核酸的擴(kuò)增方法及擴(kuò)增核酸的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于進(jìn)行有效的雜交的核酸的擴(kuò)增/檢測(cè)方法及用于這些方法的檢測(cè)器/試劑盒。在對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，以兩末端具有單鏈區(qū)的雙鏈核酸的形式進(jìn)行擴(kuò)增、檢測(cè)。另外，提供一種使用了這些靶核酸的檢測(cè)設(shè)備/試劑盒。
【專利說(shuō)明】核酸的擴(kuò)增方法及擴(kuò)增核酸的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種核酸的擴(kuò)增方法及利用該方法進(jìn)行了擴(kuò)增的核酸的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在分子生物學(xué)的研究領(lǐng)域、基因檢測(cè)等臨床應(yīng)用領(lǐng)域中，對(duì)靶核酸序列進(jìn)行特異 性地?cái)U(kuò)增的方法成為非常重要的技術(shù)。作為對(duì)利用核酸擴(kuò)增法得到的擴(kuò)增產(chǎn)物特異性地進(jìn) 行檢測(cè)的方法之一有將含有靶序列的核酸片段固定于固相來(lái)進(jìn)行檢測(cè)的方法。在該方法 中，可通過(guò)特異性地將靶核酸捕捉于固相，利用清洗等容易地將非特異性的核酸序列除去， 提1?檢測(cè)特異性。
[0003] 此時(shí)，作為將靶核酸捕捉于固相的方法，可以舉出：利用可形成特異性結(jié)合的抗 原-抗體的組合、或者配體-受體的組合的方法。例如，在非專利文獻(xiàn)1中公開(kāi)了使用下述 引物并進(jìn)行了擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的檢測(cè)法，所述引物是對(duì)一個(gè)引物的末端進(jìn)行生物素修飾且 對(duì)另一個(gè)引物進(jìn)行了熒光物質(zhì)修飾而成。在該方法中，使PCR產(chǎn)物與由鏈霉親和素-瓊脂 糖構(gòu)成的固相接觸，形成鏈霉親和素-生物素復(fù)合物，由此使其與固相結(jié)合，對(duì)所述熒光測(cè) 定，從而可檢測(cè)目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0004] 但是，可用于標(biāo)識(shí)的抗原/抗體或配體/受體的組合有限制，因此，實(shí)質(zhì)上難以同 時(shí)對(duì)多個(gè)靶核酸進(jìn)行檢測(cè)。另外，熒光標(biāo)識(shí)核酸也具有成本昂貴這樣的問(wèn)題。
[0005] 作為將靶核酸捕捉于固相的另一方法有將由具有與靶核酸互補(bǔ)的序列的寡核苷 酸構(gòu)成的探針固定在固相上，基于靶核酸與探針的雜交，將靶核酸間接地固定于固相的方 法。在該方法中，對(duì)由形成雜交而引起的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)。這樣的核酸分析法可通過(guò)改 變探針序列一次性對(duì)多個(gè)靶序列進(jìn)行分析。
[0006] 但是，為了使進(jìn)行了固定的探針與靶核酸在固相上進(jìn)行雜交，通常需要利用熱處 理使通過(guò)PCR法進(jìn)行了擴(kuò)增的雙鏈核酸改性為單鏈的工序，但不僅加熱處理復(fù)雜，還存在 由再退火引起的雜交效率的降低的問(wèn)題。另外，單鏈DNA也存在易于發(fā)生球狀化，檢測(cè)靈敏 度差這樣的問(wèn)題。在專利文獻(xiàn)1中，公開(kāi)一種在不進(jìn)行加熱處理而通過(guò)核酸酶處理來(lái)對(duì)單 鏈核酸進(jìn)行擴(kuò)增的方法，但其也存在操作復(fù)雜、發(fā)生單鏈球狀化的問(wèn)題。
[0007] 在核酸的檢測(cè)方法中，也有作為操作性優(yōu)異、迅速、簡(jiǎn)便的靶核酸的檢測(cè)方法，即 專利文獻(xiàn)2中記載的基于色譜的方法。該方法為在單一基因檢測(cè)裝置上基于毛細(xì)管作用 使含有任意所提取的基因或其片段的液體試樣轉(zhuǎn)移而連續(xù)地進(jìn)行如下工序的基因檢測(cè)方 法：從細(xì)胞、病毒或細(xì)菌中提取基因的工序；對(duì)任意提取的基因進(jìn)行片段化工序；以及檢測(cè) 工序?？膳袛嗍欠翊嬖谀繕?biāo)基因，進(jìn)而對(duì)其種類進(jìn)行鑒定。其中，在專利文獻(xiàn)2中也利用 NASBA法對(duì)單鏈核酸進(jìn)行擴(kuò)增。單鏈核酸在使用上的問(wèn)題如上所述。
[0008] 為了解決上述的問(wèn)題，在專利文獻(xiàn)3及專利文獻(xiàn)4中，在引物區(qū)的5'側(cè)具有對(duì)基 于DNA聚合酶的核酸合成進(jìn)行抑制非天然型核酸標(biāo)簽、發(fā)夾結(jié)構(gòu)或假結(jié)結(jié)構(gòu)，由此在PCR反 應(yīng)后在雙鏈核酸的一方任然殘留單鏈區(qū)。僅使用特殊的引物來(lái)進(jìn)行PCR反應(yīng)在下述的方面 優(yōu)異，即，可制作在雙鏈DNA中一條鏈的末端具有可雜交的單鏈區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物。但是，檢測(cè) 中需要熒光標(biāo)識(shí)及利用表面等離波子共振差成像的檢測(cè)，因此需要昂貴的專用裝置，在迅 速性、簡(jiǎn)便性方面存在問(wèn)題。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0010] 專利文獻(xiàn)
[0011] 專利文獻(xiàn)1 :日本特開(kāi)平5-252998號(hào)公報(bào)
[0012] 專利文獻(xiàn)2 :日本特開(kāi)2006-201062號(hào)公報(bào)
[0013] 專利文獻(xiàn)3:國(guó)際公開(kāi)第2006/095550號(hào)冊(cè)
[0014] 專利文獻(xiàn)4 :日本特開(kāi)2009-296948號(hào)公報(bào)
[0015] 非專利文獻(xiàn)
[0016] 非專利文獻(xiàn) 1 Analytical biochemistry, 193, 231-235，（1991)


【發(fā)明內(nèi)容】

[0017] 發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0018] 在臨床的基因診斷及檢測(cè)中，由于需要大型且昂貴的檢測(cè)裝置，并需要檢測(cè)時(shí)間， 因此，大多要求患者的檢測(cè)費(fèi)用及多次的到醫(yī)院看病而產(chǎn)生的麻煩及負(fù)擔(dān)。因此，從需要在 保持檢測(cè)的準(zhǔn)確性的同時(shí)減輕患者及檢測(cè)者的負(fù)擔(dān)這樣的理由考慮，需要簡(jiǎn)便、迅速、特異 性高的方法，且成本低且不需要特殊的裝置的方法。本發(fā)明為鑒于所述問(wèn)題而完成的，其目 的在于解決下述問(wèn)題：提供一種充分利用雜交法的高特異性，且減少PCR產(chǎn)物的檢測(cè)工序 中所需要的時(shí)間和工序，并且不需要特殊的設(shè)備，以目視簡(jiǎn)便且高精度地進(jìn)行檢測(cè)的核酸 檢測(cè)方法、及核酸檢測(cè)設(shè)備或試劑盒。進(jìn)而，目前需要對(duì)每個(gè)靶核酸制作昂貴的標(biāo)識(shí)標(biāo)簽， 在工序和成本方面有改善的余地。
[0019] 用于解決問(wèn)題的方法
[0020] 本發(fā)明人等為了解決上述問(wèn)題進(jìn)行了潛心研究，結(jié)果獨(dú)自地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用引物 組，其具有與各自的引物主體部的5'末端連結(jié)的在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中未進(jìn)行雙鏈化的標(biāo)簽 區(qū)，以兩末端分別具有單鏈區(qū)的雙鏈核酸的形式對(duì)靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增，使該擴(kuò)增片段與固相 結(jié)合來(lái)對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，所述固相具有能夠與所述單鏈區(qū)的一條鏈進(jìn)行雜交的寡核苷酸探 針，由此可在不需要特殊的裝置的情況下，簡(jiǎn)便且高精度地對(duì)所述DNA擴(kuò)增片段進(jìn)行檢測(cè)， 從而完成了本發(fā)明。
[0021] 即，本發(fā)明涉及一種核酸的擴(kuò)增方法，其使用5'末端側(cè)連接有不會(huì)通過(guò)核酸擴(kuò)增 反應(yīng)而雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)的引物來(lái)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而得到在兩末端具有單鏈區(qū)的核 酸。
[0022] 優(yōu)選標(biāo)簽區(qū)經(jīng)由間隔區(qū)與引物連接。
[0023] 優(yōu)選間隔區(qū)含有核酸衍生物。
[0024] 優(yōu)選核酸衍生物為選自L型核酸、3-脫氧-2-羥基-dN、修飾堿基核酸、損傷堿基 核酸、磷酸結(jié)合部位修飾核酸、RNA、2' -OMe-Ν及它們的衍生物中的至少1種以上。
[0025] 優(yōu)選L型核酸選自L型DNA、L型RNA及它們的衍生物中的至少1種以上。
[0026] 優(yōu)選3-脫氧-2-羥基-dN通過(guò)2' -5'結(jié)合與引物連接。
[0027] 優(yōu)選修飾堿基核酸含有發(fā)色團(tuán)或生物素。
[0028] 優(yōu)選發(fā)色團(tuán)選自芘、亞乙烯基、吡咯并、茈、熒光素、FITC、Cy3、Cy5、TAMRA、DABCYL、 花青苷及它們的衍生物中的至少1種以上。
[0029] 優(yōu)選損傷堿基核酸選自脫堿基核苷酸、5-羥甲基-dN及它們的衍生物中的至少1 種以上。
[0030] 優(yōu)選修飾磷酸結(jié)合部位核酸含有硫代磷酸酯或其衍生物。
[0031] 優(yōu)選核酸衍生物通過(guò)5' -5'結(jié)合與引物連接，且通過(guò)3' -3'結(jié)合與標(biāo)簽區(qū)連接。
[0032] 優(yōu)選間隔區(qū)含有非核酸衍生物。
[0033] 優(yōu)選非核酸衍生物具有D-蘇氨醇骨架。
[0034] 優(yōu)選在D-蘇氨醇骨架上導(dǎo)入有選自偶氮苯、生物素、EDTA及發(fā)色團(tuán)中的至少1種 以上。
[0035] 優(yōu)選發(fā)色團(tuán)選自芘、亞乙烯基、吡咯并、茈、熒光素、FITC、Cy3、Cy5、TAMRA、DABCYL、 花青苷及它們的衍生物中的至少1種以上。
[0036] 優(yōu)選非核酸衍生物選自碳鏈（Cn)、聚乙二醇鏈（(CH2CH 20)n)、含有二硫醚的鏈 (CnSSCn)及二硫醇亞磷酰胺中的至少1種以上。
[0037] 優(yōu)選間隔區(qū)為多種及/或多個(gè)。
[0038] 另外，本發(fā)明涉及一種核酸的檢測(cè)方法，其中，對(duì)上述的核酸的擴(kuò)增方法中所得到 的兩末端具有單鏈區(qū)的核酸進(jìn)行檢測(cè)。
[0039] 優(yōu)選包括將含有與一個(gè)單鏈區(qū)互補(bǔ)的序列的第一寡核苷酸探針固定于固相的工 序及使所述第一寡核苷酸探針與兩末端具有單鏈區(qū)的核酸進(jìn)行雜交的工序。
[0040] 優(yōu)選進(jìn)一步包括使含有與另一個(gè)單鏈區(qū)互補(bǔ)的序列的第二寡核苷酸探針與標(biāo)記 物質(zhì)結(jié)合的工序及使所述第二寡核苷酸探針與兩末端具有單鏈區(qū)的核酸進(jìn)行雜交的工序。
[0041] 優(yōu)選還包括目視辨別核酸的工序。
[0042] 優(yōu)選標(biāo)記物質(zhì)為著色載體。
[0043] 優(yōu)選在核酸檢測(cè)設(shè)備上對(duì)兩末端具有單鏈區(qū)的核酸進(jìn)行檢測(cè)。
[0044] 優(yōu)選核酸檢測(cè)設(shè)備為陣列檢測(cè)器或色譜檢測(cè)器。
[0045] 發(fā)明效果
[0046] 根據(jù)本發(fā)明，由于標(biāo)簽區(qū)不會(huì)通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)而雙鏈化，因此可以得到兩末端 具有單鏈區(qū)且利用雜交進(jìn)行高效率檢測(cè)的核酸。
[0047] 進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明，可以利用核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈區(qū)使核酸擴(kuò)增產(chǎn)物特異性地與 固相結(jié)合，進(jìn)而可以利用另一條單鏈區(qū)與標(biāo)識(shí)化合物形成復(fù)合物，在不使用特殊裝置的情 況下，可簡(jiǎn)便、迅速地目視判定核酸擴(kuò)增產(chǎn)物。進(jìn)而，與全長(zhǎng)單鏈的檢測(cè)相比，通過(guò)對(duì)結(jié)構(gòu)上 穩(wěn)定的雙鏈核酸進(jìn)行檢測(cè)，可提高檢測(cè)靈敏度。另外，通過(guò)準(zhǔn)備多種為了與固相結(jié)合的擴(kuò)增 產(chǎn)物的單鏈區(qū)、以及與其互補(bǔ)的固相上的寡核苷酸探針的組合，也可以同時(shí)辨別試樣中存 在的2種以上的靶核酸。進(jìn)而，可通過(guò)廉價(jià)的聯(lián)合引物對(duì)所有的靶核酸附加同一單鏈區(qū)。可 利用其同一單鏈區(qū)，使用同一標(biāo)簽標(biāo)識(shí)及設(shè)備來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。該情況下，不需要對(duì)每個(gè)靶核酸 制作成昂貴的標(biāo)簽標(biāo)識(shí)，可大幅地改善工序和成本。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0048] 圖1是本發(fā)明的PCR用引物的示意圖；
[0049] 圖2是本發(fā)明的PCR用第一引物的示意圖；
[0050] 圖3是本發(fā)明的PCR用第二引物的示意圖；
[0051] 圖4是本發(fā)明中部分雙鏈核酸合成法的示意圖；
[0052] 圖5是本發(fā)明中部分雙鏈核酸合成法的另一實(shí)施方式的示意圖；
[0053] 圖6是示出本發(fā)明的核酸色譜設(shè)備的一個(gè)例子的簡(jiǎn)圖；
[0054] 圖7是本發(fā)明中的PCR產(chǎn)物檢測(cè)原理的示意圖；
[0055] 圖8是示出本發(fā)明的微陣列（DNA晶片）的一個(gè)例子的簡(jiǎn)圖；
[0056] 圖9是示出本發(fā)明的珠載體的一個(gè)例子的簡(jiǎn)圖；
[0057] 圖10是參考例的改性PAGE的結(jié)果的一個(gè)例子；
[0058] 圖11是利用實(shí)施例1的核酸色譜條對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果的一個(gè)例子；
[0059] 圖12是利用實(shí)施例13的色譜條對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果；
[0060] 圖13是實(shí)施例14中使用的靶1的示意圖；
[0061] 圖14是實(shí)施例14中使用的靶2的示意圖。

【具體實(shí)施方式】
[0062] 本發(fā)明涉及一種核酸的擴(kuò)增方法，其使用5'末端連接有不會(huì)通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)而 雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)的引物來(lái)進(jìn)行核酸增幅反應(yīng)，從而得到在兩末端具有單鏈區(qū)的核酸。作為 核酸，例如可以舉出：DNA、RNA。核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的兩末端的單鏈區(qū)優(yōu)選含有天然的核苷酸。 進(jìn)而，本發(fā)明涉及一種核酸的檢測(cè)方法，其包括對(duì)所述的核酸的擴(kuò)增方法中所得到的兩末 端具有單鏈區(qū)的核酸進(jìn)行檢測(cè)的工序。
[0063] 在兩末端具有單鏈區(qū)的核酸可通過(guò)對(duì)模板試樣DNA使用特定的引物組來(lái)進(jìn)行核 酸擴(kuò)增反應(yīng)而得到。在兩末端具有單鏈區(qū)的核酸優(yōu)選為雙鏈DNA擴(kuò)增片段且在兩末端具有 單鏈區(qū)。
[0064] 試樣DNA沒(méi)有特別限定，只要可以用作核酸擴(kuò)增反應(yīng)的模板即可。具體而言，可以 使用血液、體液、組織、口腔內(nèi)粘膜、毛發(fā)、指甲、培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物、植物、微生物等源自所有生 物試樣的DNA。另外，上述試樣DNA可以為基因組DNA、cDNA、線粒體DNA、及葉綠體DNA等。 另外，也可以使用以RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后得到的cDNA。這些DNA只要根據(jù)進(jìn)行了 擴(kuò)增的DNA片段適時(shí)進(jìn)行選擇即可。另外，試樣DNA不需要進(jìn)行了精制的DNA，在核酸擴(kuò)增 反應(yīng)中可以直接應(yīng)用含有試樣DNA的細(xì)胞及組織而不用進(jìn)行精制處理。
[0065] 在兩末端具有單鏈區(qū)的雙鏈DNA擴(kuò)增片段優(yōu)選為在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中使用2個(gè)以上 具有未雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)的引物并利用核酸擴(kuò)增法而得到的產(chǎn)物。此時(shí)，雙鏈DNA擴(kuò)增片段 的兩末端的單鏈區(qū)為來(lái)自用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物中不會(huì)通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)而雙鏈化的 標(biāo)簽區(qū)的區(qū)。
[0066] 圖1示出核酸擴(kuò)增用引物。該引物由引物主體區(qū)1及在上述引物主體部的5M則 且不會(huì)通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)而雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)2構(gòu)成。另外，在引物主體區(qū)與標(biāo)簽區(qū)之間，可 以具有間隔區(qū)作為聚合酶反應(yīng)抑制區(qū)3。
[0067] 另外，雙鏈DNA擴(kuò)增片段優(yōu)選為使用第一引物組以及第二引物組并利用核酸擴(kuò)增 法而得到的產(chǎn)物，所述第一引物組含有具有能夠與靶核酸模板進(jìn)行雜交的序列、以及不能 夠與該模板進(jìn)行雜交的共有序列的引物，所述第二引物組含有具有可與上述共有序列的互 補(bǔ)序列進(jìn)行雜交的序列、以及在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中未雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)的引物。圖2示出構(gòu)成 PCR用第一引物組的引物。PCR用第一引物（聯(lián)合引物）的特征在于包含能夠與靶核酸模 板進(jìn)行雜交的引物主體區(qū)4、以及在上述引物主體區(qū)的5'側(cè)與第二引物共有的序列構(gòu)成的 共有區(qū)5。圖3示出構(gòu)成PCR用第二引物組的引物。第二引物的特征在于包含具有與上述 第一引物共有的序列的引物主體區(qū)6、以及在主體區(qū)6的5'側(cè)不會(huì)通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)而雙 鏈化的標(biāo)簽區(qū)7。在第二引物主體區(qū)和標(biāo)簽區(qū)之間可以具有間隔區(qū)作為聚合酶反應(yīng)抑制區(qū) 8〇
[0068] 所謂引物主體區(qū)，是指具有能夠作為在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中的引物而發(fā)揮作用的堿基 序列的寡核苷酸區(qū)。具體而言，為靶核酸的靶堿基序列中可與5'末端側(cè)或3'末端側(cè)進(jìn)行雜 交的序列，通常為與靶堿基序列的5'末端側(cè)或3'末端側(cè)的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列。這 些引物主體區(qū)若可與靶核酸特異性地結(jié)合，則可以具有堿基缺損、插入及錯(cuò)配部位。引物主 體區(qū)的長(zhǎng)度優(yōu)選為8堿基以上，更優(yōu)選為12堿基以上，進(jìn)一步優(yōu)選為15堿基以上。另外， 引物的鏈長(zhǎng)沒(méi)有特別限定，但從其合成的成本等觀點(diǎn)考慮，通常優(yōu)選為50堿基以下或者40 堿基以下。
[0069] 引物的標(biāo)簽區(qū)優(yōu)選含有天然的核苷酸。所謂天然的核苷酸為由天然的腺嘌呤、胸 腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的堿基、脫氧核糖、核糖的糖部及磷酸基構(gòu)成的核苷酸，各 部分為未接受人工修飾的核苷酸。天然的核苷酸可以為D型核苷酸，也可以為L(zhǎng)型核苷酸。 所謂D型核苷酸，是指由D型的脫氧核糖或者核糖構(gòu)成的核苷酸。另外，所謂L型核苷酸， 是指由L型的脫氧核糖或者核糖構(gòu)成的核苷酸。標(biāo)簽區(qū)含有天然的核苷酸，由此達(dá)到合成 廉價(jià)且容易這樣的效果。另外，引物的標(biāo)簽區(qū)中天然核苷酸的比例優(yōu)選為5%以上，更優(yōu)選 為20%以上，進(jìn)一步優(yōu)選為50%以上，更進(jìn)一步優(yōu)選為70%以上，最優(yōu)選為90%以上。標(biāo) 簽區(qū)的長(zhǎng)度沒(méi)有特別限定，為了與互補(bǔ)鏈核酸進(jìn)行雜交，只要具有充分的長(zhǎng)度即可。通常為 5堿基?60堿基，優(yōu)選為6堿基?40堿基。
[0070] 引物的標(biāo)簽區(qū)的核酸的方向優(yōu)選沿與引物主體區(qū)同一方向進(jìn)行排列。通過(guò)引物的 標(biāo)簽區(qū)的核酸方向沿與引物主體區(qū)同一方向排列，起到合成廉價(jià)且容易這樣的效果。例如， 在偶氮苯這樣的非天然的化合物進(jìn)入標(biāo)簽區(qū)與引物主體區(qū)之間的情況下，即使標(biāo)簽區(qū)和引 物主體區(qū)未直接連接也優(yōu)選沿同一方向排列。在此，所謂核酸為同一方向是指相鄰的核苷 酸彼此不是核苷酸中糖的3'位或5'位，而是5'位和3'位之間形成的磷酸二酯結(jié)合。例 如，在標(biāo)簽區(qū)中，在核苷酸彼此通過(guò)磷酸二酯鍵在糖的5'位和3'位之間進(jìn)行結(jié)合的情況 下，在主體區(qū)中，也指核苷酸彼此在糖的5'位和3'位之間形成磷酸二酯鍵。
[0071] 就間隔區(qū)而言，含有通過(guò)聚合酶來(lái)對(duì)伸長(zhǎng)反應(yīng)進(jìn)行抑制的間隔區(qū)，可以抑制在核 酸的擴(kuò)增反應(yīng)的過(guò)程中對(duì)聚合酶引起的伸長(zhǎng)反應(yīng)進(jìn)行抑制從而保持標(biāo)簽區(qū)為單鏈結(jié)構(gòu)。間 隔區(qū)的結(jié)構(gòu)只要能夠?qū)酆厦敢鸬纳扉L(zhǎng)反應(yīng)進(jìn)行抑制就沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選含有核酸 衍生物或非核酸衍生物。
[0072] 核酸衍生物只要可對(duì)聚合酶引起的伸長(zhǎng)反應(yīng)進(jìn)行抑制且將保持標(biāo)簽區(qū)為單鏈結(jié) 構(gòu)就沒(méi)有特別限定。作為核酸衍生物，可以舉出：5' -5'結(jié)合及3' -3'結(jié)合這樣的倒位序 列結(jié)構(gòu)的核酸、如牢固的發(fā)夾結(jié)構(gòu)及假結(jié)結(jié)構(gòu)這樣的具有對(duì)聚合酶的作用進(jìn)行抑制的立體 結(jié)構(gòu)的核酸、L型核酸、3-脫氧-2-羥基-dN、修飾堿基核酸、損傷堿基核酸、磷酸結(jié)合部位 修飾核酸、RNA、2' -〇Me-N、BNA (LNA)及它們的衍生物。
[0073] 如化學(xué)式（1)所示，所謂5'-5'結(jié)合或者3'-3'結(jié)合為構(gòu)成DNA的脫氧核糖的5' 位與相鄰的脫氧核糖的5'位之間夾著磷酸基而進(jìn)行結(jié)合的結(jié)構(gòu)、或者3'位與相鄰的脫氧 核糖的3'位之間夾著磷酸基而進(jìn)行結(jié)合的結(jié)構(gòu)。與通常所謂的5'位與3'位的結(jié)合的方 向相反，因此稱為倒位序列結(jié)構(gòu)。作為具體的例子，可以舉出具有2次倒位結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)，使 得引物主體區(qū)的5'區(qū)與間隔區(qū)進(jìn)行5' -5'結(jié)合而連結(jié)、且上述標(biāo)簽區(qū)的3'末端與間隔區(qū) 進(jìn)行3' -3'結(jié)合而連結(jié)。另外，倒位結(jié)構(gòu)的次數(shù)只要至少包括1次即可，沒(méi)有特別限定，但 優(yōu)選包括偶數(shù)次。若具有偶數(shù)次的倒位結(jié)構(gòu)，則與通常的引物相同標(biāo)簽區(qū)的末端為5'位， 因此，可以對(duì)從標(biāo)簽區(qū)開(kāi)始進(jìn)行的非特異性伸長(zhǎng)反應(yīng)進(jìn)行抑制，且在檢測(cè)時(shí)有效。另外，間 隔區(qū)優(yōu)選設(shè)為5?60堿基而不是如化學(xué)式（1)所示的1個(gè)堿基，由此還可以兼具間隔區(qū)以 及標(biāo)簽兩者的作用。
[0074] [化學(xué)式1]
[0075]

【權(quán)利要求】
1. 一種核酸的擴(kuò)增方法，該方法包括，使用5'末端側(cè)連接有不會(huì)通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)而 雙鏈化的標(biāo)簽區(qū)的引物來(lái)進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，從而得到在兩末端具有單鏈區(qū)的核酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，標(biāo)簽區(qū)經(jīng)由間隔區(qū)與引物連接。
3. 如權(quán)利要求2所述的靶核酸的擴(kuò)增方法，其中，間隔區(qū)含有核酸衍生物。
4. 如權(quán)利要求3所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，核酸衍生物為選自L型核酸、3-脫 氧-2-羥基-dN、修飾堿基核酸、損傷堿基核酸、磷酸結(jié)合部位修飾核酸、RNA、2' -OMe-N及 它們的衍生物中的至少1種以上。
5. 如權(quán)利要求4所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，L型核酸選自L型DNA、L型RNA及它們 的衍生物中的至少1種以上。
6. 如權(quán)利要求4所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，3-脫氧-2-羥基-dN通過(guò)2'-5'結(jié)合 與引物連接。
7. 如權(quán)利要求4所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，修飾堿基核酸含有發(fā)色團(tuán)或生物素。
8. 如權(quán)利要求7所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，發(fā)色團(tuán)選自芘、亞乙烯基、吡咯并、茈、 熒光素、FITC、Cy3、Cy5、TAMRA、DABCYL、花青苷及它們的衍生物中的至少1種以上。
9. 如權(quán)利要求4所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，損傷堿基核酸選自脫堿基核苷酸、5-羥 甲基-dN及它們的衍生物中的至少1種以上。
10. 如權(quán)利要求4所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，磷酸結(jié)合部位修飾核酸含有硫代磷酸 酯或其衍生物。
11. 如權(quán)利要求3?10中任一項(xiàng)所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，核酸衍生物通過(guò)5'-5' 結(jié)合與引物連接，且通過(guò)3' -3'結(jié)合與標(biāo)簽區(qū)連接。
12. 如權(quán)利要求2所述的靶核酸的擴(kuò)增方法，其中，間隔區(qū)含有非核酸衍生物。
13. 如權(quán)利要求12所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，非核酸衍生物具有D-蘇氨醇骨架。
14. 如權(quán)利要求13所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，在D-蘇氨醇骨架上導(dǎo)入有選自偶氮 苯、生物素、EDTA及發(fā)色團(tuán)中的至少1種以上。
15. 如權(quán)利要求14所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，發(fā)色團(tuán)選自芘、亞乙烯基、吡咯并、 茈、熒光素、？11'(：、073、0 75、了41狀、0480￥1^、花青苷及它們的衍生物中的至少1種以上。
16. 如權(quán)利要求12所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，非核酸衍生物選自碳鏈（Cn)、聚乙二 醇鏈（(CH2CH 20)n)、含有二硫醚的鏈（CnSSCn)及二硫醇亞磷酰胺中的至少1種以上。
17. 如權(quán)利要求2所述的核酸的擴(kuò)增方法，其中，間隔區(qū)為多種及/或多個(gè)。
18. -種核酸的檢測(cè)方法，其中，對(duì)權(quán)利要求1?17中任一項(xiàng)所述的核酸的擴(kuò)增方法所 得到的兩末端具有單鏈區(qū)的核酸進(jìn)行檢測(cè)。
19. 如權(quán)利要求18所述的核酸的檢測(cè)方法，其包括： 將含有與一個(gè)單鏈區(qū)互補(bǔ)的序列的第一寡核苷酸探針固定于固相的工序；以及 使所述第一寡核苷酸探針與兩末端具有單鏈區(qū)的核酸進(jìn)行雜交的工序。
20. 如權(quán)利要求19所述的核酸的檢測(cè)方法，其進(jìn)一步包括：使含有與另一個(gè)單鏈區(qū)互 補(bǔ)的序列的第二寡核苷酸探針與標(biāo)記物質(zhì)結(jié)合的工序；以及 使所述第二寡核苷酸探針與兩末端具有單鏈區(qū)的核酸進(jìn)行雜交的工序。
21. 如權(quán)利要求20所述的核酸的檢測(cè)方法，其還包括目視辨別核酸的工序。
22. 如權(quán)利要求20或21所述的核酸的檢測(cè)方法，其中，標(biāo)記物質(zhì)為著色載體。
23. 如權(quán)利要求18?22中任一項(xiàng)所述的核酸的檢測(cè)方法，其中，在核酸檢測(cè)設(shè)備上對(duì) 兩末端具有單鏈區(qū)的核酸進(jìn)行檢測(cè)。
24. 如權(quán)利要求23所述的核酸的檢測(cè)方法，其中，核酸檢測(cè)設(shè)備為陣列檢測(cè)器或色譜 檢測(cè)器。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104254620SQ201380022347
【公開(kāi)日】2014年12月31日 申請(qǐng)日期:2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月27日
【發(fā)明者】高橋孝治, 宮本重彥, 直原啟明, 佐野創(chuàng)太郎, 友野潤(rùn) 申請(qǐng)人:株式會(huì)社鐘化