納米孔的制備方法和其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供用于使用核苷酸類似物和使標簽從并入的核苷酸類似物易位通過納米孔來對核酸測序的系統(tǒng)和方法。在各方面，本發(fā)明涉及用于使用標簽分子和對從并入所述分子釋放的標簽易位通過納米孔進行檢測來對核酸測序的組合物、方法和系統(tǒng)。
【專利說明】納米孔的制備方法和其用途
[0001] 簾叉引巧
[0002] 本申請要求2013年3月14日提交的美國臨時申請第61/781,353號、2012年6 月20日提交的美國臨時申請第61/662, 330號、2012年6月20日提交的美國臨時申請第 61/662, 329號、2012年6月20日提交的美國臨時申請第61/662, 334號和2012年4月9 日提交的美國臨時申請第61/621，981號的權益，所述申請W全文引用的方式并入本文中。
[0003] 關于聯(lián)巧贊助的研究的聲明
[0004] 本發(fā)明在政府支持下在由國家衛(wèi)生研究院O^JationalInstitutesofHealth)授 予的授權號HG005109下進行。政府擁有本發(fā)明中的某些權利。

【背景技術】
[0005] 核酸測序是測定核酸的核酸基體的工藝。所述序列信息可W有助于診斷和/或治 療受試者。舉例來說，受試者的核酸序列可W用來鑒別、診斷和可能開發(fā)對于遺傳疾病的治 療。作為另一實例，對于病原體的研究可W導致對于傳染疾病的治療。
[0006] 可獲得可W用來對核酸測序的方法。然而，所述方法是昂貴的，并且在一段時間內 并且在一定精確性下可能不會提供序列信息，所述時間和精確性可能為診斷和/或治療受 試者所必需。


【發(fā)明內容】

[0007] 涉及單鏈核酸分子通過納米孔的核酸測序方法可能具有不充足的靈敏度。包含 核酸分子的核酸堿基（例如腺嘿嶺（A)、胞嚼巧（C)、鳥嘿嶺佑)、胸嚼巧（T)和/或尿嚼巧 扣)）可能不提供與彼此充分不同的信號。具體來說，嘿嶺（即A和G)具有彼此類似的大 小、形狀和電荷，并且在一些情況下提供不充分不同的信號。此外，嚼巧（即C、T和U)具有 彼此類似的大小、形狀和電荷，并且在一些情況下提供不充分不同的信號。本文中認識到對 于改進用于核酸分子鑒別和核酸測序的方法的需要。
[0008] 本發(fā)明的一方面提供一種用于對核酸分子測序的方法，所述方法包含；(a)提供 包含可個別尋址的納米孔的芯片，其中所述多個可個別尋址的納米孔的可個別尋址的納米 孔在與電極相鄰安置的膜中包含納米孔，其中所述納米孔與核酸聚合酶連接，并且其中每 個可個別尋址的納米孔適于檢測在加標簽的核巧酸聚合后從所述加標簽的核巧酸釋放的 標簽；化）引導所述核酸分子W與所述納米孔相鄰或接近；（C)借助于所述聚合酶，使核巧 酸沿著所述核酸分子聚合W產(chǎn)生與所述核酸分子的至少一部分互補的鏈，其中在聚合期 間，標簽從所述核巧酸的個別核巧酸釋放，并且其中所述釋放的標簽流動通過或接近所述 納米孔；和（d)借助于所述電極檢測所述標簽，其中所述標簽在從所述個別核巧酸釋放之 后進行檢測。在一些實施例中，（d)的所述檢測進一步包含鑒別所述標簽。在一些情況下， 所述方法進一步包含使所述鑒別的標簽與一類所述個別核巧酸相關聯(lián)。在一些情況下，所 述方法進一步包含借助于計算機處理器、基于在聚合期間檢測的所述標簽的評估來產(chǎn)生所 述核酸分子的核酸序列。
[0009] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于核酸測序的方法，所述方法包含；(a)使核酸發(fā) 夾連接到雙鏈核酸分子的一端上；化）使所述雙鏈核酸分子與發(fā)夾解離W形成單鏈核酸模 板；（C)使用加標簽的核巧酸延伸與所述單鏈核酸模板雜交的引物，其中與個別核巧酸相 關聯(lián)的標簽在延伸后釋放；和（d)借助于納米孔檢測所述釋放的標簽，由此測定雙鏈核酸 分子的核酸序列。在一些情況下，所述方法進一步包含引導從所述個別核巧酸釋放的所述 標簽通過所述納米孔。在一些情況下，所述方法進一步包含引導從所述個別核巧酸釋放的 所述標簽到與所述納米孔相鄰的位置。
[0010] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于核酸測序的方法，所述方法包含；(a)使加標簽 的核巧酸W第一速率聚合，其中與個別核巧酸相關聯(lián)的標簽在聚合后釋放；和化）通過使 所述標簽W第二速率通過納米孔來檢測所述釋放的標簽，其中所述第二速率大于或等于所 述第一速率。
[0011] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于核酸測序的方法，所述方法包含；(a)使加標簽 的核巧酸聚合，其中與個別核巧酸相關聯(lián)的標簽在聚合后釋放；和化）借助于納米孔檢測 所述釋放的標簽。在一些情況下，所述方法進一步包含引導從所述個別核巧酸釋放的所述 標簽通過所述納米孔。在一些情況下，所述方法進一步包含引導從所述個別核巧酸釋放的 所述標簽到與所述納米孔相鄰的位置。
[0012] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于核酸測序的方法，其包含借助于納米孔檢測核巧 酸向核酸分子中的并入，其中所述核酸分子不通過所述納米孔。
[0013] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于核酸測序的方法，其包含借助于納米孔檢測個別 核巧酸并入事件的副產(chǎn)物。
[0014] 一種用于對核酸分子測序的方法，其包含W大于4O的精確性區(qū)別個別核巧酸并 入事件。
[0015] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于核酸測序的方法，所述方法包含；(a)提供納米 孔陣列，其中所述陣列中的個別納米孔與核酸聚合酶結合；和化）用所述聚合酶使加標簽 的核巧酸聚合，其中個別加標簽的核巧酸包含標簽，并且其中所述標簽被釋放并且借助于 所述納米孔進行檢測。
[0016] 本發(fā)明的另一方面提供一種加標簽的核巧酸，其中所述核巧酸包含能夠在核巧酸 聚合事件中裂解并且借助于包含納米孔陣列的芯片中的納米孔進行檢測的標簽。
[0017] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于對核酸分子測序的系統(tǒng)，其包含；(a)包含可個 別尋址的納米孔的芯片，其中所述多個可個別尋址的納米孔的可個別尋址的納米孔在與電 極相鄰安置的膜中包含至少一個納米孔，其中每個可個別尋址的納米孔適于幫助檢測在于 與所述核酸分子互補的核酸鏈中并入加標簽的核巧酸后從所述加標簽的核巧酸釋放的標 簽；和化）與所述可個別尋址的納米孔禪接的計算機處理器，其中所述計算機處理器被程 序化W幫助基于從所述多個可個別尋址的納米孔接收的電信號來表征所述核酸分子的核 酸序列，其中個別電信號與在于與所述核酸分子互補的核酸鏈中并入加標簽的核巧酸之后 從所述加標簽的核巧酸釋放的標簽相關聯(lián)。
[0018] 本發(fā)明的另一方面提供一種用于對核酸分子測序的方法，所述方法包含W每皿2 至少約500個位點的密度提供可個別尋址的位點陣列，每個位點具有與核酸聚合酶連接的 納米孔；和在所述陣列的既定位點處，用聚合酶使加標簽的核巧酸聚合，其中在聚合后標簽 在所述既定位點處被釋放并且通過納米孔進行檢測。在一些情況下，所述方法進一步包含 引導借助于處理器、基于所述檢測的標簽來產(chǎn)生所述核酸分子的核酸序列。
[0019]本發(fā)明的另一方面提供一種電導測量系統(tǒng)（^conductancemeasurementsystem)， 其包含；(a)第一和第二隔室，其中第一與第二電解質溶液由物理屏障（physical barrier)間隔開，所述屏障具有至少一個直徑是納米級的孔隙；(b)用于施加穿過所述屏 障的電場的構件；（C)用于測量所述電場的變化的構件；（d)至少一種與所述孔隙連接的聚 合酶；和（e)多于一種與所述孔隙連接的磯酸酶。
[0020] 本發(fā)明的另一方面提供一種具有W下結構的化合物：
[0021]

【權利要求】
1. 一種電導測量系統(tǒng)，其包含： (a) 第一和第二隔室，其中第一與第二電解質溶液由物理屏障間隔開，所述屏障具有至 少一個直徑是納米級的孔隙； (b) 用于施加穿過所述屏障的電場的構件； (c) 用于測量所述電場的變化的構件； (d) 至少一種與所述孔隙連接的聚合酶；和 (e) 多于一種與所述孔隙連接的磷酸酶。
2. 根據(jù)權利要求1所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述孔隙的直徑是約1到10nm。
3. 根據(jù)權利要求1所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述聚合酶和所述磷酸酶與所述孔隙共 價連接。
4. 根據(jù)權利要求1所述的電導測量系統(tǒng)，其中與聚合酶相比更多磷酸酶與所述孔隙連 接。
5. 根據(jù)權利要求1到4中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述磷酸酶被定位成使得 在聚合酶反應中由所述聚合酶制造的聚磷酸酯在進入所述孔隙之前與所述磷酸酶相互作 用。
6. 根據(jù)權利要求5所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述磷酸酶與所述聚磷酸酯之間的相互 作用的速率與所述聚合酶制造所述聚磷酸酯的速率相比更快或相等。
7. 根據(jù)權利要求1到6中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述第一和所述第二隔室 中的每一者具有電荷。
8. 根據(jù)權利要求1到7中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述孔隙的內部具有負電 荷。
9. 根據(jù)權利要求1到8中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述孔隙是生物或合成的。
10. 根據(jù)權利要求9所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述孔隙是蛋白質的。
11. 根據(jù)權利要求10所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述孔隙是α溶血素蛋白質。
12. 根據(jù)權利要求1到8中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述孔隙是固態(tài)孔隙。
13. 根據(jù)權利要求1到12中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述孔隙由石墨烯形成。
14. 根據(jù)權利要求1到13中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其進一步包含各自具有實質 上相同特征的孔隙的陣列。
15. 根據(jù)權利要求1到13中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其進一步包含不同直徑的孔 隙的陣列。
16. 根據(jù)權利要求1到13中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其進一步包含孔隙的陣列，其 中所述孔隙被配置成施加穿過所述屏障的不同電場。
17. 根據(jù)權利要求1到16中任一項所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述電導測量系統(tǒng)與 CMOS電子裝置集成。
18. 根據(jù)權利要求17所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述孔隙或孔隙的陣列如圖46中所示 直接集成到CMOS模具中。
19. 一種具有以下結構的化合物：
其中所述標簽包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化學發(fā) 光化合物、單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、燒基、稀基、塊基、置氣基或其組合，其中R 1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中所述堿基是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧 啶、胸嘧啶、尿嘧啶或這些堿基之一的衍生物，其中η是1、2、3或4,并且其中所述標簽的電 荷相對于所述化合物的其余部分上的電荷正負相反。
20. 根據(jù)權利要求19所述的化合物，其中所述標簽上的所述電荷的量級與所述化合物 的所述其余部分上的所述電荷的量級相同。
21. 根據(jù)權利要求19或20所述的化合物，其中所述標簽包含多個乙二醇單元。
22. 根據(jù)權利要求19到21中任一項所述的化合物，其中所述標簽包含16、20、24或36 個乙二醇單元。
23. 根據(jù)權利要求19到22中任一項所述的化合物，其中所述標簽包含另一可鑒別部 分。
24. 根據(jù)權利要求23所述的化合物，其中所述另一可鑒別部分是基于香豆素的染料。
25. 根據(jù)權利要求19到24中任一項所述的化合物，其中所述標簽具有正電荷。
26. 根據(jù)權利要求19到25中任一項所述的化合物，其中所述標簽的去除改變所述化合 物的電荷。
27. 根據(jù)權利要求19到26中任一項所述的化合物，其中所述標簽進一步包含適當數(shù)目 的賴氨酸或精氨酸以平衡磷酸酯的數(shù)目。
28. -種組合物，其包含四種不同類型的具有以下結構的化合物：
其中所述標簽包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化學發(fā) 光化合物、單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、燒基、稀基、塊基、置氣基或其組合，其中R 1是0Η，其中R2是H 或0Η，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中η是1、2、3或4,其中所述標簽的 電荷相對于所述化合物的其余部分上的電荷正負相反，其中第一類型的化合物的堿基是腺 嘌呤或其衍生物，第二類型的化合物的堿基是鳥嘌呤或其衍生物，第三類型的化合物的堿 基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四類型的化合物的堿基是胸嘧啶或其衍生物或尿嘧啶或其 衍生物，并且其中每種類型的化合物上的標簽不同于所述其它三種類型的化合物中的每一 者上的標簽。
29. 根據(jù)權利要求28所述的組合物，其進一步包含第五類型的化合物，其在所述堿基 方面和在所述標簽方面不同于所述四種類型的化合物中的每一者，其中如果所述第四類型 的化合物的所述堿基是胸嘧啶或其衍生物，那么所述第五類型的化合物的堿基是尿嘧啶或 其衍生物，或其中如果所述第四類型的化合物的所述堿基是尿嘧啶或其衍生物，那么所述 第五類型的化合物的所述堿基是胸嘧啶或其衍生物。
30. -種用于確定化合物的身份的方法，其包含： (a) 使所述化合物與包含以下的電導測量系統(tǒng)接觸：（i)第一和第二隔室，其中第一與 第二電解質溶液由物理屏障間隔開，所述屏障具有至少一個直徑是納米級的孔隙；（ii)用 于施加穿過所述屏障的電場的構件；（iii)用于測量所述電場的變化的構件； (b) 記錄當所述化合物易位通過所述孔隙時的所述電場的所述變化，其中所述電場的 所述變化是所述化合物、所述電解質與所述孔隙之間的相互作用的結果，并且指示所述化 合物的大小、電荷和組成， 由此使得所述變化與預定值之間相關以確定所述化合物的身份。
31. 根據(jù)權利要求30所述的方法，其進一步包含在步驟（a)之前用磷酸酶處理所述化 合物的步驟。
32. -種用于確定化合物是標簽還是所述標簽的前體的方法，其包含： (a) 使所述化合物與包含以下的電導測量系統(tǒng)接觸：（i)第一和第二隔室，其中第一與 第二電解質溶液由物理屏障間隔開，所述屏障具有至少一個直徑是納米級的孔隙；（ii)用 于施加穿過所述屏障的電場的構件；（iii)用于測量所述電場的變化的構件； (b) 記錄當所述化合物易位通過所述孔隙時的所述電場的所述變化；和 (c) 將所述電場的所述變化與對應于所述標簽和所述標簽的所述前體的預定值比較， 由此確定所述化合物是所述標簽還是其所述前體。
33. 根據(jù)權利要求30到32中任一項所述的方法，其進一步包含在步驟（a)中調節(jié)所述 電場的電流偏置的步驟。
34. -種用于測定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含： (a)使所述單鏈DNA與 包含以下的電導測量系統(tǒng)接觸：（i)第一和第二隔室，其中第一與第二電解質溶液由 物理屏障間隔開，所述屏障具有至少一個直徑是納米級的孔隙；（ii)用于施加穿過所述屏 障的電場的構件；（iii)用于測量所述電場的變化的構件；（iv)至少一種與所述孔隙連接 的聚合酶；和（V)多于一種與所述孔隙連接的磷酸酶，和 一種組合物，其包含四種不同類型的具有以下結構的化合物：
其中所述標簽包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化學發(fā) 光化合物、單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、燒基、稀基、塊基、置氣基或其組合，其中R1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中η是1、2、3或4,其中所述標簽的 電荷相對于所述化合物的其余部分上的電荷正負相反，其中第一類型的化合物的堿基是腺 嘌呤或其衍生物，第二類型的化合物的堿基是鳥嘌呤或其衍生物，第三類型的化合物的堿 基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四類型的化合物的堿基是胸嘧啶或其衍生物，并且其中每 種類型的化合物上的標簽不同于所述其它三種類型的化合物中的每一者上的標簽， 其中所述單鏈DNA在電解質溶液中接觸與所述孔隙連接的所述聚合酶，并且其中所述 單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，如果所述化合物與所述單鏈DNA的在所述單鏈DNA 的與所述引物的3'端核苷酸殘基雜交的核苷酸殘基的緊密5'的核苷酸殘基互補，那么在 允許所述聚合酶催化所述化合物之一并入到所述引物中的條件下，以便形成DNA延伸產(chǎn) 物， 其中所述化合物的并入導致釋放有所述標簽與其連接的聚磷酸酯， 其中與所述孔隙連接的所述磷酸酶使所述標簽從所述聚磷酸酯裂解以釋放所述標 簽； (b) 通過施加穿過所述屏障的電場并且測量步驟（a)易位通過所述孔隙中產(chǎn)生的由所 述標簽引起的穿過所述孔隙的電子變化，來確定哪種化合物已經(jīng)并入到所述引物中以形成 步驟（a)中的所述DNA延伸產(chǎn)物，其中所述電子變化對于每種類型的標簽不同，由此鑒別所 述單鏈DNA中與所述并入的化合物互補的所述核苷酸殘基；和 (c) 對于所測序的所述單鏈DNA的每種核苷酸殘基重復進行步驟（b)， 由此測定所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。
35. -種用于測定單鏈DNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含： (a)使所述單鏈DNA與 包含以下的電導測量系統(tǒng)接觸：（i)第一和第二隔室，其中第一與第二電解質溶液由 物理屏障間隔開，所述屏障具有至少一個直徑是納米級的孔隙；（ii)用于施加穿過所述屏 障的電場的構件；（iii)用于測量所述電場的變化的構件；（iv)至少一種與所述孔隙連接 的聚合酶；和（V)多于一種與所述孔隙連接的磷酸酶，和 一種具有以下結構的化合物：
其中所述標簽包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化學發(fā) 光化合物、單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、燒基、稀基、塊基、置氣基或其組合，其中R 1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中所述堿基是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧 啶、胸嘧啶或這些堿基之一的衍生物，其中η是1、2、3或4,并且其中所述標簽的電荷相對于 所述化合物的其余部分上的電荷正負相反， 其中所述單鏈DNA在電解質溶液中接觸與所述孔隙連接的所述聚合酶，并且其中所述 單鏈DNA具有與其一部分雜交的引物，如果所述化合物與所述單鏈DNA的在所述單鏈DNA 的與所述引物的3'端核苷酸殘基雜交的核苷酸殘基的緊密5'的核苷酸殘基互補，那么在 允許所述聚合酶催化其并入到所述引物中的條件下，以便形成DNA延伸產(chǎn)物， 其中如果不并入所述化合物，那么反復重復接觸不同化合物直到并入化合物，其限制 條件為（1)所述化合物上的堿基的類型不同于所述先前化合物中的每一者上的堿基的類 型，和（2)所述化合物上的標簽的類型不同于所述先前化合物中的每一者上的標簽的類 型， 其中所述化合物的并入導致釋放有所述標簽與其連接的聚磷酸酯， 其中與所述孔隙連接的所述磷酸酶使所述標簽從所述聚磷酸酯裂解以釋放所述標 簽； (b) 通過施加穿過所述屏障的電場并且測量步驟（a)易位通過所述孔隙中產(chǎn)生的由所 述標簽引起的穿過所述孔隙的電子變化，來確定哪種化合物已經(jīng)并入到所述引物中以形成 步驟（a)中的所述DNA延伸產(chǎn)物，其中所述電子變化對于每種類型的標簽不同，由此鑒別所 述單鏈DNA中與所述并入的化合物互補的所述核苷酸殘基；和 (c) 對于所測序的所述單鏈DNA的每種核苷酸殘基反復進行步驟（a)和（b)，由此測定 所述單鏈DNA的所述核苷酸序列。
36. -種用于測定單鏈RNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含： (a)使所述單鏈RNA與 包含以下的電導測量系統(tǒng)接觸：（i)第一和第二隔室，其中第一與第二電解質溶液由 物理屏障間隔開，所述屏障具有至少一個直徑是納米級的孔隙；（ii)用于施加穿過所述屏 障的電場的構件；（iii)用于測量所述電場的變化的構件；（iv)至少一種與所述孔隙連接 的聚合酶；和（V)多于一種與所述孔隙連接的磷酸酶，和 一種組合物，其包含四種不同類型的具有以下結構的化合物：
其中所述標簽包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化學發(fā) 光化合物、單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、燒基、稀基、塊基、置氣基或其組合，其中R 1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中η是1、2、3或4,其中所述標簽的 電荷相對于所述化合物的其余部分上的電荷正負相反，其中第一類型的化合物的堿基是腺 嘌呤或其衍生物，第二類型的化合物的堿基是鳥嘌呤或其衍生物，第三類型的化合物的堿 基是胞嘧啶或其衍生物，并且第四類型的化合物的堿基是尿嘧啶或其衍生物，并且其中每 種類型的化合物上的標簽不同于所述其它三種類型的化合物中的每一者上的標簽， 其中所述單鏈RNA在電解質溶液中接觸與所述孔隙連接的所述聚合酶，并且其中所述 單鏈RNA具有與其一部分雜交的引物，如果所述化合物與所述單鏈RNA的在所述單鏈RNA 的與所述引物的3'端核苷酸殘基雜交的核苷酸殘基的緊密5'的核苷酸殘基互補，那么在 允許所述聚合酶催化所述化合物之一并入到所述引物中的條件下，以便形成RNA延伸產(chǎn) 物， 其中所述化合物的并入導致釋放有所述標簽與其連接的聚磷酸酯， 其中與所述孔隙連接的所述磷酸酶使所述標簽從所述聚磷酸酯裂解以釋放所述標 簽； (b) 通過施加穿過所述屏障的電場并且測量步驟（a)易位通過所述孔隙中產(chǎn)生的由所 述標簽引起的穿過所述孔隙的電子變化，來確定哪種化合物已經(jīng)并入到所述引物中以形成 步驟（a)中的所述RNA延伸產(chǎn)物，其中所述電子變化對于每種類型的標簽不同，由此鑒別所 述單鏈RNA中與所述并入的化合物互補的所述核苷酸殘基；和 (c) 對于所測序的所述單鏈RNA的每種核苷酸殘基重復進行步驟（b)， 由此測定所述單鏈RNA的所述核苷酸序列。
37. -種用于測定單鏈RNA的核苷酸序列的方法，所述方法包含： (a)使所述單鏈RNA與 包含以下的電導測量系統(tǒng)接觸：（i)第一和第二隔室，其中第一與第二電解質溶液由 物理屏障間隔開，所述屏障具有至少一個直徑是納米級的孔隙；（ii)用于施加穿過所述屏 障的電場的構件；（iii)用于測量所述電場的變化的構件；（iv)至少一種與所述孔隙連接 的聚合酶；和（V)多于一種與所述孔隙連接的磷酸酶，和 一種具有以下結構的化合物：
其中所述標簽包含以下中的一或多者：乙二醇、氨基酸、碳水化合物、肽、染料、化學發(fā) 光化合物、單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸、脂肪族酸、芳香 族酸、醇、硫醇基、氛基、硝基、燒基、稀基、塊基、置氣基或其組合，其中R 1是0H，其中R2是H 或0H，其中X是0、NH、S或CH2，其中Z是0、S或BH3，其中所述堿基是腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧 啶、尿嘧啶或這些堿基之一的衍生物，其中η是1、2、3或4,并且其中所述標簽的電荷相對于 所述化合物的其余部分上的電荷正負相反， 其中所述單鏈RNA在電解質溶液中接觸與所述孔隙連接的所述聚合酶，并且其中所述 單鏈RNA具有與其一部分雜交的引物，如果所述化合物與所述單鏈RNA的在所述單鏈DNA 的與所述引物的3'端核苷酸殘基雜交的核苷酸殘基的緊密5'的核苷酸殘基互補，那么在 允許所述聚合酶催化其并入到所述引物中的條件下，以便形成RNA延伸產(chǎn)物， 其中如果不并入所述化合物，那么反復重復接觸不同化合物直到并入化合物，其限制 條件為（1)所述化合物上的堿基的類型不同于所述先前化合物中的每一者上的堿基的類 型，和（2)所述化合物上的標簽的類型不同于所述先前化合物中的每一者上的標簽的類 型， 其中所述化合物的并入導致釋放有所述標簽與其連接的聚磷酸酯， 其中與所述孔隙連接的所述磷酸酶使所述標簽從所述聚磷酸酯裂解以釋放所述標 簽； (b) 通過施加穿過所述屏障的電場并且測量步驟（a)易位通過所述孔隙中產(chǎn)生的由所 述標簽引起的穿過所述孔隙的電子變化，來確定哪種化合物已經(jīng)并入到所述引物中以形成 步驟（a)中的所述RNA延伸產(chǎn)物，其中所述電子變化對于每種類型的標簽不同，由此鑒別所 述單鏈RNA中與所述并入的化合物互補的所述核苷酸殘基；和 (c) 對于所測序的所述單鏈RNA的每種核苷酸殘基反復進行步驟（a)和（b)，由此測定 所述單鏈RNA的所述核苷酸序列。
38. 根據(jù)權利要求34到37中任一項所述的方法，其中與聚合酶相比更多磷酸酶與所述 孔隙連接。
39. 根據(jù)權利要求34到37中任一項所述的方法，其中所述單鏈DNA或RNA通過使雙鏈 DNA或RNA變性而獲得，以適用者為準。
40. 根據(jù)權利要求34到37中任一項所述的方法，其中相同單鏈DNA或RNA的多個拷貝 固定于珠子上。
41. 根據(jù)權利要求40所述的方法，其中所述單鏈DNA或RNA的所述核苷酸序列使用所 述相同單鏈DNA或RNA的多個拷貝來測定。
42. 根據(jù)權利要求34到41中任一項所述的方法，其進一步在每個反復的步驟（b)之后 包含洗滌步驟以去除未并入的化合物以免與所述單鏈DNA或RNA接觸。
43. 根據(jù)權利要求34到42中任一項所述的方法，其進一步在每個反復的步驟（b)之后 包含確定與所述標簽連接的另一可鑒別部分的身份的步驟。
44. 根據(jù)權利要求34到43中任一項所述的方法，其中至少85-99%的所述釋放的標簽 易位通過所述孔隙。
45. 根據(jù)權利要求34到44中任一項所述的方法，其中所述化合物進一步包含可逆終止 子。
46. 根據(jù)權利要求45所述的方法，其進一步包含在每個反復的步驟（b)之后去除所述 可逆終止子的步驟。
47. 根據(jù)權利要求46所述的方法，其中所述可逆終止子通過生物手段、化學手段、物理 手段或通過光照射而去除。
48. 根據(jù)權利要求34到47中任一項所述的方法，其中所述孔隙的內部的電荷相對于所 述標簽或有所述標簽與其連接的所述聚磷酸酯的電荷正負相反。
49. 根據(jù)權利要求34到48中任一項所述的方法，其中所述電導測量系統(tǒng)的所述第一和 所述第二隔室中的每一者具有電荷。
50. 根據(jù)權利要求49所述的方法，其中所述第一與所述第二隔室的所述電荷極性相 反。
51. 根據(jù)權利要求49所述的方法，其中所述第一和所述第二隔室的所述電荷是可調節(jié) 的。
52. 根據(jù)權利要求34到51中任一項所述的方法，其中在步驟（b)中所述標簽易位通過 所述孔隙的速率基于標簽的所述電荷以及所述第一和所述第二隔室的所述電荷來測定。
53. 根據(jù)權利要求34到52中任一項所述的方法，其中所述第一和所述第二隔室中的每 一者的電荷使得在步驟（b)中所述標簽以與在步驟（a)中所述標簽或有所述標簽與其連接 的所述聚磷酸酯被釋放的速率相比更快或相等的速率易位通過所述孔隙。
54. -種電導測量系統(tǒng)，其包含： 間隔開至少第一與第二電解質溶液的電阻屏障； 所述電阻屏障包含至少一個直徑是納米級的孔隙； 在所述第一和第二電解質溶液中的至少一者中的至少一種具有標簽的化合物； 所述至少一個孔隙被配置成允許離子電流由施加的電勢驅動穿過所述第一和第二電 解質溶液； 所述至少一個孔隙包含被配置成使所述標簽從所述化合物裂解以釋放所述標簽的特 征；和 測量所述離子電流的構件和將其時間過程記錄為時間序列的構件，所述時間序列包括 所述至少一個孔隙不受所述標簽阻塞的時間段以及所述標簽產(chǎn)生降低的電導的脈沖的時 間段。
55. 根據(jù)權利要求54所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述標簽在所述孔隙中的滯留時間大 于測量所述離子電流的所述構件的離子電流帶寬和電流散彈噪聲的限度。
56. -種將電導時間序列的片段劃定為與不受阻塞的孔隙電導水平統(tǒng)計一致的區(qū)域和 降低的電導的脈沖以及降低的電導的個別脈沖內的統(tǒng)計穩(wěn)定片段的方法，所述電導時間序 列用包含以下的電導測量系統(tǒng)產(chǎn)生： 間隔開至少第一與第二電解質溶液的電阻屏障； 所述電阻屏障包含至少一個直徑是納米級的孔隙； 在所述第一和第二電解質溶液中的至少一者中的至少一種具有標簽的化合物； 所述至少一個孔隙被配置成允許離子電流由施加的電勢驅動穿過所述第一和第二電 解質溶液； 所述至少一個孔隙包含被配置成使所述標簽從所述化合物裂解以釋放所述標簽的特 征；和 測量所述離子電流的構件和記錄所述電導時間序列的構件，所述時間序列包括所述至 少一個孔隙不受所述標簽阻塞的時間段以及所述標簽產(chǎn)生降低的電導的脈沖的時間段； 劃定電導時間序列的片段的所述方法選自由以下組成的群組： (a) 對從所述原始電導時間序列估計的連續(xù)密度隱馬爾可夫模型的最大似然狀態(tài)序列 進行維特比解碼； (b) 經(jīng)由與偏離開放孔隙電導水平的差幅的閾值比較來劃定降低的電導的脈沖的區(qū) 域；和 (c) 通過估計每一片段的離子電流水平的集中趨勢或通過一起測量集中趨勢和片段持 續(xù)時間來表征降低的電導的脈沖的構件，片段集中趨勢的量度選自由以下組成的群組： (i) 作為連續(xù)密度隱馬爾可夫模型的一部分從所述電導時間序列估計的第一 GMM的高 斯分量的平均參數(shù)； (ii) 算術平均值； (iii) 截尾平均值； (iv) 中值；和 (V)樣品位置的最大后驗概率估計量或樣品位置的最大似然估計量。
57. 根據(jù)權利要求56所述的方法，其進一步包含以下至少一者： (a) 基于電導片段的集中趨勢的所述量度對第二高斯混合模型進行最大似然估計； (b) 借助于插值尋峰，和使所述電導時間序列的片段的集中趨勢的估計的經(jīng)驗概率密 度平滑，和對插值函數(shù)的導數(shù)求根；和 (c) 定位多峰分布估計量的模式的另一構件。
58. -種用于測定溶液中的化合物的至少一個參數(shù)的方法，其包含以下步驟： 將第一流體放置于第一儲槽中； 將第二流體放置于第二儲槽中； 所述第一和所述第二流體中的至少一者包含至少一種化合物，其中所述化合物是加標 簽的核苷酸或從加標簽的核苷酸裂解的標簽； 所述第一儲槽中的所述第一流體用電阻屏障與所述第二儲槽中的所述第二流體間隔 開； 所述電阻屏障包含至少一個孔隙； 用所述第一與所述第二流體之間的電勢使離子電流通過所述第一流體、所述至少一個 孔隙和所述第二流體； 測量通過所述至少一個孔隙的所述離子電流和所述離子電流的變化的持續(xù)時間； 所述離子電流的所述測量進行一段時間，以足以測量由所述化合物與所述至少一個孔 隙相互作用而引起的所述離子電流的降低； 和通過數(shù)學分析在所述時間段內所述離子電流的所述變化和所述離子電流的所述變 化的所述持續(xù)時間，來測定所述化合物的至少一個參數(shù)； 所述數(shù)學分析包含至少一個選自由以下組成的群組的步驟： i) 作為連續(xù)密度隱馬爾可夫模型的一部分從所述電導時間序列估計的第一 GMM的高 斯分量的平均參數(shù)； ii) 事件平均值抽??； iii) 最大似然事件狀態(tài)指定； iv) 閾值檢測和平均； V)滑動窗分析； vi) 算術平均值； vii) 截尾平均值； viii) 中值；和 ix) 樣品位置的最大后驗概率估計量或樣品位置的最大似然估計量。
59. 根據(jù)權利要求56到58中任一項所述的方法，其中所述化合物在測量所述離子電流 的所述降低之前用磷酸酶進行處理。
60. 根據(jù)權利要求56到59中任一項所述的方法，其中所述化合物是交替地帶電的化合 物，其具有第一凈電荷，并且在化學、物理或生物反應之后具有不同的第二凈電荷。
61. 根據(jù)權利要求56到60中任一項所述的方法，其中所述數(shù)學分析選自由以下組成的 群組：GMM、閾值檢測和平均以及滑動窗分析。
62. 根據(jù)權利要求56到61中任一項所述的方法，其中所述至少一個參數(shù)選自由以下組 成的群組：所述化合物的濃度、大小、電荷和組成。
63. 根據(jù)權利要求30到53和56到62中任一項所述的方法，其進一步包含校準所述電 導測量系統(tǒng)的步驟。
64. 根據(jù)權利要求30到53和56到63中任一項所述的方法，其中精確性大于4 σ。
65. 根據(jù)權利要求30到53和56到63中任一項所述的方法，其中所述精確性大于5 σ。
66. 根據(jù)權利要求30到53和56到63中任一項所述的方法，其中所述精確性大于6 σ。
67. -種加標簽的核苷酸，其中所述核苷酸包含能夠在核苷酸聚合事件中裂解并且借 助于納米孔進行檢測的標簽。
68. 根據(jù)權利要求67所述的核苷酸，其中所述標簽與所述核苷酸的5' -磷酸酯連接。
69. 根據(jù)權利要求67所述的核苷酸，其中所述標簽不是熒光團。
70. 根據(jù)權利要求67所述的核苷酸，其中所述標簽可通過其電荷、形狀、大小或其任何 組合而檢測。
71. 根據(jù)權利要求1所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述第一與第二電解質溶液相同。
72. 根據(jù)權利要求54所述的電導測量系統(tǒng)，其中所述第一與所述第二電解質溶液相 同。
73. 根據(jù)權利要求56所述的方法，其中所述第一與所述第二電解質溶液相同。
74. 根據(jù)權利要求58所述的方法，其中所述第一流體與所述第二流體相同。
75. -種加標簽的核苷酸，其中所述核苷酸包含能夠在核苷酸聚合事件中裂解并且借 助于納米孔進行檢測的標簽。
76. 根據(jù)權利要求75所述的核苷酸，其中所述標簽與所述核苷酸的5' -磷酸酯連接。
77. 根據(jù)權利要求75所述的核苷酸，其中所述標簽不是熒光團。
78. 根據(jù)權利要求75所述的核苷酸，其中所述標簽可通過其電荷、形狀、大小或其任何 組合而檢測。
79. -種用于核酸測序的方法，所述方法包含提供可個別尋址的位點陣列，每個位點具 有與核酸聚合酶連接的納米孔；和在所述陣列的既定位點處，用聚合酶使加標簽的核苷酸 聚合，其中標簽在所述既定位點處被釋放并且通過納米孔進行檢測。
【文檔編號】C12Q1/42GK104379761SQ201380025837
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月8日 優(yōu)先權日:2012年4月9日
【發(fā)明者】靜月·居, 希爾·庫瑪爾, 傳娟·陶, 民辰·錢, 詹姆斯·J·拉索, 約翰·J·卡希恩沃維奇, 約瑟夫·W·F·羅伯森 申請人:紐約哥倫比亞大學理事會, 由商務部長代表的美國政府