棉花PHYA1 RNAi改善陸地棉的纖維品質(zhì)、根伸長(zhǎng)、開花、成熟和產(chǎn)量潛力的制作方法
【專利摘要】改善陸地栽培品種(陸地棉)的纖維品質(zhì)同時(shí)保持早成熟和產(chǎn)量是常規(guī)的棉花育種的主要問(wèn)題。光敏色素在植物發(fā)育、開花和棉花纖維長(zhǎng)度中起重要的作用。靶向棉花的PHYA1基因的RNAi抑制PHYA1和/或PHYB的表達(dá)，導(dǎo)致剩余PHYA2/B/C/E基因的過(guò)表達(dá)。該改變的表達(dá)誘導(dǎo)許多光敏色素相關(guān)的表型，包括與對(duì)照植株相比，增加的根長(zhǎng)度和質(zhì)量、增加的花青素色素、旺盛的芽發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、早開花、棉鈴早成熟、增加的纖維長(zhǎng)度和增加的籽棉產(chǎn)量。這些RNAi表型穩(wěn)定遺傳，貫穿四代(T0-3)表達(dá)并且經(jīng)常規(guī)的雜交從RNAi Coker-312植株轉(zhuǎn)移至陸地栽培品種。陸地棉花育種中的這些作用可提供棉花育種的新典范，導(dǎo)致開發(fā)出具有增加的纖維長(zhǎng)度和纖維強(qiáng)度的多產(chǎn)的、早成熟陸地栽培品種。
【專利說(shuō)明】棉花PHYA1 RNAi改善陸地棉的纖維品質(zhì)、根伸長(zhǎng)、開花、成 熟和產(chǎn)量潛力
[0001] 發(fā)明背景

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002] 本發(fā)明涉及陸地棉植物中光敏色素基因調(diào)節(jié)開花、纖維起始和伸長(zhǎng)以及受光形態(tài) 發(fā)生改變影響的其他特征；包含多核苷酸編碼光敏色素 Al蛋白質(zhì)的PHYAl基因沉默構(gòu)建 體，包含PHYAl RNAi多核苷酸的轉(zhuǎn)基因棉花植株和使用光敏色素 PHYAl基因的RNA干擾產(chǎn) 生新型轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述新型轉(zhuǎn)基因植物由于PHYAl的抑制和其他光敏色素基因表 達(dá)的數(shù)倍增加，展示改善的棉花纖維品質(zhì)、早開花和早棉鈴成熟，增強(qiáng)的根伸長(zhǎng)和增加的籽 棉產(chǎn)量?！颈尘凹夹g(shù)】
[0003] 光是控制植物發(fā)育和生理學(xué)的最重要環(huán)境因素。其本質(zhì)上影響植物生長(zhǎng)的所 有方面，從種子萌發(fā)到植物形態(tài)、花芽發(fā)生、生理節(jié)奏的控制、基因調(diào)節(jié)和表達(dá)、向重力性 和向光性（Fankhauser 和 Chory. 1997. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 13:203-229 ;Furuya 和 Kim. 2000. Trends in Plant Sci. 3:87-88 ;Tepperman 等 2001. Proc. Natl. Acad. Sci.美 國(guó)98(16) :9437-9442)。植物通過(guò)數(shù)種光感受器系統(tǒng)對(duì)光作出反應(yīng)。光敏色素光感受器 基因家族的最佳表征為模式植物擬南芥屬，其具有五個(gè)光敏色素基因 PHYA、PHYB、PHYC、 PHYD 和 PHYE(Sharrock 和 Quail. 1989. Genes Dev. 3:1745-1757 ;Clack 等 1994.Plant Mol. Biol. 25:413-427 ;Cowl 等 1994. Plant Physiol. 106:813-814)。光敏色素與隱花色 素、生物鐘、植物激素和其他信號(hào)相互作用，調(diào)節(jié)花芽發(fā)生（Devlin等1998. Plant Cell 10:1479-1487 ;Devlin 等 1999.Plant Physiol. 119:909-915 ;Koornneef 等 1997.Plant Cell&Environ. 20:779-784 ;Koornneef 等 1998.Ann.Rev. Plant Physiol.Plant Mol. Biol. 49:345-370)。在擬南芥屬中，PHYA促進(jìn)植物開花。該基因中的突變?cè)斐蓴M南芥屬中 的晚開花表型（Neff和Chory. 1998. Plant Physiol. 118:27-35)。相反，PHYB是開花誘導(dǎo)的 抑制因子（Koornneef 等 1998,前文；Reed 等 2000. Plant Physiol. 122:1149-1160)。PHYB 的突變?cè)斐蓴M南芥屬（Bagnall 等 1995. Plant Physiol. 108:1495-1503)、豌豆（Mockler 等 1999. Dev. 106:2073-2082)和高粱（Childs 等 1997. Plant Physiol. 97:714-719)在短日 照（SD)和長(zhǎng)日照（LD)條件下都早開花。過(guò)表達(dá)PHYA、對(duì)光周期低敏感的植物在SD和LD 下都表現(xiàn)出光依賴性矮小、暗綠色葉子、頂端優(yōu)勢(shì)降低和早開花表型（Bagnall等，前文）。 PHYB/D/E 過(guò)表達(dá)與下胚軸長(zhǎng)度的變短（Clough 等 1995. Plant Physiol. 109:1039-1045 ; Devlin 等 1999,前文；Devlin 等 1998,前文；Lin，C. 2000. Plant Physiol. 1239:39-50) 以及如在例如Phyb突變體中觀察到的早開花表型相關(guān)，表明PHYB更復(fù)雜的作用機(jī)制 (Bagnall等，前文；Lin,前文）。在擬南芥屬的花期PHYC也促進(jìn)光周期開花和天然表型變異 (Franklin 等 2003. Plant Cell 15:1981-1989 ;Monte 等 2003. Plant Celll5:1962-1980; Balasubramanian等2006. Nat. Genet. 38:711-715)。另外，光敏色素基因調(diào)節(jié)植物營(yíng)養(yǎng)生 長(zhǎng)參數(shù)諸如高度、葉和蓮座叢產(chǎn)量（Bagnall等，前文）。
[0004] 在栽培的棉花中，光敏色素基因家族具有額外的重要性，因?yàn)橛凶C據(jù)顯示遠(yuǎn) 紅/紅（FR/R)光子比影響正在發(fā)育的纖維的長(zhǎng)度和直徑。例如，暴露于高遠(yuǎn)紅/紅光 子比的棉花纖維比暴露于提高的光合作用光的棉花纖維更長(zhǎng)（Kasperbauer，M. J. 1994. Physiol.Plantarum 91:317-321 ;Kasperbauer.M.J.2000. Crop Sci.40:1673_1678)。纖 維產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，即，纖維長(zhǎng)度和纖維強(qiáng)度的遺傳改良是世界上棉花育種計(jì)劃的主要目 標(biāo)(Perkins 等 1984.In:Cotton Agron. Monogr. Kohel and Lewis, Eds. , ASA, CSSA, and SSSA，Madison，WI，437-509頁(yè)）。因?yàn)榧徔椆I(yè)的技術(shù)改變，纖維品質(zhì)已經(jīng)成為最近幾年的 主要問(wèn)題（Perkins 等，前文；El-Mogahzy and Chewning. 2001. In:Cotton Fiber to Yarn Manufacturing. Cotton Incorporated, Cary, NC) 〇 皮馬（Gossypium barbadens)棉花纖維 比廣泛生長(zhǎng)的、早成熟的和高產(chǎn)量的陸地棉（Gossypium hirsutum)細(xì)、遺傳更強(qiáng)并且更均 一（El-Mogahzy和Chewning,前文）。找到容易的方法來(lái)改善陸地栽培品種的纖維性質(zhì)同 時(shí)保持產(chǎn)量和早成熟是世界上常規(guī)棉花育種中要解決的基本問(wèn)題。
[0005] 因此，需要開發(fā)改良的栽培棉花植株，其產(chǎn)生高產(chǎn)量的顯示改良的纖維長(zhǎng)度和纖 維強(qiáng)度的優(yōu)質(zhì)棉花纖維。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)棉花PHYAl基因的RNA干擾導(dǎo)致靶PHYAl基因的抑制以及也導(dǎo)致其 他光敏色素基因的表達(dá)數(shù)倍增加；棉花光敏色素基因家族表達(dá)譜的這種改變導(dǎo)致植物結(jié)構(gòu) 改變，包括葉柄、果枝、棉鈴花梗和根系伸長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛、早開花和棉鈴早成熟、莖葉中 增強(qiáng)衰老的花青素色素沉積、纖維品質(zhì)（長(zhǎng)度、強(qiáng)度、馬克隆值等）和纖維產(chǎn)量表型提高；并 且這些改變?cè)诤蟠蟹€(wěn)定表達(dá)并且通過(guò)基因雜交和選擇可從轉(zhuǎn)化的Coker 312基因型轉(zhuǎn) 移至陸地栽培品種。
[0007] 根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的目的是提供針對(duì)棉花中的PHYAl基因的有效的內(nèi)源基因沉 默的策略，以便改變棉屬植物的光形態(tài)發(fā)生。
[0008] 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供新的分離的或重組的多核苷酸分子，其包括編碼陸地 棉的PHYAl多肽的一部分鉸鏈區(qū)的DNA序列。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供分離的或重組的多核苷酸分子，其包括編碼PHYAl多肽 的一部分鉸鏈區(qū)包括213個(gè)堿基對(duì)連續(xù)核苷酸分子的DNA序列。
[0010] 本發(fā)明的另外目的是提供編碼PHYAl多核苷酸基因序列的發(fā)夾核酸構(gòu)建體，其包 括棉屬PHYAl基因鉸鏈區(qū)的213個(gè)連續(xù)的有義核苷酸部分（SEQ ID NO: 1)和其反義-互 補(bǔ)物，使得當(dāng)?shù)谝缓偷诙嗪塑账嵝蛄修D(zhuǎn)錄成核糖核酸時(shí)雜交以形成發(fā)夾樣雙鏈核苷酸分 子。
[0011] 本發(fā)明的另外目的是提供用于降低棉花植株中光敏色素 Al水平的方法，該方法 包括在植株中表達(dá)編碼PHYAl基因序列的異源核酸構(gòu)建體，該異源核酸構(gòu)建體包括棉屬 PHYAl基因的213bp連續(xù)的有義核苷酸部分和其反義-互補(bǔ)物，其中該表達(dá)誘導(dǎo)植株中的 RNA干擾（RNAi)產(chǎn)生這樣的植物，相對(duì)于正常陽(yáng)光下的野生型棉花植株，其葉柄、果枝、棉 鈴花梗和根系伸長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛、早開花和棉鈴早成熟、莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉 積、纖維品質(zhì)（長(zhǎng)度、強(qiáng)度、馬克隆值、均一性等）和纖維產(chǎn)量表型提高。
[0012] 本發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供用于修飾或抑制陸地棉種細(xì)胞中PHYAl基因表達(dá)的 方法，該方法包括：用包括可操作地連接至啟動(dòng)子的編碼dsRNA的核酸序列和轉(zhuǎn)錄終止序 列的載體轉(zhuǎn)化植株；選擇已經(jīng)將核酸序列整合進(jìn)入它們的基因組中的轉(zhuǎn)化植株；篩選表達(dá) 該核酸序列編碼的dsRNA的轉(zhuǎn)化植株；和選擇表達(dá)該dsRNA和/或siRNA的植株。
[0013] 本發(fā)明的另一目的是提供包括雙元載體、PHYAl RNAi構(gòu)建體的重組核苷酸序列， 其中PHYAl RNAi構(gòu)建體包括來(lái)自PHYAl基因鉸鏈區(qū)的213bp核苷酸序列，其中花椰菜花葉 病毒（CaMV)的35S啟動(dòng)子存在于靠近PHYAl發(fā)夾的上游核苷酸序列中，每個(gè)構(gòu)建體由農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的接種遞送，產(chǎn)生體外重組和PHYAl基因的抑制和其他光敏色素的表達(dá)水平的改 變。
[0014] 本發(fā)明的另一目的是提供包括PHYAl RNAi雙元載體構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。
[0015] 本發(fā)明的另外目的是提供用于生產(chǎn)其中棉花PHYAl基因被抑制的轉(zhuǎn)基因棉花植 株的方法，該方法包括：(a)用本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化宿主棉花植株細(xì)胞， (b)從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的宿主棉花植株細(xì)胞體細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植株；和（c)使所述轉(zhuǎn)基因植株在 借以所述植株顯示改變的光敏形態(tài)發(fā)生特征的條件下生長(zhǎng)，所述改變的光敏形態(tài)發(fā)生特征 包括與野生型非轉(zhuǎn)化的棉花植株相比改變的植株株型，包括更長(zhǎng)的葉柄、果枝和棉鈴花梗， 增強(qiáng)伸長(zhǎng)的根系，旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，早開花和棉鈴早成熟，莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉 淀。
[0016] 本發(fā)明的另外目的是提供通過(guò)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的包括本發(fā)明PHYAlRNAi構(gòu)建 體的轉(zhuǎn)基因棉花植株或其子代，所述植物顯示光敏形態(tài)發(fā)生特征的改變表達(dá)，包括與野生 型非轉(zhuǎn)化的棉花植株相比，植株株型變化，果枝和棉鈴花梗更長(zhǎng)、根系延伸增強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng) 旺盛、早開花和棉鈴早成熟、莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉淀。
[0017] 本發(fā)明的另外目的是提供包括本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明的另外目的是提供包括本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因棉花植株，其 中轉(zhuǎn)基因植株相對(duì)于野生型棉花植株顯示棉花纖維的長(zhǎng)度和強(qiáng)度增加以及馬克隆值、伸長(zhǎng) 率和纖維均勻性改善。
[0019] 本發(fā)明的另外目的是提供上述包括本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物的 轉(zhuǎn)基因種子。
[0020] 本發(fā)明的另一目的是提供已經(jīng)由本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的植株、植物細(xì) 胞和植物部分以及植物種子。
[0021] 本發(fā)明的另一目的是提供一種誘導(dǎo)棉花植株相對(duì)于野生型棉花植株優(yōu)良的纖維 品質(zhì)的方法；所述優(yōu)良的纖維品質(zhì)包括長(zhǎng)度和強(qiáng)度增加，馬克隆值、伸長(zhǎng)率和纖維均勻性改 善，籽棉產(chǎn)量增加；該方法包括抑制PHYAl基因。
[0022] 本發(fā)明的另一目的是提供一種啟動(dòng)棉花植株相對(duì)于野生型棉花植株早開花和棉 鈴早成熟的方法，該方法包括抑制PHYAl基因。
[0023] 本發(fā)明的另外目的是提供增強(qiáng)棉花植株相對(duì)于野生型棉花植株根發(fā)育的方法，該 方法包括抑制PHYAl基因。
[0024] 本發(fā)明的另外目的是提供增強(qiáng)棉花植株相對(duì)于野生型棉花植株旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、 莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉淀和葉柄、果枝和棉鈴花梗伸長(zhǎng)的方法，該方法包括抑制 PHYAl基因。
[0025] 本發(fā)明的另外目的是提供通過(guò)改變本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體的拷貝數(shù)以增強(qiáng) 抑制而改變植物特征的方法。
[0026] 本發(fā)明的另外目的是提供通過(guò)改變本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體的拷貝數(shù)以增強(qiáng) PHYB/C/E基因的表達(dá)而改變植物特征的方法。
[0027] 本發(fā)明的另外目的是提供包括本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞，其 中由所述細(xì)胞再生的轉(zhuǎn)基因植物顯示PHYAl基因的抑制和PHYB/C/E基因的過(guò)表達(dá)，由此產(chǎn) 生的植物相對(duì)于野生型棉花植株顯示植株株型改變，包括葉柄和果枝更長(zhǎng)、根系延伸增加、 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛、早開花和棉鈴早成熟、莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉淀、優(yōu)良的纖維品質(zhì) 以及籽棉產(chǎn)量增加，所述優(yōu)良的纖維品質(zhì)包括長(zhǎng)度和強(qiáng)度增加和馬克隆值、伸長(zhǎng)率和纖維 均勻性改善。
[0028] 由下面的說(shuō)明書本發(fā)明的其他目的和優(yōu)勢(shì)將更顯而易見。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0029] 專利或?qū)＠暾?qǐng)文件包含至少一副彩色圖。當(dāng)請(qǐng)求并且支付必要費(fèi)用后，該專利 或?qū)＠暾?qǐng)公布的附圖以及彩色附圖將由美國(guó)專利和商標(biāo)局提供。
[0030] 圖1A-1C描繪PHYAl RNAi在棉花中的作用：圖IA是PHYA基因、RNAi片段位置和 pHellsgate-8: :PHYA1 RNAi質(zhì)粒的示意性表示；圖IB描繪芽和根發(fā)育；圖IC描繪組織培 養(yǎng)中體細(xì)胞再生的Ttl-代PHYAl RNAi和對(duì)照棉花植株的纖維長(zhǎng)度特征。
[0031] 圖2A-2D顯示與對(duì)照相比PHYAl RNAi植株物中光敏色素相關(guān)的發(fā)育變化：圖2A 顯示與同一天種植的對(duì)照植株相比經(jīng)體細(xì)胞胚發(fā)生再生的TtlRNAi植株中營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)增強(qiáng)以 及早開花。圖2C顯示與相同環(huán)境下同一天種植的對(duì)照植株（圖2B)相比，T 1代RNAi植株 的早開花。圖2D顯示與Coker-312對(duì)照相比，葉柄長(zhǎng)度（Ttl)的不同，圖2E顯示根發(fā)育（T 3) 的不同。
[0032] 圖3描繪來(lái)自T1代RNAi棉花植株的纖維的纖維長(zhǎng)度。綠條是3株個(gè)體Coker-312 植物（標(biāo)記為K-312)的纖維長(zhǎng)度指數(shù)；琥珀色條是來(lái)自單株Tl代RNAi植株的纖維長(zhǎng)度指 數(shù)；黃色條是皮馬棉的纖維長(zhǎng)度指數(shù)。對(duì)照和RNAi Coker-312植物在相同的溫室環(huán)境下生 長(zhǎng)。
[0033] 圖 4A-4D 顯不在源自 RNAi Coker 312 和 AN-Boyovut-2 (Uzbek variety)栽培品 種之間雜交的RNAi系中光敏色素相關(guān)的RNAi作用：圖4A顯示田間中生長(zhǎng)的植物衰老相關(guān) 的花青素色素沉積；圖4B和4D顯示葉盤和棉花棉鈴中的花青素積聚以及葉柄和棉鈴花梗 的伸長(zhǎng)；圖4C顯示使用本發(fā)明開發(fā)的RNAi系的從生型（bush type)和產(chǎn)量。
[0034] 圖5顯示與在相同條件下生長(zhǎng)的對(duì)照相比，Coker-312的第二代RNAi植株中主要 纖維品質(zhì)性狀變化的一般性趨勢(shì)。
[0035] 圖6A-6H描繪與相同環(huán)境和條件下生長(zhǎng)的對(duì)照棉花植株相比，選擇的T2-代PHYAl RNAi植株家族〇1 2-1_7和T2-31_10)的平均表型特征的柱狀圖：圖6A描繪上半部平均 (UHM);圖6B，馬克隆值（MIC);圖6C，纖維強(qiáng)度（STR);圖6D，纖維均勻性；圖6E，纖維伸長(zhǎng) (ELO);圖6F，平均下胚軸長(zhǎng)度；圖6G，2009年7月15日花的平均數(shù)；圖6H，2009年9月15 日開放棉鈴的平均數(shù)。在威氏配對(duì)符號(hào)秩次檢驗(yàn)中RNAi基因型和對(duì)照之間測(cè)量的性狀的 統(tǒng)計(jì)顯著性在P彡0. 05下用字母"a"、"b"和"c"定義。
[0036] 圖7A描繪與相同環(huán)境和條件下生長(zhǎng)的對(duì)照棉花植株相比，選擇的T3-代PHYAl RNAi植株家族（T 3-l_7和T3-31_10)的纖維長(zhǎng)度特征，圖7C和7D描繪與相同環(huán)境和條件 下生長(zhǎng)的對(duì)照棉花植株相比，選擇的T3-代PHYAl RNAi植株家族（τ3-1_7和τ3-31_10)的 根發(fā)育特征。這些選擇的植物的PCR-確認(rèn)顯示在圖7B中：M-IOObp Ladder，1-Τ3-1_7; 2-T3-31_10 ;3 - Coker 312 ;4-pHellsgate-8: :PHYA1 質(zhì)粒；5-無(wú) DNA 模板對(duì)照。這些植株 用于利用qPCR的拷貝數(shù)鑒定和相對(duì)表達(dá)分析。
[0037] 圖8A和8B顯示2009年實(shí)驗(yàn)管理的田間測(cè)試中田間生長(zhǎng)的T3RNAi和對(duì)照植株之 間營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的差異（圖8A)。從RNAi Coker-312到陸地栽培品種（AN-Boyovut-2)的光敏 色素相關(guān)的RNAi作用的可轉(zhuǎn)移性顯示在圖8A和8B中。圖8C比較在相同環(huán)境下生長(zhǎng)的原 始栽培品種（左）和RNAi F2雜種（右）之間的纖維樣品的改善。
[0038] 圖9顯示與在相同條件下生長(zhǎng)的對(duì)照相比，第二代 AN-Boyovut-2XRNAiCoker-312雜種中主要纖維品質(zhì)性狀變化的一般性趨勢(shì)。
[0039] 發(fā)明詳述
[0040] 本發(fā)明涉及光敏色素基因在棉花中調(diào)節(jié)特定表型性狀的作用?；谖覀冏畛踉?繪制纖維長(zhǎng)度隔離雙親群體中光敏色素基因圖譜上的努力表明PHYAl基因多態(tài)性與纖維 長(zhǎng)度數(shù)量性狀基因座（QTL)的顯著相關(guān)（Abdurakhmonov 2001，前文）的發(fā)現(xiàn)，我們已經(jīng) 假設(shè)光敏色素基因在調(diào)節(jié)棉花纖維伸長(zhǎng)中具有作用（Abdurakhmonov, I. Y. 2001. Thesis. Texas A&M University,美國(guó)）。使用被子植物，尤其，系統(tǒng)發(fā)生學(xué)上密切相關(guān)的真雙子葉 植物（屬于菊類植物（Asteroids)類和薔薇類植物（rosids)類）諸如擬南芥、西紅柿、馬 鈴薯、柑桔、蘿卜、胡蘿卜和其他蔬菜、水果、油料和草料作物的光敏色素基因鉸鏈區(qū)的保守 序列，我們成功克隆并測(cè)序了植物光敏色素基因家族的棉花直系同源基因 （Abdurakhmonov 2001，前文；Abdurakhmonov 2010,前文）。我們最近已經(jīng)報(bào)道了對(duì)棉花中光敏色素基因家 族的分子-進(jìn)化特征的研究（Abdurakhmonov等2010. BMC Plant Biol. 10:119)。其他人已 經(jīng)顯示RNA-誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)是用于研究包括植物的數(shù)種有機(jī)體中基因功能的成功手 段（Waterhouse和 Helliwell. 2003. Nature Reviews Genetics 4:29-38 ;Wesley 等 200L Plant Journal 27:581-590 ;Helliwell 等 2002. Funct. Plant Biol. 29:1217-1225)。
[0041] 我們已經(jīng)研究了棉花植株中通過(guò)光敏色素基因 RNA干擾的基因-沉默的作 用。尤其，根據(jù)之前研究的纖維性狀之間的遺傳相關(guān)性，我們已經(jīng)研究了 RNAi對(duì)產(chǎn)生更 長(zhǎng)棉花纖維和對(duì)改善其他重要的纖維品質(zhì)性狀的作用。光敏色素基因表達(dá)的變化影響 開花時(shí)間。由于之前的研究已經(jīng)表明植物光敏色素基因參與硝酸還原酶（Jonassen等 2008.Planta 227(3):559-564 ;Lillo，C. 2008.Biochem J. 415(1):11-19)和耐鹽性同源 物 2 和同源物 3(Datta 等 2007)Plant Cell 19(10) :3242-3255 ;Datta 等 2008. Plant Cell 20(9):2324-2338)的調(diào)節(jié)，還評(píng)估了光敏色素基因的RNA干擾對(duì)根和芽發(fā)育的作 用。另外，已經(jīng)有數(shù)種報(bào)道針對(duì)光敏色素和其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子參與擬南芥的耐低溫/耐 冷凍和耐旱（Kim 等 2002. Plant J. 29(6) :693-704 ;Franklin 和糖行61&111.2007.恥七· Genet. 39(11) 1410-1413 ;Beck 等 2007. J. BioSci. 32(3) :501-510)。
[0042] 我們之前已經(jīng)表征了棉花基因組的所有棉花光敏色素并且研究了它們的分子進(jìn) 化（Abdurakhmonov 2001，前文；Abdurakhmonov等2010,前文）。在二倍體棉花中鑒定了兩 個(gè)同源基因 PHYAl和PHYA2基因，它們起源于A和D基因組祖先趨異之前的約1400萬(wàn)年之 前的Malvaceae-特定基因復(fù)制（MYA)。在二倍體棉花中檢測(cè)到PHYB、PHYC和PHYE的單基 因拷貝。具有異源四倍體基因組（AD)的棉花很大程度上保留全部基因互補(bǔ)體，包括至少四 個(gè)PHYA基因和兩個(gè)編碼PHYB、PHYC和PHYE的基因。在任何檢查的棉花基因組中都沒有發(fā) 現(xiàn) PHYD 基因 （Abdurakhmonov 等 2010,前文）。
[0043] 這里，我們報(bào)道了來(lái)自我們的研究的結(jié)果：使用纖維品質(zhì)QTL相關(guān)的PHYAl基因序 列通過(guò)RNA干擾（RNAi)研究光敏色素基因的生物學(xué)作用。這里我們提供了關(guān)于光形態(tài)發(fā) 生-相關(guān)因子在復(fù)雜的棉花纖維發(fā)育過(guò)程中的重要性和光敏色素-特異RNAi在改善棉花 的重要的農(nóng)藝學(xué)性狀中的有用性的第一個(gè)分子證據(jù)。此外，我們表明這些作用可通過(guò)有性 雜交轉(zhuǎn)移至陸地栽培品種。
[0044] 在該工作中，我們能夠誘導(dǎo)棉花的光敏色素相關(guān)的RNAi表型，其產(chǎn)生據(jù)認(rèn)為對(duì)棉 花育種重要但是通過(guò)常規(guī)的育種難以實(shí)現(xiàn)的數(shù)種改良的復(fù)雜農(nóng)藝學(xué)性狀。棉花光敏色素 A、B、C 和 E 的絞鏈區(qū)的特征（Abdurakhmonov 2001，前文；Abdurakhmonov 等 2010,前文） 和PHYAl基因與纖維品質(zhì)的顯著相關(guān)促使我們選擇和使用PHYAl-特定序列用于開發(fā)RNAi 構(gòu)建體。選擇的213bp長(zhǎng)的PHYAl片段與棉花PHYA2基因具有87%的核苷酸相似性，與擬 南芥PHYA具有75%的核苷酸相似性，與棉花PHYB基因具有59%的核苷酸相似性，與棉 花PHYE基因具有53%的核苷酸相似性和與棉花PHYC基因具有?50 %核苷酸相似性。有 效的基因沉默通常需要80-100%的核苷酸同源性，以誘導(dǎo)強(qiáng)的和特異的RNAi (Holzberg等 2002. Plant J. 30:315-327);因此我們的RNAi構(gòu)建體設(shè)計(jì)為優(yōu)先靶向棉花的PHYA基因。
[0045] 我們對(duì)棉花轉(zhuǎn)化的結(jié)果顯示了早期胚幼苗中感興趣的光敏色素相關(guān)的表型。例 如，我們觀察到強(qiáng)健的芽和側(cè)根發(fā)育以及早開花表型。觀察到在HY5基因突變的擬南芥 中觀察到這種強(qiáng)健的側(cè)根發(fā)育；HY5是光形態(tài)發(fā)生的正向調(diào)節(jié)物（Oyama等1997. Genes Dev. 11:2983-2995)。已知棉花纖維由種子表皮發(fā)育，因此解剖學(xué)上與表皮根尖相似， TtlPHYAl RNAi植株的根伸長(zhǎng)過(guò)程的觀察對(duì)于評(píng)估相同植物中更長(zhǎng)纖維的存在是重要的。 的確，我們的結(jié)果表明在實(shí)驗(yàn)管理田間條件下、在正常太陽(yáng)光下生長(zhǎng)的！\、T 2和T3代植物 中穩(wěn)定表達(dá)的不同RNAi棉花家族中纖維長(zhǎng)度以及其他纖維品質(zhì)特征的改善是顯著的但 是是不同的。我們的結(jié)果與對(duì)增加的遠(yuǎn)紅光/紅光比對(duì)纖維長(zhǎng)度和直徑作用的早期觀察 (Kasperbauer 2000,前文）以及我們對(duì)棉花中PHYAl與纖維長(zhǎng)度QTL相關(guān)性的初步結(jié)果 (Abdurakhmonov 2001，前文）一致。
[0046] 由于光敏色素介導(dǎo)的植物激素信號(hào)，諸如被認(rèn)為是與纖維發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵因子的 植物生長(zhǎng)素（IAA)、脫落酸（ABA)、赤霉素（GA)、油菜素內(nèi)酯（BR)、乙烯和細(xì)胞分裂素 ，（Lee 等2007. Ann. Bot. 100:1391-1401)，光敏色素相關(guān)的纖維伸長(zhǎng)可能發(fā)生（Neff等2000. Genes Dev. 3:257-271 ;Colon_Carmona 等 2000. Plant Physiol. 124(4):1728-1738 ;Stamm 和Kumar. 2010. J. Exp. Bot. 61 (11) :2889-2903)。例如，對(duì)棉花胚珠發(fā)育中植物生長(zhǎng)素生 物合成的時(shí)空操縱的最近所作的努力證明棉花的纖維產(chǎn)量和品質(zhì)參數(shù)的提高（Zhang等 2011. Nature Biotechnol. 29(5) :453-458)。通過(guò)密切的植物生長(zhǎng)素-光敏色素相互作用， 尤其PHYA (Neff等2000,前文；Colon-Carmona等，前文），關(guān)于植物生長(zhǎng)素和光信號(hào)之間的 分子交互作用存在充分支持的證據(jù)。這可解釋在我們的RNAi植株中纖維品質(zhì)改善并且表 明了 PHYA基因在該過(guò)程中的作用。此外，通過(guò)來(lái)自正在發(fā)育的胚珠中的小RNA種類的特征 (Abdurakhmonov 等 2008. BMC Plant Biol. 8:93 ;Devor 等 2009.Int. J. Plant Genomics. PubMedID :19551152)，我們觀察到負(fù)責(zé)遠(yuǎn)紅光/紅光感知和光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、向光性、向重力 性和生理節(jié)奏的光形態(tài)發(fā)生-相關(guān)的因子（PHYC、SPA1、FAR1、C0P1/9、CIP7/8和RTP2)在 纖維起始階段，更顯著地在纖維發(fā)育的纖維伸長(zhǎng)階段，被胚珠-衍生的siRNA靶向。
[0047] 但是，應(yīng)提到我們?cè)趤?lái)自不同轉(zhuǎn)化事件的T2RNAi植株中觀察到纖維性狀改善的不 同趨勢(shì)，因此表明我們使用的PHYAl基因序列片段誘導(dǎo)不同類型和水平的RNAi。該結(jié)果可 能與RNAi相關(guān)，原因是基因組中不同水平的光敏色素基因的抑制和RNAi構(gòu)建體的不同拷 貝數(shù)的組合。我們的結(jié)果表明具有特定RNAi表型的兩個(gè)明顯不同的單粒傳 （single seed decent) RNAi棉花家族在插入到它們基因組中的RNAi質(zhì)粒的拷貝數(shù)以及基因-敲除水平和 基因組合的抑制方面不同。我們觀察到三個(gè)拷貝數(shù)樣品與更深度的PHYAl基因抑制相關(guān)。 如我們所提議，我們基于PHYAl序列的RNAi構(gòu)建體主要僅僅靶向棉花PHYAl序列并且不影 響其他棉花光敏色素基因，更不用提在選擇的兩個(gè)RNAi家族中具有87%核苷酸同源性的 PHYA2基因。但是，在T3-31_10,我們觀察到與PHYAl RNAi片段具有?60%核苷酸同源性 的10%棉花PHYB基因的抑制。這些結(jié)果支持我們的假設(shè)，不同組合的光敏色素基因被在我 們的轉(zhuǎn)化中使用的PHYAl基因序列抑制。除了 PHYAl敲除，T3-31_10中PHYB的輕微抑制產(chǎn) 生與T3-l_7相比的早開花表型。
[0048] 同時(shí)，PHYAl-抑制RNAi植株中其他光敏色素基因，即，PHYA2、PHYB、PHYC和PHYE 的表達(dá)水平增加了?2至20-倍，這是出人意料的結(jié)果。有趣地是，T3-l_7中PHYAl的更深 度抑制導(dǎo)致比T 3-31_10事件中其他光敏色素的表達(dá)更多。該發(fā)現(xiàn)大體上與光敏色素基因可 能的重疊功能的報(bào)道一致（Reed等1994.Plant Physiol. 1104:1139-1149)。換句話說(shuō)，在 調(diào)節(jié)一些光敏色素-相關(guān)的表型諸如開花時(shí)，光敏色素之間可彼此替換。PHYAl RNAi家族 中PHYA2和PHY C水平的增加可以是這種替代的結(jié)果，因?yàn)樵谒局参镏蠵HYC如PHYA - 樣響應(yīng)恒定的遠(yuǎn)紅光（Takano 等 2005.Plant Cell 17:3311-3325 ;1^6丨881等 2008.]\1〇1· Plant. I (I) :84-102)，盡管PHYC的感光特異性與弱紅光傳感器（Sch印ens等2004. Curr. 0口111.?131^8丨〇1.7(5):564-569)?冊(cè)8/1)/^(]\1〇1^6等，前文）類似。另外，在我們的？?jī)?cè)八1 RNAi植株中觀察到的PHYE/B基因表達(dá)增加了?5至20-倍，這表明棉花PHYAs和PHYE/ Bs之間可能的功能重疊可能對(duì)棉花光敏色素種類是特異性的。
[0049] 我們推測(cè)棉花中PHYA基因的抑制將產(chǎn)生晚開花表型，因?yàn)镻HYA通常促進(jìn)植物開 花（Neff和Chory 1998,前文）。可選地，在我們選擇的RNAi棉花家族中增加的PHYA2表 達(dá)維持早開花。而且，增加的PHYC表達(dá)可有助于在PHYAl抑制背景下的早開花表型，因 為在長(zhǎng)日照條件下在不存在PHYA的情況下PHYC能夠促進(jìn)開花（Franklin等2003,前文； Monte等，前文；Balasubramanian等，前文）。RNAi植株中該改變的光敏色素基因表達(dá)水平 可能已經(jīng)誘導(dǎo)'避蔭'過(guò)程，導(dǎo)致植物生長(zhǎng)加速。作為對(duì)遮蓬的響應(yīng)，當(dāng)遮蔽成為問(wèn)題時(shí)植 物試圖完成它們的生命周期并且加速開花（Devlin等1999,前文；Salter等2003. Nature 426 (6967) :680-683)。我們觀察到作為PHYAl和PHYAl/BRNAi棉花植株中的標(biāo)記表型的葉 柄和果枝的伸長(zhǎng)，表明誘導(dǎo)了作為長(zhǎng)得超過(guò)鄰近的植物的嘗試的避蔭過(guò)程（Salter等，前 文）。在PHYAl RNAi棉花植株中觀察到的棉花棉鈴的早成熟也可與對(duì)遮陰的響應(yīng)相關(guān)，其 與擬南芥中包括早開花和早產(chǎn)生種子的避蔭響應(yīng)幾乎一樣（Devlin等1999,前文；Salter 等，如文）。
[0050] 值得提到的是，已知棉花的纖維長(zhǎng)度和這些特性之間負(fù)相關(guān)，在RNAi家族中觀察 到衣分率、種子和衣分指數(shù)特性降低（Miller和Rawlings。1967。Crop Sci. 7:637-640; Meredith和fcidge. 1973. Crop ScL 13:698-701)，這導(dǎo)致總體棉花產(chǎn)量受影響。但是， 在RNAi植株中觀察到的增加的產(chǎn)量潛力可由光敏色素相關(guān)的強(qiáng)健的芽和根發(fā)育來(lái)解釋， 光敏色素相關(guān)的強(qiáng)健的芽和根發(fā)育產(chǎn)生了更多的果枝、花和棉鈴，增加了來(lái)自土壤養(yǎng)分 的同化作用的效率，因此潛在地有助于觀察到的產(chǎn)量增加。之前的研究顯示，與對(duì)照相 t匕，馬鈴薯中擬南芥PHYB基因的過(guò)表達(dá)導(dǎo)致更高的光合性能，并且具有花青素色素沉積 增加的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株產(chǎn)生增加的生物質(zhì)和增加的塊莖產(chǎn)量（Thiele等1999. Plant Physiol. 120(1) :73-82)，另一種可能性是，由于光敏色素基因的表達(dá)改變，尤其PHYB/E和 PHYC表達(dá)的增加，改變的光合光感可能已經(jīng)影響光合速度，因此導(dǎo)致RNAi植株產(chǎn)量潛力增 力口。作為紅光光感受器，如PHYB，在PHYAl/BRNAi背景下棉花PHYE/C的數(shù)倍過(guò)表達(dá)可能也 產(chǎn)生上面提到的PHYB過(guò)表達(dá)馬鈴薯植株表型，其具有增加的產(chǎn)量潛力和在PHYAl RNAi植 株衰老中的花青素色素沉積。
[0051] 我們也評(píng)估了由于觀察到的強(qiáng)健的根發(fā)育，開發(fā)的PHYA1/B RNAi植株在耐干旱、 耐鹽、耐低溫/冷凍特征方面的改善，因?yàn)橹暗难芯恳呀?jīng)報(bào)道了光敏色素基因與這些作 用的相關(guān)性（Jonassen等，前文；Lillo,前文；Datta等2007,前文；Datta等2008,前文； Kim等，前文；Franklin和Whitelam,前文；Beck等，前文）。為了該目標(biāo)，在評(píng)估在自然田間 條件下以及脅迫環(huán)境下這些轉(zhuǎn)基因植物的更高代方面，正在進(jìn)行研究和付出大量的努力。
[0052] 我們使用Coker 312,具有差產(chǎn)量潛力的品系，因?yàn)槠涑浞肿C明的體外高體細(xì)胞胚 發(fā)生和高再生效率。轉(zhuǎn)基因 Coker 312品系與改良的栽培品種的雜交表明來(lái)自RNAi Coker 312的相同表型和遺傳效果的轉(zhuǎn)移。如本文我們通過(guò)PHYAl RNAi所實(shí)現(xiàn)的數(shù)種復(fù)雜性狀的 同時(shí)改善且不影響其他參數(shù)在常規(guī)的育種中受到限制。例如，由于在隨后的雜交后代中廣 泛的遺傳隔離、連鎖累贅和遺傳畸變而通常產(chǎn)生晚熟和差的農(nóng)藝學(xué)品質(zhì)的雜種，使用種間 基因雜交使來(lái)自皮馬棉花的良好纖維品質(zhì)基因基因滲入至陸地棉花栽培品種具有挑戰(zhàn)性 (Endrizzi等1985. Adv. Genetics 23:271-375)。我們的RNAi研究結(jié)果解決了這些主要問(wèn) 題并且使得具有改善的纖維品質(zhì)的早熟栽培品種，例如，具有提高的纖維品質(zhì)的早成熟的 陸地變種快速發(fā)育。因此，我們已經(jīng)開發(fā)了優(yōu)良的烏茲別克棉花栽培品種，其適應(yīng)本地棉花 生產(chǎn)同時(shí)保持原始栽培品種特定的所有其他特征。更長(zhǎng)且強(qiáng)度更大的棉花棉絨纖維的新市 場(chǎng)以及早成熟和提高的產(chǎn)量潛力將增加該技術(shù)的預(yù)計(jì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。經(jīng)光敏色素 RNAi對(duì)非生 物脅迫抗性的改善進(jìn)一步增加其商業(yè)潛力。
[0053] 我們的結(jié)果支持并強(qiáng)調(diào)植物光形態(tài)發(fā)生在棉花纖維發(fā)育中的重要性以及其對(duì)纖 維品質(zhì)的作用。我們得出這樣的結(jié)論：棉花PHYAl基因的RNAi導(dǎo)致靶向基因的抑制并且 也改變殘留其余光敏色素的表達(dá)水平。所以，棉花中觀察到的RNAi作用是由于PHYAl的抑 制和其他光敏色素表達(dá)的數(shù)倍增加。棉花光敏色素基因家族表達(dá)譜的這種改變導(dǎo)致植株株 型的改變，包括葉柄和果枝伸長(zhǎng)、早開花、棉鈴早成熟、纖維品質(zhì)和纖維產(chǎn)量表型增強(qiáng)。這些 改變?cè)诤蟠蟹€(wěn)定表達(dá)并且通過(guò)基因雜交和選擇可從轉(zhuǎn)化的Coker 312基因型轉(zhuǎn)移至陸 地栽培品種。所以，基于棉屬-來(lái)源的光敏色素基因的RNAi，優(yōu)良品質(zhì)的長(zhǎng)-纖維質(zhì)RNAi 棉花植株的發(fā)育將使得育種人員快速改善成熟、主要纖維品質(zhì)性狀和產(chǎn)量。轉(zhuǎn)移的PHYAl RNAi構(gòu)建體可在陸地栽培品種中產(chǎn)生對(duì)非生物脅迫的抗性。該RNAi策略不僅僅提供對(duì)常 規(guī)棉花育種的根本問(wèn)題的解決方案，而且也產(chǎn)生來(lái)自世界上的棉花生產(chǎn)的顯著的經(jīng)濟(jì)收入 并且將開啟用于陸地棉花育種的新篇章。
[0054] 在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含本發(fā)明核苷酸序列的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，尤 其，是根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens)細(xì)胞。
[0055] 對(duì)于直接的基因轉(zhuǎn)移和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移，通常（但不是必須）采取具有可提供 對(duì)抗生素（卡那霉素、潮霉素或氨甲喋呤）或除草劑（磺酰脲、咪唑啉酮或basta)抗性的 標(biāo)記的轉(zhuǎn)化。但是，選擇標(biāo)記的選擇對(duì)本發(fā)明不是至關(guān)重要的。
[0056] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"核酸分子"、"核酸序列"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核酸 片段"、"分離的核酸片段"在本文交換使用。這些術(shù)語(yǔ)包括核苷酸序列和類似序列。多核苷 酸可以是RNA或DNA的多聚體，其是單鏈或雙鏈并且其任選地包含合成的、非天然的或改變 的核苷酸堿基。以DNA多聚體形式的多核苷酸可由一個(gè)或多個(gè)cDNA、基因組DNA、合成DNA 的區(qū)段，或其混合物組成。
[0057] 術(shù)語(yǔ)"分離的"多核苷酸指基本上沒有通常在發(fā)現(xiàn)其的天然存在的環(huán)境下相伴或 與其相互作用的其他核酸序列，諸如其他染色體和染色體外的DNA和RNA多核苷酸。但是， 分離的多核苷酸可包含可初始作為染色體外的DNA存在但是在分離的多核苷酸中作為核 苷酸插入存在的多核苷酸序列。分離的多核苷酸可從它們天然存在的宿主細(xì)胞中純化。技 術(shù)人員已知的常規(guī)核酸純化方法可用于獲得分離的多核苷酸。術(shù)語(yǔ)也包括重組多核苷酸和 化學(xué)合成的多核苷酸。
[0058] 如本文所使用，"重組體"指通過(guò)使用限制酶、連接酶和類似的基因工程技術(shù) 操作遺傳材料獲得的核酸分子，如通過(guò)，例如下述所描述：Sambrook等1989. Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring 公頃 rbor Laboratory Press, Cold Spring 公頃 rbor，NY or DNA Cloning:A Practical Approach，I 和 II 卷出土 D.N. Glover), IRL Press, Oxford, 1985。"重組體"如本文所使用，不指天然存在的遺傳重 組體。
[0059] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"嵌合"指源自不同來(lái)與、菌株或物種在自然條件下不重組的 的兩條或更多條DNA分子，或來(lái)自相同物種以在天然基因組中不存在的方式連接的兩條或 更多條DNA分子。"構(gòu)建體"或"嵌合基因構(gòu)建體"指編碼蛋白質(zhì)、可操作地連接至啟動(dòng)子和 /或其他調(diào)控序列的核酸序列。
[0060] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)（express) "或"表達(dá)（expression) "定義為意思是僅 僅轉(zhuǎn)錄。"改變的水平"或"改變的表達(dá)"指轉(zhuǎn)基因生物體中基因產(chǎn)物（一種或多種）的生 產(chǎn)的量或比例與正常的或非轉(zhuǎn)化生物體的不同。
[0061] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"編碼（encoding) "、"編碼（coding) "或"編碼的（encoded) " 當(dāng)在具體核酸背景下使用時(shí)，意思是核酸包括必要的信息以引導(dǎo)核苷酸序列翻譯成具體的 蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)編碼的信息由使用的密碼子指定。編碼蛋白質(zhì)的核酸可包括非翻譯的序列 (例如，內(nèi)含子）核酸的翻譯區(qū)域中或可缺失這種插入的非翻譯序列（例如，如在cDNA中）。 [0062] 術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"指單個(gè)核酸片段上兩條或更多條核酸片段的相關(guān)性，使得一 個(gè)片段的功能受另一片段的影響。例如，當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)時(shí)，該啟動(dòng)子與 該編碼序列可操作地連接（即，該編碼序列在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下）。編碼序列可以可操作 地以有義或反義方向上連接至調(diào)控序列。
[0063] "調(diào)控序列"指位于編碼序列上游（5'非編碼序列）、內(nèi)部或下游（3'非編碼序列） 的核苷酸序列，并且其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA處理或穩(wěn)定性，或翻譯。這里，調(diào)控序 列可包括啟動(dòng)子：T7啟動(dòng)子、CaMV 35S啟動(dòng)子和亞基因組啟動(dòng)子（兩個(gè)，在MCS的每一側(cè)）、 翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子，和多腺苷酸化鑒定序列。
[0064] "啟動(dòng)子"指能夠控制編碼序列或功能RNA表達(dá)的核苷酸序列。一般而言，編碼序 列位于啟動(dòng)子序列的3'。啟動(dòng)子序列由相鄰的和更遠(yuǎn)的上游元件組成，后者元件通常稱為 增強(qiáng)子。因此，"增強(qiáng)子"是可刺激啟動(dòng)子活性的核苷酸序列并且可以是啟動(dòng)子的先天元件 或插入的異源元件，以增強(qiáng)啟動(dòng)子的水平或組織-特異性。啟動(dòng)子整體上可源自天然基因， 或由源自自然中出現(xiàn)的不同啟動(dòng)子的不同元件組成，或甚至包括合成核苷酸區(qū)段。本領(lǐng)域 技術(shù)人員理解，不同啟動(dòng)子可引導(dǎo)不同組織或細(xì)胞類型中，或在發(fā)育不同階段，或響應(yīng)不 同環(huán)境條件的基因的表達(dá)。使得核酸片段在大部分細(xì)胞類型中的大部分時(shí)間表達(dá)的啟動(dòng)子 通常稱為"組成型啟動(dòng)子"。經(jīng)常發(fā)現(xiàn)在植物細(xì)胞中使用的各種類型的新啟動(dòng)子；許多例子 可見 Okamuro 和 Goldberg.編輯的 1989. Biochemistry of Plants 15:1-82。進(jìn)一步認(rèn)識(shí) 至IJ，因?yàn)樵诖蟛糠智闆r下還未完全限定調(diào)控序列的精確邊界，不同長(zhǎng)度的核酸片段可具有 相同的啟動(dòng)子活性。
[0065] "RNA轉(zhuǎn)錄體"指源自DNA序列的RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄體是 DNA序列的完美互補(bǔ)副本時(shí)，稱為初級(jí)轉(zhuǎn)錄體或其可以是源自轉(zhuǎn)錄后處理的RNA序列初級(jí) 轉(zhuǎn)錄體并且稱為成熟RNA。"信使RNA(mRNA) "指在內(nèi)含子外部并且可由細(xì)胞翻譯成多肽的 RNA。"cDNA"指與mRNA模板互補(bǔ)并且源自其的DNA。cDNA可以是單鏈的或使用，例如，DNA 聚合酶I的Klenow片段轉(zhuǎn)化成雙鏈形式。"有義"RNA指包括mRNA并且所以可被細(xì)胞翻譯 成多肽的RNA轉(zhuǎn)錄體。"反義"，當(dāng)在具體的核苷酸序列背景下使用時(shí)，指參考轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的互 補(bǔ)鏈。"反義RNA"指與所有的或部分目標(biāo)初級(jí)轉(zhuǎn)錄體或mRNA互補(bǔ)并且妨礙目標(biāo)基因表達(dá) 的RNA轉(zhuǎn)錄體。反義RNA的互補(bǔ)可與具體核苷酸序列的任何部分，S卩，在5'非編碼序列、3' 非編碼序列、內(nèi)含子或編碼序列。"功能RNA"指有義RNA、反義RNA、核酶RNA，或可能未被翻 譯但是仍對(duì)細(xì)胞過(guò)程有作用的其他RNA。
[0066] "基因抑制"意思是抑制蛋白質(zhì)從基因表達(dá)的任何熟知的方法，包括反義抑制或 RNAi抑制。在抑制基因以提供具有期望的表型的植物時(shí)，反義抑制和RNAi基因抑制方法是 優(yōu)選的。對(duì)于植物細(xì)胞中基因表達(dá)的反義調(diào)節(jié)的描述，見美國(guó)專利號(hào)5, 107, 065。對(duì)于植物 中通過(guò)dsRNA轉(zhuǎn)錄的RNAi基因抑制的描述，見美國(guó)專利號(hào)6, 506, 559、美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào) 2002/0168707A1 和美國(guó)專利申請(qǐng)系列號(hào) 09/423, 143 (見 TO 98/53083)、09/127, 735 (見 WO 99/53050)09/084,942(見WO 99/61631)，其所有通過(guò)引用并入本文。通過(guò)RNAi的基因抑 制可使用具有啟動(dòng)子的重組體DNA構(gòu)建體實(shí)現(xiàn)，試試啟動(dòng)子可操作地連接至DNA元件，包括 基因的基因組DNA區(qū)段的有義和反義元件，例如，至少大約23個(gè)核苷，更優(yōu)選地大約50至 200個(gè)核苷的區(qū)段，其中有義和反義DNA組件可通過(guò)內(nèi)含子或人工DNA區(qū)段直接連接或結(jié) 合，所述內(nèi)含子或人工DNA區(qū)段當(dāng)轉(zhuǎn)錄RNA雜交以形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)可形成環(huán)。
[0067] "轉(zhuǎn)化"指核酸片段轉(zhuǎn)移進(jìn)入宿主生物體的基因組中導(dǎo)致基因地穩(wěn)定的遺傳。包 含轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體稱為"轉(zhuǎn)基因"生物體。植物轉(zhuǎn)化方法的例子包括農(nóng)桿菌 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（De Blaere等1987. Meth. Enzymol. 143:277)和粒子-加速或"基因槍"轉(zhuǎn)化 技術(shù)（Klein等1987. Nature(London)327:70-73 ;美國(guó)專利號(hào)4, 945, 050,通過(guò)引用并入本 文）。下面公開了其他轉(zhuǎn)化方法。因此，本發(fā)明分離的多核苷酸可合并到重組體構(gòu)建體，通 常DNA構(gòu)建體，其能夠引入宿主細(xì)胞中并且在其中復(fù)制。這種構(gòu)建體可以是載體，其包括 能夠在給定的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯多肽-編碼序列的復(fù)制系統(tǒng)和序列。適于植物細(xì)胞 中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染或用于建立轉(zhuǎn)基因植物的許多載體已經(jīng)在下述中描述，例如，Pouwels等1985. Supp. 1987.克隆載體（Cloning Vectors):實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（ALaboratory Manual) ;Weissbach 和 Weissbach. 1989.植物分子生物學(xué)方法（Methods for Plant Molecular Biology)， Academic Press，New York ;和 Flevin 等 1990.植物分子生物學(xué)手冊(cè)（Plant Molecular Biology Manual)，Kluwer Academic Publishers，Boston。典型地，植物表達(dá)載體包括，例 如，在5'和3'調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄控制下的一個(gè)或多個(gè)克隆的植物基因和顯性選擇標(biāo)記。這 種植物表達(dá)載體也可包含啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)域（例如，控制可誘導(dǎo)的或組成型的，環(huán)境調(diào)控的 或發(fā)育調(diào)控的，或細(xì)胞特異性表達(dá)的或組織特異性表達(dá)的調(diào)控區(qū)域）、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖 體結(jié)合位點(diǎn)、RNA加工信號(hào)、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或多腺苷酸化信號(hào)。
[0068] "蛋白質(zhì)"或"多肽"是以由編碼多肽的多核苷酸中的編碼序列確定的特定順序排 列的氨基酸的鏈。每個(gè)蛋白質(zhì)或多肽具有獨(dú)特的功能。
[0069] 本發(fā)明包括功能多肽和其功能片段以及具有相同生物功能或活性的突變體和變 異體。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"功能片段"、"突變體"和"變異體"指具有通過(guò)確定的功能試驗(yàn) 鑒定的并且與細(xì)胞中特定的生物學(xué)的、形態(tài)學(xué)的或表型的改變相關(guān)聯(lián)的生物功能或活性的 多肽。功能片段，例如，可從與能夠結(jié)合抗體分子的抗原決定部位一樣小的多肽片段至能夠 參與細(xì)胞中典型誘導(dǎo)或表型改變生物編程的大的多肽大小變化。
[0070] 異源編碼序列指編碼與上面提供的多肽不相關(guān)或除上面提供的多肽之外的肽或 蛋白質(zhì)的編碼序列，在嵌合基因構(gòu)建體中提供的位置上未固有地發(fā)現(xiàn)該編碼序列。
[0071] 編碼光敏色素蛋白質(zhì)PHYA、PHYB、PHYC、PHYD和PHYE的光敏色素基因 PHYA、PHYB、 PHYC、PHYD和PHYE可使用根據(jù)本發(fā)明的各種技術(shù)克隆?？寺∵@種基因的最簡(jiǎn)單程序需要 從的病毒基因組RNA或鑒定為生產(chǎn)所述蛋白質(zhì)的生物體的基因組DNA克隆互補(bǔ)的DNA以及 在適當(dāng)?shù)馁|(zhì)?；蜉d體上將克隆的DNA轉(zhuǎn)移至不產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主生物體，隨后鑒定已經(jīng)被 賦予生產(chǎn)該蛋白質(zhì)能力的轉(zhuǎn)化的宿主。被賦予轉(zhuǎn)化的蛋白質(zhì)功能的DNA可切割成更小的片 段并且維持蛋白質(zhì)功能賦予能力的最小片段可被進(jìn)一步表征。適于通過(guò)同源性克隆的技術(shù) 包括通過(guò)DNA雜交的標(biāo)準(zhǔn)文庫(kù)篩選或使用源自保守序列的引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò) 增。如本文所限定，當(dāng)至少80% (優(yōu)選地至少85%和最優(yōu)選地90%)的核苷酸在確定的序 列長(zhǎng)度上使用諸如CLUSTAL或PILEUP的算法匹配時(shí)，兩個(gè)DNA序列基本上是同源的。基本 上同源的序列可在如本領(lǐng)域已知的Southern雜交實(shí)驗(yàn)中在嚴(yán)格條件下鑒定。參見，例如， Sambrook等，前文。Sambrook等描述了高度嚴(yán)格條件為雜交溫度低于最佳匹配的祀標(biāo)和探 針Tm的5-KTC ;因此，"基本上同源的"序列在這種條件下雜交。
[0072] 如本文所使用，"基本上類似"指其中一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的改變導(dǎo)致一個(gè)或多 個(gè)氨基酸的替換，但是不影響由該核苷酸序列編碼的多肽的功能性質(zhì)的核酸片段。"基本上 類似"也指本發(fā)明的核酸片段的修飾，諸如基本上不影響所得轉(zhuǎn)錄體功能性質(zhì)的核苷酸的 缺失或插入。所以，應(yīng)理解本發(fā)明包括不只所述具體的示例性核苷酸或氨基酸序列并且包 括其功能等價(jià)物。在給定位點(diǎn)產(chǎn)生化學(xué)等價(jià)氨基酸，但是不影響編碼多肽的功能性質(zhì)的核 酸片段的改變是本領(lǐng)域熟知的。因此，疏水的氨基酸，氨基酸丙氨酸的密碼子可被編碼另一 疏水性較小的殘基，諸如甘氨酸，或疏水性更大的殘基，諸如纈氨酸、亮氨酸或異亮氨酸的 密碼子替換。類似地，導(dǎo)致一種帶負(fù)電的殘基替換另一帶負(fù)電的殘基，諸如天冬氨酸替換谷 氨酸，或一種帶正電的殘基替換另一帶正電的殘基，諸如賴氨酸替換精氨酸的改變也可以 被預(yù)期產(chǎn)生功能上等價(jià)的產(chǎn)物。導(dǎo)致多肽分子的N末端和C末端部分改變的核苷酸變化也 未被預(yù)期改變多肽的活性。每種所推薦的修飾是本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)中熟知的，如測(cè)定編碼的 產(chǎn)物的生物活性的保留。影響病毒或宿主細(xì)胞（真核，諸如植物、酵母、真菌或藻類；原核， 諸如細(xì)菌）中多肽的表達(dá)水平的分離的多核苷酸的選擇方法可包括下述步驟：構(gòu)建本發(fā)明 分離的多核苷酸或本發(fā)明分離的嵌合基因；將分離的多核苷酸或分離的嵌合基因引入宿主 細(xì)胞；測(cè)量在包含分離的多核苷酸的宿主細(xì)胞中多肽的水平；以及對(duì)包含分離的多核苷酸 的宿主細(xì)胞中的多肽的水平與不包含分離的多核苷酸的宿主細(xì)胞中多肽的水平進(jìn)行比較。
[0073] 而且，基本上類似核酸片段也可由它們雜交的能力表征。這種同源性的評(píng)估由在 本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的嚴(yán)格條件下的DNA-DNA或DNA-RNA雜交提供（1985. Nucleic Acid Hybridization，Hames 和 Higgins，Eds.，IRL Press，Oxford，U. Κ·)。嚴(yán)格條件可被調(diào)整以 篩選中度類似的片段諸如來(lái)自遠(yuǎn)親生物體的同源序列至高度類似的片段諸如復(fù)制來(lái)自近 親生物體的功能酶的基因。
[0074] 因此，編碼PHYAl多肽并且在嚴(yán)格條件下與本文公開的序列或其片段雜交的分離 的序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0075] 本發(fā)明的基本上類似的核酸片段也可由它們編碼的氨基酸序列與本文公開的氨 基酸序列相比的同源性百分比來(lái)表征，如通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用的算法測(cè)定。
[0076] 用于比較的序列比對(duì)的方法是本領(lǐng)域熟知的。因此，任何兩條序列之間的同源性 百分比的測(cè)定可使用數(shù)學(xué)算法來(lái)實(shí)現(xiàn)。此類數(shù)學(xué)算法的非限制性例子是Myers和Miller的 算法（1988. CABIOS 4:11-17) ,Smith 等的局部同源性算法（1981. Adv. Appl. Math. 2:482); Needleman 和 Wunsch 的同源性比對(duì)算法（1970. J. Mol. Biol. 48:443-453) ;Pearson 和 Lipman 的相似性查找方法（1988. Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448 ;Karlin和 Altschul 的算法（1990. Proc. Natl. Acad. Sci.美國(guó) 87:2264)，Karlin 和 Altschul 修改的算法 (1993. Proc. Natl. Acad. Sci.美國(guó) 90:5873-5877)。
[0077] 這些數(shù)學(xué)算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行可用于序列的比較以測(cè)定序列同源性。此類執(zhí)行包 括，但不限于：PC/基因程序中的CLUSTAU獲得自Intelligenetics公司，山景城，加利 福尼亞.）；ALIGN程序（2.0版本）和威斯康辛州遺傳學(xué)軟件包中（Wisconsin Genetics Software Package)的 GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA 和 TFASTA，版本 8 (獲得自遺傳計(jì)算機(jī) 組（Genetics Computer Group，GCG)，575Science Drive，麥迪遜，威斯康辛州，美國(guó)）。使 用這些程序的比對(duì)可使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行。
[0078] 除非另外指出，使用LASERGENE生物信息計(jì)算套件的Megalign程序（DNASTAR公 司，麥迪遜，威斯康辛州）或任何等價(jià)的程序進(jìn)行序列比對(duì)和同源性百分比計(jì)算。除非另外 指出，使用比對(duì)的 Clustal W 方法（Higgins 和 Sharp (1989. CABIOS 5:151-153)以默認(rèn)參 數(shù)（空位罰分=10,空位長(zhǎng)度罰分=1.0)進(jìn)行序列的多重比對(duì)，而使用Clustal W方法的 雙序列比對(duì)的默認(rèn)參數(shù)是空位罰分=10,空位長(zhǎng)度罰分=1.0, Slow-Accurate算法。
[0079] 如本文所使用的，在兩個(gè)核酸或多肽序列的背景下，"序列同源性"或"同源性"指 當(dāng)對(duì)指定比較窗口進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)比對(duì)時(shí)兩條序列中相同的殘基。當(dāng)提及蛋白質(zhì)使用序列一 致性的百分比時(shí)，認(rèn)識(shí)到不同的殘基位置通常保守氨基酸替換不同，其中氨基酸殘基被替 換為具有類似化學(xué)性質(zhì)（例如，電荷或疏水性）的其他氨基酸殘基并且因此不改變分子的 功能性質(zhì)。
[0080] 如本文所使用，"序列一致性的百分比"意思是通過(guò)在比較窗口上比較兩個(gè)最佳比 對(duì)的序列測(cè)定的值，其中與用于兩條序列的最佳比對(duì)的參考序列（其不包括添加或缺失） 比較時(shí)，比較窗口中的多核苷酸序列部分可包括添加或缺失（即，空位）。計(jì)算百分比如下： 測(cè)定在兩條序列中存在相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)量； 匹配的位置數(shù)除以比較窗口的總位置數(shù)；以及結(jié)果乘以100產(chǎn)生序列一致性的百分比。
[0081] 如本文所使用，"參考序列"是用作序列比較基礎(chǔ)的確定序列。參考序列可以是特 定序列的子集或全部；例如，全長(zhǎng)CDNA或基因序列的區(qū)段，或完整的CDNA或基因序列。 [0082] 術(shù)語(yǔ)"基本上一致性"的多核苷酸序列意思是使用描述的比對(duì)程序之一使用標(biāo)準(zhǔn) 參數(shù)，多核苷酸與參考序列比較包括具有至少80 %序列一致性，優(yōu)選地至少85 %，更優(yōu)選 地至少90%，最優(yōu)選地至少95%序列一致性的序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，通過(guò)考慮 密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等等，這些值可被適當(dāng)?shù)卣{(diào)整以確定由兩條核苷 酸序列編碼的蛋白質(zhì)的一致性。為了這些目的，氨基酸序列的基本上一致性通常意思是至 少80 %，優(yōu)選地至少85 %，更優(yōu)選地至少90 %，最優(yōu)選地至少95 %的序列一致性。優(yōu)選地， 使用Needleman等的同源性比對(duì)算法進(jìn)行最佳比對(duì)（1970. J. Mol. Biol. 48:443)。
[0083] 核苷酸序列基本上相同的另一標(biāo)示是兩個(gè)分子在嚴(yán)格條件下是否彼此雜交。一 般而言，嚴(yán)格條件選擇為比特定序列在確定的離子強(qiáng)度和pH下的熱解鏈溫度（Tm)低大約 5°C。但是，嚴(yán)格條件包括范圍為大約1°C至大約20°C的溫度，這取決于期望的嚴(yán)格程度，如 本文其他地方所限定的。
[0084] 氨基酸或核苷酸序列的"大部分"包括足以提供氨基酸或核苷酸序列包括的蛋白 質(zhì)或基因的推定鑒定的氨基酸或核苷酸序列。氨基酸和核苷酸序列可由本領(lǐng)域技術(shù)人員手 動(dòng)評(píng)估或通過(guò)使用基于計(jì)算機(jī)的序列比較和采用諸如BLAST算法的鑒定工具評(píng)估。一般而 言，十個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的氨基酸或三十個(gè)或更多個(gè)連續(xù)的核苷序列是必要的，以便推定鑒 定與已知的蛋白質(zhì)或基因同源的多肽或核酸序列。而且，就核苷酸序列而言，包括30個(gè)或 更多個(gè)連續(xù)的核苷酸的基因特異的寡核苷酸探針可用于基因鑒定和分離的依賴序列方法。 另外，12個(gè)或更多個(gè)核苷酸的短寡核苷酸可用作PCR的擴(kuò)增引物，以便獲得包括該引物的 特定核酸片段。因此，核苷酸序列的"大部分"包括將提供包括該序列的核酸片段的特異性 鑒定和/或分離的核苷酸序列。本說(shuō)明書教導(dǎo)編碼包括特定植物蛋白的多肽的氨基酸和核 苷酸序列。獲得本文報(bào)道的序列的利益的熟練的技術(shù)人員現(xiàn)在可使用所有或大部分公開的 序列用于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的目的。因此，這種部分表示"大部分"并且可用于建立"基 本上一致性"，即，與參考序列PHYAl相比具有至少80 %的序列一致性。因此，本發(fā)明包括如 在所附序列表中報(bào)道的全部序列以及如上定義的那些序列的大部分。
[0085] 公開的核苷酸序列的片段和變異體以及由其編碼的蛋白質(zhì)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。 "片段"旨在指一部分核苷酸序列或一部分氨基酸序列和因此由其編碼的蛋白質(zhì)。核苷酸序 列的片段可編碼保留天然蛋白質(zhì)的生物活性并且因此具有類似PHYAl蛋白質(zhì)活性的蛋白 質(zhì)片段?？蛇x地，用作雜交探針的核苷酸序列的片段可能不編碼保持生物活性的片段蛋白 質(zhì)。
[0086] "變異體"旨在指基本上類似的序列。對(duì)于核苷酸序列，因?yàn)檫z傳密碼的簡(jiǎn)并性，保 守的變異體包括編碼本發(fā)明PHYAl多肽之一的氨基酸序列的那些序列。天然存在的等位 基因變異體諸如可用使用熟知的分子生物學(xué)技術(shù)，例如，用于擴(kuò)增特定DNA區(qū)段的技術(shù)聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)鑒定的等位基因變異體。一般而言，本發(fā)明的特定核苷酸序列的變異 體與該特定核苷酸序列具有一般至少大約90%，優(yōu)選地至少大約95%和更優(yōu)選地至少大 約98%的序列一致性，如通過(guò)本文其他地方描述的序列比對(duì)程序測(cè)定的。
[0087] "變異體蛋白質(zhì)"旨在指通過(guò)缺失（所謂的截?cái)啵┗蛱砑右粋€(gè)或多個(gè)氨基酸至天然 蛋白質(zhì)的氮末端和/或C-末端；在天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨 基酸；或在天然蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而由天然蛋白質(zhì)獲得的蛋 白質(zhì)。本發(fā)明包括的變異體蛋白質(zhì)具有生物活性，即它們繼續(xù)擁有期望的天然蛋白質(zhì)的生 物活性。這種變異體可源自，例如，遺傳多態(tài)性或人為操作。本發(fā)明天然PHYAl蛋白質(zhì)的生 物活性變異體與天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列將具有至少大約90%，優(yōu)選地至少大約95%，更 優(yōu)選地至少大約98%序列一致性，如通過(guò)本文其他地方描述的序列比對(duì)程序測(cè)定的。本發(fā) 明的蛋白質(zhì)的生物活性變異體與該蛋白質(zhì)的差異可以少至1-15個(gè)氨基酸殘基或甚至1個(gè) 氣基酸殘基。
[0088] 本發(fā)明的多肽可以不同的方式發(fā)生改變包括氨基酸替換、缺失、截?cái)嗪筒迦?。可?過(guò)將本發(fā)明的蛋白質(zhì)的元件和片段組合，也可以通過(guò)將本發(fā)明的蛋白質(zhì)的元件和片段與其 他蛋白質(zhì)組合產(chǎn)生具有感興趣性質(zhì)的新型蛋白質(zhì)。這種操作的方法通常是本領(lǐng)域已知的。 因此，本發(fā)明的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列以及突變體形式。同樣地，本發(fā)明的 蛋白質(zhì)包括天然存在的蛋白質(zhì)以及其變異體和修飾形式。此類變異體將繼續(xù)具有期望的 PHYAl活性。明顯地，在編碼變異體的DNA中制造的突變不應(yīng)當(dāng)把該序列置于閱讀框之外并 且優(yōu)選地不產(chǎn)生將產(chǎn)生二級(jí)mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域。
[0089] 期望本文包括的蛋白質(zhì)序列的缺失、插入和替換不產(chǎn)生蛋白質(zhì)特征方面的根本改 變。但是，當(dāng)在這樣做之前難以預(yù)測(cè)替換、缺失或插入的精確作用時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理 解通過(guò)可觀察到PHYAl蛋白質(zhì)的作用的常規(guī)篩選試驗(yàn)評(píng)估該作用。
[0090] 應(yīng)當(dāng)理解，如本文所使用術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)基因"包括基因型已經(jīng)通過(guò)存在異源核酸而被改 變的任何細(xì)胞、細(xì)胞系、愈傷組織、組織、植物部分或植物，包括最初因此改變的基因轉(zhuǎn)移 以及通過(guò)來(lái)自最初基因轉(zhuǎn)移的有性雜交或無(wú)性繁殖而產(chǎn)生的那些。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ) "轉(zhuǎn)基因"不包括通過(guò)常規(guī)的植物育種方法或通過(guò)天然存在的事件，諸如隨機(jī)異花受精、非 重組體病毒感染、非重組體細(xì)菌轉(zhuǎn)化、非重組體轉(zhuǎn)座或自發(fā)突變而發(fā)生的基因組（染色體 或染色體外）改變。
[0091] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"棉花"包括用于商業(yè)纖維生產(chǎn)的棉花屬的任何種，優(yōu)選地 陸地棉或海島棉。
[0092] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"植物"包括提及完整的植物、植物器官（例如，頁(yè)、莖、根 等）、種子、植物細(xì)胞和其子代。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)基因植物的部分理解為包括，例如，來(lái) 源用本發(fā)明的DNA分子轉(zhuǎn)化之前的轉(zhuǎn)基因植物或它們的子代并且因此至少部分由轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞組成的植物細(xì)胞、原生質(zhì)體、組織、愈傷組織、胚以及花、莖、果實(shí)、葉、根，其也是本發(fā)明 的目的。
[0093] 如本文所使用，術(shù)語(yǔ)"植物細(xì)胞"包括，但不限于種子懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū) 域、愈傷組織、葉、根、芽、配子體、孢子體、花粉和小孢子。可用于本發(fā)明的方法的植物種類 一般與轉(zhuǎn)化技術(shù)可處理的高等植物種類一樣廣發(fā)，包括單子葉植物和雙子葉植物植物。 實(shí)施例
[0094] 已經(jīng)大體上描述了本發(fā)明，通過(guò)參考某些具體的實(shí)施例，將更好地理解本發(fā)明。具 體的實(shí)施例被包括在本文中僅僅進(jìn)一步闡釋本發(fā)明而不旨在限制本發(fā)明的范圍為權(quán)利要 求所限定的。
[0095] 實(shí)施例1
[0096] 植物材料
[0097] 在本文的研究中使用的植物材料是體細(xì)胞可再生的棉花基因型陸地棉系Coker 312和用pHellsgate-8: :PHYA1載體轉(zhuǎn)化的其轉(zhuǎn)基因衍生系?？稍偕腃oker-312種子（由 Keerti Rathore博士提供，德州農(nóng)機(jī)大學(xué)，德州大學(xué)城，德克薩斯州，美國(guó)）。為了檢查觀察 到的RNAi作用的可轉(zhuǎn)移性，我們使用數(shù)種商業(yè)上重要的烏茲別克棉花栽培品種，例如陸地 棉栽培品系A(chǔ)N-Boyovut-2用于與RNAi Coker-312植物的常規(guī)基因雜交實(shí)驗(yàn)。
[0098] 實(shí)施例2
[0099] RNAi載體構(gòu)建
[0100] 我們使用高通量pHellsgate_8GateWay質(zhì)粒載體（由P. Waterhouse博士和 C. Helliwell博士提供，CSIR0,澳大利亞）構(gòu)建了 PHYAl基因特異RNAi雙元載體構(gòu)建體 (Wesley等，前文；Helliwell等，前文）。RNAi載體被轉(zhuǎn)化進(jìn)入農(nóng)桿菌菌株LBA4404并且用 于植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
[0101] 對(duì)于棉花PHYAl基因的attB位點(diǎn)（attBl和attB2)，設(shè)計(jì)并且自綜合DNA技術(shù)公 司（Integrated DNA Technologies Inc)(愛荷華州，美國(guó)）購(gòu)買所附的基因特異引物Gos_ PHYAlattBl-F和Gos_PHYAlattB2-R(表1)。這些引物對(duì)特異性擴(kuò)增棉花的213bp PHYAl 基因片段（SEQ ID NO: 1)，其對(duì)應(yīng)棉花光敏色素 A基因的鉸鏈區(qū)的一部分。值得提到四倍體 棉花具有兩個(gè)不同的PHYAl基因，一個(gè)獲得自二倍體D-基因組祖先，另一個(gè)獲得自二倍體 A基因組祖先（Abdurakhmonov等2010,前文）。這兩個(gè)PHYAl基因在213bp RNAi部分具 有99%核苷酸一致性；它們的差異在于在由SEQ ID NO: 1提供并鑒定的序列的Y(C或T)和 R(G或A)位置有兩個(gè)單核苷酸多態(tài)性。首先，根據(jù)制造商的說(shuō)明和手冊(cè)，用KODHiFi高保真 校對(duì)DNA聚合酶（Novagen，美國(guó)）和非attB基因特異引物，由棉花基因組DNA擴(kuò)增PHYAl 的特異的棉花光敏色素基因片段。使用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證預(yù)期的基因特異性PCR產(chǎn)物。 然后在第二循環(huán)PCR反應(yīng)中以純化的第一 PCR擴(kuò)增子用作模板用attB-側(cè)翼基因-特定 引物（表1)將attBl和attB2位點(diǎn)連接至獲得的PCR產(chǎn)物上。使用凝膠電泳驗(yàn)證獲得的 attB-側(cè)翼PCR產(chǎn)物的大小和正確性。用聚乙二醇（PEG)溶液（包含26% PEG 8000、6.5mM MgCl2和0.6禮pH 5.2醋酸鈉）純化PCR產(chǎn)物去除剩余的attB引物。如Helliwell等（前 文）描述的進(jìn)行attB位點(diǎn)-側(cè)翼基因產(chǎn)物和載體之間的位點(diǎn)特異性重組反應(yīng)。
[0102] 與pD0N0R221 (Invitrogen，美國(guó)）的重組反應(yīng)在總體積10 μ 1的反應(yīng)混合物中進(jìn) 行，其中2μ1 BP克隆酶緩沖液（Invitrogen，美國(guó)）、2μ1 attB位點(diǎn)側(cè)翼PCR產(chǎn)物、150ng 質(zhì)粒載體和2μ I BP克隆酶（Invitrogen，美國(guó)）。反應(yīng)混合物在25°C下孵化過(guò)夜。重組混合 物（2μ 1)被轉(zhuǎn)化進(jìn)入化學(xué)感受態(tài)DH5-a大腸桿菌細(xì)胞（Invitrogen，美國(guó)）。轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 在包含50mg/L奇霉素的LB (Lysogene Broth)平板上生長(zhǎng)。通過(guò)使用M13引物的PCR，菌落 進(jìn)一步經(jīng)過(guò)質(zhì)粒分離和插入分析。通過(guò)NaOH/SDS裂解方法分離質(zhì)粒（Sambrook等，前文）。 根據(jù)制造商的說(shuō)明，來(lái)自包含插入pHellsgate-8的attB-PHYAl的pD0N0R221質(zhì)粒的重組 反應(yīng)以?ομ 1的總體積進(jìn)行，其中2μ I LR克隆酶緩沖液（Invitrogen，美國(guó)）、2μ 1重組 體 pD0N0R221-attB-PHYAl (150ng)、300ng pHellsgate-8 和 2 μ I LR 克隆酶（Invitrogen， 美國(guó)）。反應(yīng)混合物在室溫下孵化過(guò)夜，用蛋白酶K處理并且2μ I的等分試樣被轉(zhuǎn)化進(jìn)入 DH5-細(xì)胞（Invitrogen，美國(guó)）。細(xì)胞在包含選擇性抗生素奇霉素的LB平板上生長(zhǎng)。挑取 菌落用于進(jìn)一步確認(rèn)與attB-位點(diǎn)的正確重組。用XhoI (用于有義方向）和Xba(反義方 向）進(jìn)行限制性酶切分析；如Helliwell等描述（前文）的，選擇經(jīng)驗(yàn)證的克隆用于進(jìn)一步 的RNAi載體制備。
[0103] 表I. PCR-擴(kuò)增、載體構(gòu)建和實(shí)時(shí)定量PCR. 11的引物對(duì)和探針
[0104]

【權(quán)利要求】
1. 分離的或重組多核苷酸分子，其包括編碼陸地棉的PHYAl多肽的一部分鉸鏈區(qū)的 DNA序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸分子，其中所述DNA序列包括編碼所述 PHYAl多肽的一部分鉸鏈區(qū)的213個(gè)連續(xù)核苷酸堿基對(duì)分子。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸分子，其中所述DNA序列是SEQ ID NO: 1或 與其完全互補(bǔ)的序列。
4. 編碼PHYAl多核苷酸基因序列的發(fā)夾核酸構(gòu)建體，其包括陸地棉的PHYAl基因的一 部分鉸鏈區(qū)的約213個(gè)連續(xù)的有義核苷酸堿基對(duì)和其反義互補(bǔ)物，以致當(dāng)?shù)谝欢嗪塑账嵝?列和第二多核苷酸序列轉(zhuǎn)錄成核糖核酸時(shí)雜交以形成發(fā)夾樣雙鏈核糖核苷酸分子。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的發(fā)夾核酸構(gòu)建體，其中213個(gè)連續(xù)的有義核苷酸堿基對(duì)部分 的鉸鏈區(qū)是所述序列SEQ ID NO: 1。
6. 包括PHYAl RNAi構(gòu)建體的重組雙元載體，其中所述構(gòu)建體包括來(lái)自PHYAl基因鉸鏈 區(qū)的約213個(gè)連續(xù)堿基對(duì)的核苷酸序列，其中花椰菜花葉病毒（CaMV)的35S啟動(dòng)子存在于 緊靠 PHYAl發(fā)夾上游的核苷酸序列中，每個(gè)構(gòu)建體由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的接種遞送，產(chǎn)生體外重 組和PHYAl基因的抑制以及改變的其他光敏色素的表達(dá)水平。
7. 宿主細(xì)胞，其包括權(quán)利要求6所述的PHYAl RNAi雙元載體構(gòu)建體。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞是真雙子葉植物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞是棉花植株。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的宿主細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自選自由菊類植物 (Asteroids)和薔薇類植物組成的組中的植物。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其中所述植物細(xì)胞來(lái)自選自由下述所組成的組 中的植物：擬南芥、西紅柿、馬鈴薯、柑桔、蘿卜、胡蘿卜、花椰菜、大麥、棉花、葡萄、玉米、苜 蓿、水稻、大豆和小麥。
13. 降低植物中光敏色素 Al水平的方法，所述方法包括在所述植物中表達(dá)編碼PHYAl 基因序列的異源核酸構(gòu)建體，所述PHYAl基因序列包括雙子葉植物的PHYAl基因的一部分 鉸鏈區(qū)的約213個(gè)連續(xù)的有義核苷酸堿基對(duì)和其反義互補(bǔ)物，其中所述表達(dá)誘導(dǎo)所述植物 中的RNA干擾（RNAi)從而產(chǎn)生表現(xiàn)出下述特征中的一種或多種的植物：相對(duì)于在正常太陽(yáng) 光下栽培的野生型雙子葉植物，伸長(zhǎng)的葉柄、伸長(zhǎng)的果枝、伸長(zhǎng)的棉鈴花梗和伸長(zhǎng)的根系、 旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、早開花、棉鈴早成熟、莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉積、增加的纖維長(zhǎng) 度、提高的纖維強(qiáng)度、提高的纖維馬克隆值、提高的纖維均勻性和增加的纖維產(chǎn)量。
14. 用于降低棉花植株中光敏色素 Al水平的方法，所述方法包括在所述植株中表達(dá)編 碼PHYAl基因序列的異源核酸的構(gòu)建體，所述PHYAl基因序列包括棉屬PHYAl基因的一部 分鉸鏈區(qū)的約213個(gè)連續(xù)的有義核苷酸堿基對(duì)和其反義互補(bǔ)物，其中所述表達(dá)誘導(dǎo)所述植 物中的RNA干擾（RNAi)從而產(chǎn)生生產(chǎn)出表現(xiàn)一種或多種改善的纖維品質(zhì)特征的長(zhǎng)纖維的 植物，其中所述特征是強(qiáng)度、馬克隆值、伸長(zhǎng)率和均勻性。
15. 用于降低棉花植株中光敏色素 Al水平的方法，所述方法包括在所述植物中表達(dá)編 碼PHYAl基因序列的異源核酸構(gòu)建體，所述PHYAl基因序列包括棉屬PHYAl基因的一部分 鉸鏈區(qū)的大約213個(gè)連續(xù)的有義核苷酸堿基對(duì)和其反義互補(bǔ)物，其中所述表達(dá)誘導(dǎo)所述植 物中的RNA干擾（RNAi)從而產(chǎn)生表現(xiàn)出一種或多種下述特征的植物或所述植物的子代：相 對(duì)于在正常太陽(yáng)光下栽培的野生型棉花植株，伸長(zhǎng)的葉柄、伸長(zhǎng)的果枝、伸長(zhǎng)的棉鈴花梗和 伸長(zhǎng)的根系、旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、早開花和棉鈴早成熟、莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉積、 增加的籽棉產(chǎn)量以及一種或多種改善的纖維品質(zhì)特征，其中所述特征是強(qiáng)度、馬克隆值、伸 長(zhǎng)率和均勻性。
16. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述植物選自菊類植物（Asteroids)和薔薇類 植物。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述植物選自由如下所組成的組中的植物：擬 南芥、西紅柿、馬鈴薯、柑桔、蘿卜、胡蘿卜、花椰菜、大麥、棉花、葡萄、玉米、苜蓿、水稻、大豆 和小麥。
18. 用于修飾或抑制棉種細(xì)胞中PHYAl基因表達(dá)的方法，所述方法包括：用載體轉(zhuǎn)化 植物，所述載體包括編碼dsRNA且可操作地連接至啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列的核酸序列；選 擇已經(jīng)將所述核酸序列整合到它們的基因組中的轉(zhuǎn)化植株；篩選表達(dá)所述核酸序列編碼的 dsRNA的轉(zhuǎn)化植株，以及選擇表達(dá)所述dsRNA和/或siRNA的植株。
19. 用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因棉花植株的方法，其中所述棉花的PHYAl基因被抑制，所述方法包 括：(a)用本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體穩(wěn)定轉(zhuǎn)化宿主棉花植株細(xì)胞，（b)從所述穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的 宿主棉花植株細(xì)胞體細(xì)胞再生轉(zhuǎn)基因植株；以及（c)使所述轉(zhuǎn)基因植物在所述植株表現(xiàn)出 改變的光敏形態(tài)發(fā)生特征的條件下生長(zhǎng)，所述改變的光敏形態(tài)發(fā)生特征包括改變的植株株 型，所述植物表現(xiàn)出下述特征的一種或多種：伸長(zhǎng)的葉柄、伸長(zhǎng)的果枝、伸長(zhǎng)的棉鈴花梗、伸 長(zhǎng)的根系、旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、早開花和棉鈴早成熟、莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉積、增 加的籽棉產(chǎn)量和一種或多種改善的纖維品質(zhì)特征，其中所述特征是強(qiáng)度、馬克隆值、伸長(zhǎng)率 和均勻性。
20. 通過(guò)權(quán)利要求14所述的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因棉花植株或其子代，其包括權(quán)利要求6 所述的PHYAl RNAi構(gòu)建體，所述植株表現(xiàn)出改變表達(dá)的光敏形態(tài)發(fā)生特征，所述改變表達(dá) 的光敏形態(tài)發(fā)生特征包括改變的植株株型，所述植物表現(xiàn)出下述特征的一種或多種：與野 生型非轉(zhuǎn)化的棉花植株相比，伸長(zhǎng)的葉柄、伸長(zhǎng)的果枝、伸長(zhǎng)的棉鈴花梗和伸長(zhǎng)的根系、旺 盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、早開花和棉鈴早成熟、莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉積、增加的籽棉產(chǎn)量 和一種或多種改善的纖維品質(zhì)特征，其中所述特征是強(qiáng)度、馬克隆值、伸長(zhǎng)率和均勻性。
21. 轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞，其包括權(quán)利要求6所述的PHYAl RNAi構(gòu)建體。
22. 轉(zhuǎn)基因棉花植株，其包括權(quán)利要求6所述的PHYAl RNAi構(gòu)建體，其中所述轉(zhuǎn)基因植 物表現(xiàn)出棉花纖維相對(duì)于野生型棉花植株長(zhǎng)度和強(qiáng)度增加以及馬克隆值、伸長(zhǎng)率和纖維均 勻性改善。
23. 權(quán)利要求20所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因種子，其包括本發(fā)明所述的PHYAl RNAi構(gòu)建 體。
24. 權(quán)利要求6所述的PHYAl RNAi構(gòu)建體已經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物、植物細(xì)胞和植物部分以及 植物種子。
25. 改變植物特征的方法，其通過(guò)改變本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體的拷貝數(shù)以便增強(qiáng) 抑制。
26. 改變植物特征的方法，其通過(guò)改變本發(fā)明的PHYAl RNAi構(gòu)建體的拷貝數(shù)以便增強(qiáng) PHYB/C/E基因表達(dá)。
27. 轉(zhuǎn)基因棉花細(xì)胞，其包括權(quán)利要求6所述的PHYAl RNAi構(gòu)建體，其中從所述細(xì)胞再 生的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出PHYAl基因的抑制和PHYB/C/E基因的過(guò)表達(dá)，從而產(chǎn)生顯示出改變 的植株株型的植株，所述植株表現(xiàn)出下述特征的一種或多種：與野生型非轉(zhuǎn)化的棉花植株 相比，伸長(zhǎng)的葉柄、伸長(zhǎng)的果枝、伸長(zhǎng)的棉鈴花梗和伸長(zhǎng)的根系、旺盛的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、早開花和 棉鈴早成熟、莖葉中增強(qiáng)衰老的花青素色素沉積、增加的籽棉產(chǎn)量和一種或多種改善的纖 維品質(zhì)特征，其中所述特征是強(qiáng)度、馬克隆值、伸長(zhǎng)率和均勻性。
28. -種方法，其在常規(guī)育種中利用權(quán)利要求20-22、24和27中任一項(xiàng)所述轉(zhuǎn)基因植物 以生產(chǎn)具有相同特征的更多轉(zhuǎn)化植株或在其他各種相同的或相關(guān)植物種或雜交植物中引 入所述基因構(gòu)建體用于減少PHYAl的表型表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N15/29GK104320968SQ201380022173
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月28日
【發(fā)明者】伊布羅欽·Y·阿卜杜拉赫莫諾夫, 薩瓦拉達(dá)斯特·T·布列夫, 阿卜杜撒托·阿卜杜卡里默夫, 約尼·諾頓·詹金斯, 蘇庫(kù)馬爾·薩哈, 阿蘭·E·佩珀 申請(qǐng)人:基因組學(xué)和生物信息學(xué)中心，烏茲別克斯坦科學(xué)院及農(nóng)業(yè)和水資源部，棉花工業(yè)協(xié)會(huì), 美國(guó)農(nóng)業(yè)部, 得克薩斯A&M大學(xué)系統(tǒng)