2x SSC，0. 1% SDS、于65°C的清洗條件下與探針雜交。
[0151] 但是由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，不顯示高度同一性的核酸序列也可能編碼相似的 氨基酸序列。理解的是，可以使用此簡(jiǎn)并性來改變核酸序列以生成各編碼基本相同的蛋白 質(zhì)的多種核酸序列。
[0152] 小干擾RNA(siRNA):通過DICER酶（動(dòng)物中）或DCL酶（植物中）從dsRNA加 工出的約21-25個(gè)核苷酸的RNA。初始DICER或DCL產(chǎn)物是雙鏈的，其中兩條鏈通常長為 21-25個(gè)核苷酸并且在各3'端含有2個(gè)未配對(duì)堿基。雙鏈siRNA結(jié)構(gòu)內(nèi)的單個(gè)鏈被分開， 然后其中一條siRNA通常與多亞基復(fù)合物（誘導(dǎo)RNAi的沉默復(fù)合物（RISC))結(jié)合。siRNA 的典型功能是基于堿基配對(duì)互補(bǔ)性指引RISC到達(dá)靶物。
[0153] 可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子：任何能夠轉(zhuǎn)錄成RNA分子的多核苷酸分子。普通技術(shù)人 員已知這樣的方法，即用于將構(gòu)建體以某種方式引入細(xì)胞，從而使得可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分 子被轉(zhuǎn)錄成功能性mRNA分子，其被翻譯并因此表達(dá)為蛋白質(zhì)產(chǎn)物。還可以構(gòu)建能夠表達(dá) 反義RNA分子的構(gòu)建體，從而抑制特定目的RNA分子的翻譯。用于制備并使用構(gòu)建體及宿 主細(xì)胞的常規(guī)組合物和方法是本領(lǐng)域中技術(shù)人員公知的（參見例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版卷 1，2 和 3. Sambrook 等，Cold Spring Harbor Laboratory Press,2000)〇
[0154] 轉(zhuǎn)錄：通過RNA聚合酶生成作為DNA序列互補(bǔ)拷貝的RNA分子。
[0155] 轉(zhuǎn)錄終止區(qū)：控制轉(zhuǎn)錄本3'端形成的序列。自切割核酶和聚腺苷酸化序列是轉(zhuǎn)錄 終止序列的例子。
[0156] 轉(zhuǎn)錄性基因沉默（TGS):由與基因啟動(dòng)子區(qū)同源且有時(shí)和編碼區(qū)同源的dsRNA 的形成所觸發(fā)的現(xiàn)象。TGS導(dǎo)致DNA和組蛋白甲基化以及染色質(zhì)重構(gòu)，由此導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄 抑制而非RNA降解。TGS和PTGS都依賴于dsRNA，其被切割成?。?1-25個(gè)核苷酸）干 擾 RNA(Eckhardt, Plant Cell, 14:1433-1436,2002 ;Aufsatz 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，99:16499-16506, 2002)。
[0157] 轉(zhuǎn)基因：該術(shù)語指含有重組遺傳材料的植物/真菌/細(xì)胞/其它實(shí)體或生物體，該 重組遺傳材料通常未發(fā)現(xiàn)于該類型/物種的實(shí)體中（即為異源遺傳材料）且是通過人工操 作引入所論述的實(shí)體（或該實(shí)體的祖系）中的。由此，從其中通過轉(zhuǎn)化引入重組DNA的植 物細(xì)胞（經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞）生長出的植物是轉(zhuǎn)基因植物，且該植物的含有引入的轉(zhuǎn)基因 的所有后代（不管是有性或無性產(chǎn)生的）也都是轉(zhuǎn)基因植物。
[0158] 轉(zhuǎn)化：外源DNA進(jìn)入并改變受體細(xì)胞的過程。它可能在自然條件下或使用本領(lǐng)域 中公知的各種方法在人工條件下發(fā)生。轉(zhuǎn)化可以依賴于任何已知的用于將外來核酸序列插 入到原核或真核生物宿主細(xì)胞中的方法。對(duì)方法的選擇受到所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的影響，并 且可以包括但不限于，病毒感染、電穿孔、脂轉(zhuǎn)染、和粒子轟擊。
[0159] 經(jīng)轉(zhuǎn)化的：經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是已經(jīng)通過分子生物學(xué)技術(shù)引入核酸分子的細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn) 化的細(xì)胞包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，其中插入的DNA能夠作為自主復(fù)制質(zhì)?；蜃鳛樗拗魅旧w 的一部分復(fù)制。它們也包括在有限時(shí)間段內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)插入DNA或RNA的細(xì)胞。如本文中使 用的，術(shù)語轉(zhuǎn)化涵蓋了所有可以將核酸分子引入這類細(xì)胞中的技術(shù)，包括用病毒載體轉(zhuǎn)染、 用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化、和通過電穿孔引入裸DNA、脂轉(zhuǎn)染和粒子槍加速。
[0160] 轉(zhuǎn)座子：能夠在基因、染色體或基因組內(nèi)部轉(zhuǎn)移位置或移動(dòng)的核苷酸序列諸如 DNA或RNA序列。
[0161] 轉(zhuǎn)基因植物：含有插入到其核基因組或細(xì)胞器基因組的外來（異源）核苷酸序列 的植物。
[0162] 轉(zhuǎn)基因：通過轉(zhuǎn)化技術(shù)插入到一種或多種宿主細(xì)胞的核酸序列。
[0163] 載體：引入到宿主細(xì)胞中由此生成經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的核酸分子。載體可以包含 允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，諸如復(fù)制起點(diǎn)。載體還可以包含一種或多種治療性 基因和/或可選擇的標(biāo)志基因以及本領(lǐng)域中已知的其它遺傳元件。載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或 感染細(xì)胞，由此使得細(xì)胞表達(dá)其天然的那些以外的核酸和/或蛋白質(zhì)。任選地，載體包括幫 助實(shí)現(xiàn)核酸進(jìn)入細(xì)胞的材料，諸如病毒顆粒、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)外殼等。
[0164] 除非另外解釋的，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng) 域的普通技術(shù)人員通常的理解相同的含義。除非上下文另外清楚指出的，單數(shù)的術(shù)語"一個(gè) / 一種/該"包含復(fù)數(shù)所指對(duì)象。類似地，除非上下文另外清楚指出的，詞"或/或者"意圖 包含"和/及/以及"。因此"包含A或B"意味著包含A或B，或A和B。還應(yīng)理解的是，對(duì) 核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小、和所有分子量或分子質(zhì)量值都是大概的， 并且提供以用于描述。盡管可以在本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試中使用類似于或等同于本文中所描 述的那些的方法和材料，但在下文中描述了合適的方法和材料。本文中所提述的所有出版 物、專利申請(qǐng)、專利和其它引用都通過提述完整并入。在有沖突的情況下，參照本說明書內(nèi) 容，包括對(duì)術(shù)語的解釋。另外，材料、方法和實(shí)施例僅為例示性的并且不意圖限制。
[0165] III.對(duì)數(shù)個(gè)實(shí)施方案的概述
[0166] 本公開描述了新的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)，其包含增強(qiáng)子域以及在該增強(qiáng)子域的增強(qiáng)控制下 的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)域。所述增強(qiáng)子域包含串聯(lián)排列的多個(gè)（例如2-4個(gè)或更多個(gè)）拷貝的天然但 以前未識(shí)別的SCBV增強(qiáng)子。本公開的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)（啟動(dòng)子）相比于缺乏該增強(qiáng)子域的啟動(dòng) 子提供了增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)實(shí)施方案中，公開了嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其包含在SEQ ID N0:1 的位置337至位置618中顯示的SCBV增強(qiáng)子元件的一個(gè)或多個(gè)拷貝；以及可操作地與其連 接的包含RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和mRNA啟動(dòng)位點(diǎn)的啟動(dòng)子，其中當(dāng)在所述嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的 調(diào)節(jié)性控制下轉(zhuǎn)錄目的核苷酸序列時(shí)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量相比于用包含所述啟動(dòng)子、但不包含 所述SCBV增強(qiáng)子序列的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)所獲得的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量增加。在一些實(shí)施方案中， 嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)包含從植物病毒基因、細(xì)菌基因、真菌基因、植物核基因、植物核外基因、無 脊椎動(dòng)物基因或脊椎動(dòng)物基因的上游區(qū)獲得的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，所述啟動(dòng)子是 種子特異性的。
[0167] 還提供了包含所描述的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)和待轉(zhuǎn)錄的DNA序列的DNA構(gòu)建體。在一些實(shí) 施方案中，公開了一種DNA構(gòu)建體，其包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)，所述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)可操作地連接于可 轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，而后者可操作地連接于3'轉(zhuǎn)錄終止多核苷酸分子。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子賦予其中表達(dá)該多核苷酸分子的植物農(nóng)藝性狀。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子賦予表達(dá)該多核苷酸分子的植物以修飾的脂肪酸 譜。在最后一個(gè)實(shí)施方案中，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子賦予表達(dá)該多核苷酸分子的植物 以降低的飽和脂肪酸譜。
[0168] 還提供了轉(zhuǎn)基因植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物由公開的DNA構(gòu)建體穩(wěn)定 轉(zhuǎn)化。在一些實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物是雙子葉植物。在其它實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因 植物是單子葉植物。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物是玉米植物。在另一個(gè)具 體的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物是擬南芥植物。
[0169] 進(jìn)一步提供了公開的轉(zhuǎn)基因植物的種子。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述種子包含公開 的DNA構(gòu)建體。
[0170] 甚至還進(jìn)一步提供了轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或組織。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因植物細(xì) 胞或組織包含公開的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)。在一些實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞或組織衍生于雙 子葉植物。在其它實(shí)施方案中，所述植物細(xì)胞或組織來自單子葉植物。在一個(gè)具體的實(shí)施 方案中，所述植物細(xì)胞或組織來自玉米植物。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述轉(zhuǎn)基因植物 是擬南芥植物。
[0171] 還提供了生成公開的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞、種子或組織的方法。在一些實(shí)施方案 中，所述方法包括用公開的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織。
[0172] 進(jìn)一步提供了可從公開的轉(zhuǎn)基因植物衍生的植物細(xì)胞、果實(shí)、葉、根、芽、花、種子、 插條和其它在有性或無性繁殖中有用的再生材料、包括Fl雜交種的后代植物、雄性不育植 物和所有其它植物和植物產(chǎn)物。
[0173] 還公開了包含在SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中顯示的SCBV增強(qiáng)子元件 的一個(gè)或多個(gè)拷貝的玉米植物細(xì)胞或擬南芥植物細(xì)胞、組織或植物。在一個(gè)實(shí)施方案中，玉 米植物細(xì)胞或擬南芥植物細(xì)胞、組織或植物包含在SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中 顯示的SCBV增強(qiáng)子元件的一個(gè)或多個(gè)拷貝，其中所述SCBV增強(qiáng)子元件的一個(gè)或多個(gè)拷貝 被插入到玉米植物細(xì)胞或擬南芥細(xì)胞、組織或植物基因組的隨機(jī)位置處。在一些實(shí)施方案 中，相比于在不存在SCBV增強(qiáng)子時(shí)目的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄，SCBV增強(qiáng)子賦予在其調(diào)節(jié)性控 制下的目的核苷酸序列的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄。
[0174] IV. SCBV增強(qiáng)子及其用途
[0175] 本公開提供了來自甘蔗桿狀DNA病毒（SCBV)基因組的以前未識(shí)別的增強(qiáng)子區(qū)，該 增強(qiáng)子可用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄效率，這可能導(dǎo)致在該增強(qiáng)子控制下的DNA序列的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。特別 感興趣的是可能具有與宿主相同的遺傳起源或外來起源的基因序列（天然存在的序列（有 義和反義方向）或合成制備的序列）的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄。受試增強(qiáng)子包含以前未識(shí)別的天然 SCBV增強(qiáng)子域（其序列在SEQ ID NO: 1中位置337至618處提供）的兩個(gè)或更多個(gè)拷貝。 該增強(qiáng)子包含串聯(lián)排列的增強(qiáng)子域序列的至少2個(gè)拷貝，在一些實(shí)施方案中3個(gè)或4個(gè)或 更多個(gè)拷貝。
[0176] 還涵蓋了同源增強(qiáng)子。不意圖以任何方式受到限制的，代表性的同源序列可 以包含那些來自其它SCBV啟動(dòng)子的，例如來自不同的SCBV分離物，諸如那些記載于 Braithwaite等（Plant Cell Rep. 23:319-326, 2004 ;通過提述完整并入本文）或美國專利 5, 994, 123 (通過提述完整并入本文）中的。
[0177] 天然的增強(qiáng)子包含在其天然環(huán)境中處于啟動(dòng)子上游并且在其約600bp內(nèi)的DNA 序列。取mRNA的起始核苷酸作為0,含有增強(qiáng)子的序列是從約-50至約-1，OOObp，通常從 約-50至-950bp，一般包含約-100至-SOObp。增強(qiáng)子域是順式作用的，且期望地位于待增 強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列的約10, OOObp內(nèi)，通常約2, OOObp內(nèi)，更通常地鄰近于或位于該轉(zhuǎn)錄啟 動(dòng)序列的約1，OOObp內(nèi)。增強(qiáng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)序列可以處于任一方向，并且相對(duì)于其所 增強(qiáng)的啟動(dòng)子位于其上游或下游，不過通常在上游。
[0178] 本公開的增強(qiáng)子域可以與很多種啟動(dòng)序列一起使用，所述啟動(dòng)序列包括天然發(fā)現(xiàn) 的在增強(qiáng)子控制下的啟動(dòng)子（例如處于順式位置（鄰近且同源的））以及通常不與特定增 強(qiáng)子關(guān)聯(lián)的那些（例如異源的）。增強(qiáng)子域和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)域可以來自相同或不同的界、科或 種。感興趣的物種包括原核生物和真核生物，諸如細(xì)菌、植物、昆蟲、哺乳動(dòng)物等。組合包括 所描述的SCBV(病毒的）增強(qiáng)子域（一個(gè)或多個(gè)）與以下物種的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的 組合：SCBV的宿主（例如來自甘蔗）、另一種植物物種（例如來自相同或不同的科）、昆蟲、 脊椎動(dòng)物、細(xì)菌、真菌等。
[0179] 本公開還涵蓋了 DNA構(gòu)建體，其包含受試轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)以及在該轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)控制下 的待轉(zhuǎn)錄的DNA序列。所述DNA序列可以包含天然的開放閱讀框，其包含轉(zhuǎn)錄的5'和3'側(cè) 翼序列?；蛘?，其可以由于編碼RNA分子或其部分的互補(bǔ)體而包含反義序列。當(dāng)構(gòu)建體包 含編碼蛋白質(zhì)的開放閱讀框（ORF)時(shí)，獲得增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)速率，其通常提供該基因的多 肽表達(dá)產(chǎn)物的增加量。當(dāng)構(gòu)建體包含反義序列時(shí)，與野生型互補(bǔ)的RNA的增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄抑制 了野生型mRNA的表達(dá)，由此降低多肽表達(dá)產(chǎn)物的量；可以預(yù)見的是，所討論的野生型mRNA 可以對(duì)應(yīng)于宿主細(xì)胞的天然mRNA或病原體諸如病毒或真菌的mRNA。
[0180] 在各個(gè)實(shí)施方案中，待轉(zhuǎn)錄的DNA序列包括：基因（例如來自植物、動(dòng)物、細(xì)菌、病 毒或真菌）的蛋白質(zhì)編碼序列，其可以包含：編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的天然的開放閱讀框；自基因 編碼的mRNA衍生的互補(bǔ)DNA(cDNA)序列；產(chǎn)生期望的編碼序列的合成DNA ;自天然基因的 外顯子衍生的蛋白質(zhì)編碼序列，諸如通過外顯子連接產(chǎn)生的開放閱讀框；和/或其任意兩 種或更多種的組合。附著于這些序列的是合適的轉(zhuǎn)錄終止/聚腺苷酸化序列；來自編碼初 始RNA產(chǎn)物（由外顯子和內(nèi)含子組成）的天然基因（例如來自植物、動(dòng)物、細(xì)菌、病毒或真 菌）的序列（例如真核生物的天然的聚合酶II和聚合酶III轉(zhuǎn)錄的基因）；編碼特定的RNA 或蛋白質(zhì)產(chǎn)物的合成的DNA序列；通過誘變（諸如定點(diǎn)誘變）和/或其它遺傳工程改造技 術(shù)從已知的編碼序列（例如天然的基因序列）修飾而來的DNA序列；通過連接DNA片段實(shí) 現(xiàn)的上述任意種的嵌合體，包括編碼融合蛋白的嵌合體；和/或編碼RNA分子或其部分的互 補(bǔ)體的DNA序列。
[0181] 植物中增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄可以在增強(qiáng)植物特征性蛋白質(zhì)（內(nèi)源的-即正常發(fā)現(xiàn)于野生型 宿主中）或來自其它遺傳來源的那些蛋白質(zhì)（外源的-即正常未發(fā)現(xiàn)于野生型宿主中）的 生成中發(fā)揮作用。要從本文中所描述的增強(qiáng)子和嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)表達(dá)的序列類型的例子包 括：脂肪酸修飾蛋白；反義或小的抑制性RNA(用于基因抑制）；營養(yǎng)上重要的蛋白質(zhì)；生長 促進(jìn)因子；對(duì)特定環(huán)境條件下生長的植物給予保護(hù)的蛋白質(zhì)，例如賦予對(duì)金屬、鹽或其它毒 性抗性的蛋白質(zhì)；脅迫有關(guān)的蛋白質(zhì)，其給予對(duì)極端溫度、冷凍等的耐受；賦予植物對(duì)害蟲 或感染有關(guān)的保護(hù)的蛋白質(zhì)，例如給予對(duì)細(xì)菌、真菌或其它微生物感染抗性，或者對(duì)昆蟲捕 食（例如蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis)毒素）或其它無脊椎動(dòng)物或脊椎動(dòng)物抗性的 蛋白質(zhì)；具有植物以外的醫(yī)學(xué)重要性例如抗微生物、抗腫瘤等的化合物；具有特定商業(yè)價(jià) 值的蛋白質(zhì)或其它化合物；蛋白質(zhì)，例如代謝途徑（例如用于生成多酚化合物或其它次級(jí) 代謝物的途徑）的酶的水平升高；對(duì)植物宿主具有結(jié)構(gòu)性價(jià)值的產(chǎn)物的水平升高；等等。轉(zhuǎn) 錄的目的序列長度會(huì)是至少約8bp、至少約12bp、至少約20bp，且可以是一千或幾千個(gè)堿基 對(duì)（kbp)。
[0182] V.構(gòu)建體
[0183] 本公開的構(gòu)建體通常含有嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，其包含所提供的SCBV增強(qiáng)子元件的 一個(gè)或多個(gè)拷貝，所述一個(gè)或多個(gè)拷貝可操作地連接于啟動(dòng)子（通常至少含有RNA聚合酶 結(jié)合位點(diǎn)和mRNA啟動(dòng)位點(diǎn)），而該區(qū)域可操作地連接于可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，該分子可 操作地連接于3'轉(zhuǎn)錄終止多核苷酸分子。另外，構(gòu)建體可以包括但不限于來自植物基因的 3'非翻譯區(qū)（3'UTR)的另外的調(diào)節(jié)性多核苷酸分子（例如3'^1?以增加1111?嫩的1111?嫩穩(wěn)定 性，諸如馬鈴薯的PI-II終止區(qū)或者章魚堿或胭脂堿合酶3'終止區(qū)）。構(gòu)建體可以包括但 不限于mRNA多核苷酸分子的5'非翻譯區(qū)（5'UTR)，其可能在翻譯啟動(dòng)中起著重要作用并且 還可以是植物表達(dá)構(gòu)建體中的遺傳組件。例如，已經(jīng)證明自熱激蛋白基因衍生的不翻譯的 5'前導(dǎo)多核苷酸分子增加植物中的基因表達(dá)（參見例如美國專利5, 659, 122和5, 362, 865， 其中每個(gè)都通過提述完整并入）。如該構(gòu)建體中存在的這類額外的上游和下游調(diào)節(jié)性多核 苷酸分子可以自相對(duì)于構(gòu)建體上的其它元件為天然的或異源的來源衍生。
[0184] 因此，一個(gè)實(shí)施方案是包含嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的構(gòu)建體，該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)本身包含在 SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中顯示的SCBV增強(qiáng)子元件的一個(gè)或多個(gè)拷貝（例如2 個(gè)、3個(gè)、4個(gè)或更多個(gè)拷貝），所述拷貝可操作地連接于啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可操作地連接于 可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，從而當(dāng)將該構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞中時(shí)，指導(dǎo)所述可轉(zhuǎn)錄的多核 苷酸分子以期望的水平和/或在期望的組織或發(fā)育模式轉(zhuǎn)錄。在一些實(shí)例中，所述可轉(zhuǎn)錄 的多核苷酸分子包含基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)，且嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)提供功能性mRNA分子的轉(zhuǎn) 錄，所述mRNA分子從構(gòu)建體翻譯并表達(dá)為蛋白質(zhì)產(chǎn)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述可轉(zhuǎn)錄 的多核苷酸分子包含基因的反義區(qū)，且嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)影響反義RNA分子或其它類似的抑 制性RNA的轉(zhuǎn)錄，從而抑制靶宿主細(xì)胞中特定目的RNA分子的表達(dá)。
[0185] 本公開的更多的構(gòu)建體例子包括雙Ti質(zhì)粒邊界DNA構(gòu)建體，其具有從根癌土壤桿 菌（Agrobacterium tumefaciens)分離出的 Ti 質(zhì)粒（包含 T-DNA)的右邊界（RB 或 AGRtu. RB)和左邊界（LB或AGRtu. LB)區(qū)，其與由土壤桿菌細(xì)胞提供的轉(zhuǎn)運(yùn)分子一起，使得T-DNA 能夠整合到植物細(xì)胞的基因組中。該構(gòu)建體還可以含有提供細(xì)菌細(xì)胞中的復(fù)制功能和抗生 素選擇的質(zhì)粒骨架DNA區(qū)段，例如，大腸桿菌（Escherichia coli)復(fù)制起點(diǎn)諸如ori322、具 有廣泛宿主范圍的復(fù)制起點(diǎn)諸如oriV或oriRi、以及用于可選擇標(biāo)志的編碼區(qū)諸如Spec/ Strp，其編碼賦予對(duì)壯觀霉素或鏈霉素抗性的Tn7氨基糖苷腺苷酰轉(zhuǎn)移酶（aadA)，或慶大 霉素（Gm，Gent)可選擇標(biāo)志基因。對(duì)于植物轉(zhuǎn)化，代表性的宿主細(xì)菌菌株包括根癌土壤桿 菌ABI，C58,或LBA4404 ;然而，也可以使用植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的其它菌株。
[0186] 期望能夠鑒定在種子特異性組織內(nèi)以高水平表達(dá)?；o酶ΑΛ9去飽和酶的啟動(dòng) 子。植物?；o酶ΑΛ9去飽和酶是可溶的。它位于質(zhì)體基質(zhì)中，并使用被酯化成ACP(主 要是硬脂酰-ACP)的新合成脂肪酸作為底物。這與其它Λ-9去飽和酶形成對(duì)照，其它Λ-9 去飽和酶位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（ER,或微粒體）中，并使用被酯化成CoA的脂肪酸作為底物，并且使 棕櫚酸和硬脂酸等飽和脂肪酸去飽和。美國專利5, 723, 595和6, 706, 950涉及植物去飽和 酶。
[0187] 在植物中表達(dá)微生物Λ-9去飽和酶基因是本領(lǐng)域公知的。已經(jīng)將釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) Δ -9去飽和酶基因?qū)霟煵萑~組織中（Polashcok, J. 等，F(xiàn)ASEB J 5:A1157(1991)，且其在該組織中表觀表達(dá)。此外，在番茄中表達(dá)了這種基 因。見 Wang 等，J. Agric Food Chem. 44:3399-3402 (1996);和 C. Wang 等，Phytochemistry 58:227-232(2001)。雖然對(duì)于煙草和番茄兩者都報(bào)道了某些不飽和物的若干增加和某 些飽和物的若干降低，但煙草和番茄都不是油料作物。還有人將這種酵母基因?qū)霘W洲 油菜（Brassica napus)中（參見美國專利5, 777, 201)。已有人將另一種來自構(gòu)巢曲霉 的真菌Λ-9去飽和酶導(dǎo)入加拿大油菜中，實(shí)現(xiàn)了種子油中飽和脂肪酸的降低（參見US 20080260933A1)。在這種情況下，在種子油中硬脂酸的消耗￠1-90%)比更豐富的棕櫚酸 脂肪酸的消耗（36-49% )更多。因此，優(yōu)先作用于飽和物的?；o酶ΑΛ-9去飽和酶將實(shí) 現(xiàn)總飽和物的進(jìn)一步降低。
[0188] 油類，無論是植物還是動(dòng)物來源的，其特征都主要取決于碳原子和氫原子的數(shù)目， 以及構(gòu)成脂肪酸鏈的雙鍵的數(shù)目和位置。大多數(shù)衍生自植物的油類由不同量的棕櫚酸 (16:0)、硬脂酸（18:0)、油酸（18:1)、亞油酸（18:2)和亞麻酸（18:3)脂肪酸組成。常規(guī)地， 棕櫚酸和硬脂酸被指定為"飽和的"，因?yàn)樗鼈兊奶兼湵粴湓语柡?，因而不具有雙鍵；它們 含有最大可能數(shù)目的氫原子。然而，油酸、亞油酸、和亞麻酸為在其中分別具有一個(gè)、兩個(gè)、 和三個(gè)雙鍵的18碳的脂肪酸鏈。油酸通常被視為單不飽和脂肪酸，而亞油酸和亞麻酸被視 為多不飽和脂肪酸。美國農(nóng)業(yè)部將"無飽和物"或"沒有飽和物"的產(chǎn)品定義為具有按重量 計(jì)小于3. 5%的總飽和脂肪酸的產(chǎn)品（相比于脂肪酸的總量）。
[0189] 脂肪酸合成的主要產(chǎn)物是棕櫚酸（16:0)，其顯現(xiàn)出高效延伸而形成硬脂酸 (18:0)。當(dāng)仍在質(zhì)體中時(shí)，飽和脂肪酸隨后可以通過稱為?；鵄CP Λ-9去飽和酶的酶導(dǎo)入 一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵而被去飽和。具體地說，硬脂酸可以經(jīng)由質(zhì)體Λ-9去飽和酶迅速去 飽和而產(chǎn)生油酸（18:1)。事實(shí)上，棕櫚酸也可以經(jīng)由質(zhì)體Λ-9去飽和酶去飽和為棕櫚油 酸（16:1)，但這種脂肪酸在大多數(shù)植物油中僅以微量（0-0.2% )存在。因此，質(zhì)體中脂肪 酸合成的主要產(chǎn)物為棕櫚酸、硬脂酸、和油酸。在大多數(shù)油中，油酸是主要的合成的脂肪酸， 因?yàn)轱柡椭舅嵋缘偷枚嗟谋壤嬖凇?br> [0190] 隨后在質(zhì)體外的細(xì)胞質(zhì)中植物脂肪酸的去飽和似乎僅限于油酸，其可被微粒體去 飽和酶去飽和為亞油酸（18:2)和亞麻酸（18:3)，微粒體去飽和酶作用于被酯化為磷脂酰 膽堿（PC)的油?；孜锘騺営王；↖ineoleoyl)底物。此外，取決于不同的植物，油酸可 通過延長（達(dá)到20:1，22:1，和/或24:1)或通過添加官能團(tuán)而被進(jìn)一步修飾。然后，這些 脂肪酸連同飽和脂肪酸棕櫚酸和硬脂酸可被裝配成甘油三酯。
[0191] 因而，一個(gè)實(shí)施方案是包含嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)本身的構(gòu)建體，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)包含 可操作地連接于啟動(dòng)子的如SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中所示的SCBV增強(qiáng)子元 件的四個(gè)拷貝，所述啟動(dòng)子可操作地連接于包含?；o酶ΑΛ-9去飽和酶的可轉(zhuǎn)錄的多核 苷酸分子。其中，當(dāng)將該構(gòu)建體引入到植物細(xì)胞中時(shí)，所述?；o酶ΑΛ-9去飽和酶以期望 的水平和/或以期望的組織或發(fā)育模式表達(dá)，由此降低植物細(xì)胞和/或期望組織中飽和脂 肪酸的百分比。
[0192] 還涵蓋了包含至少一個(gè)SCBV增強(qiáng)子元件（任選地，在嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的背景 中）的構(gòu)建體，該構(gòu)建體是激活標(biāo)簽化構(gòu)建體。激活標(biāo)簽化是一種在全基因組規(guī)模隨 機(jī)并強(qiáng)烈上調(diào)基因，然后可以篩選并選擇特定表型的方法。已知在各種激活標(biāo)簽化構(gòu) 建體類型中可用的組件；參見例如：Walden等，Plant Mol. Biol. 26:1521-8, 1994(描 述了一種用于活化煙草細(xì)胞培養(yǎng)物中基因從而允許細(xì)胞在缺乏植物生長激素的情況 下生長的活化 T-DNA 標(biāo)簽構(gòu)建體）；Miklashevichs 等，Plant J. 12:489-98, 1997 ; Harling 等，EMBO J. 16:5855-66,1997 ;Walden 等，EMBO J. 13:4729-36,1994(報(bào)告 了從T-DNA標(biāo)簽側(cè)翼的植物基因組序列分離并推定牽涉植物生長激素應(yīng)答的基因）； Schell 等，TrendsPlant Sci. 3:130, 1998 (論述了對(duì)一組相關(guān)研究的調(diào)查）；Kardailsky 等，Science286:1962-1965, 1999(描述了激活T-DNA標(biāo)簽并篩選植物中的早期開花表 型）；Koncz 等，Proc Natl Acad Sci U S A 86 (21) :8467-71, 1989(描述了使用土壤桿 菌基因5啟動(dòng)子（pg5)進(jìn)行的激活標(biāo)簽化，該啟動(dòng)子僅在增殖細(xì)胞時(shí)有活性并且必須插 入到直接臨近于植物基因以影響其表達(dá)）；Wilson等，Plant Cell8:659-671，1996(利 用修飾的Ds轉(zhuǎn)座子進(jìn)行的激活標(biāo)簽化，所述轉(zhuǎn)座子攜帶CaMV 35S啟動(dòng)子和nos: :hpt 選擇盒）和Schaffer等，Cell 93:1219-1229, 1998(例示了同一系統(tǒng)，其用于上 調(diào)臨近的植物基因，從而導(dǎo)致優(yōu)勢(shì)的功能獲得性突變1996);和Weigel等，Plant Physiology, 122:1003-1013, 2000(例示了可用于篩選成百上千個(gè)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的形態(tài)學(xué) 表型的激活標(biāo)簽化載體）。
[0193] VI.用于轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的核苷酸序列
[0194] 用于通過納入如本文中提供的構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)的例示性可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸 分子包括，例如來自靶物種以外的多核苷酸分子或基因或者起源于或存在于相同物種中的 基因，但通過遺傳工程改造方法而非經(jīng)典的繁殖或育種技術(shù)納入到受體細(xì)胞中的多核苷酸 分子或基因。多核苷酸分子的類型可以包括但不限于，已經(jīng)存在于靶植物細(xì)胞中的多核苷 酸分子、來自另一種植物的多核苷酸分子、來自不同生物體的多核苷酸分子、或外部生成的 多核苷酸分子，諸如含有基因的反義信息的多核苷酸分子或編碼轉(zhuǎn)基因的人工的、合成的、 或經(jīng)修飾的版本的多核苷酸分子。
[0195] 在一個(gè)實(shí)施方案中，將如SEQ ID NO: 1的位置337至618中顯示的多核苷酸分子 (或其兩個(gè)或更多個(gè)拷貝）（例如在嵌合轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的背景中）納入到構(gòu)建體中，從而使得 所描述的SCBV增強(qiáng)子序列（或兩個(gè)或更多個(gè)這類序列的系列）可操作地連接于可轉(zhuǎn)錄的 多核苷酸分子，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子是有農(nóng)藝意義的基因或其它表達(dá)序列（更一般 地，目的核苷酸序列）。如本文中使用的，術(shù)語"有農(nóng)藝意義的基因"指包括但不限于如下 的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子：提供與植物形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生長和發(fā)育、產(chǎn)量、營養(yǎng)改善、疾病 或害蟲抗性、或環(huán)境或化學(xué)耐受性有關(guān)的期望屬性的基因。期望表達(dá)有農(nóng)藝學(xué)利益的基因， 例如，從而賦予農(nóng)藝學(xué)上重要的性狀。對(duì)農(nóng)作物植物提供有益的農(nóng)藝性狀的有農(nóng)藝學(xué)利益 的基因可以是，例如一種或多種賦予表達(dá)該基因的植物以下益處的序列：除草劑抗性（參 見例如美國專利 6, 803, 501 ;6, 448, 476 ;6, 248, 876 ;6, 225, 114 ;6, 107, 549 ;5, 866, 775 ; 5, 804, 425 ;5, 633, 435 ;5, 463, 175 ;以及美國公開 US20030135879 和 US20030115626)、增 加的產(chǎn)量（參見例如美國專利USRE38, 446 ;美國專利6, 716, 474 ;6, 663, 906 ;6, 476, 295 ; 6, 441，277 ;6, 423, 828 ;6, 399, 330 ;6, 372, 211 ;6, 235, 971 ;6, 222, 098 ;5, 716, 837)、 昆蟲控制（參見例如美國專利 6, 809, 078 ;6, 713, 063 ;6, 686, 452 ;6, 657, 046 ; 6, 645, 497 ；6, 642, 030 ；6, 639, 054 ；6, 620, 988 ；6, 593, 293 ；6, 555, 655 ；6, 538, 109 ； 6, 537, 756 ；6, 521, 442 ；6, 501, 009 ；6, 468, 523 ；6, 326, 351 ；6, 313, 378 ；6, 284, 949 ； 6, 281, 016 ；6, 248, 536 ；6, 242, 241 ；6, 221, 649 ；6, 177, 615 ；6, 156, 573 ；6, 153, 814 ； 6, 110, 464 ；6, 093, 695 ；6, 063, 756 ；6, 063, 597 ；6, 023, 013 ；5, 959, 091 ；5, 942, 664 ； 5, 942, 658, 5, 880, 275 ;5, 763, 245 ;5, 763, 241)、真菌疾病抗性（參見例如美國專利 6, 653, 280 ；6, 573, 361 ；6, 506, 962 ；6, 316, 407 ；6, 215, 048 ；5, 516, 671 ；5, 773, 696 ； 6, 121，436 ;6, 316, 407 ;6, 506, 962)、病毒抗性（參見例如美國專利 6, 617, 496 ; 6, 608, 241 ;6, 015, 940 ;6, 013, 864 ;5, 850, 023 ;5, 304, 730)、線蟲抗性（參見例如美國 專利6, 228, 992)、細(xì)菌疾病抗性（參見例如美國專利5, 516, 671)、植物生長和發(fā)育（參 見例如美國專利6, 723, 897 ;6, 518, 488)、淀粉產(chǎn)生量（參見例如美國專利6, 538, 181 ; 6, 538, 179 ;6, 538, 178 ;5, 750, 876 ;6, 476, 295)、改進(jìn)的油產(chǎn)生量（參見例如美國專 利6, 444, 876 ;6, 426, 447 ;6, 380, 462)、高油產(chǎn)生量（參見例如美國專利6, 495, 739 ; 5, 608, 149 ;6, 483, 008 ;6, 476, 295)、改進(jìn)的脂肪酸含量（參見例如美國專利6, 828, 475 ; 6, 822, 141 ；6, 770, 465 ；6, 706, 950 ；6, 660, 849 ；6, 596, 538 ；6, 589, 767 ；6, 537, 750 ； 6, 489, 461 ;6, 459, 018)、纖維產(chǎn)生量（參見例如美國專利 6, 576, 818 ;6, 271，443 ; 5, 981，834 ;5, 869, 720)、高蛋白產(chǎn)生量（參見例如美國專利6, 380, 466)、果實(shí)成熟（參見 例如美國專利5, 512, 466)、改善的可消化性（參見例如美國專利6, 531，648)、改善的味 道（參見例如美國專利6, 011，199)、低棉子糖（參見例如美國專利6, 166, 292)、增強(qiáng)的 動(dòng)物和/或人營養(yǎng)（參見例如美國專利6, 723, 837 ;6, 653, 530 ;6, 541，259 ;5, 985, 605 ; 6, 171，640)、環(huán)境脅迫抗性（參見例如美國專利6, 072, 103)、期望的肽（例如藥學(xué)的或可 分泌的肽）（參見例如美國專利6, 812, 379 ;6, 774, 283 ;6, 140, 075 ;6, 080, 560)、改進(jìn)的加 工性狀（參見例如美國專利6, 476, 295)、工業(yè)酶生產(chǎn)（參見例如美國專利5, 543, 576)、氮 固定（參見例如美國專利5, 229, 114)、雜交種子產(chǎn)生（參見例如美國專利5, 689, 041)、生 物聚合物（參見例如美國專利USRE37, 543 ;美國專利6, 228, 623 ;5, 958, 745和美國公開 此.舊20030028917)和生物燃料生產(chǎn)（參見例如美國專利5,998,700)。在上文所列出的專 利和公開申請(qǐng)中描述的遺傳元件、方法和轉(zhuǎn)基因通過提述并入本文。
[0196] 或者，可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子可以通過編碼導(dǎo)致內(nèi)源基因表達(dá)受到靶向抑制（經(jīng) 由例如反義、抑制性RNA(RNAi)、或共抑制介導(dǎo)的機(jī)制）的反義的或RNA分子來影響上文提 述（或其它）的植物屬性或表型。RNA還可以是催化性RNA分子（核酶），其被工程改造以 切割期望的內(nèi)源mRNA產(chǎn)物。因此，任何編碼影響目的表型、生化或形態(tài)學(xué)變化的轉(zhuǎn)錄RNA分 子的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子都可以受益于由本文中提供的序列和構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。
[0197] 可以將描述的SCBV增強(qiáng)子或包含其一個(gè)或多個(gè)拷貝的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)組入到 具有一個(gè)或多個(gè)標(biāo)志基因的構(gòu)建體（任何可以以某種方式篩選其表達(dá)或打分的可轉(zhuǎn)錄 的多核苷酸分子）中，并在瞬時(shí)或穩(wěn)定的植物分析中測(cè)試以提供對(duì)穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因植物中 調(diào)節(jié)元件的基因表達(dá)樣式的指征。在這類實(shí)施方案的實(shí)施中使用的標(biāo)志基因包括但不 限于，編碼以下蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子：β -葡糖醛酸糖苷酶（記載于美國專利 5, 599, 670的⑶S)和綠色熒光蛋白（記載于美國專利5, 491，084和6, 146, 826的GFP)、 賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)、或賦予除草劑耐受性的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域中已知可用的抗生素 抗性標(biāo)志，包括那些編碼賦予對(duì)卡那霉素抗性（nptll)、潮霉素 B抗性（aph IV)、鏈霉素 抗性、或壯觀霉素抗性（aad，spec/strep)和慶大霉素抗性（aac3和aacC4)的蛋白質(zhì) 的。已經(jīng)證明轉(zhuǎn)基因植物對(duì)其耐受性并且可以應(yīng)用本發(fā)明的方法的除草劑包括但不限 于：草甘膦（glyphosate)、草胺膦（glufosinate)、磺酰脲類（sulfonylureas)、咪唑啉酮 類（imidazolinones)、溴苯臆（bromoxynil)、茅草枯（dalapon)、cyclohezanedione、原 口卜啉原（protoporphyrinogen)氧化酶抑制劑、和isoxasflutole除草劑。編碼牽涉除草 劑耐受性的蛋白質(zhì)的多核苷酸分子是本領(lǐng)域中已知的，并且包括但不限于編碼2, 4-D降 解酶（記載于WO 2007/053482A2或美國專利7, 838, 733的aad-12)的多核苷酸分子；編 碼5-烯醇丙酮酰莽草酸（enolpyruvylshikimate)-3-磷酸合酶（EPSPS，記載于美國專利 5, 627, 061，5, 633, 435, 6, 040, 497和美國專利5, 094, 945中用于草甘膦耐受性）的多核 苷酸分子；編碼草甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶（記載于美國專利5, 463, 175 的GOX和記載于美國公開No. 20030083480的GAT)的多核苷酸；編碼溴苯腈腈水解酶 (Bxn，記載于美國專利4, 810, 648用于溴苯腈耐受性）的多核苷酸分子；記載于Misawa 等（Plant J.4:833_840，l993)和 Misawa 等（Plant 1 6:481-489，1"4)中用于編碼對(duì) 達(dá)草滅（norflurazon)耐受性的八氫番茄紅素去飽和酶（crtl)的多核苷酸分子；記載于 Sathasiivan等（Nucl. Acids Res. 18:2188-2193, 1990)中編碼用于對(duì)磺酰脲除草劑耐受 性的乙酰羥酸合酶（AHAS，又稱為ALS)的多核苷酸分子；編碼降解麥草畏的酶加氧酶（記 載于美國專利公開US20030135879和US20030115626,用于麥草畏耐受性）的多核苷酸 分子；和編碼草胺膦和雙丙氨膦（bialaphos)耐受性的多核苷酸分子（記載于DeBlock 等 EMBO J. 6:2513-2519, 1987 中的 bar 基因）、記載于 Wohlleben et al·，（1988)Gene 70:25-37中的pat基因、或記載于美國專利申請(qǐng)2007/086813中的DSM-2基因）。本公開的 調(diào)節(jié)元件可以表達(dá)編碼以下酶的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子：膦絲菌素（phosphinothricin)乙 酰轉(zhuǎn)移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基葡糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、羥苯基丙酮酸脫氫酶、潮霉素磷酸轉(zhuǎn) 移酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、茅草枯脫齒素酶、溴苯腈抗性腈水解酶、鄰氨基苯甲酸酯合酶、草 甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶。
[0198] 可以將含有至少一個(gè)可操作地連接于標(biāo)志基因或其它目的核苷酸序列的SCBV增 強(qiáng)子（例如在嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的背景中）的構(gòu)建體投遞到組織（例如經(jīng)轉(zhuǎn)化的）中，并且通 過依賴于所轉(zhuǎn)錄的標(biāo)志或序列的合適機(jī)制來分析該組織。當(dāng)將調(diào)節(jié)元件可操作地連接于穩(wěn) 定植物中有農(nóng)藝學(xué)利益的基因時(shí)，可以將這類定量或定性分析用作工具來評(píng)估該調(diào)節(jié)元件 的潛在表達(dá)譜。在瞬時(shí)測(cè)定法中可以使用標(biāo)志基因；在瞬時(shí)測(cè)定法中測(cè)試標(biāo)志基因表達(dá)的 方法是本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員已知的。已經(jīng)報(bào)告了使用多種植物、組織和DNA投遞系統(tǒng)的 標(biāo)志基因的瞬時(shí)表達(dá)。例如，瞬時(shí)分析系統(tǒng)包括但不限于，在使用任何感興趣的植物物種的 任何瞬時(shí)植物測(cè)定法中經(jīng)由對(duì)組織的電穿孔或粒子轟擊進(jìn)行的直接基因投遞。這類瞬時(shí)系 統(tǒng)會(huì)包括但不限于，對(duì)來自多種組織來源的原生質(zhì)體的電穿孔或?qū)Ω信d趣的特定組織的粒 子轟擊。本公開涵蓋了任何瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)評(píng)估調(diào)節(jié)元件的用途，所述調(diào)節(jié)元件可操作地連 接于任何可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，其包括但不限于標(biāo)志基因或有農(nóng)藝學(xué)利益的基因。預(yù)想 通過合適的投遞系統(tǒng)在瞬時(shí)中測(cè)試的植物組織的例子包括但不限于，葉基組織、愈傷組織、 子葉、根、胚乳、胚、花組織、花粉、和表皮組織。
[0199] VII.植物轉(zhuǎn)化
[0200] 可以使用任何植物轉(zhuǎn)化方法將含有如本文中描述的增強(qiáng)子元件（或其多個(gè)拷 貝）或嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的植物轉(zhuǎn)化構(gòu)建體引入植物中。在本發(fā)明的實(shí)踐中，用于通過將 植物表達(dá)構(gòu)建體引入到植物基因組中來轉(zhuǎn)化植物的方法和材料可以包括任何公知且經(jīng) 過證明的方法，包括電穿孔（例如美國專利5, 384, 253)、微粒轟擊（microprojectile bombardment)(例如美國專利 5, 015, 580 ;5, 550, 318 ;5, 538, 880 ;6, 160, 208 ;6, 399, 861 ; 和6, 403, 865)、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（例如美國專利5, 824, 877 ;5, 591，616 ;5, 981，840 ; 和6, 384, 301)、和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化（例如美國專利5, 508, 184)。對(duì)本領(lǐng)域中的技術(shù)人員明顯 的是，可以利用并修改許多轉(zhuǎn)化方法學(xué)以從任意數(shù)量的感興趣的靶作物生成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因 植物。
[0201] 用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物的特定方法是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的。舉例而 言，已經(jīng)描述了許多農(nóng)作物的轉(zhuǎn)化和植物再生方法，所述農(nóng)作物包括但不限于，擬南 芥（Arabidopsis thaliana)、棉花（Gossypium hirsutum)、大豆(Glycine max)、花生 (Arachis hypogaea)和蕓苔屬（Brassica)的成員。
[0202] 類似地，用于轉(zhuǎn)化單子葉植物的具體方法也是本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知 的。舉例而言，已經(jīng)描述了許多農(nóng)作物的轉(zhuǎn)化和植物再生方法，所述農(nóng)作物包括但 不限于，大麥（Hordeum vulgarae);玉米（玉蜀黍）；燕麥（Avena sativa);野茅 (orchard grass) (Dactylis glomerata);稻（Oryza sativa，包括秈稻和粳稻品種）； 高粱（Sorghum bicolor);甘鹿（甘鹿屬（Saccharum)的種）；高羊茅（tall fescue) (Festuca arundinacea);草坪草（turfgrass)物種（例如 Agrostis stolonifera, Poa pratensis, Stenotaphrum secundatum);小麥（Triticum aestivum)、和苜猜（Medicago sativa)〇
[0203] 可以對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物分析感興趣的基因的存在以及由本文中描述的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào) 節(jié)區(qū)賦予的表達(dá)水平和/或譜。本領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員可使用眾多用于分析經(jīng)轉(zhuǎn)化植物 的方法。例如，用于植物分析的方法包括Southern和Northern印跡分析、基于PCR(或其 它基于核酸擴(kuò)增的方法，諸如Invader?或Taqman?測(cè)定法）的方法、生化分析、表型篩 選方法、田間評(píng)估、和免疫診斷測(cè)定法（例如用于蛋白質(zhì)的檢測(cè)、定位、和/或定量）。
[0204] 已經(jīng)在玉米和擬南芥中證明了使用所描述的SCBV增強(qiáng)子的增強(qiáng)的基因表達(dá)， 但預(yù)期該增強(qiáng)子在其它植物物種中起作用，所述植物可能包括雙子葉植物以及單子葉植 物。具有4個(gè)SCBV上游區(qū)拷貝的增強(qiáng)子元件提供了本文中研究的組合的最高表達(dá)水 平。更少或更多的上游區(qū)拷貝、以及與來自其它來源的增強(qiáng)子元件的組合也可以提供調(diào) 控基因表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)。同樣的激活子、構(gòu)建體和辦法可能可以用于其它農(nóng)作物物種，所述農(nóng) 作物物種由于其基因組序列可獲或正在進(jìn)展中可以對(duì)其鑒定基因（包括高粱（Sorghum bicolor)、小麥(Triticum aestivum)、大麥（Hordeum vulgare)、粟（Foxtail millet) (Setaria italica)、甘鹿(Saccharum offic inarum)、巨芒(Miscanthus giganteus)), 或者可以通過后續(xù)基因組測(cè)序努力或可能的染色體同線性來對(duì)其鑒定'活化基因'（包 括燕麥（Avena sativa)、黑麥（Secale cereale)、珍珠粟（Pennisetum glaucum)、龍爪 稷（Finger millet) (Eluesine coracana)、黍稷（Proso millet) (Panicum miliaceum)、 Teff millet (Eragrostis tef))，或用于其基因組序列可獲或正在進(jìn)展中的模式草物種 (包括紫色假燕麥（Brachypodium distachyon)、狗尾草（Green bristlegrass) (Setaria viridis))〇
[0205] 提供以下實(shí)施例以例示某些具體特征和/或?qū)嵤┓桨?。不?yīng)將這些實(shí)施例理解為 限制本發(fā)明為所描述的具體特征或?qū)嵤┓桨浮?實(shí)施例
[0206] 實(shí)施例1
[0207] 對(duì)包含甘蔗桿狀病毒（SCBV)啟動(dòng)子的增強(qiáng)子元件的序列的鑒定
[0208] 本實(shí)施例例示了對(duì)包含SCBV啟動(dòng)子增強(qiáng)子元件的序列的鑒定。
[0209] 首先通過瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定法檢查自SCBV基因組（GenBank登錄號(hào)AJ277091，并由 Geijskes等，Arch. Virol.，147:2393-2404, 2002描述）衍生的啟動(dòng)子片段以確定該啟動(dòng) 子序列的哪些區(qū)域含有增強(qiáng)子元件序列。在啟動(dòng)子分析研究中，將自SCBV啟動(dòng)子（SEQ ID NO: 1)衍生的多個(gè)片段克隆到螢火蟲熒光素酶（LUC)報(bào)告蛋白的編碼區(qū)上游，所述各 片段含有從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（定義為+1位置）-839至+106bp (質(zhì)粒pSCBV839)、從-576至 +106bp (質(zhì)粒pSCBV576)、以及從-333至+106bp (質(zhì)粒pSCBV333)的序列。由胭脂堿合酶 (Nos) 3'UTR區(qū)的一個(gè)拷貝終止轉(zhuǎn)錄（如公開在GenBank登錄號(hào)V00087. 1(其通過提述據(jù)此 完整并入）的堿基1847-2103以及圖1中的）。通過用粒子轟擊將它們轉(zhuǎn)化到玉米Hi-II懸 浮細(xì)胞（在下面實(shí)施例2中有具體描述）中并監(jiān)測(cè)LUC報(bào)告基因的活性來測(cè)試這些構(gòu)建體 的瞬時(shí)轉(zhuǎn)錄活性。通過將等摩爾量的質(zhì)粒DNA (含有SCBV = LUC構(gòu)建體）和參照質(zhì)粒的DNA 共轉(zhuǎn)化來標(biāo)準(zhǔn)化各實(shí)驗(yàn)中的螢光素酶活性，所述參照質(zhì)粒攜帶由驅(qū)動(dòng)GUS ( β -葡糖醛酸糖 苷酶）編碼區(qū)表達(dá)的玉米泛素 I (ubil)基因啟動(dòng)子（如公開于美國專利5, 510, 474,其通過 提述完整據(jù)此并入；基本上GenBank登錄號(hào)S94464. 1的堿基7-1990,其通過提述完整據(jù)此 并入）和終止表達(dá)的玉米Per53'UTR終止子組成的構(gòu)建體（如公開于美國專利6, 699, 984， 其通過提述完整據(jù)此并入；例如構(gòu)建體ubil :GUS)。轟擊后兩天，從經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞分離總蛋 白并通過發(fā)現(xiàn)于例如（Maliga 等，Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)的方法來測(cè)量 LUC 酶活性 (表達(dá)為螢光素酶單位（LU)/mg蛋白）和⑶S酶活性（表達(dá)為⑶S活力單位（⑶)/μ g蛋 白）。通過將LUC水平對(duì)⑶S水平標(biāo)準(zhǔn)化為LU/mg蛋白：⑶/ μ g蛋白的比率，來比較三種 SCBV = LUC構(gòu)建體中測(cè)試啟動(dòng)子的相對(duì)活性。瞬時(shí)測(cè)試結(jié)果顯示LUC活性隨著轟擊的質(zhì)粒 DNA濃度的增加也線性增加，提示LUC活性與轉(zhuǎn)錄本水平相關(guān)。進(jìn)一步地，含有轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)上游-576bp至下游+106bp的序列的SCBV啟動(dòng)子片段具有全長啟動(dòng)子片段（此處定義 為含有起始位點(diǎn)上游_839bp至下游+106bp的序列）66% ±2%的活性。相比之下，含有 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游_333bp至下游+106bp的序列的SCBV啟動(dòng)子片段僅具有全長啟動(dòng)子片 段17% ±1 %的活性。因此，對(duì)應(yīng)于大部分SCBV啟動(dòng)子活性的序列位于從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 起-333bp的上游。
[0210] 檢查了 SCBV啟動(dòng)子序列的能夠增強(qiáng)異源最小啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄的部分。如 由這些實(shí)驗(yàn)限定的，增強(qiáng)子元件被操作性鑒定為短（200-300bp)的順式作用DNA序列（缺 乏TATA盒），當(dāng)在瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)化系統(tǒng)中對(duì)其進(jìn)行測(cè)試時(shí)，在將其置于異源最小啟動(dòng)子序 列的5'附近時(shí)，以可重復(fù)且可測(cè)量的方式增加異源最小啟動(dòng)子的表達(dá)活性。此外，增強(qiáng)子 元件的串聯(lián)重復(fù)比其單拷貝提供了更高的異源最小啟動(dòng)子表達(dá)活性水平。在本實(shí)施例中利 用的異源最小啟動(dòng)子元件包含玉米醇脫氫酶I(Adhl)基因啟動(dòng)子（對(duì)應(yīng)于GenBank登錄號(hào) X04049的堿基997-1202,其通過提述完整并入本文）從-100至+106的堿基。
[0211] 將兩個(gè)自SCBV啟動(dòng)子衍生的片段克隆到包含最小玉米Adhl啟動(dòng)子及與之融合的 編碼區(qū)（編碼螢火蟲螢光素酶（LUC)蛋白）的序列的5'端，所述片段包含相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始 位點(diǎn)從-503至-222bp和從-758至-222bp的序列。如上文所描述的通過Nos 3' UTR終 止嵌合基因的轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)化玉米Hi-II懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，其通過用攜帶LUC和GUS構(gòu)建體的質(zhì) 粒DNA進(jìn)行粒子轟擊，并如上文所述測(cè)量和比較酶活性。相對(duì)于沒有加入SCBV序列的最小 Adhl啟動(dòng)子，包含具有置于最小Adhl啟動(dòng)子5'端的-503至-222序列或-758至-222序 列的LUC構(gòu)建體的質(zhì)粒分別顯示出多6倍和多4倍的LUC活性。因此，在SCBV啟動(dòng)子的這 些片段中的序列增強(qiáng)了由異源玉米啟動(dòng)子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。
[0212] 通過將-502至_222bp序列的1個(gè)、2個(gè)或4個(gè)拷貝克隆到融合于LUC編碼區(qū)的最 小玉米Adhl啟動(dòng)子5'端來測(cè)試-503至-222bp SCBV增強(qiáng)子區(qū)的多拷貝增加由最小Adhl 啟動(dòng)子介導(dǎo)的表達(dá)的能力（圖3A)。將攜帶該構(gòu)建體（以及具有參照ubil:GUS構(gòu)建體的 質(zhì)粒DNA)的質(zhì)粒DNA轟擊到玉米Hi-II懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中，并如上文所述測(cè)量和比較LUC和 GUS活性。相對(duì)于用缺乏SCBV增強(qiáng)子序列的類似的最小Adhl啟動(dòng)子構(gòu)建體轟擊的細(xì)胞，用 含有SCBV增強(qiáng)子序列的1個(gè)、2個(gè)或4個(gè)拷貝的構(gòu)建體轟擊的細(xì)胞分別具有超過5倍、6倍 和10倍更多的LUC活性（圖3B)。
[0213] 包含SCBV啟動(dòng)子（如SEQ ID NO: 1中提供的）的-502至-222bp的核酸堿基編 碼轉(zhuǎn)錄活化活性，該活性賦予植物啟動(dòng)子更好的表達(dá)屬性。進(jìn)一步地，通過堆積包含SCBV 啟動(dòng)子（如SEQ ID NO: 1中提供的）的-502至-222bp的堿基的多個(gè)串聯(lián)拷貝來增加轉(zhuǎn)錄 活化活性。再進(jìn)一步地，還可以進(jìn)一步檢查和利用本文中提供的方法和試劑來提供保持轉(zhuǎn) 錄活化活性的更短的序列，或者可以在新的組合中與其它轉(zhuǎn)錄激活子元件和植物啟動(dòng)子組 合。
[0214] 實(shí)施例2
[0215] 玉米Hi-II懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中SCBV = LUC和ubl:⑶S構(gòu)建體的瞬時(shí)表達(dá)測(cè)試
[0216] 本實(shí)施例描述了玉米Hi-II懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中SCBV = LUC和ubl:⑶S構(gòu)建體的瞬時(shí) 表達(dá)測(cè)試。
[0217] 通過用按上文所描述的構(gòu)建的攜帶LUC和⑶S構(gòu)建體的質(zhì)粒DNA進(jìn) 行粒子轟擊轉(zhuǎn)化玉米Hi-II懸浮培養(yǎng)細(xì)胞（Armstrong等，]\&^666]161:.(]〇〇卩· Newslett. ,65:92-93, 1991)，并測(cè)量和比較酶活性。使用QiAfilter?質(zhì)粒Maxi試劑盒 (Qiagen, Germantown, Maryland)來大量制備質(zhì)粒DNA，并使用標(biāo)準(zhǔn)的分子方法來分析其數(shù) 量和質(zhì)量。
[0218] 用于轟擊的玉米Hi-II懸浮培養(yǎng)細(xì)朐的制各.在H9CP+培養(yǎng)某中于28°C在黑暗 中，在125rpm的振蕩器上維持Hi-II細(xì)胞（H9CP培養(yǎng)基由以下組成：MS鹽4. 3gm/L、蔗糖 3%、酪蛋白氨基酸 200mg/L、肌醇 100mg/L、2,4-D 2mg/L、NAA 2mg/L、1000X MS 維生素 ImL/ L、L-腦氨酸 700mg/L、和椰子汁（coconut water) (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) 62. 5mL/ L，pH 6.0)。在轟擊前，將2日齡的Hi-II培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到G-N6培養(yǎng)基（CHU N6培養(yǎng)基 3. 98g/L、CHU N6 維生素 lmL/L (兩種 CHU 組分都來自 PhytoTechnology Laboratories?, 1^1^^&，1?)、肌醇10011^/1、2,4-0 211^/1和蔗糖3%，？!16.0)中并允許其生長24小時(shí)。在 轟擊當(dāng)日，將G-N6生長的細(xì)胞（2. 5gm細(xì)胞）轉(zhuǎn)移到置于G-N6培養(yǎng)基（含有0. 5M D-山梨 糖醇和0. 5M D-甘露醇）上的無菌Whatman No. 1濾紙盤（55mm)，并溫育4小時(shí)。使用經(jīng)滲 透調(diào)節(jié)過的細(xì)胞進(jìn)行轟擊。
[0219] 具有質(zhì)粒DNA的金顆粒的制各和轟擊測(cè)定法.用70%乙醇清洗金顆粒（1 μ m直 徑，BioRad，Hercules，CA) 10分鐘，然后用無菌水清洗3次。將顆粒以120mg/mL的濃度分 散到50%甘油中。對(duì)于一個(gè)典型實(shí)驗(yàn)，將15(^1^(1811^)金顆粒、約5以8質(zhì)粒0嫩、15(^1^ 2. 5M CaC12、和30 μ L 0. 2M亞精胺組合起來。在室溫將反應(yīng)（總體積375 μ L)溫育10分 鐘，偶爾溫和攪動(dòng)。將DNA包被的金顆粒短暫離心、用420 μ L 70%乙醇清洗，隨后用420 μ L 100%乙醇清洗。將最終的離心沉淀重懸于110 μ L 100%乙醇中并用Branson 1450超聲 波儀進(jìn)行簡(jiǎn)單的超聲處理（3次各3秒的脈沖，每次脈沖之間為1分鐘）。將用DNA包被的 金顆粒的12. 2 μ L等分試樣散布到9個(gè)巨載體（macrocarrier) (BioRad, Hercules, CA)的 每一個(gè)上，并在使用BioRad roSlOOO/He系統(tǒng)的轟擊測(cè)定法中使用。使用3510psi盤以靶 距離9cm轉(zhuǎn)化懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，并且每個(gè)板轟擊3次。在轟擊后，將細(xì)胞在黑暗中于28°C溫 育，首先在含有D-山梨糖醇和D-甘露醇培養(yǎng)基的G-N6上溫育12小時(shí)，接著在G-N6板上 再溫育36小時(shí)。從板上收集細(xì)胞，吸干以除去緩沖液，并用300 μ L 2x CCLT LUC提取緩沖 液（Promega Corporation, Madison, WI)提取。離心后，收集約600 μ L蛋白質(zhì)提取物。使 用Bradford測(cè)定法估算蛋白質(zhì)濃度。
[0220] 測(cè)量LUC酶活性（表示為螢光素酶單位（LU)/mg蛋白）和GUS酶活性（表示為 GUS 活力單位（GU)/yg 蛋白），其通過在例如 Maliga 等（Methods in Plant Molecular Biology. A Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)中 記載的方法。通過將LUC水平對(duì)GUS水平標(biāo)準(zhǔn)化為LUC/mg蛋白：GUS/yg蛋白的比率來比 較SCBV = LUC構(gòu)建體中測(cè)試啟動(dòng)子的相對(duì)活性。
[0221] 實(shí)施例3
[0222] 用于玉米植物中激活標(biāo)簽化的質(zhì)粒
[0223] 本實(shí)施例描述了土壤桿菌超二元質(zhì)粒的生成。
[0224] 超二元系統(tǒng)是土壤桿菌穿梭載體/同源重組系統(tǒng)的一個(gè)特殊化的例子（Komari 等，Meth. Mol. Biol. 343:15-41，2006, Komari 等，Plant Physiol. 114:1155-1160, 2007 ;還 參見歐洲專利No. EP604662B1和美國專利7, 060, 876,各通過提述完整并入）。與超二元系 統(tǒng)一起采用的根癌土壤桿菌宿主菌株是LBA4404 (pSBl)。菌株LBA4404 (pSBl)攜帶兩個(gè)獨(dú) 立復(fù)制的質(zhì)粒PAL4404和pSBl。pAL4404是Ti質(zhì)粒衍生的輔助質(zhì)粒，其含有完整的vir基 因集（來自Ti質(zhì)粒pTiACH5)，但不具有T-DNA區(qū)（且因此不具有T-DNA左邊界和右邊界 重復(fù)序列）。質(zhì)粒pSBl供應(yīng)了自pTiBo542衍生的另一 vir基因部分集。在超_兀系統(tǒng)中 使用的穿梭載體的一個(gè)例子是PSB11，其含有被T-DNA右邊界和左邊界重復(fù)區(qū)側(cè)翼的克隆 多接頭，該克隆多接頭充當(dāng)預(yù)定用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因的引入位點(diǎn)。穿梭載體PSBll不 能在土壤桿菌中獨(dú)立復(fù)制,但在經(jīng)由PSBl和pSBll上存在的共有序列之間的同源重組整合 到pSBl中時(shí)作為共整合質(zhì)粒穩(wěn)定維持在土壤桿菌中。由此，通過自兩種不同的土壤桿菌Ti 質(zhì)粒來源（pTiACH5和pTiBo542)衍生的Vir蛋白有效地作用于經(jīng)修飾的pSBll載體上的 LBA4404(pSBl)中引入的完全修飾過的T-DNA區(qū)，并將其轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。已經(jīng)證明超二 元系統(tǒng)在單子葉植物物種的轉(zhuǎn)化中特別有用（參見Hiei等，Plant J. 6:271-282,1994,和 Ishida 等，Nat. Biotechnol. 14:745-750, 1996)。
[0225] 用于生成經(jīng)激活標(biāo)簽化的玉米植物的轉(zhuǎn)化質(zhì)?？梢园ㄍㄟ^超二元質(zhì)粒pSBl 和pEPP1088(具有pSBll載體骨架）之間的同源重組形成的共整合質(zhì)粒（參見歐洲專 利No. EP604662B1和美國專利7060876,各通過提述據(jù)此并入）。所述共整合質(zhì)粒被稱為 pSBl: :pEPP1088或ZeaTAG載體。pEPP1088的結(jié)構(gòu)由限制酶分析和對(duì)構(gòu)建體的選定區(qū)域 的DNA序列測(cè)定驗(yàn)證。例示pEPP1088的相關(guān)特征的結(jié)構(gòu)圖在圖3中給出。pEPP1088在 T-DNA左邊界（LB)和右序列（RB)序列（由pSBll質(zhì)粒提供）之間的位置處含有上文所描 述的-502至-222bpSCBV增強(qiáng)子序列的4個(gè)拷貝以及可選擇的標(biāo)志基因，其由以下構(gòu)成：稻 (Oryza sativa)肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子和相關(guān)的第1內(nèi)含子和5'UTR(基本如GenBank登錄 號(hào)EU155408. 1的堿基12-1411所公開的，其通過提述完整據(jù)此并入）、AAD-1除草劑耐受蛋 白的編碼序列（如美國專利申請(qǐng)No. 20090093366中公開的）、和來自玉米脂肪酶的3' UTR 終止序列（基本如GenBank登錄號(hào)gb I L35913. I lMZELIPASE的堿基921-1277和美國專利 7, 179, 902中所公開的，其通過提述完整據(jù)此并入）。
[0226] pEPP1088的T-DNA(且如存在于pSBl: :pEPP1088中的）在通過土壤桿菌介導(dǎo)的 轉(zhuǎn)化引入玉米細(xì)胞中時(shí)整合到玉米染色體中的隨機(jī)位置處。對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞的選擇由 T-DNA中的組成性表達(dá)的AADl可選擇標(biāo)志基因提供。攜帶強(qiáng)力的-502至-222bp SCBV轉(zhuǎn) 錄增強(qiáng)子激活子元件的串聯(lián)拷貝的T-DNA導(dǎo)致整合位點(diǎn)附近天然基因的異常表達(dá)，由此在 一些情況中，為從經(jīng)轉(zhuǎn)化的組織再生的植物提供了新的可鑒定的性狀。存在幫助對(duì)受體位 點(diǎn)附近受影響的基因進(jìn)行分離和鑒定的現(xiàn)代分子生物學(xué)方法，由此為分離的基因用于進(jìn)一 步開發(fā)提供了條件。
[0227] 實(shí)施例4
[0228] 土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化
[0229] 本實(shí)施例描述了土壤桿菌介導(dǎo)的玉米轉(zhuǎn)化的生成。
[0230] 未成熟胚的生成.將來自B104近交系的種子種植到含有Sunshine Custom Blend? 160 (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA)的 4 加侖罐中。使用高壓鈉和金屬齒 化物燈與16:8小時(shí)光照：黑暗光周期的組合，使植物在溫室中生長。為了獲得用于轉(zhuǎn)化的 未成熟的胚，實(shí)施受控的近緣授粉。在授粉后10-13天當(dāng)胚大小為約I. 4-2. Omm時(shí)，分離未 成熟的胚。
[0231] 感染和共培養(yǎng).通過將玉米穗浸沒到有Tween 20 (每500mL 1或2滴）的50 %商 品化漂白劑中10分鐘，并用無菌水漂洗3次對(duì)其進(jìn)行表面消毒。將在YEP固體培養(yǎng)基（含 有50mg/L壯觀霉素、lOmg/L利福平、和50mg/L鏈霉素）上于28°C生長3天或于25°C生長4 天的細(xì)菌取1或2個(gè)菌環(huán)轉(zhuǎn)移到含有100 μ M乙酰丁香酮的5mL液體感染培養(yǎng)基（MS鹽、ISU 修改的MS維生素、3. 3mg/L麥草畏、68. 4gm/L鹿糖、36gm/L葡萄糖、700mg/L L-脯氨酸，pH 5.2)中，來制備含有超二元載體共整合質(zhì)粒的土壤桿菌細(xì)胞的懸浮液。使用無菌5mL移液 管溫和地吹打該溶液，直到得到均勻的懸浮液，并將濃度調(diào)節(jié)到使用Ultrospec 10細(xì)胞密 度儀（GE Healthcare/Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)在 600nm 處（0D600)測(cè)量 的光密度為〇. 3-0. 5。將未成熟的胚直接分離到含有2mL感染培養(yǎng)基的微離心管中。除 去培養(yǎng)基并用l_2mL新鮮的感染培養(yǎng)基替換2次，然后將其除去并用I. 5mL 土壤桿菌溶 液替換。將土壤桿菌和胚溶液在室溫溫育5分鐘并轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含 有MS鹽、ISU修改的MS維生素、3. 3mg/L麥草畏、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、IOOmg/ L肌醇、100mg/L酪蛋白酶促水解產(chǎn)物、15mg/L AgN03、100yM乙酰丁香酮、和2. 3-3gm/L Gelzan?(Sigma-Aldrich，St. Louis, MO)，pH 5. 8。共培養(yǎng)溫育在黑暗下或在24小時(shí)白熒光 光照條件（約50 μ EnT2s-1)下于25°C進(jìn)行3-4天。
[0232] 靜息和選擇.共培養(yǎng)后，將胚轉(zhuǎn)移到無選擇的基于MS的靜息培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基 含有MS鹽、ISU修改的MS維生素、3. 3mg/L麥草畏、30gm/L蔗糖、700mg/L L-脯氨酸、IOOmg/ L肌醇、100mg/L酪蛋白酶促水解產(chǎn)物、15mg/LAgN03、0. 5gm/L MES(2-(N-嗎啉）乙磺酸一 水合物(ethanesulfonic acid monohydrate) ；PhytoTechnologies Labr. , Lenexa, KS) > 250mg/L羧芐青霉素、和2.3gm/L GelzanTM，pH 5.8。溫育在黑暗下或在24小時(shí)的白熒光光 照條件（約50 μ EnT2iT1)下于28°C進(jìn)行7天。在7日靜息期后，將胚轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。 為了選出經(jīng)超二元質(zhì)粒（含有植物可表達(dá)的AADl可選擇標(biāo)志基因）轉(zhuǎn)化的玉米組織，使用 補(bǔ)充有氟吡氯禾靈（Haloxyfop)的基于MS的靜息培養(yǎng)基（如上）。將胚首先轉(zhuǎn)移到含有 IOOnM氟吡氯禾靈的選擇培養(yǎng)基中并溫育1-2周，然后轉(zhuǎn)移到含有500nM氟吡氯禾靈的選擇 培養(yǎng)基中并再溫育2-4周。經(jīng)過在黑暗下或在24小時(shí)白熒光光照條件下（約50 μ EnT2iT1) 于28°C約5-8周的過程，獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的分離株。通過將回收的分離株每隔1-2周轉(zhuǎn)移到新 鮮的選擇培養(yǎng)基中使其壯大，以用于再生和進(jìn)一步分析。
[0233] 玉米轉(zhuǎn)化領(lǐng)域中的技術(shù)人員會(huì)理解當(dāng)使用其它的植物可表達(dá)的、可選擇的標(biāo)志基 因（例如除草劑耐受基因）時(shí)有其它選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的方法可供使用。
[0234] 預(yù)再生.在選擇過程后，將暴露于24小時(shí)光照方案的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到基于MS的預(yù) 再生培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有MS鹽、ISU修改的MS維生素、45gm/L蔗糖、350mg/L L-脯氨 酸、100mg/L 肌醇、50mg/L 酪蛋白酶促水解產(chǎn)物、lmg/L AgN03、0. 25gm/L MES、0. 5mg/L 萘 乙酸、2.5mg/L脫落酸、lmg/L 6-節(jié)氨基噪呤、250mg/L羧節(jié)青霉素、2.5gm/L Gelzan?、和 500nM氟吡氯禾靈，pH 5. 8。在24小時(shí)白熒光光照條件（約50 μ EnT2s-1)下于28°C持續(xù)溫 育7天。
[0235] 再生和小植株分離.為了再生，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到基于MS的第一再生培養(yǎng)基中，該 培養(yǎng)基含有MS鹽、ISU修改的MS維生素、60gm/L蔗糖、100mg/L肌醇、125mg/L羧芐青霉素、 2. 5gm/L Gelzan?、和500nM氟吡氯禾靈，pH 5. 8。在黑暗下或在24小時(shí)白熒光光照條件 (約δΟμΕπΓ2^)下于28°C 2周后，將組織轉(zhuǎn)移到基于MS的第二再生培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基 由以下構(gòu)成：MS鹽、ISU修改的MS維生素、30gm/L鹿糖、100mg/L肌醇、3gm/L Gelzan?, pH 5. 8(有或無500nM氟吡氯禾靈）。再生/選擇在16小時(shí)或24小時(shí)白熒光光照條件（約 50 μ EnT2iT1)下于28°C持續(xù)2周。當(dāng)小植株長度達(dá)到3-5cm時(shí)，將它們切下并轉(zhuǎn)移到第二再 生培養(yǎng)基（如上，但無氟吡氯禾靈）中，并在16小時(shí)白熒光光照條件（約δΟμΕπΓ2^)下于 25°C溫育以允許芽和根的進(jìn)一步生長和發(fā)育。
[0236] 種子生成.將植物移植到Metro-Mix? 360無土生長培養(yǎng)基（Sun Gro Horticulture)中并在生長室中使其長壯（harden off)。然后將植物移植到Sunshine Custom Blend 160 土壤混合物中并在溫室中生長至開花。進(jìn)行受控的授粉以用于種子生 成。
[0237] 實(shí)施例5
[0238] 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的玉米細(xì)胞中的SCBV增強(qiáng)子活性
[0239] 從自經(jīng)轉(zhuǎn)化的B104未成熟胚再生的10株Ttl植物分離出基因組DNA (Qiagen DNeasy植物Mini試劑盒；Qiagen, Germantown, Maryland),并通過反向PCR克隆和對(duì) 由反向PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序來測(cè)定整合的T-DNA (從pSBI: : pEPP 1088轉(zhuǎn)移） 的基因組位置。通過使用側(cè)翼序列作為查詢序列的BLAST搜索（Altschul等，J.Mol. Biol.，215:403-410,和 Karlin 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990)，確定 位于4xSCBV增強(qiáng)子的IOkb內(nèi)的側(cè)翼編碼區(qū)所代表的基因的身份。對(duì)BLAST結(jié)果的分析揭 示，T-DNA(因此4XSCBV增強(qiáng)子亦然）在10個(gè)系的每一個(gè)中都被整合到不同的基因組位置， 且因此4XSCBV增強(qiáng)子在每個(gè)系中都被不同的基因側(cè)翼（表1)。
[0240] 從10個(gè)Ttl系的葉組織中分離出總RNA (Qiagen RNeasy植物Mini試劑 盒，Qiagen, Germantown, Maryland)。通過使用針對(duì)側(cè)翼于4XSCBV增強(qiáng)子的相關(guān)基因的特 異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和RT-PCR(實(shí)時(shí)PCR)，在合適的T tl植物和未經(jīng)轉(zhuǎn)化的對(duì)照植物之間比 較鑒定的側(cè)翼基因的轉(zhuǎn)錄本累積。作為對(duì)照，還測(cè)定了內(nèi)源GAPDH基因的轉(zhuǎn)錄本累積。
[0241] RT-PCR產(chǎn)物揭示這些系中來源于3個(gè)不同的側(cè)翼基因的轉(zhuǎn)錄本的累積增加了。 4XSCBV增強(qiáng)子在2個(gè)Ttl系中位于受影響的側(cè)翼基因的上游2. 6kb和2. 8kb，在第3個(gè)Ttl 系中位于受影響的側(cè)翼基因的下游478bp。由此，這些結(jié)果指示由T-DNA投遞的4XSCBV 增強(qiáng)子導(dǎo)致整合位點(diǎn)附近基因轉(zhuǎn)錄本的不依賴于鏈的、增加的累積（strand-independent increased accumulation)。表1指示了鑒定出的側(cè)翼基因和對(duì)其轉(zhuǎn)錄水平的分析結(jié)果。
[0242] 表I. 4XSCBV增強(qiáng)子對(duì)10株TO植物中側(cè)翼基因的RNA累積的影響。
[0243]
【權(quán)利要求】
1. 一種嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，包含： 顯示在SEQ ID NO: 1的位置337至位置618中的甘蔗桿狀病毒（SCBV)增強(qiáng)子元件或 其同源物的一個(gè)或多個(gè)拷貝；和 與其可操作地連接的、從植物種子特異性基因的上游區(qū)獲得的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包 含RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)和mRNA啟動(dòng)位點(diǎn)， 其中當(dāng)在所述嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)性控制下轉(zhuǎn)錄目的核苷酸序列時(shí)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量 相比于用包含所述啟動(dòng)子但不包含所述SCBV增強(qiáng)子序列的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)所獲得的轉(zhuǎn)錄 廣物的量提1?。
2. 權(quán)利要求1的啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子是從Lesquerella fendleri 3-酮脂酰輔酶A 種子特異性基因的上游區(qū)獲得的。
3. 權(quán)利要求1的核苷酸序列，其中該核苷酸序列為脂肪酸修飾性核苷酸序列。
4. 權(quán)利要求3的脂肪酸修飾性核苷酸序列，其由構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans)酰 基輔酶A A 9去飽和酶核苷酸序列組成。
5. -種構(gòu)建體，其包含：權(quán)利要求1的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，所述轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)可操作地連接 于可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子，所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子可操作地連接于3'轉(zhuǎn)錄終止多核苷 酸分子。
6. 權(quán)利要求5的構(gòu)建體，其中所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子對(duì)其中表達(dá)所述多核苷酸分 子的植物賦予農(nóng)藝性狀。
7. 權(quán)利要求5的構(gòu)建體，其中所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子對(duì)其中表達(dá)該多核苷酸分子 的植物賦予增值性狀或油脂修飾性狀。
8. 用權(quán)利要求5的構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。
9. 權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子對(duì)其中表達(dá)該多核苷酸 分子的植物賦予農(nóng)藝性狀。
10. 權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述可轉(zhuǎn)錄的多核苷酸分子對(duì)所述植物賦予增值 性狀或油脂修飾性狀。
11. 權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中所述種子包含權(quán)利要求5的構(gòu)建體。
12. 權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物，該植物是擬南芥（Arabidopsis Thaliana)植物。
13. 包含權(quán)利要求1的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
14. 一種生成轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括用權(quán)利要求5的構(gòu)建體來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織。
15. 權(quán)利要求14的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是雙子葉植物。
16. 權(quán)利要求14的方法，其中所述轉(zhuǎn)基因植物是單子葉植物。
17. 用權(quán)利要求5的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織。
18. 權(quán)利要求17的植物細(xì)胞或組織，其中所述植物細(xì)胞或組織來自雙子葉植物。
19. 權(quán)利要求17的植物細(xì)胞或組織，其中所述植物細(xì)胞或組織來源于單子葉植物。
20. 可以從權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物獲得的植物細(xì)胞、果實(shí)、葉、根、芽、花、種子、插條、 和其它可用在有性或無性繁殖中的繁殖材料、包括F1雜交種的后代植物、雄性不育植物和 所有其它植物及植物產(chǎn)物。
21. -種擬南芥植物細(xì)胞、組織或植物，其包含顯示于SEQ ID NO: 1的位置337至位置 618中的甘蔗桿狀病毒（SCBV)增強(qiáng)子元件或其同源物的4個(gè)拷貝，其中所述SCBV增強(qiáng)子元 件的4個(gè)拷貝插入到所述擬南芥植物細(xì)胞、組織或植物的基因組中。
22. 權(quán)利要求21的擬南芥植物細(xì)胞、組織或植物，其中所述SCBV增強(qiáng)子元件對(duì)在該 SCBV增強(qiáng)子調(diào)節(jié)性控制下的目的核苷酸序列賦予增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄，所述增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄是與不存在 SCBV增強(qiáng)子時(shí)該目的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄相比而言的。
23. -種增強(qiáng)目的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的方法，包括： 將包含SEQ ID NO: 2的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到擬南芥植物的基因組中；和 在所述植物的種子中表達(dá)所述DNA構(gòu)建體，從而在該種子中產(chǎn)生修飾的脂肪酸譜。
24. 權(quán)利要求23的方法，其中所述修飾的脂肪酸譜包括飽和脂肪酸百分比的降低。
25. 權(quán)利要求23的方法，其中所述DNA構(gòu)建體包含SCBV增強(qiáng)子元件的4個(gè)拷貝、從 Lesquerella fendleri 3-酮脂酰輔酶A種子特異性基因的上游區(qū)獲得的啟動(dòng)子、構(gòu)巢曲 霉?；o酶A A 9去飽和酶核苷酸序列、和根癌土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)開 放閱讀框233'非翻譯區(qū)。
26. 權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)化方法，其中轉(zhuǎn)化包括根癌土壤桿菌介導(dǎo)的花序浸漬。
27. 權(quán)利要求23的表達(dá)方法，其中表達(dá)包括種子特異性表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104411827SQ201380021781
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】P·A·歐文斯默洛, C·拉森, S·A·貝文, J·P·戴維斯, V·S·雷迪, W·M·安利, M·A·湯普森 申請(qǐng)人:陶氏益農(nóng)公司