提取和儲存核酸的方法和組合物的制作方法
【專利摘要】本公開總體上涉及用于長期在環(huán)境條件下以干燥形式提取、穩(wěn)定和儲存核酸(特別是RNA)的固體基質(zhì)。也描述了從固體組合物提取、收集和回收核酸的方法。
【專利說明】提取和儲存核酸的方法和組合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本公開總體上涉及用于以干燥形式從生物樣品環(huán)境提取、穩(wěn)定和保存核酸的固體 組合物。本公開也描述從固體組合物提取、收集、保存和回收核酸的方法。
[0002] 發(fā)明背景 由于化學自水解和酶介導的降解兩者，RNA是最不穩(wěn)定的生物分子之一。因此，提取和 保存從生物樣品得到的RNA易受多種環(huán)境因素影響，包括但不限于用于提取或收集RNA的 緩沖劑、pH、溫度，特別是強力（robust)核糖核酸酶（RNases)的普遍存在。因此，純化和未 純化狀態(tài)的RNA -般都需要在-80°C儲存，以防止水解和酶降解，并保持RNA樣品的完整性。 為了避免與_80°C冷凍相關(guān)的成本和空間要求，在環(huán)境條件下提取、收集和保存RNA的能力 在經(jīng)濟上合乎需要。
[0003] 目前在環(huán)境條件下以液態(tài)保存RNA的方法集中在RNA酶（RNases)的失活，例如， 通過使用去污劑、離液化合物（chaotropic compound)、還原劑、過渡金屬、有機溶劑、螯合 齊U、蛋白酶、RNA酶肽抑制劑和抗RNA酶抗體。另外的努力已集中在使RNA化學修飾，以防 止酯交換和自水解。但很多市售RNA保存產(chǎn)品僅可在室溫保存RNA數(shù)天或數(shù)星期。聲稱以 干燥形式成功收集和保存RNA的目前技術(shù)一般需要在儲存RNA之前首先使RNA從生物材料 (例如，生物樣品，如血液、血清、組織、唾液等）"預純化"并濃縮。
[0004] 以干燥形式保存RNA的目前技術(shù)還需要另外的干燥設備。因此，這些方法無助于 在不進行顯著樣品處理的情況下從樣品（例如，生物樣品）直接收集RNA。
[0005] 因此，本領(lǐng)域期需且需要將從樣品（例如，生物樣品）提取、穩(wěn)定和儲存/保存RNA 整合在單一過程內(nèi)的組合物和方法。這些組合物和方法允許在環(huán)境條件下長期儲存RNA，并 允許回收完整的RNA用于進一步分析。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 描述了從樣品（例如，下文限定的生物樣品）提取和儲存核酸的固體基質(zhì)，其中包 含蛋白變性劑、還原劑和緩沖劑的組合物在固體基質(zhì)中以干燥形式存在。本申請的固體基 質(zhì)允許在環(huán)境條件下以干燥形式長期儲存RNA和DNA?？墒挂愿稍镄问桨怂幔ɡ?， RNA)的固體基質(zhì)經(jīng)過一個過程，從而以適用于進一步分析所收集的核酸樣品的完整形式從 固體基質(zhì)釋放核酸。也提供了用本發(fā)明的固體基質(zhì)從生物樣品提取和儲存核酸的方法。
[0007] 附圖簡述 在參考附圖閱讀以下詳述時，化學改性的多孔薄膜的這些和其他特征、方面和優(yōu)點將 變得更好理解，其中在全部附圖中相同的符號代表相同的元件，其中： 圖1提供在將培養(yǎng)的人細胞點樣到不同組成的固體基質(zhì)后用電洗脫從纖維素回收的 核酸的代表性電泳圖。指出了高分子量基因組DNA和28s/18s rRNA帶。還提供了用Image J.的DNA和RNA的定量。在A組中從各泳道的頂部到底部劃垂直線，并且用標繪分布函數(shù) (Plot Profile function),將像素強度（灰度值任意單位）作為線距離（cm)的函數(shù)作圖。 在框中顯示相當于基因組DNA和28s/18s rRNA的峰。另外的試驗細節(jié)闡明于以下實施例 部分。
[0008] 圖2提供各描述的組合物的28s和18s rRNA的凝膠像素強度，顯示為灰度值任意 單位。分析前，纖維素樣品在干燥箱中在室溫儲存10天。28s與18s rRNA之比在圖上的各 條上闡明。另外的試驗細節(jié)闡明于以下實施例部分。
[0009] 圖3提供各描述的組合物的28s和18s rRNA的凝膠像素強度。分析前，纖維素樣 品在干燥箱中在室溫儲存13天。各試驗條件的28s與18s rRNA之比在圖上的各條上顯現(xiàn)。 另外的試驗細節(jié)闡明于以下實施例部分。
[0010] 圖4提供各描述的組合物的28s和18s rRNA的凝膠像素強度。分析前，纖維素樣 品在干燥箱中在室溫儲存10天。各試驗條件的28s與18s rRNA之比在圖上的各條上顯現(xiàn)。 另外的試驗細節(jié)闡明于以下實施例部分。
[0011] 圖5提供所示各組合物的28s和18s rRNA條帶的凝膠像素強度。分析前，纖維素 樣品在干燥箱中在室溫儲存30天。各試驗條件的28s與18s rRNA之比在圖上的各條上顯 現(xiàn)。另外的試驗細節(jié)闡明于以下實施例部分。
[0012] 圖6提供對于所列各條件從纖維素紙上的經(jīng)干燥血斑（blood spot)檢測的RNA 完整性計數(shù)（RIN)，這用 RNA 6000 Pico LabChips在 Agilent 2100 Bioanalyzer 生物分析 儀上測定。另外的試驗細節(jié)闡明于以下實施例部分。
[0013] 圖7提供了在纖維素紙上抗日光破壞的mRNA保護的證據(jù)。圖形中的各條表示包 含圖中所示組合物的UV處理和未處理樣品之間的qRT-PCR循環(huán)閾的差異。另外的試驗細 節(jié)闡明于以下實施例部分。
[0014] 圖8提供在不同緩沖劑存在下在不同溫度經(jīng)4星期時間在纖維素基紙上的TCEP 活性。另外的細節(jié)提供于實施例部分。
[0015] 發(fā)明詳述 本文描述從樣品（例如，生物樣品）提取并儲存核酸（例如，RNA、DNA或其組合）的固 體基質(zhì)，其中包含蛋白變性劑、還原劑和緩沖劑的組合物在固體基質(zhì)中以干燥狀態(tài)存在。本 發(fā)明的組合物允許在環(huán)境儲存條件下長期干燥保存核酸。關(guān)于RNA的環(huán)境保存（眾所周知 其是不穩(wěn)定的），這一觀察結(jié)果特別重要。本文所用術(shù)語"固體基質(zhì)"包括但不限于纖維素 基產(chǎn)品、纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維或其任何組合。本申請的固體基質(zhì)可以是多孔的。在 具體實施方案中，固體基質(zhì)為來自Whatman?的多孔纖維素紙，例如FTA?或FTA? Elute。 術(shù)語"提取"指從樣品（更具體地講，生物樣品）分離和分開核酸的任何方法。例如，核酸， 如RNA和DNA，可在空氣中蒸發(fā)性的樣品細胞裂解期間釋放，或者通過存在于化學改性固體 基質(zhì)（例如FTA? Elute纖維素紙）中的化合物（其與樣品接觸時引起細胞裂解并釋放核 酸）釋放。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應了解，可在公開的組合物和方法中使用使得從樣品（例如， 未純化生物樣品）提取核酸（特別是RNA)的任何方法，從而核酸能夠俘獲在固體基質(zhì)上用 于穩(wěn)定和保存核酸。從樣品提取核酸的方法的以上實例只為了說明目的提供。在本文中， 對于以適用于進一步分析的形式保持經(jīng)提取核酸，術(shù)語"儲存"或"保存"可互換使用。
[0016] 核酸（特別是RNA)領(lǐng)域的技術(shù)人員傳統(tǒng)上根據(jù)下列評價RNA的穩(wěn)定性和品質(zhì)： (l)mRNA靶的定量RT-PCR擴增；（2)在Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀上的RNA完 整性計數(shù)（RIN)分析；和（3) 28s: 18s核糖體RNA (rRNA)之比，這兼顧（compromise)總細胞 RNA的整體。高品質(zhì)細胞RNA -般顯示大于1的28s: 18s rRNA比，并且RIN評分接近10。 另外，高品質(zhì)細胞RNA支持低豐度和大的（例如，大于lkB) mRNA二者的有效擴增。為了方 便的目的，rRNA信號強度和28s: 18s rRNA之比通常用于通過凝膠電泳快速篩選并識別具 有強的RNA儲存性質(zhì)的樣品。
[0017] 本文限定的"生物樣品"包括但不限于從任何生物體（包括人）得到的血液、血清、 組織和唾液。生物樣品可由經(jīng)過自診斷檢驗（例如，血糖監(jiān)測）的個人得到，或者由受過訓 練的醫(yī)學專業(yè)人員通過多種技術(shù)得到，包括例如用針抽吸血液，或者刮或擦患者皮膚上的 特定區(qū)域，例如損傷處。收集各種生物樣品的方法在本領(lǐng)域熟知。術(shù)語"樣品"不僅包括以 上限定的生物樣品，而且還包括例如組織培養(yǎng)細胞和純化的核酸。
[0018] 包含蛋白變性劑、還原劑和緩沖劑的組合物存在于本公開的干燥固體基質(zhì)中。組 合物可包含一種或多種各以上所列組分。組合物可任選進一步包含紫外（UV)抑制劑、自由 基捕集劑、RNA酶抑制劑、螯合劑或其任何組合。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應了解，多種蛋白變性劑 在本領(lǐng)域已知，并且可經(jīng)驗性地選擇用于本文所述的組合物和方法。并非旨在受限于具體 的蛋白變性劑，示例性蛋白變性劑包括硫氰酸胍、鹽酸胍、精氨酸、十二烷基硫酸鈉（SDS)、 脲或其任何組合。示例性蛋白變性劑的示意圖如下所示：

【權(quán)利要求】
1. 一種用于從樣品提取和儲存核酸的固體基質(zhì)，其中包含至少一種蛋白變性劑、至少 一種還原劑和緩沖劑的組合物在固體基質(zhì)中以干燥狀態(tài)存在。
2. 權(quán)利要求1的固體基質(zhì)，其中所述樣品為生物樣品。
3. 權(quán)利要求1的固體基質(zhì)，其中在固體基質(zhì)中存在的組合物進一步包含UV抑制劑、自 由基捕集劑、螯合劑或其任何組合。
4. 權(quán)利要求1的固體基質(zhì)，其中在固體基質(zhì)中存在的組合物進一步包含RNA酶抑制 劑。
5. 權(quán)利要求1的固體基質(zhì)，其中所述固體基質(zhì)允許在環(huán)境條件下以干燥形式長期儲 存核酸。
6. 權(quán)利要求5的固體基質(zhì)，其中所述核酸為RNA、DNA或其組合。
7. 權(quán)利要求6的固體基質(zhì)，其中所述核酸為RNA。
8. 權(quán)利要求1的固體基質(zhì)，其中所述固體基質(zhì)為包含纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維 或其任何組合的多孔基質(zhì)。
9. 權(quán)利要求8的固體基質(zhì)，其中所述多孔基質(zhì)為纖維素紙。
10. 權(quán)利要求1的固體基質(zhì)，其中所述蛋白變性劑選自鹽酸胍、硫氰酸胍（GITC)、精氨 酸、十二烷基硫酸鈉（SDS)、脲及其任何組合。
11. 權(quán)利要求1的固體基質(zhì)，其中所述還原劑選自二硫蘇糖醇（DTT)、2-巰基乙醇 (2-ME)、三（2-羧基乙基）膦（TCEP)及其組合。
12. 權(quán)利要求1的固體基質(zhì)，其中所述緩沖劑選自2-氨基-2-羥基甲基-丙-1，3-二 醇（1'1^)、2-(^嗎啉代）乙磺酸（1^5)、3-(^嗎啉代）丙磺酸（厘(^5)、4-(2-羥基乙 基）-1_哌嗪乙磺酸（HEPES)、檸檬酸鹽緩沖劑和磷酸鹽緩沖劑。
13. 權(quán)利要求12的固體基質(zhì)，其中所述緩沖劑具有3-8之間的pH。
14. 權(quán)利要求3的固體基質(zhì)，其中UV防護劑或自由基捕集劑選自氫醌單甲醚（MEHQ)、 氫醌（HQ)、甲基氫醌（THQ)和抗壞血酸。
15. 權(quán)利要求4的固體基質(zhì)，其中所述RNA酶抑制劑為氧釩核糖核苷復合物（VRC)、核 苷酸類似物或市售RNA酶抑制劑。
16. 權(quán)利要求1的固體基質(zhì)，其中所述固體基質(zhì)為基于多孔纖維素的基質(zhì)，并且 a) 所述蛋白變性劑為GITC、去污劑或其組合； b) 所述還原劑為DTT、TCEP或其組合；并且 c) 所述緩沖劑為Tris、MES或MOPS。
17. 權(quán)利要求16的固體基質(zhì)，所述固體基質(zhì)進一步包含自由基捕集劑，其中自由基捕 集劑包括MEHQ、HQ、THQ或抗壞血酸。
18. -種從樣品提取和儲存核酸的方法，所述方法包括： a) 提供固體基質(zhì)，其中包含至少一種蛋白變性劑、至少一種還原劑、緩沖劑和任選的 自由基捕集劑的組合物在固體基質(zhì)中以干燥狀態(tài)存在； b) 將樣品施加到固體基質(zhì)，以收集核酸； c) 使固體基質(zhì)干燥；并且 d) 在環(huán)境條件下以干燥狀態(tài)在固體基質(zhì)上儲存核酸。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述方法進一步包括從固體基質(zhì)回收核酸。
20. 權(quán)利要求18的方法，其中所述樣品為生物樣品。
21. 權(quán)利要求20的方法，其中所述生物樣品為血液、血清、組織、唾液或細胞。
22. 權(quán)利要求18的方法，其中所述樣品為純化的核酸樣品或組織培養(yǎng)細胞制品。
23. 權(quán)利要求18的方法，其中不需要為了穩(wěn)定和保存核酸而在樣品施加到固體基質(zhì) 之前從樣品純化核酸。
24. 權(quán)利要求18的方法，其中所述方法允許在環(huán)境條件下以干燥形式長期儲存RNA。
25. 權(quán)利要求19的方法，其中通過使基質(zhì)在水溶液、緩沖劑或有機溶液中重新水合而 從固體基質(zhì)回收核酸，并且其中使核酸經(jīng)過進一步分析。
26. 權(quán)利要求19的方法，其中核酸通過電洗脫從固體基質(zhì)回收。
【文檔編號】C12N5/00GK104254776SQ201380022584
【公開日】2014年12月31日 申請日期:2013年4月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月30日
【發(fā)明者】李兵, D.R.穆爾, E.L.克瓦姆 申請人:通用電氣公司