具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)化效率的細(xì)菌突變體的制作方法
【專利摘要】在此提供了具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)化效率的乳桿菌突變體，該突變體包括對(duì)編碼限制修飾系統(tǒng)蛋白的內(nèi)源基因的破壞。還描述了用于產(chǎn)生這些突變體的方法、用于使用這些突變體產(chǎn)生轉(zhuǎn)化體的方法、以及用于使用這些突變體產(chǎn)生多肽或發(fā)酵產(chǎn)物的方法。
【專利說(shuō)明】具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)化效率的細(xì)菌突變體
[0001] 序列表的引用
[0002] 本申請(qǐng)包括一個(gè)計(jì)算機(jī)可讀形式的序列表，將其通過(guò)引用結(jié)合在此。
[000引背景
[0004]由于它缺乏宿主樣甲基化模式，抑或由于相對(duì)于宿主DNA的稀有堿基修飾的存在， 對(duì)于給定細(xì)胞，被識(shí)別為外源的DNA可W被祀向于在細(xì)胞內(nèi)降解炬air(貝爾）和Black(布 萊克），2007,JMolBiol(分子生物學(xué)雜志）（366:768-778)。據(jù)報(bào)道，隨后被限制性內(nèi)切 核酸酶降解構(gòu)成了將DNA引入細(xì)菌中的有效屏障炬riggs(布里格斯）等人Appl.Environ. Microbiol.(應(yīng)用與環(huán)境微生物學(xué)）1"4, 6〇, 2〇〇6-2〇10 ;Accetto(阿奇巧）等人FEMS Microbiol.Lett.(歐洲微生物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)快報(bào)）2005, 247, 177-183 ;(貝爾）和 Black(布萊克），J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜志）2007, 366, 768-778;Corvaglia(科爾瓦 利亞）等人Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊）2010, 107, 11954-11958 ; Monk(蒙克）等人，2012,HiBio3(2):e00277-ll.doi:10. 1128/mBio. 00277-11)。
[0005] 通過(guò)多種標(biāo)準(zhǔn)，該些基于核酸酶的系統(tǒng)被分為四種主要類型，I型至IV型 (Robeds(羅伯茨）等人NucleicAcidsRes.(核酸研究）2003,31, 1805-1812)。I型至 III型系統(tǒng)涵蓋了成對(duì)的甲基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切核酸酶活性，降解缺乏適當(dāng)甲基化模式的外源 DNA，而IV型酶是僅切割已經(jīng)被修飾的DNA底物的內(nèi)切核酸酶（Tock(巧科）和化yden(德 萊登），Curr.Opin.Microbiol.(微生物學(xué)新見）2005, 8, 466-472)。
[0006] 對(duì)于多種工業(yè)上相關(guān)的過(guò)程（例如代謝工程和生化生產(chǎn)）而言，細(xì)菌轉(zhuǎn)化體提供 了關(guān)鍵平臺(tái)。然而，將外源DNA引入一些細(xì)菌宿主（例如乳桿菌）會(huì)是一個(gè)無(wú)效率的過(guò)程， 生成的轉(zhuǎn)化體極少，如果有的話。在本領(lǐng)域中，對(duì)于將DNA引入細(xì)菌宿主細(xì)胞來(lái)改進(jìn)所得轉(zhuǎn) 化體的效率的新方法存在需要。本發(fā)明滿足了該些和其他需要。
[0007] 概述
[0008] 在此描述了具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)化效率的分離的乳桿菌突變體。在一個(gè)方面，是親本乳 桿菌菌株的突變體，包含對(duì)編碼I型限制修飾系統(tǒng)亞基（例如限制性亞基（restriction subunit)或特異性亞基（specificitysubunit))的內(nèi)源基因的破壞，其中當(dāng)在相同條件下 培養(yǎng)時(shí)，與親本乳桿菌菌株相比，該突變體具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)化效率。在一些方面，乳桿菌突變 體是路氏乳桿菌突變體。
[0009] 還描述了用于獲得乳桿菌突變體的方法，該些方法包括在親本乳桿菌菌株中破壞 編碼I型限制修飾系統(tǒng)亞基（例如限制性亞基或特異性亞基）的內(nèi)源基因。
[0010] 還描述的是用于獲得乳桿菌轉(zhuǎn)化體的方法，該些方法包括將異源多核巧酸轉(zhuǎn)化進(jìn) 入乳桿菌突變體。
[0011] 還描述的是產(chǎn)生多膚的方法，該些方法包括；(a)培養(yǎng)包含編碼該多膚的異源多 核巧酸的乳桿菌轉(zhuǎn)化體；W及化）回收該多膚。
[0012] 還描述的是產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該些方法包括；（a)培養(yǎng)包含編碼該一發(fā)酵通 路的多膚的異源多核巧酸的乳桿菌轉(zhuǎn)化體；W及化）回收該發(fā)酵產(chǎn)物。在一些方面，發(fā)酵產(chǎn) 物是丙醇（正丙醇或異丙醇）。
[0013] 附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0014] 圖1示出了與來(lái)自路氏乳桿菌SJ11400的相應(yīng)的突變的特異性結(jié)構(gòu)域相比，來(lái)自 路氏乳桿菌SJ10655的限制修飾系統(tǒng)特異性結(jié)構(gòu)域LAR0818(SEQIDN0:2)的比對(duì)。
[0015] 圖2示出了與來(lái)自路氏乳桿菌SJ10655的相應(yīng)的特異性結(jié)構(gòu)域相比，來(lái)自路氏乳 桿菌JCM1112的限制修飾系統(tǒng)特異性結(jié)構(gòu)域LAR1344(SEQIDN0:14)的比對(duì)。
[0016] 圖3示出了與來(lái)自路氏乳桿菌SJ10655的相應(yīng)的特異性結(jié)構(gòu)域相比，來(lái)自路氏乳 桿菌JCM1112的限制修飾系統(tǒng)特異性結(jié)構(gòu)域LAR1346(SEQIDN0:12)的比對(duì)。
[0017] 圖4示出了PSJ10600的質(zhì)粒圖。
[0018] 圖5示出了PJP042的質(zhì)粒圖。
[0019] 圖6示出了PSJ10762的質(zhì)粒圖。
[0020] 圖7示出了PTRGU1065的質(zhì)粒圖。
[0021] 圖8示出了PTRGU1073的質(zhì)粒圖。
[0022] 圖9示出了地KQ357的質(zhì)粒圖。
[0023] 定義
[0024] 破壞；術(shù)語(yǔ)"破壞"是指參比基因的編碼區(qū)和/或控制序列被部分地或完全地修飾 (例如通過(guò)刪除、插入、和/或取代一個(gè)或多個(gè)核巧酸，或通過(guò)與RNAi或反義技術(shù)關(guān)聯(lián)）， 導(dǎo)致表達(dá)缺失（失活）或降低，和/或編碼的多膚的酶活性缺失或/降低。可W使用本領(lǐng) 域已知的技術(shù)測(cè)量破壞的效果，例如使用來(lái)自在此引用的無(wú)細(xì)胞提取物測(cè)量來(lái)檢測(cè)酶活性 的缺失或降低；或通過(guò)相應(yīng)的mRNA的缺失或降低（例如至少25%降低、至少50%降低、至 少60 %降低、至少70 %降低、至少80 %降低、或至少90 %降低）；具有酶活性的相應(yīng)多膚的 量的缺失或降低（例如至少25%降低、至少50%降低、至少60%降低、至少70%降低、至 少80%降低、或至少90%降低）；或具有酶活性的相應(yīng)多膚的特定活性的缺失或降低（例 如至少25 %降低、至少50 %降低、至少60 %降低、至少70 %降低、至少80 %降低、或至少 90%降低）。可W通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法產(chǎn)生感興趣的具體基因的破壞，例如通過(guò)直接同 源重組（參見MethodsinYeastGenetics(酵母遺傳實(shí)驗(yàn)方法）（1997版），Adams(亞當(dāng) 斯）、Gottschling(戈特施林）、Kaiser(凱澤）、和Stem(斯提姆），ColdSpringHarbor Press(冷泉港出版社）（1998))。
[0025] 親本；術(shù)語(yǔ)"親本"或"親本乳桿菌菌株"是指對(duì)其做出破壞來(lái)產(chǎn)生在此描述的突 變體乳桿菌菌株的乳桿菌菌株。親本可W是天然存在的（野生型）多膚或預(yù)先修飾的乳桿 菌菌株。
[0026] 突變體；術(shù)語(yǔ)"突變體"是指在對(duì)親本乳桿菌菌株做出破壞后，生成的乳桿菌菌株。
[0027]I型限制修飾系統(tǒng)；術(shù)語(yǔ)"I型限制修飾系統(tǒng)"是指包含至少一個(gè)限制性亞基 化sdR)、至少一個(gè)修飾性亞基（modificationsubunit)化sdM)W及至少一個(gè)說(shuō)明性亞基 (specificationsubunit) ^sd巧的多功能酶復(fù)合物，其中該復(fù)合物發(fā)揮內(nèi)切核酸酶和甲基 轉(zhuǎn)移酶活性（參見Murray(穆雷），Microbiol.Mol.Biol.Rev.(微生物學(xué)與分子生物學(xué)評(píng) 論）2000,64:412-4:34)。
[002引化dR亞基包括用于ATP水解的活性位點(diǎn)和對(duì)于內(nèi)切核酸酶活性而言所必需的其 他序列?；痙M亞基包括用于DNA甲基化的活性位點(diǎn)和用于AdoMeUS-腺巧甲硫氨酸）的結(jié) 合位點(diǎn)。HsdS亞基包括賦予復(fù)合物的限制性活性和修飾性活性該二者祀序列特異性的兩個(gè) 祀識(shí)別結(jié)構(gòu)域。
[0029] 改進(jìn)的轉(zhuǎn)化效率；術(shù)語(yǔ)"改進(jìn)的轉(zhuǎn)化效率"是指當(dāng)在相同條件下轉(zhuǎn)化并且培養(yǎng) 時(shí)，與親本乳桿菌菌株相比，參比乳桿菌突變體菌株能夠產(chǎn)生增加量的轉(zhuǎn)化體?？蒞通過(guò) 用至少一種適合的DNA，例如在此引用的質(zhì)粒中的任一種（例如PSJ10 76 2、PTRGU106 5、 PTRGU1073)，使用如在W下實(shí)例中描述的電穿孔，產(chǎn)生增加量的轉(zhuǎn)化體，由此來(lái)證明改進(jìn)的 轉(zhuǎn)化效率。在一些方面，與親本乳桿菌菌株相比，該乳桿菌突變體菌株能夠產(chǎn)生至少2倍 的，例如至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少500倍、 至少1000倍、至少2000倍、至少5000倍、至少10000倍、至少20000倍、至少50000倍、或 至少100000倍更多的轉(zhuǎn)化體。
[0030] 分離的：術(shù)語(yǔ)"分離的"意思指處于自然界中不存在的形式或環(huán)境中的一種參比 物質(zhì)。分離的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括（1)任何非天然發(fā)生的物質(zhì)，（2)任何物質(zhì)，包括但 不局限于從與其性質(zhì)上相關(guān)的一種或多種或所有天然發(fā)生的組分至少部分除去的任何宿 主細(xì)胞、酶、變體、核酸、蛋白、膚或輔因子；（3)相對(duì)于自然中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，由人手工修飾的 任何物質(zhì)；或（4)通過(guò)相對(duì)于與其天然相關(guān)的其他組分，增加物質(zhì)的量而修飾的任何物質(zhì) (例如，宿主細(xì)胞中的重組產(chǎn)生；編碼該物質(zhì)的基因的多個(gè)拷貝；W及使用比與編碼該物質(zhì) 的基因天然相關(guān)的啟動(dòng)子更強(qiáng)的啟動(dòng)子）。
[0031] 成熟多膚序列：術(shù)語(yǔ)"成熟多膚序列"是指在任何翻譯后序列修飾（例如N末 端加工和/或C末端截短）之后的參比多膚序列部分。例如基于信號(hào)P(Signal巧程 序（Nielsen(尼爾森）等人，Protein!Engineering(蛋白質(zhì)工程）1997, 10, 1-6)或 Inte;rP;roScan程序（The!EuropeanBioinformaticsInstitute(歐洲生物信息學(xué)研究 所）），可W預(yù)測(cè)成熟多膚序列。在一些實(shí)例中，成熟多膚序列可W與整個(gè)參比多膚序列相 同。本領(lǐng)域已知，宿主細(xì)胞可W產(chǎn)生由相同多核巧酸表達(dá)的兩種或更多種不同的成熟多膚 序列的混合物（即，具有不同的C末端和/或N末端氨基酸）。
[0032] 編碼序列；術(shù)語(yǔ)"編碼序列"是指明確一種多膚的氨基酸序列的多核巧酸序列。編 碼序列的邊界一般由開放閱讀框架決定，該開放閱讀框架通常WATG起始密碼子或替代性 起始密碼子（例如GTG和TTG)開始，并且W終止密碼子（例如TAA、TAG、和TGA)結(jié)束。編 碼序列可W是基因組DNA、cDNA、合成的多核巧酸、和/或重組多核巧酸的一個(gè)序列。
[0033] 成熟多膚編碼序列；術(shù)語(yǔ)"成熟多膚編碼序列"是指編碼成熟多膚序列的參比多核 巧酸序列部分。例如基于信號(hào)P(Signal巧程序（同上）或Inte巧roScan程序（同上），可 W預(yù)測(cè)成熟多膚編碼序列。在一些實(shí)例中，成熟多膚編碼序列可W與整個(gè)參比多核巧酸序 列相同。
[0034] 序列一致性；兩個(gè)氨基酸序列之間或兩個(gè)核巧酸序列之間的相關(guān)性由參數(shù)"序列 一致性"描述。
[00巧]出于在此描述的目的，使用Needleman(尼德曼）-Wunsch(翁施）算法來(lái)確定在兩 個(gè)氨基酸序列之間的序列一致性的程度（Needleman(尼德曼）和Wunsch(翁施），J.Mol. Biol.(分子生物學(xué)雜志）1970, 48, 443-453)，如在EMBOSS軟件包的Needle(尼德爾）程序 所實(shí)現(xiàn)的（EMBOSSJhe!EuropeanMolecularBiologyOpenSoftwareSuite(歐洲分子生 物學(xué)開放軟件包），化Ce(賴斯）等人，TrendsGenet.(遺傳學(xué)趨勢(shì)）2000, 16, 276-277)，優(yōu) 選的是版本3. 0. 0或更新的版本。所使用的該些任選參數(shù)是空位開放罰分10、空位延伸罰 分0. 5,及邸L0SUM62炬L0SUM62的EMBOSS版本）取代矩陣。將標(biāo)記為"最長(zhǎng)一致性"的尼 德爾輸出（使用非簡(jiǎn)化選項(xiàng)（nobriefoption)獲得）用作一致性百分比并且計(jì)算如下：
[0036](一致的殘基X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0037] 出于在此描述的目的，使用Needleman(尼德曼）-Wunsch(翁施）算法來(lái)確定在 兩種脫氧核巧酸序列之間的序列一致性的程度（Needleman(尼德曼）和Wunsch(翁施）， 1970,同上），如在EMBOSS軟件包的Needle(尼德爾）程序所實(shí)現(xiàn)的（EMBOSS;化e化ropean MolecularBiologyOpenSoftwareSuite(歐洲分子生物學(xué)開放軟件包），I?ice(賴斯）等 人，2000,同上），優(yōu)選的是版本3. 0. 0或更新的版本。使用的任選參數(shù)是空位開放罰分10， 空位延伸罰分0. 5及邸NA即化(NCBINUC4. 4的EMBOSS版本）取代矩陣。標(biāo)記為"最長(zhǎng)一 致性"的尼德爾的輸出（使用-nobrief選項(xiàng)獲得）被用作百分比一致性并且被計(jì)算如下：
[0038](一致的脫氧核糖核巧酸X100)/(比對(duì)長(zhǎng)度-比對(duì)中的空位總數(shù)）
[0039] 異源多核巧酸：在此將術(shù)語(yǔ)"異源多核巧酸"定義為W下多核巧酸；對(duì)該宿主細(xì)胞 而言不是天然的多核巧酸；已經(jīng)對(duì)編碼區(qū)做出一種或多種（例如，兩種，若干種）結(jié)構(gòu)修飾 的天然多核巧酸；由于通過(guò)重組DNA技術(shù)對(duì)DNA的操作而定量改變其表達(dá)的天然多核巧酸， 例如，將一種不同的（外源的）啟動(dòng)子連接至該多核巧酸；或通過(guò)向該宿主細(xì)胞中引入該多 核巧酸的一個(gè)或多個(gè)另外的拷貝而定量改變其表達(dá)的天然多核巧酸。
[0040] 內(nèi)源基因；術(shù)語(yǔ)"內(nèi)源基因"是指對(duì)于親本乳桿菌菌株是原生（native)的基因。
[0041] 核酸構(gòu)建體；術(shù)語(yǔ)"核酸構(gòu)建體"是指一種包括一個(gè)或多個(gè)（例如，兩個(gè)、若干個(gè)） 控制序列的多核巧酸。多核巧酸可W是單鏈的或雙鏈的，并且可W分離自天然存在的基因、 可W被修飾來(lái)W另外的不會(huì)在自然界中存在的方式包含核酸的區(qū)段，或可W是合成的。
[0042] 控制序列；術(shù)語(yǔ)"控制序列"是指多膚表達(dá)所必需的核酸序列。控制序列對(duì)于編碼 多膚的多核巧酸可W是天然的或外源的，并且彼此可W是原生的或外源的。此類控制序列 包括但不局限于，前導(dǎo)序列、聚腺巧酸化序列、前膚序列、啟動(dòng)子序列、信號(hào)膚序列及轉(zhuǎn)錄終 止子序列。出于引入有利于將該些控制序列與編碼一種多膚的多核巧酸的編碼區(qū)連接的特 異性限制酶切位點(diǎn)的目的，該些控制序列可W提供有多個(gè)接頭。
[0043] 可操作地連接；術(shù)語(yǔ)"可操作地連接"是指一種配置，其中一個(gè)控制序列相對(duì)于一 種多核巧酸的編碼序列放置在一個(gè)適當(dāng)位置處，W使得控制序列指引編碼序列的表達(dá)。
[0044] 表達(dá)；術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"包括在多膚的產(chǎn)生中涉及的任何步驟，包括但不局限于，轉(zhuǎn)錄、 轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾、W及分泌?？蒞對(duì)表達(dá)進(jìn)行測(cè)量一例如，來(lái)檢測(cè)增加的表 達(dá)一通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如測(cè)量mRNA和/或翻譯的多膚的水平。
[004引表達(dá)載體；術(shù)語(yǔ)"表達(dá)載體"是指一種線性或環(huán)形的DM分子，該分子包括編碼一 種多膚的多核巧酸并且被可操作地連接至控制序列，其中該些控制序列提供編碼該多膚的 多核巧酸的表達(dá)。最低限度上，該表達(dá)載體包括啟動(dòng)子序列，W及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)序 列。
[0046] 宿主細(xì)胞；術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"是指對(duì)于用核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、 轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的任何細(xì)胞類型。術(shù)語(yǔ)"宿主細(xì)胞"涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本 細(xì)胞不同的親本細(xì)胞的任何后代。
[0047] 轉(zhuǎn)化；術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"是指將異源多核巧酸引入乳桿菌細(xì)胞，該樣使得該DNA維持為 染色體整合體或維持為自主復(fù)制的染色體外載體。轉(zhuǎn)化后生成的乳桿菌細(xì)胞在此被描述為 "轉(zhuǎn)化體"。
[004引等位基因變體；術(shù)語(yǔ)"等位基因變體"是指占用同一染色體位點(diǎn)的一種基因的兩個(gè) 或更多個(gè)替代形式中的任一者。等位基因變異由突變天然產(chǎn)生，并且可W導(dǎo)致群體內(nèi)的多 態(tài)性。基因突變可W是靜默的（在所編碼的多膚中沒有改變）或可編碼具有改變的氨基酸 序列的多膚。多膚的等位基因變體是由基因的等位基因變體編碼的多膚。
[0049] 在此提及"約"一個(gè)數(shù)值或參數(shù)包括指向那個(gè)數(shù)值或參數(shù)本身的方面。例如，提及 "約X"的描述包括方面"X"。當(dāng)與測(cè)量值組合使用時(shí)，"約"包括涵蓋至少與測(cè)量該具體數(shù) 值的方法相關(guān)的不確定性的范圍，并且可W包括在給定的數(shù)值附近正或負(fù)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的范 圍。
[0050] 如在此和所附權(quán)利要求書中所使用，單數(shù)形式"一種/個(gè)"、"或"W及"該"包括復(fù) 數(shù)指示物，除非上下文W另外的方式清楚表明。應(yīng)該理解的是在此描述的該些方面包括"由 方面組成"和/或"基本由方面組成"。
[0051] 除非由上下文W另外的方式定義或清楚表明，在此使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù) 語(yǔ)具有如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。
[00閲詳細(xì)說(shuō)明
[0053] 乳桿菌突變體
[0054]除其他W外，在此描述的是親本乳桿菌菌株的突變體，例如分離的突變體，包括對(duì) 內(nèi)源限制修飾系統(tǒng)基因（例如編碼I型限制修飾系統(tǒng)亞基的基因）的破壞，其中當(dāng)在相同 條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本乳桿菌菌株相比，該些突變體具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)化效率。如在W下實(shí)例部 分中所示， 申請(qǐng)人:已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)對(duì)內(nèi)源限制修飾系統(tǒng)基因的破壞可W改進(jìn)乳桿菌宿 主的轉(zhuǎn)化效率。此類破壞可W防止轉(zhuǎn)化體DNA被宿主細(xì)胞的限制修飾系統(tǒng)降解，由此改進(jìn) 了用于生物技術(shù)應(yīng)用的宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率和總體有用性。
[0055] 突變體和相關(guān)方法的親本菌株可W是任何乳桿菌菌株，例如野生型乳桿菌或其突 變體。在一些方面，親本乳桿菌菌株是植物乳桿菌、食果糖乳桿菌、或路氏乳桿菌菌株。在 一個(gè)方面，親本菌株是植物乳桿菌菌株。在另一方面，親本菌株是食果糖乳桿菌菌株。在另 一方面，親本菌株是路氏乳桿菌菌株。
[0056]設(shè)想的另外的親本乳桿菌菌株包括但不局限于耐酸乳桿菌、一種乳桿菌 (Lacidifarinae)、馬里乳桿菌、嗜酸乳桿菌、敏捷乳桿菌、低溫乳桿菌、消化乳桿菌、解 淀粉乳桿菌、嗜淀粉乳桿菌、一種乳桿菌（L.amylotro地icus)、食淀粉乳桿菌、動(dòng)物乳 桿菌、胃竇乳桿菌、一種乳桿菌（L.apodemi)、一種乳桿菌（L.aquaticus)、亞利桑納乳 桿菌、鳥乳桿菌、己伐利亞乳桿菌、雙發(fā)酵乳桿菌、己博乳桿菌、短乳桿菌、布氏乳桿菌、 保加利亞乳桿菌、可可乳桿菌、一種乳桿菌（L.camelliae)、多毛乳桿菌、一種乳桿菌 (L.carni)、干酪乳桿菌、鏈狀乳桿菌、纖維二糖乳桿菌、一種乳桿菌（L.ceti)、一種乳桿 菌（L.coleohominis)、丘狀菌落乳桿菌、一種乳桿菌（L.composti)、曲面乳桿菌、一種乳 桿菌（L.con化SUS)、棒狀乳桿菌、卷曲乳桿菌、一種乳桿菌（L.crustorum)、彎曲乳桿菌、 一種乳桿菌（L.cypricasei)、德氏乳桿菌、糊精乳桿菌、一種乳桿菌（L.diolivorans)、一 種乳桿菌（L.divergens)、一種乳桿菌（L.durianis)、一種乳桿菌（L.equi)、一種乳桿菌 (L.equicursoris)、一種乳桿菌（L.equigenerosi)、一種乳桿菌（L.fabifermentans)、香 腸乳桿菌、一種乳桿菌（L.farraginis)、一種乳桿菌（L.ferintoshensis)、發(fā)酵乳桿菌、 一種乳桿菌（L.化rnicalis)、食果糖乳桿菌、果糖乳桿菌、一種乳桿菌（L.化umenti)、一 種乳桿菌（L.fuchuensis)、雞乳桿菌、加氏乳桿菌、一種乳桿菌（L.gastri州S)、一種乳桿 菌（L.曲anensis)、草乳桿菌、一種乳桿菌(X.halotolerans)、一種乳桿菌(X.hammesii)、 哈氏乳桿菌、一種乳桿菌（L.harbinensis)、一種乳桿菌（L.hayakitensis)、瑞dr乳桿 菌、異型腐酒乳桿菌、希氏乳桿菌、同型腐酒乳桿菌、一種乳桿菌（L.hordei)、一種乳桿菌 (L.iners)、一種乳桿菌（L.ingluviei)、腸乳桿菌、詹氏乳桿菌、約氏乳桿菌、一種乳桿菌 (L.kalixensis)、一種乳桿菌（L.kandleri)、馬乳酒樣乳桿菌、馬乳酒樣乳桿菌、高加索酸 奶粒乳桿菌、高加索酸奶乳桿菌、一種乳桿菌（L.kimchii)、一種乳桿菌（L.kisonensis)、 一種乳桿菌（L.kitasatonis)、一種乳桿菌（L.kunkeei)、一種乳桿菌（L.Iactis)、一種乳 桿菌（L.Ieichmannii)、林氏乳桿菌、壞發(fā)酵乳桿菌、蘋果乳桿菌、麥芽香乳桿菌、食木墓 乳桿菌、一種乳桿菌（L.mindensis)、一種乳桿菌（L.minor)、一種乳桿菌（L.minutus)、 黏膜乳桿菌、鼠乳桿菌、一種乳桿菌（L.nagelii)、一種乳桿菌（L.namurensis)、一種 乳桿菌（L.nantensis)、一種乳桿菌（L.nodensis)、一種乳桿菌（L.oeni)、一種乳桿 菌（L.oligofermentans)、口乳桿菌、一種乳桿菌（L.otakiensis)、面包乳桿菌、美洲 虎乳桿菌、一種乳桿菌（L.parabrevis)、類布氏乳桿菌、類干酪乳桿菌、一種乳桿菌 (L.paracollinoides)、一種乳桿菌（L.parafarraginis)、類高加索酸奶乳桿菌、一種乳 桿菌（X.paralimentarius)、一種乳桿菌（X.paraplantarum)、戊糖乳桿菌、一種乳桿菌 (L.perolens) > 一種乳桿菌（L.piscicola)、植物乳桿菌、一種乳桿菌（L.pobuzihii)、橋 乳桿菌、一種乳桿菌（L.psittaci)、一種乳桿菌（Lrapi)、一種乳桿菌（Lrennini)、路氏 乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、一種乳桿菌（L.rimae)、羅氏乳桿菌、一種乳桿菌（L.rossiae)、瘤 胃乳桿菌、一種乳桿菌（L.saerimneri)、一種乳桿菌（L.sakei)、唾液乳桿菌、一種乳桿菌 (L.sanfranciscensis)、一種乳桿菌（L.satsumensis)、一種乳桿菌（L.secaliphilus)、 一種乳桿菌（L.senmaiz址ei)、沙氏乳桿菌、一種乳桿菌（L.siliginis)、一種乳桿 菌（L.similis)、一 種乳桿菌（L.sobrius)、一 種乳桿菌（L.spicheri)、一 種乳桿 菌（L.sucicola)、一種乳桿菌（L.suebi州s)、一種乳桿菌（L.sunkii)、一種乳桿菌 (L.suntoryeus) > 一 種乳桿菌（L.taiwanensis)、一 種乳桿菌（L.thailandensis)、一 種 乳桿菌（L.thermotolerans)、發(fā)狀乳桿菌、一種乳桿菌（L.tucceti)、齒銀乳桿菌、一種 乳桿菌（L.ul化nensis)、一種乳桿菌（L.uvarum)、牛痘乳桿菌、陰道乳桿菌、一種乳桿菌 (L.versmoldensis)、綠色乳桿菌、較乳桿菌、一種乳桿菌（L.xylosus)、果汁乳桿菌、玉米乳 桿菌、和一種乳桿菌（L.zymae)。
[0057] 破壞的基因可W是編碼I型限制修飾系統(tǒng)亞基（例如I型限制修飾系統(tǒng)的限制性 亞基、I型限制修飾系統(tǒng)的特異性亞基、和/或I型限制修飾系統(tǒng)的修飾性亞基）的任何適 合的內(nèi)源基因。
[005引祀基因的實(shí)例包括編碼包含SEQIDN0:2、4、和/或6的特異性亞基；SEQIDN0:8的限制性亞基；W及SEQIDNO:10的修飾性亞基的路氏乳桿菌多功能酶復(fù)合物的那些。另 外的祀包括編碼包含SEQIDNO:12和/或14的特異性亞基（specificitysubunit);SEQ IDNO:16的限制性亞基；W及SEQIDNO:18的修飾性亞基的路氏乳桿菌多功能酶復(fù)合物 的基因。祀基因的另外的實(shí)例包括在此描述的那些，例如表4中描繪的那些。
[0059] 在一些方面，編碼限制性亞基的內(nèi)源基因和編碼特異性亞基的內(nèi)源基因該二者被 破壞。在一些方面，編碼限制性亞基的內(nèi)源基因被破壞，編碼特異性亞基的內(nèi)源基因被破 壞，并且編碼修飾性亞基內(nèi)源基因被破壞。
[0060] 在突變體和相關(guān)方法的一些方面，破壞的基因是編碼I型限制修飾系統(tǒng)的特異性 亞基的內(nèi)源基因。編碼特異性亞基的內(nèi)源基因的實(shí)例包括具有SEQID^:1、3、5、11、或13 中示出的編碼序列的路氏乳桿菌基因，SEQID^:1、3、5、11、或13分別編碼具有569 10 ^:2、4、6、12、和14的氨基酸序列的亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼與569 10^:2、4、 6、12、14、表4中描繪的任何特異性亞基的序列、或其成熟多膚序列具有至少60%，例如至 少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至 少99%、或100%的序列一致性的特異性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼具有與SEQID NO:2、4、6、12、14或表4中標(biāo)繪的任何特異性亞基的序列差別不大于十個(gè)氨基酸，例如不大 于五個(gè)氨基酸、不大于四個(gè)氨基酸、不大于H個(gè)氨基酸、不大于兩個(gè)氨基酸、或不大于一個(gè) 氨基酸的序列的特異性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:2或由其組成的 特異性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:2的成熟多膚序列或由其組成的 特異性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:4或由其組成的特異性亞基。在 一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:4的成熟多膚序列或由其組成的特異性亞基。在 一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:6或由其組成的特異性亞基。在一些方面，內(nèi)源基 因編碼包括SEQIDN0:6的成熟多膚序列或由其組成的特異性亞基。在一些方面，內(nèi)源基 因編碼包括SEQIDNO: 12或由其組成的特異性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQ IDNO: 12的成熟多膚序列或由其組成的特異性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQ IDNO: 14或由其組成的特異性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDNO: 14的成熟 多膚序列或由其組成的特異性亞基。
[0061] 在突變體或相關(guān)方法的其他方面，編碼特異性亞基的內(nèi)源基因的編碼序列與SEQ IDNO: 1、3、5、11、13、編碼表4中描繪的特異性亞基的任何基因序列、或其成熟多膚編碼序 列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、 至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序 列包括SEQIDNO: 1或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDNO: 1的 成熟多膚編碼序列或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDN0:3或由 其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDN0:3的成熟多膚編碼序列或由其 組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDN0:5或由其組成。在一些方面，內(nèi)源 基因的編碼序列包括SEQIDN0:5的成熟多膚編碼序列或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基 因的編碼序列包括SEQIDNO: 11或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQ IDNO: 11的成熟多膚編碼序列或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQID NO: 13或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDNO: 13的成熟多膚編碼 序列或由其組成。
[0062] 在突變體或相關(guān)方法的其他方面，在至少低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，中嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、 中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，編碼特異性亞基的基因的 編碼序列與SEQIDNO: 1、3、5、11、13，或編碼表4中描繪的特異性亞基的任何基因序列的全 長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交。
[0063] 在突變體和相關(guān)方法的一些方面，破壞的基因是編碼I型限制修飾系統(tǒng)的限制性 亞基的內(nèi)源基因。編碼限制性亞基的內(nèi)源基因的實(shí)例包括具有SEQIDN0:7和15中示出 的編碼序列的路氏乳桿菌基因，SEQIDN0:7和15分別編碼具有SEQIDN0:8和16的氨 基酸序列的亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼與SEQIDN0:8、SEQIDNO: 16、表4中描繪 的任何限制性亞基的序列、或其成熟多膚序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至 少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列 一致性的限制性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼具有與SEQIDN0:8、SEQIDNO: 16或表 4中描繪的任何限制性亞基的序列差別不大于十個(gè)氨基酸，例如不大于五個(gè)氨基酸、不大于 四個(gè)氨基酸、不大于H個(gè)氨基酸、不大于兩個(gè)氨基酸、或不大于一個(gè)氨基酸的序列的限制性 亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:8或由其組成的限制性亞基。在一些方 面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:8的成熟多膚序列或由其組成的限制性亞基。在一些方 面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDNO: 16或由其組成的限制性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編 碼包括SEQIDNO: 16的成熟多膚序列或由其組成的限制性亞基。
[0064] 在突變體和相關(guān)方法的其他方面，編碼限制性亞基的內(nèi)源基因的編碼序列與SEQ IDNO: 7、SEQIDNO: 15、編碼表4中描繪的限制性亞基的任何基因序列、或其成熟多膚編碼 序列具有至少60 %，例如至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、 至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序 列包括SEQIDN0:7或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDN0:7的 成熟多膚編碼序列或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDNO: 15或由 其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDNO: 15的成熟多膚編碼序列或由其 組成。
[0065] 在突變體和相關(guān)方法的其他方面，在至少低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，中嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、 中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，編碼限制性亞基的基因的 編碼序列與SEQIDNO: 7、SEQIDNO: 15,或編碼表4中描繪的限制性亞基的任何基因序列 的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交。
[0066] 在突變體和相關(guān)方法的一些方面，破壞的基因是編碼I型限制修飾系統(tǒng)的修飾性 亞基的內(nèi)源基因。編碼修飾性亞基的內(nèi)源基因的實(shí)例包括具有SEQIDNO:9和17中示出的 編碼序列的路氏乳桿菌基因，SEQIDN0:9和17分別編碼具有SEQIDNO: 10和18的氨基 酸序列的亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼與SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 18、表4中描繪的 任何修飾性亞基的序列、或其成熟多膚序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少 80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一 致性的修飾性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼具有與SEQIDNO: 10、SEQIDNO: 18或表 4中標(biāo)繪的任何修飾性亞基的序列差別不大于十個(gè)氨基酸，例如不大于五個(gè)氨基酸、不大于 四個(gè)氨基酸、不大于H個(gè)氨基酸、不大于兩個(gè)氨基酸、或不大于一個(gè)氨基酸的序列的修飾性 亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDNO: 10或由其組成的修飾性亞基。在一些方 面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDNO: 10的成熟多膚序列或由其組成的修飾性亞基。在一些方 面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDNO: 18或由其組成的修飾性亞基。在一些方面，內(nèi)源基因編 碼包括SEQIDNO: 18的成熟多膚序列或由其組成的修飾性亞基。
[0067] 在突變體或相關(guān)方法的其他方面，編碼修飾性亞基的內(nèi)源基因的編碼序列與 N0:9、SEQIDNO: 17、編碼表4中描繪的修飾性亞基的任何基因序列、或其成熟多膚編碼序 列具有至少60 %，例如至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至 少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列 包括SEQIDNO:9或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDNO:9的成 熟多膚編碼序列或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDNO: 17或由其 組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDNO: 17的成熟多膚編碼序列或由其組 成。
[0068] 在突變體或相關(guān)方法的其他方面，在至少低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，中嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、 中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，編碼修飾性亞基的基因的 編碼序列與SEQIDN0:9、SEQIDNO: 17,或編碼表4中描繪的編碼修飾性亞基的任何基因 序列的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交。
[0069] 在突變體和相關(guān)方法的一些方面，破壞的基因是編碼非I型限制修飾系統(tǒng)蛋白的 內(nèi)源基因。如在此使用的非I型限制修飾系統(tǒng)是指不是I型分類的限制修飾系統(tǒng)蛋白（例 如II型、III型、或IV型）。編碼非I型限制修飾系統(tǒng)蛋白的內(nèi)源基因的實(shí)例包括具有SEQ IDNO: 19和21中示出的編碼序列的路氏乳桿菌基因，SEQIDNO: 19和21分別編碼具有 SEQIDNO: 20和22的氨基酸序列的蛋白。在一些方面，內(nèi)源基因編碼與SEQIDNO: 20、 SEQIDNO:22、或其成熟多膚序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至 少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性的蛋 白。在一些方面，內(nèi)源基因編碼具有與SEQIDNO: 20或SEQIDNO: 22差別不大于十個(gè)氨 基酸，例如不大于五個(gè)氨基酸、不大于四個(gè)氨基酸、不大于H個(gè)氨基酸、不大于兩個(gè)氨基酸、 或不大于一個(gè)氨基酸的序列的蛋白。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:20或由其 組成的蛋白。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:22的成熟多膚序列或由其組成的 蛋白。在一些方面，內(nèi)源基因編碼包括SEQIDN0:20或由其組成的蛋白。在一些方面，內(nèi) 源基因編碼包括SEQIDN0:22的成熟多膚序列或由其組成的蛋白。
[0070] 在突變體和相關(guān)方法的其他方面，內(nèi)源基因的編碼序列與SEQIDNO: 19、SEQID NO:21、或其成熟多膚編碼序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少 85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列一致性。在一 些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDNO: 19或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編 碼序列包括SEQIDNO: 19的成熟多膚編碼序列或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼 序列包括SEQIDN0:21或由其組成。在一些方面，內(nèi)源基因的編碼序列包括SEQIDN0:21 的成熟多膚編碼序列或由其組成。
[0071] 在突變體和相關(guān)方法的其他方面，在至少低嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，中嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、 中-高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下、或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，編碼非I型限制修飾系統(tǒng) 蛋白的基因的編碼序列與SEQIDNO: 19或SEQIDN0:21的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交。
[0072] 在此披露的多核巧酸序列，或其子序列；連同在此描述的氨基酸序列，或其片段； 可W根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法用于設(shè)計(jì)核酸探針W鑒定和克隆來(lái)自不同屬或種的菌株的、I 型限制修飾系統(tǒng)的同源亞基。具體而言，可W根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，使用該樣的探針與來(lái) 自感興趣的乳桿菌物種的DNA雜交，W便鑒定和分離其中的對(duì)應(yīng)基因。該樣的探針可W大 大短于整個(gè)序列，例如長(zhǎng)度至少為14個(gè)核巧酸，至少25個(gè)核巧酸、至少35個(gè)核巧酸、至少 70個(gè)核巧酸。該些探針可W更長(zhǎng)，例如長(zhǎng)度至少為100個(gè)核巧酸，至少200個(gè)核巧酸、至少 300個(gè)核巧酸、至少400個(gè)核巧酸、至少500個(gè)核巧酸?？蒞使用甚至更長(zhǎng)的探針，例如長(zhǎng)度 至少為600個(gè)核巧酸，至少700個(gè)核巧酸、至少800個(gè)核巧酸、至少900個(gè)核巧酸。DNA和 RNA探針該二者都可使用。典型地將探針進(jìn)行標(biāo)記，用于檢測(cè)相應(yīng)的基因（例如，用3中、巧、 35S、生物素或抗生物素蛋白）。
[0073] 可W針對(duì)與W上描述的探針雜交的DNA，來(lái)篩選由該樣的其他菌株制備的DNA文 庫(kù)。來(lái)自該類其他菌株的基因組DNA或其他DNA可W通過(guò)瓊脂糖或聚丙帰醜胺凝膠電泳， 或其他分離技術(shù)來(lái)分離。來(lái)自文庫(kù)的DNA或分離的DNA可轉(zhuǎn)移到并固定在硝酸纖維素或其 他適合的載體材料上。為鑒定與在此描述的多核巧酸序列或其子序列同源的克隆或DNA，可 W在DNA印跡法中使用載體材料。對(duì)W上描述的探針的目的，雜交是指，在非常低至非常高 的嚴(yán)謹(jǐn)度下，多核巧酸雜交至與該些多核巧酸序列或其全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈、或W上項(xiàng)的子序列對(duì) 應(yīng)的標(biāo)記核酸探針上。在該些條件下，核酸探針雜交的分子可W使用例如X射線膠片而進(jìn) 行檢測(cè)。
[0074] 對(duì)于長(zhǎng)度為至少100個(gè)核巧酸的長(zhǎng)探針而言，非常低至非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件定義為 最佳地按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在42C下在5XSSPE、0. 3 %SDS、200微克/mL剪切并變性 的娃魚精子DNA中，W及對(duì)于非常低和低嚴(yán)謹(jǐn)度在25 %甲醜胺中，對(duì)于中和中-高嚴(yán)謹(jǐn)度在 35%甲醜胺中，或?qū)τ诟吆头浅８邍?yán)謹(jǐn)度在50%甲醜胺中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。將 載體材料最終使用2XSSC、0. 2%SDS在45C(非常低嚴(yán)謹(jǐn)度）、在5(TC(低嚴(yán)謹(jǐn)度）、在 55C(中嚴(yán)謹(jǐn)度）、在6(TC(中-高嚴(yán)謹(jǐn)度）、在65C(高嚴(yán)謹(jǐn)度）、W及在7(TC(非常高 嚴(yán)謹(jǐn)度）洗涂H次，每次持續(xù)15分鐘。
[0075] 對(duì)于長(zhǎng)度為約15個(gè)核巧酸至約70個(gè)核巧酸的短的探針而言，嚴(yán)謹(jǐn)度條件被定義 為最佳地按照標(biāo)準(zhǔn)DNA印跡程序，在比使用根據(jù)Bolton(博爾頓）和McCarthy(麥卡錫） (Proc.化tl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊）1962, 48, 1390)的計(jì)算而計(jì)算的Tm低約 5°C至約 10°C下，在0. 9MNaCl、0. 09MTris-肥UpH7. 6)、6mM邸TA、0. 5%NP-40、1X登哈特 氏溶液值enhar化'Ssolution)、ImM焦磯酸軸、ImM磯酸二氨軸、0.ImMATP、W及0. 2mg的 酵母RNA/mL中預(yù)雜交和雜交12至24小時(shí)。最后將載體材料在計(jì)算的TmW下5C至IOC， 在6XSCC加0. 1 %SDS中洗涂1次持續(xù)15分鐘并且使用6XSSC洗涂2次，每次15分鐘。
[0076] 來(lái)自不同屬或種的菌株的在此描述的I型限制修飾系統(tǒng)亞基的同系物一般具有 是次要性質(zhì)的氨基酸變化，即并不顯著影響蛋白的折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插 入；典型地具有一個(gè)至約30個(gè)氨基酸的小刪除；小氨基末端或駿基-末端延伸，例如一種 氨基-末端甲硫氨酸殘基；具有至多約20-25個(gè)殘基的一種小連接膚；或通過(guò)改變凈電荷 促進(jìn)純化或另一種功能的一種小延伸，例如一種聚組氨酸段、一種抗原表位或一種結(jié)合結(jié) 構(gòu)域。
[0077] 保守取代的實(shí)例處于W下組內(nèi)：堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸W及組氨酸）、酸性 氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）、極性氨基酸（谷氨醜胺和天冬醜胺）、疏水性氨基酸（亮氨 酸、異亮氨酸W及額氨酸）、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、色氨酸W及酪氨酸）、W及小氨基酸 (甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸W及甲硫氨酸）?？傮w上不會(huì)改變特異性活性的氨基酸取 代是本領(lǐng)域已知的，并且例如由H.NeuratMH.諾伊拉特）和R.L化11化L希爾）1979年 描述于化eProteins(蛋白質(zhì)）中，AcademicPress(學(xué)術(shù)出版社），紐約。最常發(fā)生的交 換是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、!'虹/Ser、Ala/Gly、AlaA虹、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、 Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
[0078] 可W根據(jù)本領(lǐng)域已知的程序來(lái)鑒定必需氨基酸，例如定點(diǎn)誘變或丙氨酸掃描誘 變（Cunnin曲am(坎寧安）和Wells(威爾斯），Science(科學(xué)）1989,244, 1081-1085)。 在后一種技術(shù)中，在分子中的每個(gè)殘基處引入單個(gè)丙氨酸突變，并且測(cè)試所得突變分子的 活性W鑒定對(duì)該分子的活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。還參看Hilton(希爾頓）等人，J.Biol. 化em(生物化學(xué)雜志）1996, 271，4699-4708。也可結(jié)合假定接觸位點(diǎn)氨基酸的突變，如通 過(guò)W下技術(shù)例如核磁共振、結(jié)晶學(xué)、電子衍射、或光親和標(biāo)記進(jìn)行確定的對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行物理學(xué) 分析，從而確定酶的活性位點(diǎn)或其他生物學(xué)相互作用。參看例如deVos(德沃斯）等人， Science(科學(xué)）1992, 255, 306-312;Smith(史密斯）等人，J.Mol.Biol.(分子生物學(xué)雜 志）1992, 224, 899-904;Wlodaver(沃爾達(dá)韋爾）等人，陽(yáng)BSLett.(歐洲生物化學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián) 盟通訊）（陽(yáng)BSLett.) 1992, 309, 59-64。還可W從與其他相關(guān)酶的一致性分析來(lái)推斷必需 氨基酸的一致性。
[0079] 使用已知的誘變、重組和/或改組方法、隨后進(jìn)行一個(gè)相關(guān)的篩選程序可W 做出單一或多種氨基酸取代、缺失和/或插入并對(duì)其進(jìn)行測(cè)試，該些相關(guān)的篩選程 序例如由Rei化aar(里德哈爾）-Olson(奧爾森）和Sauer(薩奧爾），Science(科 學(xué)）1988, 241，53-57;Bowie(博維）和Sauer(薩奧爾），Proc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.(美 國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊）1989, 86, 2152-2156 ;W0 95/17413;或WO95/22625披露的那些。可W 使用的其他方法包括：易錯(cuò)PCR、瞻菌體展示（例如，Lowman(洛曼）等人，Biochemistry(生 物化學(xué)）1991，30, 10832-10837 ;美國(guó)專利號(hào) 5, 223, 409 ;W0 92/06204)，W及區(qū)域定向 誘變值erbyshire(德比希爾）等人，Gene(基因）1986, 46, 145;Ner(內(nèi)爾）等人，DNA 1988, 7, 127)。
[0080] 可W結(jié)合誘變/改組方法與高通量自動(dòng)化篩選方法來(lái)檢測(cè)由宿主細(xì)胞表達(dá) 的克隆的、誘變的多膚的活性（Ness(內(nèi)斯）等人，化化reBiotechnol.(自然生物技 術(shù)）1999, 17, 893-896)?？蒞使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法，從宿主細(xì)胞回收編碼活性酶的誘變 的DNA分子，并且對(duì)其進(jìn)行迅速測(cè)序。該些方法允許迅速確定多膚中單個(gè)氨基酸殘基的重 要性。
[0081]I型限制修飾系統(tǒng)亞基基因的破壞和產(chǎn)生乳桿菌突變體的方法
[0082] 可W通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的方法（包括在此描述的那些方法）破壞編碼I型限制 修飾系統(tǒng)亞基的參比基因，來(lái)構(gòu)建在此描述的乳桿菌突變株?？蒞破壞基因的一部分，例如 編碼區(qū)或表達(dá)編碼區(qū)所需的控制序列。該樣的控制序列可W是啟動(dòng)子序列或其功能部分， 即足W影響該基因的表達(dá)的部分。例如，可W使啟動(dòng)子序列滅活，導(dǎo)致沒有表達(dá)，或者可W 用更弱啟動(dòng)子取代天然啟動(dòng)子序列來(lái)減少編碼序列的表達(dá)。用于可能的修飾的其他控制序 列包括但不局限于前導(dǎo)子、前膚序列、信號(hào)序列、轉(zhuǎn)錄終止子、和轉(zhuǎn)錄激活因子。
[0083] 可W通過(guò)基因刪除技術(shù)來(lái)構(gòu)建乳桿菌突變株，W消除或減少基因表達(dá)?；騽h除 技術(shù)使得能夠部分或完全除去基因，由此消除它們的表達(dá)。在該樣的方法中，通過(guò)使用已經(jīng) 被構(gòu)建為連續(xù)地包含側(cè)翼于該基因的5'和3'區(qū)域的質(zhì)粒，用同源重組來(lái)完成基因的刪除。
[0084] 還可W通過(guò)引入、取代、和/或除去該基因或其轉(zhuǎn)錄或翻譯所需的它的控制序列 中的一個(gè)或多個(gè)（若干個(gè)）核巧酸，來(lái)構(gòu)建乳桿菌突變株。例如，可W插入或除去核巧酸， 用于終止密碼子的引入、起始密碼子的除去、或開放讀碼框的框移。該樣一個(gè)修飾可W根 據(jù)本領(lǐng)域已知的方法通過(guò)定點(diǎn)誘變或PCR產(chǎn)生的誘變來(lái)完成。參見例如Botstein(博特 斯坦）和Siortle(肖特爾），Science(科學(xué)）I985, 229, 4了19;Lo(盧）等人，Proc.化tl. Acad.Sci.U.S.A.(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊）1985,81, 2285;Higuchi(極口）等人，Nucleic AcidsRes(核酸研究）1988, 16,7351 ;Shimada(島田），Meth.Mol.Biol.(分子生物學(xué)方 法）1996, 57, 157;Ho(何）等人，Gene(基因）1989, 77, 61 ;Hoi~ton(霍頓）等人，，Gene(基 因）I989, 77,Gl;W及Sarkar(薩卡爾）和Sommer(索姆），BioTechniques(生物技 術(shù)）1990,8, 404。
[0085] 還可W通過(guò)將一個(gè)破壞的核酸構(gòu)件體插入該基因，用基因破壞技術(shù)構(gòu)建乳桿菌突 變株，該一破壞的核酸構(gòu)建體包含與將產(chǎn)生同源區(qū)的復(fù)制并且合并該些復(fù)制的區(qū)域之間的 構(gòu)建體DNA的基因同源的核酸片段。如果插入的構(gòu)建體將該基因的啟動(dòng)子與編碼區(qū)分開或 中斷編碼序列，該樣使得非功能基因產(chǎn)物生成，則該樣一個(gè)基因破壞可W消除基因表達(dá)。破 壞構(gòu)建體可W簡(jiǎn)單地是伴隨與該基因同源的5'和3'區(qū)域的一個(gè)選擇性標(biāo)記基因。選擇性 標(biāo)記使得能夠鑒定包含破壞的基因的轉(zhuǎn)化體。
[0086] 還可W通過(guò)基因轉(zhuǎn)換的過(guò)程，構(gòu)建乳桿菌突變株（參見例如Iglesias(伊格萊西 亞斯）和Trautner(特勞特納），MolecularGeneralGenetics(分子遺傳學(xué)和普通遺傳 學(xué)）1983, 189, 73-76)。例如，在基因轉(zhuǎn)化方法中，將對(duì)應(yīng)于該基因的核巧酸序列在體外進(jìn)行 誘變W產(chǎn)生缺陷的核巧酸序列，然后將其轉(zhuǎn)化到親本乳桿菌菌株中W產(chǎn)生缺陷基因。通過(guò) 同源重組，該缺陷的核巧酸序列替換內(nèi)源基因。希望的是該缺陷的核巧酸序列還包括用于 選擇包含該缺陷基因的轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記。
[0087] 還可W使用與該基因的核巧酸序列互補(bǔ)的核巧酸序列，用建立的反義技術(shù)構(gòu)建乳 桿菌突變株（Parish(帕里什）和Stoker(斯巧克），F(xiàn)EMSMicrobiol.Lett.(歐洲微生物 學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)微生物學(xué)快報(bào)）1997, 154, 151-157)。更確切，用乳桿菌突變株的該基因的表達(dá) 可W通過(guò)引入與該基因的核巧酸序列互補(bǔ)的核巧酸序列來(lái)減少或滅活，其中該核巧酸序列 可在菌株中轉(zhuǎn)錄并能與菌株中所產(chǎn)生的mRNA發(fā)生雜交。在允許互補(bǔ)的反義核巧酸序列與 mRNA發(fā)生雜交的條件下，所翻譯蛋白的量由此降低或消除。
[0088] 還可W通過(guò)建立的RNA干擾（RNAU技術(shù)構(gòu)建乳桿菌突變株（參見例如WO 2005/056772 和WO2008/080017)。
[0089] 可W通過(guò)使用本領(lǐng)域熟知的方法的隨機(jī)誘變或?qū)Ｒ徽T變進(jìn)一步構(gòu)建乳桿菌突變 株，該些誘變包括但不局限于化學(xué)誘變（參見例如化pwood(霍普伍德），化eIsolationOf MutantsinMethodsinMicrobiology(微生物學(xué)方法中突變體的分離）（J.R.Norris(諾 里斯）和D.W.I^itibons(里邦斯）編輯）363-433頁(yè),AcademicPress(學(xué)術(shù)出版社），紐約， 1970)。該基因的修飾可W通過(guò)使親本菌株經(jīng)受誘變，并且篩選該基因的表達(dá)已經(jīng)被減少或 滅活的突變株來(lái)進(jìn)行。誘變可W是專一的或隨機(jī)的，可W例如通過(guò)使用適合的物理或化學(xué) 誘變劑、通過(guò)使用適合的寡核巧酸、或通過(guò)使DNA序列經(jīng)PCR產(chǎn)生的誘變來(lái)進(jìn)行。此外，誘 變可W通過(guò)使用該些誘變方法的任意組合來(lái)進(jìn)行。
[0090] 適用于本發(fā)明目的的物理或化學(xué)誘變劑的實(shí)例包括紫外線扣V)照射，輕胺，N-甲 基-N'-硝基-N-亞硝基脈（MNNG)，N-甲基-N'-亞硝基脈（NTG)，鄰甲基輕胺，亞硝酸，己 基甲賴酸（EM巧，亞硫酸氨軸，甲酸和核巧酸類似物。當(dāng)使用該樣的試劑時(shí)，誘變典型地是在 適合條件下在所選的誘變處理試劑的存在下通過(guò)賠育有待誘變的親本菌株并選擇展示基 因表達(dá)減少或不表達(dá)的突變體來(lái)進(jìn)行的。
[0091] 可W使用來(lái)自其他微生物來(lái)源的與在此描述的基因同源或互補(bǔ)的核巧酸序列來(lái) 破壞所選的乳桿菌菌株中的相應(yīng)的基因。
[0092] 在一個(gè)方面，乳桿菌突變體中基因的修飾未用選擇性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記?？蒞通過(guò)在 反選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)該些突變體來(lái)完成選擇性標(biāo)記基因的除去。在選擇性標(biāo)記基因包含側(cè) 翼于其5'和3'端的重復(fù)的情況下，當(dāng)突變株經(jīng)受反選擇時(shí)，該些重復(fù)將通過(guò)同源重組促進(jìn) 選擇性標(biāo)記基因的環(huán)出。還可W通過(guò)將一個(gè)核酸片段（該核酸片段包括缺陷基因的5'和 3'區(qū)域，但是缺乏選擇性標(biāo)記基因）引入該突變株，隨后在反選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇，用同 源重組除去選擇性標(biāo)記基因。通過(guò)同源重組，包含選擇性標(biāo)記基因的缺陷基因被替換為缺 乏選擇性標(biāo)記基因的核酸片段。也可使用本領(lǐng)域已知的其他方法。
[0093] 還描述的是產(chǎn)生在此描述的乳桿菌突變體的方法。在一個(gè)方面，描述的是用于獲 得在此描述的乳桿菌突變體的方法，該方法包括在親本乳桿菌菌株中，破壞編碼I型限制 修飾系統(tǒng)亞基的內(nèi)源基因。在另一方面，描述的是用于獲得在此描述的乳桿菌突變體的方 法，該方法包括；(a)培養(yǎng)親本乳桿菌菌株；(a)在（a)的親本乳桿菌菌株中，破壞編碼I型 限制修飾系統(tǒng)亞基的內(nèi)源基因；W及（C)分離生成自化）的突變株。
[0094] 轉(zhuǎn)化的DNA和相關(guān)方法
[0095] 對(duì)于產(chǎn)生乳桿菌轉(zhuǎn)化體，在此描述的乳桿菌突變體是有用的。在一個(gè)方面，描述 的是獲得乳桿菌轉(zhuǎn)化體的方法，該方法包括將異源多核巧酸轉(zhuǎn)化進(jìn)在此描述的乳桿菌突變 體。在另一方面，描述的是獲得乳桿菌轉(zhuǎn)化體的方法，該方法包括；(a)培養(yǎng)在此描述的乳 桿菌突變體；化）將異源多核巧酸轉(zhuǎn)化進(jìn)（a)的乳桿菌突變體；W及（C)分離生成自化）的 轉(zhuǎn)化體菌株。
[0096] 在此描述的轉(zhuǎn)化的DNA可W是任何感興趣的DNA。DNA可W是基因組來(lái)源的、CDNA 來(lái)源的、半合成來(lái)源的，合成來(lái)源的、或它們的任何組合。DNA可W是編碼具有感興趣的生物 活性的任何多膚的異源多核巧酸或可W是在具有生物活性的多膚的表達(dá)中涉及的DNA，例 如啟動(dòng)子。
[0097] 具有生物活性的多膚可W是任何感興趣的多膚。多膚對(duì)于感興趣的乳桿菌宿主細(xì) 胞而言可W是原生的或外源的。多膚可W是下述多膚和雜合多膚的天然發(fā)生的等位基因變 體和基因工程變體。
[009引術(shù)語(yǔ)"多膚"在此并非指特定長(zhǎng)度的編碼產(chǎn)物，因此涵蓋膚、寡膚和蛋白。術(shù)語(yǔ)"多 膚"還涵蓋雜合多膚，其包含獲得自至少兩種不同多膚的部分的或完整的多膚序列的組合， 其中一種或多種對(duì)于乳桿菌細(xì)胞而言可W是外源的。多膚還包括多膚的天然出現(xiàn)的等位變 體和工程化變體。
[0099] 在一個(gè)方面，多膚是抗體、抗原、抗微生物膚、酶、生長(zhǎng)因子、激素、免疫放大介質(zhì) (immunodilator)、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、報(bào)告蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白W及轉(zhuǎn)錄因子。
[0100] 在另一方面，多膚是氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、或者連接酶。 在一個(gè)最優(yōu)選的方面，多膚是a-葡糖巧酶，氨膚酶，淀粉酶，碳水化物酶，駿膚酶，過(guò)氧化 氨酶，纖維素酶，幾下質(zhì)酶，角質(zhì)酶（CUtinase)，環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶，脫氧核糖核酸酶，醋 酶，a-半乳糖巧酶，目-半乳糖巧酶，葡糖淀粉酶，葡糖腦巧脂酶，a-葡糖巧酶，目-葡 萄巧酶，轉(zhuǎn)化酶，漆酶，脂肪酶，甘露糖巧酶，變聚糖酶（mutanase)，氧化酶，果膠分解酶 (pectinolyticenzyme)，過(guò)氧化物酶，磯脂酶，肌醇六磯酸酶，多酷氧化酶，蛋白水解酶，核 糖核酸酶，谷氨醜胺轉(zhuǎn)移酶，尿激酶，或木聚糖酶。
[0101] 在另一個(gè)方面，多膚是白蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白原、彈性蛋白或明膠。
[0102] 在另一方面，多膚是雜合多膚，其包含獲得自至少兩種不同多膚的部分的或完整 的多膚序列的組合，其中一種或多種對(duì)于乳桿菌宿主細(xì)胞而言可W是外源的。
[0103] 在另一方面，多膚是融合多膚，其中另一多膚融合在該多膚或其片斷的N-末端或 C-末端。通過(guò)將編碼一種多膚的核巧酸序列（或其一部分）融合于編碼另一種多膚的核巧 酸序列（或其一部分）來(lái)生產(chǎn)融合多膚。產(chǎn)生融合多膚的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，并且包 含連接編碼多膚的編碼序列，W使得它們同框，并且融合多膚的表達(dá)受到相同的一種或多 種啟動(dòng)子和終止子的控制。
[0104]編碼感興趣的多膚的異源多核巧酸可W獲得自任何原核的、真核的、或其他來(lái)源。 出于本發(fā)明的目的，如在此使用，術(shù)語(yǔ)"獲得自"與給定來(lái)源一起使用時(shí)應(yīng)指該多膚是由該 來(lái)源或由其中已經(jīng)插入了來(lái)自該來(lái)源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生的。
[0105] 用于分離或克隆編碼感興趣的多膚的異源多核巧酸的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并且 包括從基因組DNA分離，從CDNA制備，或其組合。自此類基因組DNA克隆感興趣的DNA可 W通過(guò)例如使用熟知的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)來(lái)實(shí)現(xiàn)。參見，例如，Innis(英尼斯）等人， PCRProtocols=AGuidetoMethodsandApplication(PCR實(shí)驗(yàn)方案：方法和應(yīng)用的指 南），AcademicPress(學(xué)術(shù)出版社），紐約，1990?？寺〕绦蚩蒞涉及切除和分離包含編碼 多膚的核酸序列的希望的核酸片段，將該片段插入載體分子，并將該重組載體慘入乳桿菌 突變體，其中將會(huì)復(fù)制多個(gè)拷貝或克隆的該核酸序列。DNA可W是基因組來(lái)源的、CDNA來(lái)源 的、RNA來(lái)源的、半合成來(lái)源的，合成來(lái)源的、或它們的任何組合。
[0106] 可W按多種方式操作編碼感興趣的多膚的異源多核巧酸，W提供該多膚在突變?nèi)?桿菌菌株中的表達(dá)。取決于表達(dá)載體，在其插入載體W前操作多核巧酸序列可W是希望的 或必需的。利用重組DNA方法修飾核巧酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的。
[0107] 可W將包含編碼多膚的多核巧酸的核酸構(gòu)建體可操作地連接至一個(gè)或多個(gè)（若 干個(gè)）控制序列，在與該些控制序列相容的條件下，該些控制序列能夠指導(dǎo)突變?nèi)闂U菌菌 株中編碼序列的表達(dá)。
[010引控制序列可W是適當(dāng)?shù)膯?dòng)子序列、由本發(fā)明的突變?nèi)闂U菌菌株識(shí)別的核巧酸序 列，用于表達(dá)編碼該多膚的多核巧酸。啟動(dòng)子序列包含介導(dǎo)多膚表達(dá)的轉(zhuǎn)錄控制序列。該 啟動(dòng)子可W是在突變?nèi)闂U菌菌株中示出轉(zhuǎn)錄活性的任何核巧酸序列，包括突變型、截短型 及雜合型啟動(dòng)子，并且可W獲得自編碼與該突變?nèi)闂U菌菌株原生抑或外源的細(xì)胞外或細(xì)胞 內(nèi)多膚的基因。
[0109]在突變?nèi)闂U菌菌株中，適合指導(dǎo)核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子的實(shí)例是獲得自W下 各項(xiàng)的啟動(dòng)子：解淀粉芽抱桿菌a-淀粉酶基因（amyQ)、地衣芽抱桿菌a-淀粉酶基因 (amyL)、地衣芽抱桿菌青霉素酶基因（pen巧、嗜熱脂肪芽抱桿菌麥芽淀粉酶基因（amyM)、 枯草芽抱桿菌果聚糖藏糖酶基因（sacB)、枯草芽抱桿菌xylA和xylB基因、大腸桿菌Iac 操作子、大腸桿菌trc啟動(dòng)子巧gon(埃貢）等人，Gene(基因）1988, 69, 301-315)，天藍(lán) 色鏈霉菌瓊脂酶基因（dagA)、和原核目-內(nèi)醜胺酶基因（Villa(維拉）-Kamaroff(卡 瑪諾夫）等人，Proc.化tl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊）1978, 75, 3727-3731)， 連同tac啟動(dòng)子值eBoer(德波爾）等人，Proc.化tl.Acad.Sci.USA(美國(guó)國(guó)家科學(xué)院 院刊）1983, 80,21-25)。另外的啟動(dòng)子描述于佑Hbed(吉爾伯特）等人，Scientific American(科學(xué)美國(guó)人）1980, 242, 74-94)中的"來(lái)自重組細(xì)菌的有用蛋白扣Se化1 proteinsfromrecombinantbacteria)";W及Sambrook(薩姆布魯克）等人，1989,同上 中。
[0110] 控制序列也可W是適合的轉(zhuǎn)錄終止子序列，由突變?nèi)闂U菌菌株識(shí)別的序列，W終 止轉(zhuǎn)錄。該終止子序列可操作地連接至編碼該異源多膚的核巧酸序列的3'末端?？蒞使 用在乳桿菌菌株中具有功能的任何終止子。
[0111] 控制序列也可W是適合的前導(dǎo)子序列，對(duì)突變?nèi)闂U菌菌株翻譯重要的mRNA的非 翻譯區(qū)。該前導(dǎo)子序列可操作地連接至編碼該異源多膚的核巧酸序列的5'末端。可W使 用在突變?nèi)闂U菌菌株中具有功能的任何前導(dǎo)子序列。
[0112] 控制序列也可W是信號(hào)膚編碼序列，該編碼序列編碼與多膚氨基末端相連的氨基 酸序列，并且指導(dǎo)編碼的多膚進(jìn)入細(xì)胞的分泌通路。核巧酸序列的編碼序列的5'端可W固 有地包含信號(hào)膚編碼序列，該信號(hào)膚編碼序列在翻譯讀碼框中與編碼分泌的多膚的編碼序 列天然連接?？商娲?，編碼序列的5'端可W包含對(duì)編碼序列是外源的信號(hào)膚編碼序列。 在編碼序列不天然地包含信號(hào)膚編碼序列的情況下，可能需要外源信號(hào)膚編碼序列?？商?代地，外源信號(hào)膚編碼序列可W單純地替代天然信號(hào)膚編碼序列W便增強(qiáng)多膚的分泌。然 而，將表達(dá)的多膚引入突變?nèi)闂U菌菌株的分泌通路（即分泌進(jìn)入培養(yǎng)基）的任何信號(hào)膚編 碼序列可W用于本發(fā)明。
[0113] 包含核巧酸序列、啟動(dòng)子、W及轉(zhuǎn)錄和翻譯停止信號(hào)的重組表達(dá)載體可W用于重 組產(chǎn)生感興趣的多膚?？蒞將在此描述的不同核酸和控制序列連接起來(lái)W產(chǎn)生重組表達(dá)載 體，該重組表達(dá)載體可包括一個(gè)或多個(gè)（例如兩個(gè)、若干個(gè)）方便的限制位點(diǎn)，來(lái)允許在該 些位點(diǎn)插入或取代編碼多膚的核巧酸序列?？商娲?，可W通過(guò)將核巧酸序列或包含該序 列的核酸構(gòu)建體插入用于表達(dá)的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，來(lái)表達(dá)核巧酸序列。在產(chǎn)生表達(dá)載體時(shí)， 編碼序列是位于該載體中，W使得該編碼序列與用于表達(dá)的適當(dāng)控制序列可操作地連接。
[0114] 重組表達(dá)載體可W是可便利地經(jīng)受重組DNA程序并且可引起核巧酸序列表達(dá)的 任何載體（例如，質(zhì)?；虿《荆?。載體的選擇將典型地取決于它與有待引入該載體的突變?nèi)?桿菌菌株的相容性。該載體可W是一種線性的或閉合的環(huán)狀質(zhì)粒。
[0115] 該載體可W是一種自主復(fù)制載體，即，作為一種染色體外實(shí)體存在的一種載體，該 載體的復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制，例如一種質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。 該載體可W包含用于確保自我復(fù)制的任何裝置?？商娲兀撦d體可W是該樣一種載體，當(dāng) 它被引入突變?nèi)闂U菌菌株中時(shí)，被整合到基因組中并且與其中已整合了它的一個(gè)或多個(gè)染 色體一起復(fù)制。此外，可W使用單一載體或質(zhì)?；騼蓚€(gè)或更多個(gè)載體或質(zhì)粒（該些載體或 質(zhì)粒共同包含有待引入到突變?nèi)闂U菌菌株的基因組中的總DNA)、或轉(zhuǎn)座子。
[0116] 該載體可W包含一個(gè)或多個(gè)（例如兩個(gè)、若干個(gè)）選擇性標(biāo)記，該些選擇性標(biāo)記允 許容易選擇轉(zhuǎn)化的突變?nèi)闂U菌菌株。選擇性標(biāo)記是一種基因，該基因的產(chǎn)物提供了殺生物 劑抗性或病毒抗性、重金屬抗性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)型、等。
[0117] 用于在突變?nèi)闂U菌菌株中使用的選擇性標(biāo)記的實(shí)例包括但不局限于來(lái)自枯草芽 抱桿菌或地衣芽抱桿菌的dal基因，或賦予抗生素抗性（例如氨予青霉素、氯霉素、卡那霉 素、或四環(huán)素抗性）的標(biāo)記。酵母宿主細(xì)胞的適合的標(biāo)記是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、W及URA3。
[0118] 該些載體可W包含允許載體整合到乳桿菌基因組中或者允許載體在細(xì)胞中獨(dú)立 于基因組自主復(fù)制的一個(gè)或多個(gè)（例如兩個(gè)、若干個(gè)）元件。
[0119] 對(duì)于整合到突變?nèi)闂U菌菌株的基因組中，該載體可W依靠編碼感興趣的多膚的 多核巧酸的序列或者用于通過(guò)同源或非同源重組整合到該基因組中的該載體的任何其他 元件?？商娲兀d體可包含另外的核巧酸序列用于指導(dǎo)通過(guò)同源重組在一個(gè)或多個(gè)染 色體中的一個(gè)或多個(gè)確定位置整合進(jìn)入突變?nèi)闂U菌菌株基因組中。為了增加在精確位置 處整合的可能性，整合元件應(yīng)優(yōu)選包含足夠數(shù)目的核酸，例如如100-1，500堿基對(duì)、優(yōu)選 400-1，500堿基對(duì)和最優(yōu)選800-1，500堿基對(duì)，其與相應(yīng)的祀序列具有高的一致性程度W 增強(qiáng)同源重組的概率。該些整合元件可W是與突變?nèi)闂U菌菌株的基因組中的祀序列同源的 任何序列。此外，整合元件可W是非編碼的或編碼的核巧酸序列。另一方面，該載體可W通 過(guò)非同源重組整合到突變?nèi)闂U菌菌株的基因組中。
[0120] 對(duì)于自主復(fù)制，載體可W進(jìn)一步包含使該載體能夠在突變?nèi)闂U菌菌株中自主復(fù) 制的復(fù)制起點(diǎn)。復(fù)制起點(diǎn)可W是在細(xì)胞中起作用的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù) 語(yǔ)"復(fù)制起點(diǎn)"或"質(zhì)粒復(fù)制子"在此定義為使質(zhì)?；蜉d體能夠在體內(nèi)復(fù)制的核巧酸序列。 在突變?nèi)闂U菌菌株中有用的細(xì)菌的復(fù)制起點(diǎn)的實(shí)例是允許在大腸桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的質(zhì) 粒地R322、PUC19、PACYC177、W及PACYC184W及允許在芽抱桿菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的pUBllO、 口6194、9了41060、^及941目1的復(fù)制起點(diǎn)。
[0121] 用于連接在此描述的元件來(lái)構(gòu)建重組表達(dá)載體的程序是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟 知的（參見例如J.Sambrook(薩姆布魯克），E.F.化itsch(弗里奇），和T.Mania化S(曼尼 亞特斯），1989,MolecularCloning,AL油oratoryManual(分子克隆實(shí)驗(yàn)指南），第二版， 冷泉港，紐約）。
[0122] 該DNA還可W是控制序列，例如啟動(dòng)子，用于操作感興趣的基因的表達(dá)。W上描述 了控制序列的非限制性實(shí)例。
[0123] 該DNA可W進(jìn)一步是用于在乳桿菌細(xì)胞中滅活感興趣的基因的核酸構(gòu)建體。
[0124] 該DNA不局限于W上披露的特定實(shí)例的范圍，因?yàn)樵撔?shí)例旨在作為本發(fā)明若干 方面的說(shuō)明。
[01巧]可W使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如，如在W下實(shí)例部分中描述的電穿孔，進(jìn)行該DNA進(jìn)入突變?nèi)闂U菌菌株的轉(zhuǎn)化。
[0126] 可W使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，該些技術(shù)包括但不局限于劃線平板分離、在富 集培養(yǎng)基或選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、溫度生長(zhǎng)選擇、過(guò)濾、或單細(xì)胞分離技術(shù)（例如流式細(xì)胞術(shù) 和微流體技術(shù)），來(lái)分離在此描述的轉(zhuǎn)化體。
[0127] 在此描述的乳桿菌突變體的一些方面中，在轉(zhuǎn)化后修復(fù)了對(duì)編碼I型限制修飾系 統(tǒng)亞基的內(nèi)源基因的破壞。I型限制修飾系統(tǒng)亞基基因的修復(fù)使對(duì)于識(shí)別和降解會(huì)是例如 細(xì)胞穩(wěn)定性的有害物的外源DNA而言是重要的天然保護(hù)系統(tǒng)得到恢復(fù)。如在此使用，"修復(fù) 對(duì)I型限制修飾系統(tǒng)亞基基因的破壞"是指增加破壞的基因的表達(dá)，和/或增加由該一破壞 的基因編碼的多膚的活性?？蒞使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，連同在此描述的那些，例如用于直 接修飾破壞的基因的技術(shù)（例如將破壞的基因反轉(zhuǎn)回它的原生基因序列），和/或用于將功 能基因轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳桿菌宿主的技術(shù)（例如宿主基因組中在不同基因座的基因的整合），進(jìn) 行由該基因編碼的多膚的增加的基因表達(dá)和增加的活性。因此，在一個(gè)方面，獲得在此描述 的乳桿菌轉(zhuǎn)化體的方法進(jìn)一步包括修復(fù)對(duì)編碼I型限制修飾系統(tǒng)亞基的內(nèi)源基因的破壞。 [012引產(chǎn)生多膚和發(fā)酵產(chǎn)物的方法
[0129]名fi太
[0130] 如W上提到，在此描述的乳桿菌突變體可W增加在產(chǎn)生乳桿菌轉(zhuǎn)化體方面的效 率，該些乳桿菌轉(zhuǎn)化體例如在產(chǎn)生具有生物活性的多膚方面是有用的。因此，在一個(gè)方面， 產(chǎn)生具有生物活性的多膚的方法包括；(a)在有助于產(chǎn)生該多膚的條件下，培養(yǎng)用編碼該 多膚的異源多核巧酸轉(zhuǎn)化的乳桿菌宿主細(xì)胞，其中該乳桿菌宿主細(xì)胞是在此描述的乳桿菌 突變體（例如包含對(duì)編碼I型限制修飾系統(tǒng)亞基的內(nèi)源基因的破壞的乳桿菌突變體） 及（b)回收該多膚。
[0131] 在另一方面，描述的是產(chǎn)生多膚的方法，該方法包括；(a)培養(yǎng)在此描述的乳桿菌 轉(zhuǎn)化體（例如用編碼該多膚的異源多核巧酸轉(zhuǎn)化的在此描述的乳桿菌突變體）；W及化） 回收該多膚。
[0132] 該些感受態(tài)乳桿菌宿主細(xì)胞是在適合于使用本領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生該多膚的 一種營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。例如，可W通過(guò)搖瓶培養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中于適合的培 養(yǎng)基中并且在允許感興趣的多膚表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行小規(guī)模或大規(guī)模發(fā)酵（包括 連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵）培養(yǎng)細(xì)胞。該培養(yǎng)是使用本領(lǐng)域中已知的程序，在一種 適合營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生，該培養(yǎng)基包含碳和氮來(lái)源及無(wú)機(jī)鹽。適合培養(yǎng)基是自商業(yè)供應(yīng)商 可獲得的，或可W根據(jù)公開的組成（例如，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中也的目錄中）來(lái)制備。感 興趣的分泌物質(zhì)，例如多膚或發(fā)酵產(chǎn)物，可W直接回收自培養(yǎng)基。
[0133] 可W使用本領(lǐng)域已知的、對(duì)于該物質(zhì)是特異性的方法來(lái)檢測(cè)具有生物活性的多 膚。該些檢測(cè)方法可W包括特異性抗體的使用、高效液相層析、毛細(xì)管層析、酶產(chǎn)物的形 成、酶底物的消失、或SDS-PA(iE。例如，酶試驗(yàn)可用來(lái)確定具有酶活性的多膚的活性。確 定酶活性的方法在本領(lǐng)域中對(duì)許多酶都是已知的（參見，例如，D.Schomburg(施姆堡）和 M.Salzmann(薩爾茲曼；）（編輯），Enzyme化nclbook(酶手冊(cè)），SpringerVerlag(施普林 格出版公司），紐約，1990)。
[0134] 可W通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法分離具有生物活性的生成的多膚。例如，感興趣的多 膚可W用常規(guī)程序從培養(yǎng)基中分離，常該些規(guī)程序包括但不局限于離也，過(guò)濾，提取，噴霧 干燥，蒸發(fā)，或沉淀。分離的多膚可進(jìn)一步用本領(lǐng)域已知的多種程序純化，該些程序包括但 不局限于層析（例如離子交換層析，親和層析，疏水層析，聚焦層析、W及大小排阻層析）， 電泳程序（例如制備級(jí)等點(diǎn)聚焦電泳（IEF))，溶解度差異（例如硫酸按沉淀），或提?。▍?見例如，Protein化rification(蛋白純化），J. -C.Janson(詹森）和LarsRyden(拉爾斯 賴登），編輯，VCH化Wishers(VCH出版社），紐約，1989)。 。"引 發(fā)酵產(chǎn)物
[0136] 在此描述的乳桿菌突變體可W用于代謝工程，例如用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物。增加的突 變體的轉(zhuǎn)化效率可W提供超過(guò)現(xiàn)存宿主的使用乳桿菌的工具，并且可W允許針對(duì)現(xiàn)存的和 新的代謝通路的過(guò)表達(dá)異源基因的迅速篩選。
[0137]"發(fā)酵"或"發(fā)酵過(guò)程"是指任何發(fā)酵過(guò)程或包括發(fā)酵步驟的任何過(guò)程。發(fā)酵過(guò)程 還包括用于消費(fèi)性醇工業(yè)（例如啤酒和酒）、乳品工業(yè)（例如發(fā)酵乳制品）、皮革工業(yè)、煙草 工業(yè)、和精細(xì)化學(xué)工業(yè)或散裝化學(xué)工業(yè)的發(fā)酵過(guò)程。
[013引在一個(gè)方面，描述的是產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該方法包括；(a)在有助于產(chǎn)生發(fā)酵 產(chǎn)物的條件下，培養(yǎng)在此描述的乳桿菌轉(zhuǎn)化體（例如用編碼發(fā)酵通路的一種或多種多膚的 一種或多種異源多核巧酸轉(zhuǎn)化的在此描述的乳桿菌突變體）；W及化）回收發(fā)酵產(chǎn)物。
[0139] 乳桿菌轉(zhuǎn)化體可W是用一個(gè)或多個(gè)異源發(fā)酵通路基因轉(zhuǎn)化的在此描述的任 何乳桿菌突變體，導(dǎo)致增加產(chǎn)生希望的發(fā)酵產(chǎn)物。用于多種希望的發(fā)酵產(chǎn)物的發(fā)酵的 代謝通路基因和相應(yīng)的工程化轉(zhuǎn)化體是本領(lǐng)域已知的，例如產(chǎn)生異丙醇和正丙醇（WO 2012/058603)、3-輕基丙酸（WO2005/118719)、蘋果酸（WO2011/028643)、1，4-下二 醇（W02008/115840)、l, 3-下二醇（WO2010/127319)、2-下醇（W02010/144746)、THF(W0 2010/141920)、己內(nèi)醜胺（WO2010129936)、己撐二胺（WO2010129936)、己醜丙酸（WO 2010129936)、2/3-輕基異下酸（WO2009/135074)、甲基丙帰酸（WO2009/135074)、己二酸 (WO2009/151728)、下二帰（WO2011/140171)、粘康酸鹽（醋）（W02011/017560)和 4-輕基 下酵（WO2011/047101)(該些申請(qǐng)的內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此）。在此描述的乳桿菌突變體 可W提供用來(lái)進(jìn)一步改進(jìn)W上參考文獻(xiàn)中發(fā)酵產(chǎn)物生產(chǎn)的工具。
[0140] 可W在包含任何一種或多種（例如，兩種、若干種）糖的可發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行用 于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該些糖是例如葡萄糖、果糖、藏糖、纖維二糖、木糖、木麗糖、阿拉伯 糖、甘露糖、半乳糖、和/或可溶的低聚糖。在一些情況下，該種發(fā)酵培養(yǎng)基源自天然來(lái)源， 例如甘藏、淀粉、或纖維素；并且可W來(lái)自該種來(lái)源的酶水解（糖化作用）的預(yù)處理。
[0141] 除了來(lái)自一種或多種（例如，兩種、若干種）糖的適當(dāng)?shù)奶荚粗猓摽砂l(fā)酵的培 養(yǎng)基可W包含本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他營(yíng)養(yǎng)素或刺激物，例如大量營(yíng)養(yǎng)素（如，氮 源）W及微量營(yíng)養(yǎng)素（如，維生素、礦物鹽、W及金屬輔因子）。在一些方面中，碳源優(yōu)先地 可W補(bǔ)充有至少一種碳源，例如酵母提取物、N2、蛋白腺（例如，Bacto?蛋白腺）、或大豆蛋 白腺（例如，Bacto?大豆蛋白腺）。維生素的非限制性實(shí)例包括多種維生素、生物素、泛酸 鹽、煙酸、內(nèi)消旋肌醇、硫胺素、化唆醇、對(duì)氨基苯甲酸、葉酸、核黃素、W及維生素A、維生素 B、維生素C、維生素D、W及維生素E。礦物鹽和金屬輔因子的實(shí)例包括，但不局限于，化、P、 K、Mg、S、Ca、化、ZruMruW及化。
[0142] 典型地將發(fā)酵微生物添加至發(fā)酵培養(yǎng)基，并且進(jìn)行發(fā)酵，持續(xù)約8至約96小時(shí)，例 如約24至約60小時(shí)。溫度典型地在約26C至約6(TC之間，例如約32C或50。并且抑 為約抑3至約抑8,例如抑4-5、6、或7。
[0143] 視情況而定，可W在厭氧、基本上厭氧（微好氧）、或好氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。簡(jiǎn)言 之，厭氧的是指一種缺少氧氣的環(huán)境，基本上厭氧的（微好氧的）是指一種其中氧氣的濃 度比空氣低的環(huán)境，并且好氧是指一種其中氧氣濃度大致等于或大于空氣的氧氣濃度的環(huán) 境。基本上厭氧條件包括例如使得在培養(yǎng)基中的溶氧濃度保持在小于10%的飽和度的培 養(yǎng)、分批發(fā)酵或連續(xù)發(fā)酵。基本上厭氧條件還包括使細(xì)胞在維持有小于1 %氧氣的氣氛的密 封室內(nèi)的液體培養(yǎng)基中或固體瓊脂上生長(zhǎng)或靜止。例如可W通過(guò)向培養(yǎng)物鼓吹N2/C02混合 物或其他一種或多種適合的非氧氣體來(lái)維持氧氣的百分比。在一些實(shí)施例中，在厭氧條件 或基本上厭氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。
[0144]用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法可W采用任何適合的發(fā)酵操作模式。例如，分批模式發(fā) 酵可W與一個(gè)封閉系統(tǒng)一起使用，其中培養(yǎng)基和宿主微生物（在發(fā)酵的開始設(shè)置的）除了 試劑（某些例如用于抑控制、泡沫控制或過(guò)程支持所需的其他試劑）之外，沒有另外的投 入。在此描述的過(guò)程還可W在補(bǔ)料分批模式或連續(xù)模式中利用。
[0145] 可W在若干生物反應(yīng)器構(gòu)型中實(shí)踐用于產(chǎn)生發(fā)酵產(chǎn)物的方法，該些生物反應(yīng)器構(gòu) 型例如是攬拌槽、鼓泡培、氣升式反應(yīng)器W及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他反應(yīng)器。視情 況而定，能W游離細(xì)胞培養(yǎng)或固定化細(xì)胞培養(yǎng)的方式執(zhí)行該些方法?？蒞使用任何用于支 持固定化細(xì)胞培養(yǎng)的材料，例如藻酸鹽、纖維床、或菱形材料，例如溫石棉、蒙脫石KSF和蒙 脫石K-IO。
[0146] 發(fā)酵產(chǎn)物可W是源自發(fā)酵的任何物質(zhì)。發(fā)酵產(chǎn)物可W是而不局限于：醇（例如， 阿拉伯糖醇、正下醇、異下醇、己醇、甘油、甲醇、己二醇、1，3-丙二醇（丙二醇）、下二醇、丙 H醇、山梨糖醇、W及木糖醇）；焼姪（例如戊焼、己焼、庚焼、辛焼、壬焼、癸焼、十一焼、W及 十二焼）巧焼姪（例如，環(huán)戊焼、環(huán)己焼、環(huán)庚焼、W及環(huán)辛焼）；帰姪（例如，戊帰、己帰、 庚帰、W及辛帰）；氨基酸（例如，天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、W及蘇氨酸）； 氣體（例如，甲焼、氨氣化2)、二氧化碳（C02)、W及一氧化碳（CO));異戊二帰；麗（例如， 丙麗）；有機(jī)酸（例如，己酸、醋麗酸、己二酸、抗壞血酸、巧樣酸、2, 5-二麗-D-葡糖酸、甲 酸、富馬酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖酵酸、戊二酸、3-輕基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二 酸、草酸、草醜己酸、丙酸、玻巧酸、W及木糖酸）及聚麗化合物。發(fā)酵產(chǎn)物還可W是作為 高價(jià)值產(chǎn)物的蛋白。
[0147] 在一個(gè)方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種醇。將理解，術(shù)語(yǔ)"醇"涵蓋含有一個(gè)或多個(gè)輕基部 分的物質(zhì)。醇可W是任何醇，包括而不局限于；丙醇、正下醇、異下醇、異下醇、己醇、甲醇、 阿拉伯糖醇、下二醇、己二醇、甘油（glycerin)、丙H醇（glycerol)、1, 3-丙二醇、山梨糖 醇、或木糖醇。參見例如，Gong(宮）等人，1999，Ethanolproductionfromrenew油Ie resources(由可再生資源生產(chǎn)己酉享），inAdvancesinBiochemicalEngineering/ Biotechnology(在生化工程/生物技術(shù)進(jìn)展中），Sch巧er,T.(斯卡皮爾），編輯， Springer-Verlag(施普林格出版社）柏林海德堡，德國(guó)，65:207-241 ;Silveira(西爾維 拉）M.M.,和Jonas(喬納斯），R.,Appl.Microbiol.Biotechnol.(應(yīng)用微生物學(xué)與生物技 術(shù)）2002, 59:400-408 ;Nigam,P.(尼加姆）和Sin曲,D.(辛格），ProcessBiochemistry(加 工生物化學(xué)）199530:117-124 ;Ezeji(埃塞吉）等人,WorldJournalofMicrobiologyand Biotechnology(微生物與生物技術(shù)世界雜志）200319:595-603。
[014引在一個(gè)方面，發(fā)酵產(chǎn)物是丙醇，例如異丙醇和/或正丙醇（參見WO2012/058603， 其內(nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在此）。
[0149] 在另一方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種焼姪。焼姪可W是任何無(wú)支鏈的或支鏈的焼姪，包括 而不局限于；戊焼、己焼、庚焼、辛焼、壬焼、癸焼、十一焼、或十二焼。
[0150] 在另一個(gè)方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種環(huán)焼，例如環(huán)戊焼、環(huán)己焼、環(huán)庚焼、或環(huán)辛焼。
[0151] 在另一方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種帰姪。帰姪可W是任何無(wú)支鏈的或支鏈的帰姪，包括 而不局限于；戊帰、己帰、庚帰、或辛帰。
[0152] 在另一方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種氨基酸。氨基酸可W是任何氨基酸，包括而不局 限于；天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、賴氨酸、絲氨酸、或蘇氨酸。參見例如化chard,A.(理 查德），和Margaritis,A.(馬加里蒂斯），Biotechnol.Bioeng.(生物技術(shù)和生物工 程）2004,87,501-515。
[0153] 在另一個(gè)優(yōu)選方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種氣體。氣體可W是任何氣體，包括而不 局限于：甲焼、馬、C〇2、或C0。參見例如Kataoka(片岡）等人，WaterScienceand Technology(水科學(xué)和技術(shù)）1997, 36, 41-47 ;W及GunaseelanV.N.(古那森蘭），Biomass andBioenergy(生物質(zhì)和生物能），1997, 13, 83-114。
[0154] 在另一方面，發(fā)酵產(chǎn)物是異戊二帰。
[0巧5] 在另一方面，發(fā)酵產(chǎn)物是一種麗。應(yīng)理解的是，術(shù)語(yǔ)"麗"涵蓋包含一個(gè)或多個(gè)麗 部分的物質(zhì)。在一個(gè)方面，該麗是丙麗。
[0156] 在另一方面，發(fā)酵產(chǎn)物是有機(jī)酸。有機(jī)酸可W是任何有機(jī)酸，包括而不局限于；己 酸、醋麗酸（acetonicacid)、己二酸、抗壞血酸、巧樣酸、2, 5-二麗-D-葡糖酸、甲酸、富馬 酸、葡糖二酸、葡糖酸、葡糖酵酸、戊二酸、3-輕基丙酸、衣康酸、乳酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、 丙酸、玻巧酸、或木糖酸。參見，例如，Chen，R.(陳，R.)，和Lee，Y.Y.(李，Y.Y.)，Appl. Biochem.Biotechnol.(應(yīng)用生物化學(xué)和生物技術(shù)）1997, 63-65, 435-448。在一些方面，發(fā) 酵產(chǎn)物是一種氨基酸。氨基酸可W是任何氨基酸，包括而不局限于；天冬氨酸、谷氨酸、甘氨 酸、賴氨酸、絲氨酸、或蘇氨酸。參見例如化chard,A.(理查德，A.)，和Margaritis,A.(馬 加里蒂斯，A. )，Biotechnol.Bioeng.(生物技術(shù)和生物工程）2004, 87, 501-515。
[0157] 在另一方面，發(fā)酵產(chǎn)物是聚麗化合物。
[0158] 可W使用本領(lǐng)域已知的方法，如W上描述對(duì)多膚進(jìn)行的描述，進(jìn)行用來(lái)測(cè)試發(fā) 酵產(chǎn)物的產(chǎn)生的適合試驗(yàn)。例如，可W通過(guò)多種方法（例如HPLC(高效液相層析法）、 GC-MS(氣相層析-質(zhì)譜法）和LC-MS(液相層析-質(zhì)譜法））或使用本領(lǐng)域熟知的常規(guī)程序 的其他適合的分析方法對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物（W及其他有機(jī)化合物，例如副產(chǎn)物）進(jìn)行分析。還可 W用培養(yǎng)上清液測(cè)試發(fā)酵液中的發(fā)酵產(chǎn)物的釋放。可W使用例如針對(duì)葡萄糖和醇類的折光 率檢測(cè)器、W及針對(duì)有機(jī)酸的UV檢測(cè)器通過(guò)HPLC(Lin(林）等人，Biotechnol.Bioeng.(生 物技術(shù)和生物工程）2005, 90,（775-779))、或使用本領(lǐng)域熟知的其他適合的試驗(yàn)和檢測(cè)方 法量化在發(fā)酵培養(yǎng)基中的副產(chǎn)物和殘余的糖（例如，葡萄糖）。
[0159] 可W使用本領(lǐng)域已知的任何程序從發(fā)酵培養(yǎng)基中回收發(fā)酵產(chǎn)物，該些程序包括， 但不限于層析法（例如，尺寸排阻層析法、吸附層析法、離子交換層析法）、電泳程序、溶解 度差異、蒸觸、萃?。ɡ?，液液萃?。?、滲透蒸發(fā)、萃取過(guò)濾、膜過(guò)濾、膜分離、反滲透、超濾、 或結(jié)晶化。
[0160] 通過(guò)說(shuō)明的方式提供W下實(shí)例而不是旨在限制本發(fā)明。
[0161] 實(shí)例
[0162] 用作緩沖液和底物的化學(xué)品至少是試劑等級(jí)的商品。
[0163] 巧王困株 陽(yáng)164] 路氏乳桿甫ST10655伯4ZXV)
[0165] 描述為路氏乳桿菌DSM20016的菌株獲得自一個(gè)公共菌株保藏處。該一菌株在MRS 培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，并且整分試樣被冷凍為SJ10468。將SJ10468接種進(jìn)MRS培養(yǎng)基，在 37C增殖（不搖動(dòng)）持續(xù)一天，并且涂布在MRS瓊脂平板上，W獲得單菌落。在37C生長(zhǎng)兩 天后，在MRS瓊脂平板上重新分離單菌落，該平板在37C賠育持續(xù)H天，并且在該平板上刮 去細(xì)胞生長(zhǎng)，并且在該菌株保藏處中被儲(chǔ)存為SJ10655 (別名；04ZXV)。
[0166] 相同的細(xì)胞生長(zhǎng)用于接種IOmlMRS培養(yǎng)基，在37°C，將其賠育（不搖動(dòng)）持續(xù)3 天，隨后通過(guò)離也收獲細(xì)胞，并且使用QIAampDNA血液試劑盒（Qiagen公司，Hilden(希爾 登），德國(guó)）制備基因組DNA并且發(fā)送用于基因組測(cè)序。
[0167] 基因組測(cè)序掲示，分離的SJ10655(04ZXV)具有與JCM1112的基因組（而不是 與緊密相關(guān)的菌株DSM20016的基因組）基本一致的基因組。JCM1112和DSM20016源自 相同的原分離物，路氏乳桿菌巧75(Morita(莫里培）等人DNAresearch值NA研究）， 2008, 15, 151-161。）
[0168]大腸巧菌S.T2(參化Diderichsen(化德單希燕)等人J.Bacteriol.(細(xì)菌學(xué)雜 志）1990, 172,4315-4321)。
[0169]大腸巧菌MG1655(參見Blattner(布拉特納）等人Science(科 學(xué)）1997,277, 1453-1462)。
[0170]大腸桿甫TGl
[0171]TGl是常用克隆菌株并且獲得自商業(yè)供應(yīng)商；它具有W下基因型： F' [1:raD36lacIqAQac幻M15proA+B+]glnV(supE〇thi-1A(mcrB-hsdSM) 5CrK-mK-McrB-) thiA(lac-proAB)。
[0172] 培養(yǎng)基
[0173]LB平板由W下構(gòu)成；37gLB瓊脂（Sigma公司catno.L3027)，W及至IL的雙蒸 水。
[0174]LBPGS平板由W下構(gòu)成；37gLB瓊脂（Sigma公司catno.L3027)，0. 5%淀粉 (Merck公司cat.no. 101252)，0.OlM馬?〇4,〇. 4%葡萄糖，W及至IL的雙蒸水。
[0175]TY肉汁培養(yǎng)基由W下構(gòu)成；20g膜蛋白腺值ifco公司catno. 211699)，5g酵母 提取物值ifco公司catno. 212750)，7*l〇-3g氯化亞鐵（ferrochloride)，l*l〇-3g氯化猛 (II)，1. 5*l〇-3g硫酸鎮(zhèn)，W及至IL的雙蒸水。
[017引基本培養(yǎng)基（MM)由W下構(gòu)成；20g葡萄糖，1. Ig皿2口04,8. 9g馬冊(cè)04; 1. Og(NH4)2S04;0. 5g化-巧樣酸鹽；5. Og M拆04? 7&0 ;4.8mg MnS04? &0 ;2mg硫胺 素；0. 4mg/L生物素；0. 135gFeCls? 6&0 ; IOmgZnCla? 4&0 ; IOmgCaCla? 6&0 ; IOmg Na2Mo04? 2&0 ;9. 5mg CuS04? 5&0 ;2. 5mg H3BO3; W及至IL的雙蒸水，用肥1將抑調(diào)節(jié)至 7。
[0177] MRS培養(yǎng)基獲得自Difco?，為Difco?乳桿菌MRS瓊脂抑或Difco?乳桿菌MRS液 體培養(yǎng)基，具有W下構(gòu)成一Difco?乳桿菌MRS瓊脂；化蛋白腺No. 3 (10.Og)，牛肉提取物 (10.Og)，酵母提取物（5.Og)，右旋糖（20.Og)，聚山梨醇醋80 (1.Og)，巧樣酸饋化Og)，己 酸軸（5.Og)，硫酸鎮(zhèn)化Ig)，硫酸猛（0. 05g)，磯酸氨二鐘化Og)，瓊脂（15.Og)W及至IL 的水。Difco?乳桿菌MRS液體培養(yǎng)基；由相同成分組成而沒有瓊脂。
[017引 LC(攜帶乳桿菌的）培養(yǎng)基（LCM)由W下構(gòu)成：膜蛋白酶（IOg),膜蛋白腺（3g)， 酵母提取物巧扣，皿2口04(3扣，吐溫80(11111)，己酸軸（1扣，巧樣酸饋（1.5扣，半脫氨 酸-HCl(Cystein-HCl) (0.2g)，M拆04. 7H20(12mg)，F(xiàn)eS04.?&0(0.68mg)，MnS04. 2H20(25mg)， W及至IL的雙蒸水，抑調(diào)節(jié)至7. 0。在高壓滅菌后添加無(wú)菌葡萄糖至1%巧ml的20%葡 萄糖母液/IOOml培養(yǎng)基）。
[0179]實(shí)例1;轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)方案 陽(yáng)180] 乳桿甫甫株
[0181] 除非另外指明，如制造商所述，使用QIAprepSpin小量制備試劑盒（Qiagen公司， Hilden(希爾登），德國(guó)），從在TY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的、并且補(bǔ)充有適當(dāng)抗生素的2ml的過(guò)夜培 養(yǎng)物純化大腸桿菌中構(gòu)建的質(zhì)粒DNA。在50微升的體積中回收質(zhì)粒DNA，并且一微升的該 一質(zhì)粒制劑用于乳桿菌的電穿孔。
[0182] 通過(guò)電穿孔，將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化進(jìn)入乳桿菌菌株。用于電穿孔的路氏乳桿菌菌株制 備如下：將來(lái)自冷凍儲(chǔ)用培養(yǎng)物的菌株接種進(jìn)LCM培養(yǎng)基，并且在37C，將其賠育（不搖 動(dòng)）過(guò)夜。將5ml整分試樣移入500mlLCM培養(yǎng)基，并且在37C，將其賠育（不搖動(dòng)），直 至ODew達(dá)到大致0. 8。如W上通過(guò)離也收獲細(xì)胞，在室溫下，在50ml的離子交換的無(wú)菌水 中重新息浮并且洗涂2次，并且通過(guò)離也進(jìn)行收獲。最終在2. 5ml的30%陽(yáng)G1500中輕輕 重新息浮該些細(xì)胞，并且在醇/干冰浴中將50微升整分試樣快速冷凍，并且儲(chǔ)存在-8(TC直 至使用。W下在各自實(shí)例中描述了對(duì)電穿孔程序的改編。
[0183] 電穿孔程序A;在冰上解凍冷凍細(xì)胞，并且添加在TE緩沖液中的2微升的DNA息 浮液。將40微升的混合物轉(zhuǎn)移至冰冷的2mm電穿孔比色皿，保持在冰上1-3分鐘，并且在 BioRadGene化Iser?中進(jìn)行電穿孔，其中設(shè)置為1. 5kV;25微法；400歐姆。添加500微 升的LCM，并且在涂板前，在37C，將該混合物賠育（不搖動(dòng)）持續(xù)2小時(shí)。在補(bǔ)充有所需 抗生素的LCM瓊脂平板（用％瓊脂固化的LCM培養(yǎng)基）抑或MRS瓊脂平板上將細(xì)胞涂板， 并且在厭氧培養(yǎng)室（Oxoid公司，配備有不產(chǎn)氣菌小袋）中賠育。
[0184] 電穿孔程序B;在冰上解凍冷凍細(xì)胞，并且添加在TE緩沖液中的1微升的DNA息 浮液。將40微升的混合物轉(zhuǎn)移至冰冷的Imm電穿孔比色皿，保持在冰上1-3分鐘，并且在 BioRadGene化Iser?中進(jìn)行電穿孔，其中設(shè)置為1. 2kV;25微法；400歐姆。添加500微 升的LCM，并且在37C將該混合物賠育（不搖動(dòng)）持續(xù)4小時(shí)，之后在補(bǔ)充有所需抗生素的 MRS瓊脂平板上涂板，并且在厭氧培養(yǎng)室中賠育。 財(cái) 大腸桿甫甫株
[0186]通過(guò)如制造商所述，使用BioRadGene化Iser?炬ioRad公司，Hercules(赫拉克 勒斯），加利福尼亞州，美國(guó)）的電穿孔，抑或通過(guò)使用按本領(lǐng)域普遍知道的普通教科書程 序制備的用化學(xué)方法的感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。
[0187] 實(shí)例2;質(zhì)粒構(gòu)建。 陽(yáng)18引 PST10600
[0189]基于質(zhì)粒pVS2(vonWri曲t(馮賴特）等人，Appl.Environ.Microbiol.(應(yīng)用與 環(huán)境微生物學(xué)）1987, 53, 1584-1588)和Rud(路德）等人所述的啟動(dòng)子（Rud(路德）等人 Microbiology(微生物學(xué)）2006, 152, 1011-1019)構(gòu)建一組組成型表達(dá)載體。由Geneart AG公司（Regenburg(雷根堡），德國(guó)）化學(xué)合成包含Pll啟動(dòng)子（具有選擇的側(cè)翼限制位 點(diǎn)的）的DNA片段，W及包含P27(具有選擇的側(cè)翼限制位點(diǎn)的）的另一片段。
[0190] 包含具有側(cè)翼限制位點(diǎn)的Pll的DNA片段，W及包含具有側(cè)翼限制位點(diǎn)的P27的 DNA片段分別示出于SEQIDN0:506和507中。WDNA制劑的形式獲得該兩個(gè)DNA片段， 其中已經(jīng)將該些片段插入標(biāo)準(zhǔn)Geneart載體，pM。將包含Pll的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌SJ2 細(xì)胞，并且將轉(zhuǎn)化體保持為包含質(zhì)粒PSJ10560的SJ10560。將包含P27的載體轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸 桿菌SJ2細(xì)胞，并且將轉(zhuǎn)化體保持為包含質(zhì)粒PSJ10561的SJ10561。
[0191] 從Geneart載體切下處于17化PHindIII片段形式的含啟動(dòng)子片段，并且連接至 HindIII消化的PUC19。從由SJ10560制備的載體切下含Pll片段，連接至PUC19,并且將大 腸桿菌SJ2的正確轉(zhuǎn)化體保持為分別包含PSJ10585和PSJ10586的SJ10585和SJ10586。 從由SJ10561制備的載體切下含P27片段，連接至PUC19,并且將大腸桿菌SJ2的正確轉(zhuǎn)化 體保持為分別包含PSJ10587和PSJ10588的SJ10587和SJ10588。
[0192] 在植物乳桿菌NC8(保持為SJ10491的一個(gè)菌株）中獲得質(zhì)粒pVS2,通過(guò)本領(lǐng)域已 知的質(zhì)粒制備程序從該一菌株提取，并且轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌MG1655,在37C，在LB瓊脂平板 上，選擇紅霉素抗性（200微克/ml)。兩個(gè)該樣的轉(zhuǎn)化體被保持為SJ10583和SJ10584。
[0193] 為了將Pll插入pVS2,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，從PSJ10585切下含Pll的17化P HindIII片段并且純化，并且連接至化ndIII消化的、已經(jīng)制備自SJ10583的pVS2。通過(guò)電 穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌MG1655,在LB瓊脂平板上，選擇紅霉素抗性（200微克/ ml),并且將兩個(gè)轉(zhuǎn)化體（二者都容納質(zhì)粒，其中啟動(dòng)子插入物在兩個(gè)可能的方向中具體的 一個(gè)中）保持為包含PSJ10600 (圖 4)和PSJ10601 的SJ10600 和SJ10601。 陽(yáng)194] PST10795
[0195] 在H種有機(jī)體大腸桿菌、植物乳桿菌和路氏乳桿菌中，將在費(fèi)氏丙酸桿菌中鑒定 的硫解酶基因的1152bp編碼序列（不具有終止密碼子）針對(duì)表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，并且合成地構(gòu) 建進(jìn)入PSJ10676。包含密碼子優(yōu)化的CDS的DNA片段被設(shè)計(jì)為具有緊密地在起始密碼子之 前的序列5'-AAGCTTTC-3'(用來(lái)添加化ndin位點(diǎn)并且將起始區(qū)轉(zhuǎn)化為化Ol相容的Bs抑I 位點(diǎn)）^及緊密地在下游的序列5，-1461'押464(：^6406447^^^'4〇：-3,669 10側(cè):459) (用來(lái)添加終止密碼子、和限制位點(diǎn)甜al-XhoI-EcoRI-Kpnl)。
[0196] 然后將生成的序列提交至GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德國(guó)）并由該 公司進(jìn)行合成，并且W包含目-內(nèi)醜胺酶編碼基因WaTEM-I的PM骨架載體交付。通過(guò)電 穿孔，將從Geneart公司交付的DNA制品轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌SJ2,選擇氨予青霉素抗性（200微 克 /ml)，并且兩個(gè)轉(zhuǎn)化體保持為SJ10676 (SJ2/PSJ10676)和SJ10677 (SJ2/PSJ10677)。
[0197] 費(fèi)氏丙酸桿菌硫解酶基因的密碼子優(yōu)化的核巧酸序列（CO)和推斷的氨基酸序列 分別是SEQIDN0:460和461。編碼序列是包括終止密碼子的115化P，并且編碼的預(yù)測(cè)蛋 白是384個(gè)氨基酸。使用信號(hào)P(Si即al巧程序（Nielsen(尼爾森）等人，1997,Protein 化gineering(蛋白質(zhì)工程），10:1-6)，預(yù)測(cè)在該序列中沒有信號(hào)膚。基于該一程序，預(yù)測(cè)的 成熟蛋白包含384個(gè)氨基酸，具有39.SkDa的預(yù)測(cè)分子量和6. 1的等電抑。
[0198] 用BspHI和EcoRI消化質(zhì)粒PSJ10676,并且使用凝膠電泳純化生成的1. 17化片 段。用化Ol和EcoRI消化質(zhì)粒PSJ10600,并且使用凝膠電泳純化5. 2化片段?；旌?、連接 純化的片段，并且將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)TGl電感受態(tài)細(xì)胞，在37C，在LB平板上，選擇紅霉 素抗性（200微克/ml)。通過(guò)使用化il的限制性分析，分析生成的菌落中的四個(gè)并且將它 們視為包含希望的重組質(zhì)粒，并且通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了該些中的一個(gè)，將其保持，由 此產(chǎn)生SJ10795 (TGl/pSJ10795)。 陽(yáng)19引 PST10798
[0200] 設(shè)計(jì)在丙麗下醇梭桿菌中鑒定的硫解酶基因的1176bp編碼序列（不具有終止密 碼子），用于在H種有機(jī)體大腸桿菌、植物乳桿菌和路氏乳桿菌中優(yōu)化表達(dá)，并且合成地構(gòu) 建進(jìn)入PSJ10705。包含密碼子優(yōu)化的編碼序列的DNA片段被設(shè)計(jì)為具有緊密地在起始密 碼子之前的序列5' -AAGCTTTC-3'(用來(lái)添加HindIII位點(diǎn)并且將起始區(qū)轉(zhuǎn)化為化Ol相容 的839^位點(diǎn)）^及緊密地在下游的序列5'-1461'口'464口'〔646644口'〔6614〇：-3,669 10 N0:459)(用來(lái)添加終止密碼子、和限制位點(diǎn)甜al-XhoI-EcoRI-Kpnl)。
[020。 然后將生成的序列提交至GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德國(guó)）并由該 公司進(jìn)行合成，并且W包含目-內(nèi)醜胺酶編碼基因WaTEM-I的PM骨架載體交付。通過(guò)電 穿孔，將從Geneart公司交付的DNA制品轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌SJ2,選擇氨予青霉素抗性（200微 克 /ml)，并且兩個(gè)轉(zhuǎn)化體保持為SJ10705 (SJ2/PSJ10705)和SJ10706 (SJ2/PSJ10706)。
[0202] 丙麗下醇梭桿菌硫解酶基因的野生型核巧酸序列（WT)、密碼子優(yōu)化的核巧酸序列 (CO)、和推斷的氨基酸序列分別是SEQIDNO:462、463、和464。編碼序列是包括終止密碼子 的1179bp，并且編碼的預(yù)測(cè)蛋白是392個(gè)氨基酸。使用信號(hào)P(Signal巧程序（Nielsen(尼 爾森）等人，Protein化gineering(蛋白質(zhì)工程），1997, 10, 1-6)，預(yù)測(cè)在該序列中沒有信 號(hào)膚?；谠撘怀绦?，預(yù)測(cè)的成熟蛋白包含392個(gè)氨基酸，具有41. 4kDa的預(yù)測(cè)分子量和 7. 08的等電抑。
[0203] 用BspHI和EcoRI消化質(zhì)粒PSJ10705,而用化〇1和EcoRI消化PSJ10600。使用 凝膠電泳各自純化產(chǎn)生的PSJ10705的1193bp片段和PSJ10600的5147bp片段，并且隨后 如在此概述的進(jìn)行連接。
[0204] 通過(guò)電穿孔，將連接混合物的整分試樣用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，并且在LB平板上， 用200微克/ml紅毒素選擇轉(zhuǎn)化體。通過(guò)使用化il的限制性分析連同DNA測(cè)序，分析了 4 個(gè)菌落中3個(gè)，并且將它們視為包含希望的重組質(zhì)粒，并且將該些中的兩個(gè)保持，由此產(chǎn)生 SJ10798(TGl/pSJ10798)和SJ10799(TGl/pSJ10799)。 陽(yáng)20引 PST10743
[0206] 在H種有機(jī)體大腸桿菌、植物乳桿菌和路氏乳桿菌中，將在短乳桿菌中鑒定的 硫解酶基因的1167bp編碼序列（不具有終止密碼子）優(yōu)化表達(dá)，并且合成地構(gòu)建進(jìn)入 PSJ10699。包含密碼子優(yōu)化的CDS的DNA片段被設(shè)計(jì)為具有緊密地在起始密碼子之前的序 列5' -AAGCTTCC-3'(用來(lái)添加HindIII位點(diǎn)并且將起始區(qū)轉(zhuǎn)化為化Ol位點(diǎn)）W及緊密地 在下游的序列5'-1461'押464(：1'〔646644口'〔6614〇：-3'669 10側(cè):459)(用來(lái)添加終止密 碼子、和限制位點(diǎn)甜al-XhoI-EcoRI-Kpnl)。
[0207] 然后將生成的序列提交至GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德國(guó)）并由該 公司進(jìn)行合成，并且W包含目-內(nèi)醜胺酶編碼基因WaTEM-I的PM骨架載體交付。通過(guò)電 穿孔，將從Geneart公司交付的DNA制品轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌SJ2,選擇氨予青霉素抗性（200微 克 /ml)，并且兩個(gè)轉(zhuǎn)化體保持為SJ10699 (SJ2/PSJ10699)和SJ10700 (SJ2/PSJ10700)。
[020引短乳桿菌硫解酶基因的密碼子優(yōu)化的核巧酸序列（CO)和推斷的氨基酸序列分別 是SEQIDN0:465和466。編碼序列是包括終止密碼子的117化P，并且編碼的預(yù)測(cè)蛋白是 389個(gè)氨基酸。使用信號(hào)P(Signal巧程序（Nielsen(尼爾森）等人，1997,同上），預(yù)測(cè)在 該序列中沒有信號(hào)膚?；谠撘怀绦?，預(yù)測(cè)的成熟蛋白包含389個(gè)氨基酸，具有40. 4kDa的 預(yù)測(cè)分子量和6. 5的等電抑。
[0209]用化Ol和EcoRI消化質(zhì)粒PSJ10699,并且使用凝膠電泳純化生成的1. 18化片段。 用化Ol和EcoRI消化質(zhì)粒PSJ10600,并且使用凝膠電泳純化5. 2化片段?；旌?、連接純化的 片段，并且將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)MG1655電感受態(tài)細(xì)胞，在37C，在LB平板上，選擇紅霉素抗 性（200微克/ml)。通過(guò)使用ClaI的限制性分析，分析生成的菌落中的16個(gè)并且將兩個(gè)視 為包含希望的重組質(zhì)粒，并且通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)，將其保持，由此產(chǎn)生SJ10743 (TGl/ PSJ10743)和SJ10757(TGl/pSJ10757)。 陽(yáng)210] PST10796
[02U] 使用W下示出的引物671826和671827,從SJ10468的染色體DNA擴(kuò)增來(lái)自路氏乳 桿菌的1176bp硫解酶編碼序列（不具有終止密碼子）（同上）。
[0212] 引物 671826:
[0213] 5, -AGTCAAGCTTCCATGGAGAAGGTTTACATTGTTGC-3,（SEQIDN0:467)
[0214]引物 671827:
[02巧]5, -ATGCGGTACCGAATTCCTCGAGTCTAGACTAAATTTTCTTAAGCAGAACCG-3'(SEQID NO:468)
[0216]PCR反應(yīng)編程為；94°C持續(xù)2分鐘；并且然后19個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在95C持續(xù) 30砂、59C持續(xù)1分鐘、W及72C持續(xù)2分鐘；然后一個(gè)循環(huán)，在72C持續(xù)5分鐘。用 化oI+EcoRI消化大致1. 2化的PCR擴(kuò)增的片段，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化，并且然后連接至 質(zhì)粒PSIP409的瓊脂糖凝膠電泳純化的EcoRI-NcoI載體片段（W02012/058603)。將連接混 合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌SJ2,選擇氨予青霉素抗性（200微克/ml)，并且將通過(guò)限制酶切消化 和DNA測(cè)序視為正確的轉(zhuǎn)化體保持為SJ10694(SJ2/pSJ10694)。
[0217] 路氏乳桿菌硫解酶基因的密碼子優(yōu)化的核巧酸序列（CO)和推斷的氨基酸序列分 別是SEQIDN0:469和470。編碼序列是包括終止密碼子的1179bp，并且編碼的預(yù)測(cè)蛋白 是392個(gè)氨基酸。使用信號(hào)P(Signal巧程序（Nielsen(尼爾森）等人，1997,同上），預(yù)測(cè) 在該序列中沒有信號(hào)膚?；谠撘怀绦颍A(yù)測(cè)的成熟蛋白包含392個(gè)氨基酸，具有41.OkDa 的預(yù)測(cè)分子量和5. 4的等電抑。
[021引用化Ol和EcoRI消化質(zhì)粒PSJ10694,并且使用凝膠電泳純化生成的1. 19化片段。 用化Ol和EcoRI消化質(zhì)粒PSJ10600,并且使用凝膠電泳純化5. 2化片段。混合、連接純化 的片段，并且將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)TGl電感受態(tài)細(xì)胞，在37C，在LB平板上，選擇紅霉素抗 性（200微克/ml)。通過(guò)使用化il的限制性分析，分析生成的菌落中的四個(gè)并且將它們視 為包含希望的重組質(zhì)粒，并且通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)了該些中的兩個(gè)，將其保持，由此產(chǎn) 生SJ10796(TGl/pSJ10796)和SJ10797(TGl/pSJ10797)。 陽(yáng)21引PST10762
[0220] 在H種有機(jī)體大腸桿菌、植物乳桿菌和路氏乳桿菌中，將來(lái)自發(fā)酵乳桿菌的異丙 醇脫氨酶（SWISSPR0T:B2GD冊(cè)）的1068bpCDS(不具有終止密碼子）針對(duì)表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，并 且合成地構(gòu)建進(jìn)入PSJ10703。
[0221] 包含密碼子優(yōu)化的異丙醇脫氨酶CDS(sa化Lf)的DNA片段被設(shè)計(jì)為具有緊密地 在起始密碼子之前的序列 5'-GGTACCACTATTACAAGGAGATTTTAGTC-3'（SEQIDN0:471) (用來(lái)添加化nl位點(diǎn)和乳桿菌RB巧W及緊密地在下游的XmaI和化ndIII限制位點(diǎn)。該些 構(gòu)建體獲得自GeneartAG公司，并且如前所述進(jìn)行轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生SJ10703 (SJ2/PSJ10703)和 SJ10704(SJ2/pSJ10704)。
[0222] 發(fā)酵乳桿菌異丙醇脫氨酶基因的密碼子優(yōu)化的核巧酸序列（CO)和推斷的氨基酸 序列分別是SEQIDN0:472和473。編碼序列是包括終止密碼子的107化P，并且編碼的預(yù) 測(cè)蛋白是356個(gè)氨基酸。使用信號(hào)P(Signal巧程序（Nielsen(尼爾森）等人，1997,同 上），預(yù)測(cè)在該序列中沒有信號(hào)膚。基于該一程序，預(yù)測(cè)的成熟蛋白包含356個(gè)氨基酸，具有 37. 9kDa的預(yù)測(cè)分子量和5. 2的等電抑。
[0223]用BspHI和XmaI消化質(zhì)粒PSJ10703,并且使用凝膠電泳純化生成的1. 1化片 段。用XmaI和化Ol消化質(zhì)粒PSJ10600,并且使用凝膠電泳純化生成的5. 1化片段。混 合、連接純化的片段，并且將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)JM103連同TGl電感受態(tài)細(xì)胞，在37C，在 LB平板上，選擇紅霉素抗性（200微克/ml)。通過(guò)使用ClaI的限制性分析，分析轉(zhuǎn)化體， 并且將兩個(gè)（來(lái)自每個(gè)宿主菌株中各一個(gè)）視為包含希望的重組質(zhì)粒，并且通過(guò)DNA測(cè)序 證實(shí)，將其保持為SJ10762(JM103/pSJ10762)和SJ10765(TGl/pSJ10765)。還證實(shí)轉(zhuǎn)化體 SJ10766(JM103/pSJ10766)包含發(fā)酵乳桿菌異丙醇脫氨酶基因。PSJ10762的質(zhì)粒圖示出于 圖6。 陽(yáng)224] DSTl1298(熱敏裁體）
[0225] 對(duì)于整合進(jìn)入W及隨后從乳桿菌染色體切除而有用的熱敏載體是基于 pG+Host4(Aggligene，法國(guó)；參見Biswas(比斯瓦斯）等人J.Bacteriol.(細(xì)菌學(xué)雜 志）1993, 175, 3628-363巧。使用質(zhì)粒pUC19(Yanisch(雅尼奇）-Perron(佩龍）等人 Gene(基因）1985, 33, 103-119)作為模板，W及W下示出的引物689229和689230,通過(guò)PCR 擴(kuò)增，獲得在大腸桿菌中發(fā)揮功能的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)。
[0226]引物 689229:
[0227] 5, -GACTAAGCTTGGGCCCTCCTCGCTCACTGACTCGCT-3'（SEQIDN0:474)
[022引 引物 689230:
[0229] 5, -GACTGAATTCGGGCCCTCATGACCAAAATCCCTTAACG-3'（SEQIDN0:475)
[0230] 用EcoRI+Hindlll消化通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得大致0. 8化的DNA片段，并且通過(guò)瓊脂 糖凝膠電泳進(jìn)行純化。
[023。用EcoRI+Hindlll消化pG+Host4,并且用堿性磯酸酶處理消化的載體?；旌稀⑦B 接片段的和載體DNA，并且將連接混合物轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌SJ2感受態(tài)細(xì)胞，選擇紅霉素抗性 (200微克/ml)。包含具有插入pG+Host4骨架的PUC19復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體被保持為 SJ11298(SJ2/pSJ11298)。
[0232] 根據(jù)W上描述的程序B，將質(zhì)粒pSJl1298引入SJl1294突變?nèi)闂U菌菌株（參見實(shí) 例3)，并且在補(bǔ)充有紅霉素（10微克/ml)的MRS培養(yǎng)基中，在3(TC抑或37C增殖獲得的轉(zhuǎn) 化體（SJ11487)。過(guò)夜賠育后，將400yL的培養(yǎng)物接種進(jìn)具有10微克/ml紅毒素的1. 5mL MRS中。在30°C抑或37°C生長(zhǎng)3小時(shí)后，在0. 8血STE緩沖液（每升包含；26. 8ml25%藏 糖、50mlIMTris(pH7. 5)、和2ml0. 5M邸TA)中洗涂細(xì)胞，并且使用Qiagen公司spin試 劑盒（Qiagen公司，Hilden(希爾登），德國(guó)），提取質(zhì)粒DNA。
[023引與37C培養(yǎng)物相比，從3(TC培養(yǎng)物獲得實(shí)質(zhì)上更多的質(zhì)粒DNA，證實(shí)了在路氏乳 桿菌中該一質(zhì)粒的復(fù)制的熱敏性質(zhì)。 陽(yáng)234] D服Q357
[0235] 將質(zhì)粒載體PSIP409(WO2012/058603)用作模板，用于編碼-葡萄糖酵酸酶的報(bào) 告基因gusA的PCR擴(kuò)增，使用修飾的隨機(jī)化引物pr029;5'-CCCATGTCGACNNNNNNNNA GTTGTTGACANNNNNNNNNNNNNNTGRTAWDN?NNNNTATAGCGTACTTAGCTGGCC-3'(SEQ IDN0:516)(由Rud(路德）等人描述，（Rud(路德）等人Microbiology(微生物 學(xué)）2006, 152, 1011-1019)，W及引物 665282:5,-GCTATCAATCAAAGCAAC-3,（沈QID NO: 517)，使用Phusion恥圾啟動(dòng)DNA聚合酶（Finnzymes公司，芬蘭）。
[0236]PCR反應(yīng)編程為；94°C持續(xù)2分鐘；并且然后30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)在94C持續(xù)30 砂、56C持續(xù)1分鐘、W及72C持續(xù)1分鐘；然后一個(gè)循環(huán)，在72C持續(xù)5分鐘。該生成 編碼側(cè)翼是Sail和EcoRI限制位點(diǎn)的啟動(dòng)子和gusA基因的2化片段。如制造商推薦，使 用PCR純化試劑盒（Qiagen公司，Hilden(希爾登），德國(guó)），純化PCR產(chǎn)物。然后將純化的 PCR產(chǎn)物用于運(yùn)行一個(gè)另外的PCR循環(huán)，用引物665282,如下；94°C持續(xù)2:30分鐘，56C持 續(xù)1分鐘，W及72C持續(xù)5分鐘。再次如制造商推薦，使用PCR純化試劑盒（Qiagen公司， Hilden(希爾登），德國(guó)），純化PCR產(chǎn)物（2化）。
[0237] 然后用Sall+EcoRI消化PCR產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行純化，并且最終連接至 質(zhì)粒PSIP411的瓊脂糖凝膠電泳純化的SalI-EcoRI載體片段（3.化b) (W02012/058603)。 將連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，選擇紅霉素抗性（200微克/ml)。
[0238] 將包含質(zhì)粒地KQ357(5.化b)的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體鑒定為具有質(zhì)粒編碼的gusA基因 的W下上游序列；5,-GTCGACCCGGAAGTAGTTGTTGACACGCACCTGCTTGTGTGATAAATTAA ATTTATAGCGTACTTAGCTGGCC-3'(沈QIDN0:518)。
[0239] P服Q357的質(zhì)粒圖示出于圖9。 陽(yáng)240] PST11460
[024^ 由GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德國(guó)）化學(xué)合成質(zhì)粒PSJ11460,并且 該質(zhì)粒包含編碼來(lái)自植物乳桿菌的己醜己酸脫駿酶的DNA序列。在標(biāo)準(zhǔn)Geneart載體中 獲得該基因，并且然后將該基因轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌SJ2電感受態(tài)細(xì)胞，并且將轉(zhuǎn)化體保持為 SJl1460(該質(zhì)粒表示為pSJl1460)。包含己醜己酸脫駿酶基因的合成的化Ol-KpnI片段 (標(biāo)為adc_D13974)具有SEQIDN0:515中示出的核巧酸序列。 陽(yáng)24引PST11464
[024引由GeneartAG公司（Regenburg(雷根堡），德國(guó)）化學(xué)合成質(zhì)粒PSJ11464,并 且該質(zhì)粒包含編碼來(lái)自胃竇乳桿菌的仲醇脫氨酶的DNA序列。在標(biāo)準(zhǔn)Geneart載體中獲 得該基因，并且然后將該基因轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌SJ2電感受態(tài)細(xì)胞，并且將轉(zhuǎn)化體保持為 SJl1464(該質(zhì)粒表示為pSJl1464)。包含該醇脫氨酶基因的合成的化nl-Xmal片段（標(biāo)為 sa&_D13976)具有SEQIDN0:514中示出的核巧酸序列。 陽(yáng)244]PTRGU1065
[024引使用W下引物P540和P541，通過(guò)PCR擴(kuò)增地KQ357的載體骨架。
[0246]P540 ;5' -CAATGATCTAGACTCGAGGA-3'（沈QIDN0:504)
[0247] P541 ;5' -GACGTACCATGGCTAAAATC-3'（沈QIDN0:505)
[024引對(duì)于該P(yáng)CR反應(yīng)，使用Phusioi悚巧啟動(dòng)DNA聚合酶（Finnzymes公司，芬蘭），并且 該一擴(kuò)增反應(yīng)編程為；30個(gè)循環(huán)，在98C持續(xù)2分鐘；98C持續(xù)20砂，梯度從4(TC至6(TC 持續(xù)30砂，72°C持續(xù)1分鐘30砂；然后一個(gè)循環(huán)，在72°C持續(xù)5分鐘。如在瓊脂糖凝膠電 泳上估計(jì)，所有測(cè)試的溫度，除了 47. 7C，導(dǎo)致3. 3化DNA片段的擴(kuò)增。根據(jù)制造商的指示， 用PCR純化試劑盒（Qiagen公司，Hilden(希爾登），德國(guó)）純化生成的PCR產(chǎn)物。
[0249]在 37 °C,分別用限制性內(nèi)切酶化ol+Xmal、化oI+Kpnl、和KpnI+Xmal(New 化glandBiol油S公司，Ipswich(伊普斯威奇），馬薩諸塞州，美國(guó)）將W上PCR產(chǎn)物、pSJ10701(W02012/058603)、W及pSJ11464(同上）消化過(guò)夜。在 37°C，用IU小牛腸磯酸 酶（CIP) (New化glandBiol油S公司）將地KQ357的限制的PCR產(chǎn)物去磯酸化，持續(xù)30 分鐘。所有H種消化物隨后經(jīng)歷在0. 75%瓊脂糖凝膠上的電泳，并且根據(jù)制造商的指示， 使用QIAquick凝膠提取試劑盒（Qiagen公司）純化具有大致3. 3化(P服Q357擴(kuò)增子）、 0. 9化（adc_D72YKT)、W及 1. 1化（sa&_D13976)的條帶。
[0巧0] 在室溫下，使用包含IOmMATP的T4DNA連接酶緩沖液中的T4DM連接酶 (F.Hoffmann-LaRocheLtd公司，己塞爾，瑞± )，將純化的消化DNA片段W-個(gè)H片段連 接反應(yīng)進(jìn)行連接，過(guò)夜。經(jīng)由42C熱休克持續(xù)2分鐘，將連接混合物的5yL整分試樣轉(zhuǎn)化 進(jìn)化學(xué)上的感受態(tài)大腸桿菌TGl。在37C，搖動(dòng)下恢復(fù)3小時(shí)后，將細(xì)胞在包含200yg/ml 紅霉素的LB瓊脂平板上涂板，并且在37C賠育過(guò)夜。將一個(gè)菌落，大腸桿菌TRGU1065接種 進(jìn)具有100yg/血紅霉素的液體LB培養(yǎng)基中，并且在37C賠育固液。使用巧aprep?Spin 小量制備試劑盒（Qiagen公司），分離相應(yīng)質(zhì)粒PTRGU1065,并且經(jīng)受DNA測(cè)序W證實(shí)adc_D72YKT和sadh_D13976被克隆進(jìn)了載體。將來(lái)自液體過(guò)夜培養(yǎng)物的包含PTRGU44的大腸桿 菌TRGU1065 儲(chǔ)存在-8(rC的30%丙H醇中。pTRGU1065 的質(zhì)粒圖示出于圖7。 。巧。PTRGU1073
[0巧2] W基本上相同的方式，將質(zhì)粒PTRGU1073構(gòu)建為pTRGU1065(同上），其中adc_ D72YKT被換成adc_D13974。從載體pSJ11460(如W下描述進(jìn)行合成）克隆dc_D13974。PTRGU1073的質(zhì)粒圖示出于圖8。
[0巧引實(shí)例3 ;具有編碼I型限制修飾系統(tǒng)的特異性亞基的破壞的基因（LAR_0818)的乳 桿菌突變體的分離
[0254] 從W下描述的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)最初產(chǎn)生包含破壞的特異性亞基的路氏乳桿菌突變體并 且進(jìn)行選擇。
[0巧5] 使用W上描述的實(shí)驗(yàn)方案（程序A)，用質(zhì)粒PSJ10795、PSJ10796、PSJ10798、和 PSJ10743轉(zhuǎn)化路氏乳桿菌SJ10655。在具有10微克/ml紅霉素的MRS平板上，W及在具有 10微克/ml紅霉素的LCM平板（具有1 %葡萄糖）上進(jìn)行選擇。在37C，將該些平板厭氧 賠育2天，隨后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果示于表1中。 。巧引表1 :
[0巧7]
【權(quán)利要求】
1. 親本乳桿菌菌株的一種分離的突變體，該突變體包含對(duì)編碼I型限制修飾系統(tǒng)亞基 的內(nèi)源基因的破壞。
2. 如權(quán)利要求1所述的分離的突變體，該突變體包含對(duì)編碼I型限制修飾系統(tǒng)的限制 性亞基的內(nèi)源基因的破壞或?qū)幋aI型限制修飾系統(tǒng)的特異性亞基的內(nèi)源基因的破壞。
3. 如權(quán)利要求2所述的分離的突變體，其中（a)該限制性亞基與SEQIDN0:8、SEQID NO: 16、或其成熟多肽序列具有至少60 %，例如至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、 至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性；(b)在至少 低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，編碼該限制性亞基的基因的編碼序列與SEQID N0:7或SEQIDNO: 15的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交；或（c)編碼該限制性亞基的基因的編碼序列與 SEQIDNO:7、SEQIDNO: 15、或其成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少70%、至少 75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100% 的序列一致性。
4. 如權(quán)利要求2或3所述的分離的突變體，其中該限制性亞基包括SEQIDN0:8、SEQ IDNO: 16、或其成熟多肽序列或由它們組成。
5. 如權(quán)利要求2所述的分離的突變體，其中（a)該特異性亞基與SEQIDN0:2、4、6、 12、14、或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、 至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性；(b)在至少 低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，編碼該特異性亞基的基因的編碼序列與SEQID NO: 1、3、5、11、或13的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交；或（〇)編碼該特異性亞基的基因的編碼序列與5￡〇 10勵(lì):1、3、5、11、或13、或其成熟多肽編碼序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、 至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序 列一致性。
6. 如權(quán)利要求2或6所述的分離的突變體，其中該特異性亞基包括SEQIDNO: 2、4、6、 12、14、或其成熟多肽序列或由它們組成。
7. 如權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，其中破壞發(fā)生在編碼該I型限制修 飾系統(tǒng)亞基的基因的編碼序列中。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親 本乳桿菌菌株相比，該突變體產(chǎn)生至少25 %更少（例如至少50 %更少、至少60 %更少、至少 70%更少、至少80%更少、或至少90%更少）的由破壞的基因編碼的I型限制修飾系統(tǒng)亞 基。
9. 如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，其中編碼該I型限制修飾系統(tǒng)亞基 的內(nèi)源基因被滅活。
10. 如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，該突變體進(jìn)一步包括對(duì)編碼一個(gè) 非I型限制修飾系統(tǒng)蛋白的內(nèi)源基因的破壞。
11. 如權(quán)利要求10所述的分離的突變體，其中（a)該非I型限制修飾系統(tǒng)蛋白與SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:22、或其成熟多肽序列具有至少60%，例如至少70%、至少75%、至 少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %、或100 %的序列 一致性；(b)在至少低、中、中-高、高或非常高嚴(yán)謹(jǐn)度條件下，編碼該非I型限制修飾系統(tǒng) 蛋白的基因的編碼序列與3￡〇10勵(lì) ：19或5￡〇10勵(lì):21的全長(zhǎng)互補(bǔ)鏈雜交；或（(：）編碼 該非I型限制修飾系統(tǒng)蛋白的基因的編碼序列與SEQIDNO: 19、SEQIDN0:21、或其成熟 多肽編碼序列具有至少60 %，例如至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、 至少95%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%的序列一致性。
12. 如權(quán)利要求10或11所述的分離的突變體，其中該非I型限制修飾系統(tǒng)蛋白包括 SEQIDNO: 20、SEQIDNO: 22、或其成熟多肽序列或由它們組成。
13. 如權(quán)利要求10-12中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，其中破壞發(fā)生在編碼該非I型限 制修飾系統(tǒng)蛋白的基因的編碼序列中。
14. 如權(quán)利要求10-13中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與 親本乳桿菌菌株相比，該突變體產(chǎn)生至少25 %更少（例如至少50 %更少、至少60 %更少、至 少70%更少、至少80%更少、或至少90%更少）的由破壞的基因編碼的非I型限制修飾系 統(tǒng)蛋白。
15. 如權(quán)利要求10-14中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，其中編碼該非I型限制修飾系統(tǒng) 蛋白的內(nèi)源基因被滅活。
16. 如權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與 親本乳桿菌菌株相比，該突變體具有改進(jìn)的轉(zhuǎn)化效率。
17. 如權(quán)利要求16所述的分離的突變體，其中當(dāng)在相同條件下培養(yǎng)時(shí)，與親本乳桿菌 菌株相比，使用PSJ10762、pTRGU1065、或pTRGU1073作為轉(zhuǎn)化體DNA，該突變體具有改進(jìn)的 轉(zhuǎn)化效率。
18. 如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，其中當(dāng)在相同條件下轉(zhuǎn)化并且培 養(yǎng)時(shí)，與親本乳桿菌菌株相比，該突變體能夠產(chǎn)生至少10倍（例如至少100倍、至少1000 倍、至少10000倍、或至少100000倍）更多的轉(zhuǎn)化體。
19. 如權(quán)利要求1-18中任一項(xiàng)所述的分離的突變體，其中該乳桿菌菌株選自植物乳桿 菌、食果糖乳桿菌、和路氏乳桿菌。
20. 用于獲得如權(quán)利要求1-19中任一項(xiàng)所述的分離的突變體的一種方法，該方法包 括：(a)培養(yǎng)一種親本乳桿菌菌株；(b)在（a)的親本乳桿菌菌株中，破壞編碼該I型限制修 飾系統(tǒng)亞基或非I型限制修飾系統(tǒng)蛋白的內(nèi)源基因；以及（c)分離生成自（b)的突變體菌 株。
21. 用于獲得乳桿菌轉(zhuǎn)化體的一種方法，該方法包括：(a)培養(yǎng)如權(quán)利要求1-19中任一 項(xiàng)所述的分離的乳桿菌突變體；(b)將一種異源多核苷酸轉(zhuǎn)化進(jìn)（a)的乳桿菌突變體；以及 (c)分離生成自（b)的轉(zhuǎn)化體菌株。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法，該方法進(jìn)一步包括修復(fù)對(duì)編碼該I型限制修飾系統(tǒng)亞 基或非I型限制修飾系統(tǒng)蛋白的內(nèi)源基因的破壞。
23. 通過(guò)如權(quán)利要求21或22所述的方法產(chǎn)生的一種乳桿菌轉(zhuǎn)化體。
【文檔編號(hào)】C12N15/74GK104379734SQ201380025964
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月18日
【發(fā)明者】S·T·約根森, T·B·雷蓋拉, B·克伯曼, P·B·奧爾森, B·克里斯坦森 申請(qǐng)人:諾維信公司