使用來自棒曲霉(ASPERGILLUS CLAVATUS)的α-淀粉酶進行糖化的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種來自棒曲霉(Aspergillus clavatus)的真菌α-淀粉酶(AcAmy1)。AcAmy1具有4.5的最佳pH并且可在30-75℃下工作，以允許所述酶在糖化反應(yīng)中與葡糖淀粉酶組合使用。這消除了對將糖化反應(yīng)實施為分批過程的需求，在所述分批過程中必須對pH和溫度加以重新調(diào)整，以便最佳地使用所述α-淀粉酶或葡糖淀粉酶。AcAmy1還催化淀粉底物糖化為低聚糖組合物，所述低聚糖組合物與所述由來自白曲霉(Aspergillus kawachii)的α-淀粉酶催化的糖化產(chǎn)物相比，顯著地富含DP2和(DP1+DP2)。這通過在例如同步糖化發(fā)酵工藝中的發(fā)酵生物而促進對所述低聚糖組合物的利用。
【專利說明】使用來自棒曲霉（ASPERGILLUSCLAVATUS)的a-淀粉酶進 行糖化
[0001] 優(yōu)先權(quán)
[0002] 本專利申請要求提交于2012年5月11日的國際專利申請No. PCT/CN2012/075352 的優(yōu)先權(quán)，該專利申請全文以引用方式并入。
[0003] 序列表
[0004] 附件是包括SEQ ID NO: 1-13的序列表，其以引用方式整體并入本文。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0005] 使用來自棒曲霉的a -淀粉酶（AcAmyl)或其變體的方法，包括將淀粉糖化，例如， 同步糖化發(fā)酵（SSF)。

【背景技術(shù)】
[0006] 淀粉由直鏈淀粉（15-30%重量/重量）和支鏈淀粉（70-85%重量/重量）的混 合物組成。直鏈淀粉由a-1，4-連接的葡萄糖單元的直鏈組成，分子量（MW)為約60, 000 至約800, 000。支鏈淀粉是每24-30個葡萄糖單元含有a -1，6分支點的支鏈聚合物；其MW 可商達一億。
[0007] 濃縮右旋糖漿形式的得自淀粉的糖目前通過酶催化法制備，所述方法涉及：（1) 用a -淀粉酶將固體淀粉液化（或降低粘度）成平均聚合度為約7-10的糊精，以及（2)用 淀粉葡糖苷酶（也稱為葡糖淀粉酶或GA)將所得的液化淀粉（即淀粉水解物）糖化。所得 的糖漿具有高葡萄糖含量。大部分商業(yè)生產(chǎn)的葡萄糖漿隨后通過酶法異構(gòu)化為稱為異糖漿 (isosyrup)的右旋糖/果糖混合物。所得的糖漿也可用微生物（諸如酵母）發(fā)酵以產(chǎn)生商 品，包括例如乙醇、檸檬酸、乳酸、琥珀酸、衣康酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸鹽、賴氨酸、其他有機 酸、其他氨基酸和其他生物化學物質(zhì)?？赏瑫r進行發(fā)酵和糖化（即SSF工藝）來實現(xiàn)更大 的經(jīng)濟性和效率。
[0008] a -淀粉酶通過隨機裂解內(nèi)部a -1，4-糖苷鍵來水解淀粉、糖原和相關(guān)多糖。特別 是來自芽孢桿菌屬（Bacilli)的a-淀粉酶已被用于多種不同的用途，包括淀粉液化和糖 化、紡織物退漿、造紙和紙漿工業(yè)中的淀粉改性、釀造、烘焙、食品工業(yè)的糖漿的生產(chǎn)、發(fā)酵 工藝的原料的生產(chǎn)，以及用于動物飼料中以提高可消化性。這些酶也可用于在盤碟洗滌和 衣物洗滌過程中除去含淀粉污垢和污漬。
[0009] 若干曲霉屬（Aspergillus)物種，包括棒曲霉（A. clavatus)，在保持于酸性條件 下時顯不出強效淀粉分解行為。參見Nehira et al. (1956) "Taxonomic studies on the genus Aspergillus. VIII. The relation between the morphological characteristics and the amylolytic properties in the Aspergillus, ^Hakko Kogaku Zasshi 34:391-99, 423-28, 457-63 (Nehira等人，1956年，"曲霉屬的毒性研究VIII，曲霉屬的形 態(tài)學特征和淀粉分解特性之間的關(guān)系"，Hakko Kogaku Zasshi,第34卷，第391-399頁，第 423-428頁，第457-463頁）。例如，棒曲霉除多糖降解酶之外分泌淀粉酶活性，其允許該 真菌消化其環(huán)境中的復合碳水化合物。參見Ogundero et al. (1987) "Polysaccharide degrading enzymes of a toxigenic strain of Aspergillus clavatus from Nigerian poultry feeds，"Die Nahrung 10:993-1000 (Ogundero 等人，1987 年，"來自尼日利亞家禽 飼料的棒曲霉產(chǎn)毒菌株的多糖降解酶"，Die Nahrung，第10卷，第993-1000頁）。在確定pH 對棒曲霉降解經(jīng)碾磨飼料的能力的作用時，棒曲霉在從3. 2至7. 8的所有受測試pH值下均 顯不出降解飼料的能力。參見 Ogundero (1987)"Toxigenic fungi and the deterioration of Nigerian poultry feeds,''Mycopathologia 100:75-83(0gundero, 1987 年，"產(chǎn)毒真 菌和尼日利亞家禽飼料的變質(zhì)"，《真菌病理學》，第100卷，第75-83頁）。隨后的研究顯 示當棒曲霉在玉蜀黍酵母提取物培養(yǎng)基或小麥酵母提取物培養(yǎng)基上生長時，棒曲霉淀粉 酶在 pH 7-8 處具有峰值活性。Adisa(1994) "Mycoflora of post-harvest maize and wheat grains and the implications of their contamination by molds, 'Die Nahrung 38 (3) : 318-26 (Adisa，1994年，"采收后玉蜀黍和小麥籽粒的真菌區(qū)系以及它們被霉菌污染 的本質(zhì)"，Die Nahrung,第38卷，第3期，第318-326頁）。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 來自棒曲霉的Ct -淀粉酶（AcAmyl)在適當溫度和酸性pH下催化糖化較長的時 間。提供了來自棒曲霉NRRLl的已知a-淀粉酶的例子（SEQ ID NO: 1)、所述a-淀粉酶的 變體、編碼核酸以及表達所述多核苷酸的宿主細胞。AcAmyl具有酸性工作范圍，并且在同步 糖化發(fā)酵（SSF)中有助于高乙醇產(chǎn)率和低淀粉殘余，例如，特別是當與葡糖淀粉酶一起使 用時。盡管Adisal994公開了棒曲霉的峰值淀粉酶活性出現(xiàn)于25-30°C下的pH 7-8處，但 AcAmyl在50°C下的pH 4. 5處具有pH最佳值。AcAmyl在高溫和低pH下表現(xiàn)出高活性，所 以AcAmyl在存在真菌葡糖淀粉酶諸如黑曲霉（Aspergillus niger)葡糖淀粉酶（AnGA)的 情況下可在糖化工藝中有效地使用。與白曲霉（Aspergillus kawachii) a-淀粉酶（AkAA) 催化的糖化產(chǎn)物相比，AcAmy 1有利地催化淀粉糖化為顯著富含DPI和DP2 (即，葡萄糖和麥 芽糖）的低聚糖組合物。AcAmyl能夠以比AkAA低的劑量使用，以生成與其相當水平的乙 醇。AcAmyl可以與源自植物（例如，谷物和糧食）的酶結(jié)合使用。AcAmyl還可以與由宿主 細胞分泌或內(nèi)源于宿主細胞的酶結(jié)合使用。例如，AcAmyl可被添加到發(fā)酵或SSF工藝，在 所述工藝期間一種或多種淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、酯酶、氧化還原酶、 轉(zhuǎn)移酶或其他酶由生產(chǎn)宿主分泌。AcAmyl也可以與內(nèi)源性非分泌型生產(chǎn)宿主酶結(jié)合工作。 在另一個例子中，AcAmyl可在發(fā)酵或SSF期間由生產(chǎn)宿主細胞與其他酶一起分泌。AcAmyl 淀粉酶還可以有效地將淀粉直接水解為糖漿和/或生物化學物質(zhì)（例如，醇類、有機酸、氨 基酸、其他生物化學物質(zhì)和生物材料），其中反應(yīng)溫度低于底物的糊化溫度。AcAmyl可在發(fā) 酵或SSF期間由宿主細胞與其他酶一起分泌。
[0011] 因此，提供了一種糖化可包含淀粉的溶液以制備包含葡萄糖的組合物的方法，其 中所述方法可包括：（i)使包含淀粉的溶液與分離的AcAmyl或其變體接觸，所述分離的 AcAmyl或其變體具有a -淀粉酶活性并包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及 (11) 糖化包含淀粉的溶液以制備包含葡萄糖的組合物；其中所述分離的AcAmyl或其變體 催化淀粉溶液糖化為葡萄糖。
[0012]AcAmyl或其變體的劑量可以為AkAA劑量的約17 % -50 %，或任選地約 17% -34%，以在相同的條件下減少相同量的殘余淀粉。AcAmyl或其變體的劑量還可以為 AkAA劑量的約17% -50%，或任選地約17% -34%，以在相同的條件下減少相同量的DP3+。
[0013] 當以總DP1-DP7的重量百分比測量時，與由AkAA在相同條件下生成的包含葡萄糖 的第二組合物相比，包含葡萄糖的所述組合物可富含DP1、DP2或（DP1+DP2)。DPl可在約2 小時處富集約1. 5倍。此外，DP2可在約2小時處富集2至3倍。此外，（DP1+DP2)可在約 2小時處富集約2. 2倍。
[0014] AcAmyl或其變體可包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1 的第20-497位殘基具有至少90 %、95 %或99 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。AcAmy 1 或其變體還可包含（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位 殘基。AcAmyl或其變體可由與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的 第20-497位殘基具有至少80 %、90 %、95 %或99 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組 成。AcAmyl或其變體還可由（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第 20-497位殘基組成。
[0015] 淀粉溶液可包括液化淀粉、糊化淀粉或顆粒淀粉。糖化可在約30°C至約75°C的溫 度范圍內(nèi)進行。所述溫度范圍還可為471：-741：。糖化可在口112.0-口117.5的口11范圍內(nèi) 進行。所述pH范圍還可為pH 3. 5 - pH 5. 5。所述pH范圍還可為pH 3. 5 - pH 4. 5。
[0016] 所述方法還可包括發(fā)酵葡萄糖組合物以制備發(fā)酵最終（EOF)產(chǎn)物。發(fā)酵可以是同 步糖化發(fā)酵（SSF)反應(yīng)。發(fā)酵可在pH 2-8下并且在25°C-70°C的溫度范圍內(nèi)進行48-70 小時。EOF產(chǎn)物可包含8%-18% (v/v)的乙醇。EOF產(chǎn)物可包含代謝物。代謝物可以是檸 檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸S -內(nèi)酯、 異抗壞血酸鈉、Q 3脂肪酸、丁醇、氨基酸、賴氨酸、衣康酸、1，3-丙二醇或異戊二烯。
[0017] 還提供了 AcAmyl或其變體在制備發(fā)酵飲料中的用途，以及制備發(fā)酵飲料的方法， 所述方法可包括：使麥芽漿和/或麥芽汁與AcAmyl或其變體接觸。一種制備發(fā)酵飲料的方 法，其可包括：(a)制備麥芽漿；(b)過濾所述麥芽漿以獲得麥芽汁；以及（c)發(fā)酵麥芽汁以 獲得發(fā)酵飲料，其中AcAmyl或其變體被添加至：（i)步驟（a)的麥芽漿和/或（ii)步驟 (b)的麥芽汁和/或（iii)步驟（c)的麥芽汁。還提供了由所公開的方法制備的發(fā)酵飲料。 [0018] 發(fā)酵飲料或發(fā)酵最終產(chǎn)物可選自啤酒，所述啤酒選自例如全麥芽啤酒、根據(jù)"純凈 法（Reinheitsgebot) "釀造的啤酒、愛爾啤酒、印度淡啤酒（IPA)、拉格啤酒、苦啤酒、低麥 芽啤酒（Happoshu)(第二啤酒）、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤酒、低卡路里 啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒（stout)、麥芽酒、無酒精啤酒和無酒精麥芽酒；或 谷物或麥芽飲料，例如水果味麥芽飲料、酒味麥芽飲料和咖啡味麥芽飲料。
[0019] 所述方法還可包括將葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖酶、葡萄糖異構(gòu)酶、木糖異構(gòu) 酶、磷酸酶、植酸酶、支鏈淀粉酶、P -淀粉酶、不是AcAmyl的a -淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、 半纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、異淀粉酶、氧化還原酶、酯酶、轉(zhuǎn)移酶、果膠酶、a -葡糖苷酶、 3 -葡糖苷酶或它們的組合添加至淀粉溶液。葡糖淀粉酶可被添加至〇. 1-2個葡糖淀粉酶 單位（GAU)/g ds。
[0020] 分離的AcAmyl或其變體可由宿主細胞表達和分泌。淀粉溶液可與宿主細胞接觸。 宿主細胞還可表達和分泌葡糖淀粉酶。宿主細胞還可以能夠發(fā)酵葡萄糖組合物。
[0021] 因此，提供了一種用于糖化包含淀粉的溶液的組合物，所述組合物可以包含分離 的AcAmyl或其變體，所述分離的AcAmyl或其變體具有a-淀粉酶活性并包含與（ a) SEQ ID NO:1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%、 99%或100%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。AcAmyl或其變體可由與（a)SEQ ID N0:1 的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80 %、90 %、95 %、99 % 或100%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。
[0022] 所述組合物可以是培養(yǎng)細胞材料。所述組合物還可包含葡糖淀粉酶。AcAmyl或其 變體還可以是經(jīng)純化的。
[0023] AcAmyl或其變體可由宿主細胞表達和分泌。宿主細胞可以是絲狀真菌細胞。宿主 細胞可以是曲霉屬物種或里氏木霉（Trichoderma reesei)細胞。
[0024] 因此，提供了一種烘焙方法，包括將烘焙組合物添加到待烘焙的物質(zhì)中，隨后烘焙 所述物質(zhì)以制備烘焙產(chǎn)品，其中所述烘焙組合物包含分離的AcAmyl或其變體，所述分離的 AcAmyl或其變體具有a-淀粉酶活性并包含與（ a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID N0:1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%、99%或100%的氨基酸序列同 一性的氨基酸序列，其中所述分離的AcAmyl或其變體催化物質(zhì)中存在的淀粉組分的水解， 以生成較小的淀粉衍生分子。AcAmyl或其變體可由與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基 或（b)SEQ ID N0:1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%、99%或100%的氨基酸 序列同一性的氨基酸序列組成。烘焙組合物還可以包含粉、抗變陳淀粉酶、磷脂酶和/或磷 脂。
[0025] 因此，還提供了一種制備食品組合物的方法，包括將以下物質(zhì)混合：（i) 一種或多 種食品成分，和（ii)分離的AcAmyl或其變體，所述分離的AcAmyl或其變體具有a -淀粉 酶活性并包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘 基具有至少80 %、90 %、95 %、99 %或100 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述 分離的AcAmyl或其變體催化食品成分中存在的淀粉組分的水解以生成葡萄糖。AcAmyl或 其變體可由與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基 具有至少80%、90%、95%、99%或100%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。所述方 法還可包括烘焙所述食品組合物以制備烘焙產(chǎn)品。所述方法還可包括（i)提供淀粉介質(zhì)； (ii)將AcAmyl或其變體添加至淀粉介質(zhì)；以及（iii)在步驟（b)期間或之后對所述淀粉 介質(zhì)加熱以制備烘焙產(chǎn)品。
[0026] 當以總DP1-DP7的重量百分比測量時，與由AkAA在相同條件下生成的第二烘焙好 的產(chǎn)品相比，所述食品組合物可富含DP1、DP2或（DP1+DP2)。所述食品組合物可選自食品、 烘焙組合物、食品添加劑、動物食品、飼料產(chǎn)品、飼料添加劑、油、肉和豬油。所述食品組合物 可包括面團或面團產(chǎn)品，優(yōu)選地經(jīng)加工的面團產(chǎn)品。
[0027] -種或多種食品成分可包括烘焙成分或添加劑。一種或多種食品成分還可 以選自粉；抗變陳淀粉酶；磷脂酶；磷脂；具有生麥芽糖（maltogenic) a -淀粉酶活性 的生麥芽糖a-淀粉酶或其變體、同源物或突變體；烘焙木聚糖酶（EC 3. 2. 1.8);以 及脂肪酶。一種或多種食品成分還可以選自（i)來自嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus)的生麥芽糖a-淀粉酶、（ii)來自芽孢桿菌屬（Bacillus)、曲霉屬、 嗜熱真菌屬（Thermomyces)或木霉屬（Trichoderma)的烘焙木聚糖酶、（iii)來自異孢鐮 抱菌（Fusarium heterosporum)的糖脂酶。
[0028] 因此，還提供了一種用于制備食品組合物的組合物，其包含分離的AcAmyl或其變 體以及一種或多種食品成分，所述分離的AcAmyl或其變體具有a -淀粉酶活性并包含與 (a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。還提供了權(quán)利要求69-73中任一項所述的AcAmyl或 其變體在制備食品組合物中的用途。所述食品組合物可包括面團或面團產(chǎn)品，包括經(jīng)加工 的面團產(chǎn)品。所述食品組合物可以是烘焙組合物。AcAmyl或其變體可在面團產(chǎn)品中使用， 用于延緩或減輕面團產(chǎn)品變陳，優(yōu)選地延緩或減輕其不利回生。
[0029] 因此，提供了一種從衣物、盤碟或紡織物除去淀粉污漬的方法，其可包括在存在含 水組合物的情況下溫育衣物、盤碟或紡織物的表面，所述含水組合物包含有效量的分離的 AcAmyl或其變體，所述分離的AcAmyl或其變體具有a-淀粉酶活性并包含與（ a) SEQ ID NO:1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%、 99%或100%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；允許AcAmyl或其變體水解存在于淀粉污 漬中的淀粉組分以生成溶解在含水組合物中的較小的淀粉衍生分子；以及漂洗所述表面， 從而從所述表面上除去淀粉污漬。AcAmyl或其變體可由與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位 殘基或（b)SEQ ID N0:1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%、99%或100%的氨 基酸序列同一性的氨基酸序列組成。
[0030] 因此，提供了一種用于從衣物、盤碟或紡織物除去淀粉污漬的組合物，其可包含分 離的AcAmyl或其變體以及表面活性劑，所述分離的AcAmyl或其變體具有a -淀粉酶活性 并包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有 至少80%、90%、95%、99%或100%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。4〇411^1或其變體 可由與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至 少80%、90%、95%、99%或100%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。所述組合物可 以是衣物洗滌劑、衣物洗滌劑添加劑、或人工或自動盤碟洗滌劑。
[0031] 因此，還提供了一種將紡織物退漿的方法，其可包括使退漿組合物與紡織物接觸 足以將紡織物退漿的一段時間，其中所述退漿組合物可以包含分離的AcAmyl或其變體，所 述分離的AcAmyl或其變體具有a -淀粉酶活性并包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位 殘基或（b)SEQ ID N0:1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%、99%或100%的氨 基酸序列同一性的氨基酸序列；并允許AcAmyl或其變體將存在于淀粉污漬中的淀粉組分 退漿以生成溶解在含水組合物中的較小的淀粉衍生分子；以及漂洗所述表面，從而從所述 表面上除去淀粉污漬。AcAmyl或其變體可由與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID N0:1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%、99%或100%的氨基酸序列同 一性的氨基酸序列組成。
[0032] 因此，還提供了 AcAmyl或其變體在制備葡萄糖組合物中的用途。還提供了一種由 所公開的方法制備的葡萄糖組合物。還提供了 AcAmyl或其變體在制備液化淀粉中的用途。 并且還公開了由所公開的方法制備的液化淀粉。
[0033] 此外，公開了可包含AcAmyl或其變體的退漿組合物在使紡織物退漿中的用途，以 及可包含AcAmyl或其變體的烘焙組合物在制備烘焙產(chǎn)品中的用途。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0034] 附圖并入本說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分，且例示了本文所公開的各種方法 和組合物。在附圖中：
[0035] 圖IA和圖IB示出了 AcAmyl催化核心、連接區(qū)域和碳水化合物結(jié)合域（分別為SEQ ID NO: 1的第20-497位、第498-528位和第529-636位殘基）或全長與來自以下的a -淀 粉酶的相應(yīng)殘基的ClustalW比對：柄籃狀菌（T. stipitatus) ATCC 10500 (分別為SEQ ID NO: 4的第20-497位和第520-627位殘基）；構(gòu)巢曲霉（A. nidulans) FGSC A4(分別為SEQ ID NO: 5 的第 20-497 位和第 516-623 位殘基）；煙曲霉（A. fumigatus)Af293(分別為 SEQ ID NO: 12的第24-502位和第523-630位殘基）；以及土曲霉（A.terreus)NIH2624(分別為 SEQ ID NO: 13的第21-497位和第500-607位殘基）。由圖1中的星號標示的殘基為與SEQ ID N0:4-5以及SEQ ID NO: 12-13中的保守殘基對應(yīng)的AcAmyl殘基。
[0036] 圖2示出了包含編碼AcAmyl多肽的多核苷酸的pJG153表達載體 pJG153(Tex3gM_AcAmyl)的圖譜。
[0037]圖3A示出了白曲霉a -淀粉酶（AkAA)的a -淀粉酶活性（相對單位）對pH的 依賴性。圖3B示出了 AcAmyl的a -淀粉酶活性（相對單位）對pH的依賴性。a -淀粉酶 活性基于2ppm酶而言，并通過在50°C下從馬鈴薯支鏈淀粉底物釋放的還原糖測定。
[0038] 圖4A示出了 AkAA的a -淀粉酶活性（相對單位）對溫度的依賴性。圖4B示出 了 AcAmyl的a -淀粉酶活性（相對單位）對溫度的依賴性。a -淀粉酶活性基于2ppm酶 而言，并通過在pH 4. O(AkAA)或pH 4. 5 (AcAmyl)下從馬鈴薯支鏈淀粉底物釋放的還原糖 測定。
[0039] 圖5A示出了在pH 3. 5或pH 4. 8下溫育所示的時間段后AkAA的殘留a -淀粉酶 活性（相對單位）。圖5B示出了在pH 3. 5或pH 4. 8下維持所示時間段的AcAmyl的殘留 a _淀粉酶活性（相對單位）。a -淀粉酶活性基于2ppm酶而言，并通過從馬鈴薯支鏈淀粉 底物釋放的還原糖測定。

【具體實施方式】
[0040] 提供了來自棒曲霉的真菌a _淀粉酶（AcAmyl)。AcAmyl具有為pH 4. 5的最佳pH 值，并且在pH 3至pH 7的范圍內(nèi)具有至少70%的活性。當在pH 4. 5下測試時，所述酶具 有66°C的最佳溫度，并且在47-74°C的溫度范圍內(nèi)具有至少70%的活性。這些特性允許所 述酶在相同的反應(yīng)條件下與葡糖淀粉酶結(jié)合使用。這消除了對將糖化反應(yīng)實施為分批過程 的需求，在所述分批過程中必須對PH和溫度加以調(diào)整，以便最佳地使用a -淀粉酶或葡糖 淀粉酶。
[0041] AcAmyl還催化包含淀粉的組合物糖化為葡萄糖。例如，在50°C、pH5. 3下，使用 DP7、支鏈淀粉或麥芽糖糊精底物糖化兩小時之后，制得低聚糖組合物。當以總DP1-DP7的 重量百分比測量時，與相同條件下AkAA催化的糖化的產(chǎn)物相比，所述組合物富含DPI、DP2 和（DP1+DP2)。例如，DP2在約2小時處富集2至3倍，DPI在約2小時處富集約1. 5倍，并 且（DP1+DP2)在約2小時處富集約2. 2倍。這例如通過在SSF工藝中發(fā)酵生物來促進對低 聚糖組合物的利用。在起這種作用時，AcAmyl能夠以較低的酶劑量產(chǎn)生與AkAA相同的乙 醇產(chǎn)率，同時減少了不溶性殘余淀粉，并且將不溶性殘余淀粉對最終產(chǎn)物質(zhì)量的任何負面 影響降至最低。
[0042] AcAmyl及其變體淀粉酶的示例性應(yīng)用為將淀粉糖化的工藝如SSF，以及清潔組合 物的制備，所述清潔組合物例如用于清潔衣物、盤碟以及對于紡織物處理（如，退漿）而言 的其他表面的洗滌劑組合物。
[0043] L定義和縮寫
[0044] 根據(jù)此詳細描述，應(yīng)用下面的縮寫和定義。注意，除非上下文另有明確指明，否則 單數(shù)形式"一個"、"一種"和"所述"包括多個指代物。因此，例如，提及"酶"包括多個此種 酶，而提及"劑量"，包括提及一個或多個劑量以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物，等等。
[0045] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 通常所理解的含義。下面提供如下的術(shù)語。
[0046] I. L縮寫和首字母縮略詞
[0047] 除非另外指明，否則以下縮寫/首字母縮略詞具有如下含義：
[0048] ABTS 2, 2-連氮基-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸
[0049] AcAmyl 棒曲霉a-淀粉酶
[0050] AE 醇乙氧基化物
[0051] AEO 醇乙氧基化物
[0052] AEOS 醇乙氧基硫酸鹽
[0053] AES 醇乙氧基硫酸鹽
[0054] AkAA 白曲霉a_淀粉酶
[0055] AnGA 黑曲霉葡糖淀粉酶
[0056] AOS a-烯烴磺酸鹽
[0057] AS 燒基硫酸鹽
[0058] cDNA 互補DNA
[0059]CMC 羧甲基纖維素
[0060]DE 右旋糖當量
[0061]DNA 脫氧核糖核酸
[0062]DPn 具有n個亞單元的多糖聚合度
[0063]ds或DS 干固形物
[0064]DTMPA 二亞乙基三胺五乙酸
[0065] EC 酶學委員會
[0066]EDTA 乙二胺四乙酸
[0067] EO 環(huán)氧乙烷（聚合物片段）
[0068]EOF 發(fā)酵結(jié)束
[0069]FGSC 美國真菌遺傳學資源中心
[0070] GA 葡糖淀粉酶
[0071] GAU/g ds 葡糖淀粉酶活性單位/克干固形物
[0072]HFCS 高果糖玉米糖漿
[0073]HgGA 灰腐質(zhì)霉（Humicola grisea)葡糖淀粉酶
[0074] IPTG 異丙基P -D-硫代半乳糖苷
[0075] IRS 不溶性殘余淀粉
[0076] kDa 千道爾頓
[0077] LAS 直鏈烷基苯磺酸鹽
[0078] MW 分子量
[0079] MWU 改良的伍格母單位；1. 6 X l(T5mg/MWU=活性單位
[0080] NCBI 美國國家生物技術(shù)信息中心
[0081] NOBS 壬?；趸交撬猁}
[0082] NTA 次氮基乙酸
[0083] OxAm Purastar HPAM 5000L(美國丹尼斯科有限公司（Danisco US Inc.))
[0084] PAHBAH 對羥基苯甲酰肼
[0085] PEG 聚乙二醇
[0086] pi 等電點
[0087] ppm 百萬分率，例如U g蛋白質(zhì)/克干固形物
[0088] PVA 聚（乙烯醇）
[0089] PVP 聚（乙烯吡咯烷酮）
[0090] RNA 核糖核酸
[0091] SAS 烷基磺酸鹽
[0092] SDS-PAGE 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳
[0093] SSF 同步糖化發(fā)酵
[0094] SSU/g固形物可溶性淀粉單位/克干固形物
[0095] sp. 物種
[0096] TAED 四乙?；叶?br> [0097] TrGA 里氏木霉葡糖淀粉酶
[0098] w/v 重量/體積
[0099] w/w 重量/重量
[0100] v/v 體積/體積
[0101] wt % 重量％
[0102] V 攝氏度
[0103] H2O 水
[0104] dH20或DI 去離子水
[0105] dIH20 Milli-Q過濾的去離子水
[0106] g或 gm 克
[0107] u g 微克
[0108] mg 毫克
[0109] kg 千克
[0110] u L和U 1 微升
[0111] mL和ml 毫升
[0112] mm 毫米
[0113] u m 微米
[0114] M 摩爾
[0115] mM 毫摩爾
[0116] UM 微摩爾
[0117] U 單位
[0118] sec 秒
[0119] min 分鐘
[0120] hr 小時
[0121] DO 溶氧
[0122] Ncm 牛頓厘米
[0123] ETOH 乙醇
[0124]eq. 當量
[0125] N 當量濃度
[0126] 1.2.
[0127] 術(shù)語"淀粉酶"或"淀粉分解酶"是指除其他方面外還能夠催化淀粉的降解的 酶。a-淀粉酶為裂解淀粉中的a-D-(1 - 4)0-糖苷鍵的水解酶。一般來講，a-淀粉酶 (EC 3. 2. I. 1 ; a -D-(1 - 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶）定義為以隨機方式裂解淀粉分子內(nèi)的 a -D- (1 - 4) 0-糖苷鍵從而生成含有三個或更多個（1-4) - a -連接的D-葡萄糖單元的多 糖的內(nèi)切作用酶。相反地，外切淀粉分解酶如P -淀粉酶（EC 3. 2. 1. 2 ; a -D-(1 - 4)-葡 聚糖麥芽糖水解酶）和一些產(chǎn)物特異性淀粉酶如生麥芽糖a -淀粉酶（EC 3. 2. 1. 133)從 底物的非還原端裂解多糖分子。P -淀粉酶、a -葡糖苷酶（EC 3. 2. 1. 20 ; a -D-葡糖苷葡 萄糖水解酶）、葡糖淀粉酶（EC 3. 2. 1. 3 ; a -D-(1 - 4)-葡聚糖葡糖水解酶）和產(chǎn)物特異 性淀粉酶如麥芽四糖苷酶（EC 3. 2. 1. 60)和麥芽六糖苷酶（EC 3. 2. 1. 98)可產(chǎn)生特定長度 的麥芽低聚糖或特定麥芽低聚糖的富集糖漿。
[0128] 本文的"酶單位"是指在規(guī)定的測定條件下每一定時間所形成的產(chǎn)物的量。例如， "葡糖淀粉酶活性單位" (GAU)定義為在60°C、pH 4. 2下每小時從可溶性淀粉底物（4% DS) 產(chǎn)生Ig葡萄糖的酶量。"可溶性淀粉單位"（SSU)是在pH 4. 5、50°C下每分鐘從可溶性淀 粉底物（4% DS)產(chǎn)生Img葡萄糖的酶量。DS是指"干固形物"。
[0129] 如本文所用，術(shù)語"淀粉"指由植物的復雜多糖碳水化合物構(gòu)成的任何材料，由具 有式（C 6HltlO5)x(其中X可以是任何數(shù)字）的直鏈淀粉和支鏈淀粉構(gòu)成。所述術(shù)語包括基于 植物的材料，諸如谷粒、谷物、草、塊莖和根，并且更具體地講是從小麥、大麥、玉米、黑麥、 水稻、高梁、糠、木薯、小米、馬鈴薯、甘薯和木薯粉獲得的材料。術(shù)語"淀粉"包括顆粒淀粉。 術(shù)語"顆粒淀粉"是指生的即未蒸煮過的淀粉，例如尚未經(jīng)受糊化的淀粉。
[0130] 關(guān)于多肽的術(shù)語"野生型"、"親本"或"參考"是指不在一個或多個氨基酸位置處 包括人為制造的置換、插入或缺失的天然存在的多肽。類似地，關(guān)于多核苷酸的術(shù)語"野生 型"、"親本"或"參考"是指不包括人為制造的核苷改變的天然存在的多核苷酸。然而，應(yīng)當 注意，編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的多核苷酸不局限于天然存在的多核苷酸，而 涵蓋編碼野生型多肽、親本多肽或參考多肽的任何多核苷酸。
[0131] 對野生型蛋白質(zhì)的提及應(yīng)理解為包括所述蛋白質(zhì)的成熟形式。"成熟"多肽意指 缺少信號序列的AcAmyl多肽或其變體。例如，信號序列可在多肽的表達期間切除。成熟 AcAmyl的長度為617個氨基酸，所述長度覆蓋SEQ ID NO: 1的第20-636位，其中所述位置 從N端計數(shù)。野生型AcAmyl的信號序列的長度為19個氨基酸，并具有SEQ ID NO: 3中示 出的序列。成熟AcAmyl或其變體可包含取自不同蛋白質(zhì)的信號序列。成熟蛋白質(zhì)可以是 成熟多肽和信號序列多肽之間的融合蛋白。
[0132] AcAmyl的"催化核心"跨越SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基。AcAmyl的"連接子" 或"連接區(qū)域"跨越第498-528位殘基。第529-636位氨基酸殘基構(gòu)成AcAmyl的"碳水化 合物結(jié)合域"。
[0133] 關(guān)于多肽的術(shù)語"變體"是指因其包括一個或多個天然存在的或人為的氨基酸置 換、插入或缺失而不同于指定的野生型多肽、親本多肽或參考多肽的多肽。類似地，關(guān)于多 核苷酸的術(shù)語"變體"是指核苷酸序列不同于指定的野生型多核苷酸、親本多核苷酸或參考 多核苷酸的多核苷酸。野生型、親本或參考多肽或多核苷酸的身份從上下文來看將是顯而 易見的。AcAmyl的"變體"和"變體a-淀粉酶多肽"在本文中是同義詞。
[0134] 就本發(fā)明的a_淀粉酶而言，"活性"是指a_淀粉酶活性，其可如本文所述進行測 量。
[0135] 當關(guān)于對象細胞、核酸、蛋白質(zhì)或載體而使用時，術(shù)語"重組"指所述對象已從其天 然狀態(tài)經(jīng)過修飾。因此，例如，重組細胞表達未在天然（非重組）形式的細胞中存在的基 因，或者以不同于自然界中存在的水平或條件表達天然基因。重組核酸與天然序列相差一 個或多個核苷酸和/或有效連接（operably linked to)至異源序列，如表達載體中的異源 啟動子。重組蛋白可與天然序列相差一個或多個氨基酸和/或與異源序列融合。包含編碼 AcAmyl或其變體的核酸的載體是重組載體。
[0136] 術(shù)語"回收的"、"分離的"和"分開的"是指從如天然存在的那樣與其天然相關(guān)的 至少一種其他物質(zhì)或組分中移除的化合物、蛋白質(zhì)（多肽）、細胞、核酸、氨基酸或其他指定 的物質(zhì)或組分，如從棒曲霉物種的細胞分離的AcAmyl。"分離的"AcAmyl或其變體包括但不 限于：包含分泌的AcAmyl或變體多肽以及在異源宿主細胞（即，非棒曲霉的宿主細胞）中 表達的AcAmyl或變體多肽的培養(yǎng)發(fā)酵液。
[0137] 如本文所用，術(shù)語"純化的"是指處于相對純的狀態(tài)的物質(zhì)（如，分離的多肽或多 核苷酸），所述相對純的狀態(tài)如純度至少約90%、純度至少約95%、純度至少約98%、或純 度甚至至少約99%。
[0138] 關(guān)于酶的術(shù)語"熱穩(wěn)定的"和"熱穩(wěn)定性"是指酶在暴露于高溫后保持活性的能力。 酶（如淀粉酶）的熱穩(wěn)定性是由其半衰期（t 1/2)度量的，所述半衰期以分鐘、小時或天為單 位給出，在此期間酶活性在限定的條件下?lián)p失一半。半衰期可通過測量暴露于（即，經(jīng)受） 高溫后殘余的a-淀粉酶活性來計算。
[0139] 關(guān)于酶的"pH范圍"是指酶在其下顯示出催化活性的pH值范圍。
[0140] 如本文所用，關(guān)于酶的術(shù)語"pH穩(wěn)定的"和"pH穩(wěn)定性"涉及在預定的時間段（如， 15分鐘、30分鐘、1小時）內(nèi)、酶在寬泛的pH值范圍內(nèi)保持活性的能力。
[0141] 如本文所用，術(shù)語"氨基酸序列"與術(shù)語"多肽"、"蛋白質(zhì)"和"肽"是同義詞，并且 可互換使用。在此類氨基酸序列表現(xiàn)出活性的情況下，它們可被稱為"酶"。使用常規(guī)的氨基 酸殘基的單字母或三字母代碼，其中氨基酸序列以標準的氨基端至羧基端取向（即，N - C) 提供。
[0142] 術(shù)語"核酸"涵蓋DNA、RNA、異源雙鏈體和能夠編碼多肽的合成分子。核酸可為單 鏈或雙鏈的，而且可為化學修飾物。術(shù)語"核酸"與"多核苷酸"可互換使用。由于遺傳密碼 具有簡并性，故可以使用不止一個密碼子來編碼特定氨基酸，并且本發(fā)明組合物和方法涵 蓋編碼特定氨基酸序列的核苷酸序列。除非另作說明，否則核酸序列以5'至3'取向給出。
[0143] 如本文所用，"雜交"是指在印跡雜交技術(shù)和PCR技術(shù)期間核酸的一條鏈與互補 鏈形成雙鏈即與之堿基配對的過程。嚴格雜交條件的例子為在如下條件下的雜交：65°C和 0. IX SSC (其中IX SSC = 0. 15M NaCl，0. 015M檸檬酸三鈉，pH 7. 0)。雜交的雙鏈核酸通 過解鏈溫度（Tm)表征，在解鏈溫度下一半雜交的核酸不與互補鏈配對。雙鏈內(nèi)的錯配核苷 酸降低T m。編碼變體a-淀粉酶的核酸相比于SEQ ID N0:2與其相同互補鏈的核苷酸之間 形成的雙鏈可具有降低rc _3°C或更多的Tm。
[0144] 如本文所用，"合成"分子通過體外化學合成或酶促合成而生成、而非由生物體生 成。
[0145] 如本文所用，關(guān)于細胞使用的術(shù)語"轉(zhuǎn)化"、"穩(wěn)定轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)基因"意指含有整合 進其基因組中或作為經(jīng)多代保留下來的附加體而攜帶的非天然（如，異源）核酸序列的細 胞。
[0146] 在將核酸序列插入細胞的情況下，術(shù)語"引入"意指本領(lǐng)域已知的"轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)化" 或"轉(zhuǎn)導"。
[0147] "宿主菌株"或"宿主細胞"為已將表達載體、噬菌體、病毒或其他DNA構(gòu)建體，包括 編碼目的多肽（如，AcAmyl或其變體）的多核苷酸引入其中的生物體。示例性的宿主菌株 是能夠表達目的多肽和/或使糖發(fā)酵的微生物細胞（例如細菌、絲狀真菌和酵母）。術(shù)語 "宿主細胞"包括由細胞產(chǎn)生的原生質(zhì)體。
[0148] 關(guān)于多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語"異源"是指并非天然存在于宿主細胞中的多核苷 酸或蛋白質(zhì)。
[0149] 關(guān)于多核苷酸或蛋白質(zhì)的術(shù)語"內(nèi)源"是指天然存在于宿主細胞中的多核苷酸或 蛋白質(zhì)。
[0150] 如本文所用，術(shù)語"表達"是指基于核酸序列生成多肽的過程。所述過程包括轉(zhuǎn)錄 和翻譯二者。
[0151] "選擇標記"或"選擇性標記"是指這樣的基因，其能夠在宿主中表達以有利于選擇 攜帶該基因的宿主細胞。選擇性標記的例子包括（但不限于）抗微生物劑（如潮霉素、博 來霉素或氯霉素）和/或賦予宿主細胞代謝益處（如營養(yǎng)益處）的基因。
[0152] "載體"是指設(shè)計用來將核酸引入一種或多種細胞類型中的多核苷酸序列。載體包 括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質(zhì)粒、噬菌體顆粒、盒（cassette)等等。
[0153] "表達載體"是指包含編碼目標多肽的DNA序列的DNA構(gòu)建體，所述編碼序列有效 連接至能夠?qū)崿F(xiàn)所述DNA在合適宿主中表達的合適控制序列。這種控制序列可包括實現(xiàn)轉(zhuǎn) 錄的啟動子、控制轉(zhuǎn)錄的任選的操縱子序列、編碼合適的mRNA上核糖體結(jié)合位點的序列和 控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的增強子和序列。
[0154] 術(shù)語"有效連接"意指指定組分處于一種允許它們以預期的方式起作用的關(guān)系 (包括但不限于并置）。例如，調(diào)控序列有效連接至編碼序列，使得編碼序列的表達受調(diào)控 序列的控制。
[0155] "信號序列"是連接至蛋白質(zhì)的N-端部分的氨基酸的序列，其促進蛋白質(zhì)分泌至細 胞外。細胞外蛋白質(zhì)的成熟形式?jīng)]有信號序列，其在分泌過程期間被切除。
[0156] 如本文所用，"生物活性"是指具有特定生物活性（例如酶活性）的序列。
[0157] 如本文所用，"樣片"是其上施有污漬的一塊材料，例如織物。所述材料可以是例如 由棉、聚酯或天然纖維與合成纖維的混合物制成的織物。所述樣片還可以是紙，例如濾紙或 硝化纖維素，或者是一塊硬質(zhì)材料，如陶瓷、金屬或玻璃。對于淀粉酶，污漬是基于淀粉的， 但是也可以包括血液、乳、墨、草、茶、酒、菠菜、肉汁、巧克力、蛋、奶酪、粘土、顏料、油或這些 化合物的混合物。
[0158] 如本文所用，"小樣片"是自樣片上用單孔打孔裝置切下的部分，或者用定制的96 孔打孔裝置（其中該多孔打孔模式與標準96孔微量滴定板匹配）切下的部分，或者是以其 他方式自樣片上取下的部分。樣片可以是紡織物、紙、金屬或其他合適的材料。小樣片可以 在放入24孔、48孔或96孔微量滴定板孔之前或之后具有固著的污漬。"小樣片"也可以通 過向小塊材料施加污漬而制成。例如，小樣片可以是直徑為5/8英寸或0. 25英寸的一塊施 有污漬的織物。定制的打孔器以使得其同時將96個樣片遞送至96孔板的所有孔中的方式 設(shè)計。所述裝置可以通過簡單地向同一96孔板多次上樣，而允許向每孔遞送不止一個樣 片。可以設(shè)想將多孔打孔裝置用于向任何格式的板（包括但不限于24孔、48孔和96孔 板）同時遞送多個樣片。在另一個可設(shè)想的方法中，染污的測試平臺可以是由金屬、塑料、 玻璃、陶瓷或另一合適材料制成的、被污物載污體包覆的珠。然后將一個或多個包覆的珠置 于含有合適緩沖液和酶的96孔、48孔或24孔板或更大版式的板的孔中。
[0159] 如本文所用，"包含AcAmyl或其變體的培養(yǎng)細胞材料"或者類似的用語是指包含 AcAmyl或其變體作為組分的細胞裂解液或上清液（包括培養(yǎng)基）。細胞材料可以來自出于 制備AcAmyl或其變體的目的而在培養(yǎng)物中生長的異源宿主。
[0160] "序列同一性百分比"意指以默認參數(shù)用CLUSTAL W算法比對時，變體與野生型 AcAmyl具有至少一定的氨基酸殘基同一性百分比。參見Thompson et al. (1994)Nucleic Acids Res. 22:4673-4680(Thompson等人，1994年，《核酸研究》，第22卷，第4673-4680頁）。 CLUSTAL W算法的默認參數(shù)為：
[01611

【權(quán)利要求】
1. 一種糖化包含淀粉的組合物以制備包含葡萄糖的組合物的方法，其中所述方法包 括： (i) 使所述包含淀粉的溶液與分離的AcAmyl或其變體接觸，所述分離的AcAmyl或其 變體具有α-淀粉酶活性并包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1 的第20-497位殘基具有至少80 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；以及 (ii) 糖化所述包含淀粉的溶液以制備所述包含葡萄糖的組合物；其中所述分離的 AcAmyl或其變體催化所述淀粉溶液的糖化而產(chǎn)生葡萄糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體以AkAA的劑量的約 17% -50%，或任選地約17% -34%給予，以在相同的條件下減少相同量的殘余淀粉。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體以AkAA的劑量的約 17% -50%，或任選地約17% -34%給予，以在相同的條件下減少相同量的DP3+。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中當以總DP1-DP7的重量百分比測量時，與由AkAA 在相同條件下生成的包含葡萄糖的第二組合物相比，所述包含葡萄糖的組合物富含DPI、 DP2 或（DP1+DP2)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中DPl在約2小時處富集約1. 5倍。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中DP2在約2小時處富集2至3倍。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中（DP1+DP2)在約2小時處富集約2. 2倍。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體包含與（a)SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少90%、95%或 99 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體包含（a) SEQ ID NO: 1的第 20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體由與（a)SEQ ID NO:1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95% 或99 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體由（a)SEQ ID NO: 1的第 20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基組成。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述包含淀粉的組合物包含液化淀 粉、糊化淀粉或顆粒淀粉。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項所述的方法，其中糖化在約30°C至約75°C的溫度范圍 內(nèi)進行。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述溫度范圍為47°C -74°C。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任一項所述的方法，其中糖化在pH 2. 0-pH7. 5的pH范圍內(nèi) 進行。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述pH范圍為pH 3. 5-pH5. 5。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述pH范圍為pH 3. 5-pH4. 5。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1-17中任一項所述的方法，還包括使所述葡萄糖組合物發(fā)酵以制備 發(fā)酵最終（EOF)產(chǎn)物。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述發(fā)酵是同步糖化發(fā)酵（SSF)反應(yīng)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的方法，其中所述發(fā)酵在pH 2-8下并且在25°C -70°C 的溫度范圍內(nèi)進行48-70小時。
21. 根據(jù)權(quán)利要求18-20中任一項所述的方法，其中所述EOF產(chǎn)物包含乙醇。
22. 根據(jù)權(quán)利要求18-21中任一項所述的方法，其中所述EOF產(chǎn)物包含8%-18% (v/ v)乙醇。
23. 根據(jù)權(quán)利要求18-22中任一項所述的方法，其中所述方法還包括使麥芽漿和/或麥 芽汁與所述AcAmyl或其變體接觸。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述方法還包括： (a) 制備麥芽楽； (b) 過濾所述麥芽漿以獲得麥芽汁；以及 (c) 使所述麥芽汁發(fā)酵以獲得發(fā)酵飲料， 其中AcAmyl或其變體被添加至： (i) 步驟（a)的所述麥芽漿和/或 (ii) 步驟（b)的所述麥芽汁和/或 (iii) 步驟（c)的所述麥芽汁。
25. 根據(jù)權(quán)利要求18-24中任一項所述的方法，其中所述EOF產(chǎn)物包含代謝物。
26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述代謝物是檸檬酸、乳酸、琥珀酸、谷氨酸一 鈉、葡糖酸、葡糖酸鈉、葡糖酸鈣、葡糖酸鉀、葡糖酸S -內(nèi)酯、異抗壞血酸鈉 、Ω 3脂肪酸、丁 醇、氨基酸、賴氨酸、衣康酸、1，3-丙二醇或異戊二烯。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1-26中任一項所述的方法，還包括將葡糖淀粉酶、己糖激酶、木聚糖 酶、葡萄糖異構(gòu)酶、木糖異構(gòu)酶、磷酸酶、植酸酶、支鏈淀粉酶、β-淀粉酶、不是AcAmyl的 α -淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、異淀粉酶、氧化還原酶、酯酶、 轉(zhuǎn)移酶、果膠酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶或它們的組合添加至所述淀粉溶液。
28. 根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中添加所述葡糖淀粉酶達到0. 1-2個葡糖淀粉酶 單位（GAU)/g ds。
29. 根據(jù)權(quán)利要求1-28中任一項所述的方法，其中所述分離的AcAmyl或其變體由宿主 細胞表達和分泌。
30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中使所述包含淀粉的組合物與所述宿主細胞接 觸。
31. 根據(jù)權(quán)利要求29或30所述的方法，其中所述宿主細胞還表達和分泌葡糖淀粉酶。
32. 根據(jù)權(quán)利要求29-31中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞能夠使所述葡萄糖 組合物發(fā)酵。
33. -種包含通過權(quán)利要求1所述的方法制備的葡萄糖的組合物。
34. -種通過權(quán)利要求1所述的方法制備的液化淀粉。
35. -種通過權(quán)利要求18-32中任一項所述的方法制備的發(fā)酵飲料。
36. -種用于糖化包含淀粉的組合物的組合物,其包含分離的AcAmyl或其變體,所述 分離的AcAmyl或其變體具有α -淀粉酶活性并包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘 基或（b)SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%的氨基酸序列同一性的氨基酸序 列。
37. 根據(jù)權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體包含與（a)SEQ ID NO: I 的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少90%、95%或99%的 氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
38. 根據(jù)權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體包含（a) SEQ ID NO: 1 的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基。
39. 根據(jù)權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體由與（a)SEQ ID N0:1的 第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%或99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。
40. 根據(jù)權(quán)利要求39所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體由（a) SEQ ID NO: 1的 第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基組成。
41. 根據(jù)權(quán)利要求36-40中任一項所述的組合物，其中所述組合物是培養(yǎng)細胞材料。
42. 根據(jù)權(quán)利要求36-41中任一項所述的組合物，其中所述組合物還包含葡糖淀粉酶。
43. 根據(jù)權(quán)利要求36-40和權(quán)利要求42中任一項所述的組合物，其中所述AcAmyl或其 變體是經(jīng)純化的。
44. 根據(jù)權(quán)利要求36-43中任一項所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體由宿主細 胞表達和分泌。
45. 根據(jù)權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述宿主細胞是絲狀真菌細胞。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的組合物，其中所述宿主細胞是曲霉屬（Aspergillus)物種 或里氏木霉（Trichoderma reesei)細胞。
47. 根據(jù)權(quán)利要求1-46中任一項所述的AcAmyl或其變體在制備包含葡萄糖的組合物 中的用途。
48. 根據(jù)權(quán)利要求1-46中任一項所述的AcAmyl或其變體在制備液化淀粉中的用途。
49. 根據(jù)權(quán)利要求1-46中任一項所述的AcAmyl或其變體在制備發(fā)酵飲料中的用途。
50. 根據(jù)權(quán)利要求18-32中任一項所述的方法、根據(jù)權(quán)利要求45所述的發(fā)酵飲料或根 據(jù)權(quán)利要求49所述的用途，其中所述發(fā)酵飲料或發(fā)酵最終產(chǎn)物選自： i) 選自如下的啤酒：全麥芽啤酒、根據(jù)"純凈法"釀造的啤酒、愛爾啤酒、印度淡啤酒、 拉格啤酒、苦啤酒、低麥芽啤酒（第二啤酒）、第三啤酒、干啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低酒精啤 酒、低卡路里啤酒、波特啤酒、博克啤酒、司陶特啤酒、麥芽酒、無酒精啤酒和無酒精麥芽酒； 以及 ii) 選自如下的谷物或麥芽飲料：水果味麥芽飲料、酒味麥芽飲料和咖啡味麥芽飲料。
51. -種制備食品組合物的方法，包括將以下物質(zhì)混合 (i) 一種或多種食品成分，以及 (ii) 分離的AcAmyl或其變體，所述分離的AcAmyl或其變體具有α -淀粉酶活性并包 含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少 80 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列， 其中所述分離的AcAmyl或其變體催化所述食品成分中存在的淀粉組分的水解而產(chǎn)生 葡萄糖。
52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體以AkAA的劑量的約 17% -50%，或任選地約17% -34%給予，以在相同的條件下減少相同量的殘余淀粉。
53. 根據(jù)權(quán)利要求51或52所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體以AkAA的劑量的約 17% -50%，或任選地約17% -34%給予，以在相同的條件下減少相同量的DP3+。
54. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中當以總DP1-DP7的重量百分比測量時，與 由AkAA在相同條件下生成的第二烘焙好的產(chǎn)品相比，所述食品組合物富含DPI、DP2或 (DP1+DP2)。
55. 根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中DPl在約2小時處富集約1. 5倍。
56. 根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中DP2在約2小時處富集2至3倍。
57. 根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中（DP1+DP2)在約2小時處富集約2. 2倍。
58. 根據(jù)權(quán)利要求51-57中任一項所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少90%、 95 %或99 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
59. 根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體包含（a) SEQ ID NO: 1的 第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基。
60. 根據(jù)權(quán)利要求51-57中任一項所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體由與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、 95%或99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體由（a) SEQ ID NO: 1的第 20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基組成。
62. 根據(jù)權(quán)利要求54-61中任一項所述的方法，其中所述食品組合物選自食品、烘焙組 合物、食品添加劑、動物食品、飼料產(chǎn)品、飼料添加劑、油、肉和豬油。
63. 根據(jù)權(quán)利要求54-62中任一項所述的方法，并且其中所述一種或多種食品成分包 含烘焙成分或添加劑。
64. 根據(jù)權(quán)利要求51-63中任一項所述的方法，其中所述一種或多種食品成分選自粉； 抗變陳淀粉酶；磷脂酶；磷脂；具有生麥芽糖α-淀粉酶活性的生麥芽糖α-淀粉酶或其變 體、同源物或突變體；烘焙木聚糖酶（EC 3. 2. 1. 8);以及脂肪酶。
65. 根據(jù)權(quán)利要求64所述的方法，其中所述一種或多種食品成分選自： (i) 來自嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus)的生麥芽糖α-淀粉酶， (ii) 來自芽孢桿菌屬（Bacillus)、曲霉屬（Aspergillus)、嗜熱真菌屬（Thermomyces) 或木霉屬（Trichoderma)的烘焙木聚糖酶， (iii) 來自異孢鐮孢菌（Fusarium heterosporum)的糖脂酶。
66. 根據(jù)權(quán)利要求51-65中任一項所述的方法，其中所述食品組合物包含面團或面團 產(chǎn)品，優(yōu)選經(jīng)加工的面團產(chǎn)品。
67. 根據(jù)權(quán)利要求51-66中任一項所述的方法，包括烘焙所述食品組合物以制備烘焙 產(chǎn)品。
68. 根據(jù)權(quán)利要求51-67中任一項所述的方法，其中所述方法還包括： (i) 提供淀粉介質(zhì)； (ii) 將所述AcAmyl或其變體添加至所述淀粉介質(zhì)；以及 (iii) 在步驟（b)期間或之后對所述淀粉介質(zhì)加熱以制備烘焙產(chǎn)品。
69. -種用于制備食品組合物的組合物，其包含分離的AcAmyl或其變體以及一種或多 種食品成分，所述分離的AcAmyl或其變體具有α -淀粉酶活性并包含與（a) SEQ ID NO: I 的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80 %的氨基酸序列同 一性的氨基酸序列。
70. 根據(jù)權(quán)利要求69所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體包含與（a)SEQ ID N0:1 的第20-636位殘基或（b)SEQ ID N0:1的第20-497位殘基具有至少90%、95%或99%的 氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體包含（a) SEQ ID NO: 1 的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基。
72. 根據(jù)權(quán)利要求69所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體由與（a)SEQ ID N0:1的 第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%或99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。
73. 根據(jù)權(quán)利要求72所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體由（a) SEQ ID NO: 1的 第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基組成。
74. 根據(jù)權(quán)利要求69-73中任一項所述的AcAmyl或其變體在制備食品組合物中的用 途。
75. 根據(jù)權(quán)利要求74所述的用途，其中所述食品組合物包括面團或面團產(chǎn)品，優(yōu)選經(jīng) 加工的面團產(chǎn)品。
76. 根據(jù)權(quán)利要求74或75所述的用途，其中所述食品組合物為烘焙組合物。
77. 根據(jù)權(quán)利要求69-73中任一項所述的AcAmyl或其變體在面團產(chǎn)品中用于延緩或減 輕所述面團產(chǎn)品變陳，優(yōu)選地延緩或減輕其不利回生的用途。
78. -種從衣物、盤碟或紡織物除去淀粉污漬的方法，包括在存在含水組合物的情況下 溫育所述衣物、盤碟或紡織物的表面，所述含水組合物包含有效量的分離的AcAmyl或其變 體，所述分離的AcAmyl或其變體具有α-淀粉酶活性并包含與（ a)SEQ ID NO: 1的第20-636 位殘基或（b)SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%的氨基酸序列同一性的氨基酸 序列；并允許所述AcAmyl或其變體水解存在于所述淀粉污漬中的淀粉組分以生成溶解在 所述含水組合物中的較小的淀粉衍生分子；以及漂洗所述表面，從而從所述表面上除去所 述淀粉污漬。
79. 根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體以AkAA的劑量的約 17% -50%，或任選地約17% -34%給予，以在相同的條件下減少相同量的殘余淀粉。
80. 根據(jù)權(quán)利要求78或79所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體以AkAA的劑量的約 17% -50%，或任選地約17% -34%給予，以在相同的條件下減少相同量的DP3+。
81. 根據(jù)權(quán)利要求78所述的方法，其中當以總DP1-DP7的重量百分比測量時，與 由AkAA在相同條件下生成的淀粉衍生分子相比，所述淀粉衍生分子富含DPI、DP2或 (DP1+DP2)。
82. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中DPl在約2小時處富集約1. 5倍。
83. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中DP2在約2小時處富集2至3倍。
84. 根據(jù)權(quán)利要求81所述的方法，其中（DP1+DP2)在約2小時處富集約2. 2倍。
85. 根據(jù)權(quán)利要求78-80中任一項所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少90%、 95 %或99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
86. 根據(jù)權(quán)利要求85所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體包含（a) SEQ ID NO: 1的 第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基。
87. 根據(jù)權(quán)利要求78-80中任一項所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體由與（a)SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、 95 %或99 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。
88. 根據(jù)權(quán)利要求87所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體由（a) SEQ ID NO: 1的第 20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基組成。
89. -種用于從衣物、盤碟或紡織物除去淀粉污漬的組合物，所述組合物包含分離的 AcAmyl或其變體以及表面活性劑，所述分離的AcAmyl或其變體具有α -淀粉酶活性并包 含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少 80 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
90. 根據(jù)權(quán)利要求89所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體包含與（a)SEQ ID NO: 1 的第20-636位殘基或（b)SEQ ID N0:1的第20-497位殘基具有至少90%、95%或99%的 氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
91. 根據(jù)權(quán)利要求90所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體包含（a) SEQ ID NO: 1 的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基。
92. 根據(jù)權(quán)利要求89所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體由與（a)SEQ ID NO: 1的 第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%、90%、95%或99% 的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。
93. 根據(jù)權(quán)利要求92所述的組合物，其中所述AcAmyl或其變體由（a) SEQ ID NO: 1的 第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基組成。
94. 根據(jù)權(quán)利要求89-93中任一項所述的組合物，其中所述組合物是衣物洗滌劑、衣物 洗滌劑添加劑、或人工或自動盤碟洗滌劑。
95. -種將紡織物退漿的方法，包括使退漿組合物與紡織物接觸足以將所述紡織物退 楽的一段時間，其中所述退楽組合物包含分離的AcAmyl或其變體,所述分離的AcAmyl或其 變體具有α-淀粉酶活性并包含與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1 的第20-497位殘基具有至少80 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列；并允許所述AcAmyl 或其變體將存在于所述淀粉污漬中的淀粉組分退漿以生成溶解在所述含水組合物中的較 小的淀粉衍生分子；以及漂洗所述表面，從而從所述表面上除去所述淀粉污漬。
96. 根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體以AkAA的劑量的約 17% -50%，或任選地約17% -34%給予，以在相同的條件下減少相同量的殘余淀粉。
97. 根據(jù)權(quán)利要求95或96所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體以AkAA的劑量的約 17% -50%，或任選地約17% -34%給予，以在相同的條件下減少相同量的DP3+。
98. 根據(jù)權(quán)利要求95所述的方法，其中當以總DP1-DP7的重量百分比測量時，與 由AkAA在相同條件下生成的淀粉衍生分子相比，所述淀粉衍生分子富含DPI、DP2或 (DP1+DP2)。
99. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中DPl在約2小時處富集約1. 5倍。
100. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中DP2在約2小時處富集2至3倍。
101. 根據(jù)權(quán)利要求98所述的方法，其中（DP1+DP2)在約2小時處富集約2. 2倍。
102. 根據(jù)權(quán)利要求95-101中任一項所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體包含與 (a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少90%、 95 %或99 %的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
103. 根據(jù)權(quán)利要求102所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體包含（a)SEQ ID N0:1 的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基。
104. 根據(jù)權(quán)利要求95-101中任一項所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體由與（a) SEQ ID NO: 1的第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基具有至少80%、 90%、95%或99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列組成。
105. 根據(jù)權(quán)利要求104所述的方法，其中所述AcAmyl或其變體由（a)SEQ ID N0:1的 第20-636位殘基或（b) SEQ ID NO: 1的第20-497位殘基組成。
106. 包含AcAmyl或其變體的退漿組合物在使紡織物退漿中的用途。
【文檔編號】C12P19/14GK104321437SQ201380024428
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年5月6日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月11日
【發(fā)明者】K·A·克拉克森, 葛晶, 華玲, J·A·惠廷克, M·S·舍費爾斯, Z·唐, P·J·M·特尼森, M·范布魯塞爾-茲維內(nèi), C·瓦羅門, B·張 申請人:丹尼斯科美國公司