使用來(lái)自木質(zhì)纖維素材料的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過(guò)程的液體殘余物生產(chǎn)酶混合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用分解纖維素的微生物生產(chǎn)酶混合物的方法，其包括兩個(gè)步驟：步驟a），其為在碳質(zhì)生長(zhǎng)溶液存在的情況下在密閉反應(yīng)器中生長(zhǎng)所述微生物；步驟b），其為通過(guò)供應(yīng)碳質(zhì)生產(chǎn)溶液進(jìn)行所述酶混合物的生產(chǎn)，所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液的碳質(zhì)底物的濃度范圍為150-400g/L，所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液含有碳質(zhì)誘導(dǎo)物底物；其特征在于所述碳質(zhì)誘導(dǎo)物底物為來(lái)自木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理步驟的液體殘余物，其C5糖寡聚物是存在于所述液體殘余物中的總糖的至少1重量％，和存在于所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液中的總糖的至少0.3重量％。
【專利說(shuō)明】使用來(lái)自木質(zhì)纖維素材料的生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過(guò)程的液體殘余 物生產(chǎn)酶混合物的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及生產(chǎn)纖維素和半纖維素酶，尤其是在從纖維素或木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn) 乙醇的背景中。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 自從20世紀(jì)70年代，在水解組分多糖為可發(fā)酵糖后將木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化為乙 醇已經(jīng)稱為眾多研究的焦點(diǎn)。可以研究的實(shí)例為來(lái)自國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室（National RenewableEnergyLaboratory)的參考工作(ProcessDesignandEconomicsfor BiochemicalConversionofLignocellulosicBiomasstoEthanol,Humbird等人， NREL/TP-5100-57764,May2011)〇
[0003] 木質(zhì)纖維素材料是纖維素材料，即由多于90重量％的纖維素和/或木質(zhì)纖維素構(gòu) 成，即由纖維素、半纖維素構(gòu)成，其為基本上由戊糖類和己糖類以及木質(zhì)素構(gòu)成的多糖，其 為具有基于酚類化合物的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和高分子量的大分子。
[0004] 木材、秸桿和玉米芯是最廣泛使用的木質(zhì)纖維素材料，但其他來(lái)源，專用的林木栽 培物、產(chǎn)乙醇的糖和谷類作物的殘余物、來(lái)自造紙工業(yè)的產(chǎn)品和殘余物以及木質(zhì)纖維素材 料的轉(zhuǎn)化產(chǎn)品也可以使用。它們大部分由約35% -50%的纖維素、20%-30%的半纖維素和 15%-25%的木質(zhì)素構(gòu)成。
[0005] 生物化學(xué)轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素材料為乙醇的方法包括物理化學(xué)預(yù)處理步驟和隨后使 用酶混合物（enzymaticcocktail)進(jìn)行酶促水解的步驟，將釋放的糖進(jìn)行乙醇發(fā)酵的步驟 (乙醇發(fā)酵和酶促水解可能同時(shí)進(jìn)行)，和純化乙醇的步驟。
[0006] 酶混合物是纖維素分解酶(也稱為纖維素酶)和/或半纖維素分解酶的混合物。纖 維素分解酶具有三種主要類型的活性：內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和纖維二糖酶，其后者 也稱為β_葡萄糖苷酶。半纖維素分解酶具體具有木聚糖酶活性。
[0007] 酶促水解是有效的且在溫和條件下進(jìn)行。相反的是，酶的成本仍較高，占轉(zhuǎn)化木質(zhì) 纖維素材料為乙醇成本中的20%-50%。為此原因，已進(jìn)行大量關(guān)于降低該成本的研究：首先 通過(guò)選擇高產(chǎn)微生物和通過(guò)改進(jìn)生產(chǎn)所述酶的方法來(lái)優(yōu)化酶生產(chǎn)，隨后通過(guò)優(yōu)化預(yù)處理步 驟，通過(guò)改進(jìn)這些酶的比活性，和通過(guò)優(yōu)化酶促水解步驟的實(shí)施來(lái)降低水解中酶的量。
[0008] 在過(guò)去的幾十年中，大量研究針對(duì)于理解酶混合物的作用機(jī)制和表達(dá)。該目標(biāo)為 通過(guò)修飾微生物導(dǎo)致分泌最適合于水解木質(zhì)纖維素材料的混合物。
[0009] 最廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)酶混合物的分解纖維素的微生物是真菌里氏木霉 reesei)。在誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物例如纖維素，存在的情況下，野生菌株具有分 泌被認(rèn)為是最適合于水解纖維素的酶混合物的能力。具有對(duì)于水解木質(zhì)纖維素材料不可或 缺的特性的其他蛋白也由里氏木霉所產(chǎn)生，例如木聚糖酶。誘導(dǎo)物底物的存在對(duì)于表達(dá)纖 維素分解酶和/或半纖維素分解酶是不可或缺的。碳質(zhì)底物的性質(zhì)對(duì)酶混合物的構(gòu)成具有 相當(dāng)大的影響。對(duì)于木糖的情況正是這樣，當(dāng)木糖伴隨有碳質(zhì)誘導(dǎo)物底物諸如纖維素或乳 糖時(shí)，可以顯著改進(jìn)稱為木聚糖酶活性的活性。
[0010] 乳糖保持為酶混合物的生產(chǎn)的工業(yè)方法中最合適的底物之一；然而，其成本變化 巨大，且占大約酶成本價(jià)中的三分之一至三分之二。當(dāng)乳糖用作碳質(zhì)底物時(shí)，酶混合物生產(chǎn) 方法依賴于碳的外部來(lái)源。為此原因，使用獲自生物化學(xué)轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素材料過(guò)程的碳質(zhì) 底物構(gòu)成了重大進(jìn)步。
[0011] 專利申請(qǐng)EP1 690 944公開(kāi)了來(lái)自于衍生自預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的以單體 形式的半纖維素級(jí)分的提取物可用作用于分解纖維素的微生物生長(zhǎng)和生產(chǎn)酶的非誘導(dǎo)物 碳質(zhì)底物。在后一種情況下，必須與誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物混合以生產(chǎn)纖維素酶(乳糖或纖維二 糖)。
[0012] 專利申請(qǐng)WO09 026 716Al和WO09 0061486Al描述了使用含有用于生產(chǎn)纖維 素酶的誘導(dǎo)物糖的碳質(zhì)底物以及碳的主要來(lái)源從里氏木霉生產(chǎn)酶混合物。該申請(qǐng)公開(kāi)了 3 重量％的誘導(dǎo)物糖足以誘導(dǎo)產(chǎn)生纖維素酶。相比于其中將木糖單獨(dú)用于生產(chǎn)溶液中的實(shí) 例，纖維素酶的生產(chǎn)擴(kuò)大了多于4倍。所描述的誘導(dǎo)物糖為可能由纖維素水解產(chǎn)生的單糖、 二糖和寡糖（〇；糖）。碳的主要來(lái)源是獲自半纖維素或獲自合成木糖的包含單糖、二糖和寡 糖的總體。
[0013] 文件FR2 962 444公開(kāi)了生產(chǎn)纖維素分解酶和/或半纖維素分解酶的方法。誘 導(dǎo)物底物為葡萄糖或纖維素水解物、乳糖和木糖的混合物，或具有至少10重量％的這三組 組分的每一種的半纖維素水解物的溶液。該文件表明誘導(dǎo)物底物除上文列出的組分外，再 無(wú)任何其他糖，纖維素水解物為獲自纖維素水解的葡萄糖，且半纖維素水解物為C5糖的溶 液。
[0014] 文件EP2 371 950Al描述了基于調(diào)節(jié)溶解于培養(yǎng)基中的氧壓力的波動(dòng)而生產(chǎn)纖 維素酶的方法。該文件公開(kāi)了碳質(zhì)誘導(dǎo)物底物選自乳糖、木糖、纖維二糖、槐糖、發(fā)酵單體糖 后獲得的殘余物和/或水溶性戊糖的粗提取物，即水溶性C5糖。
[0015]出版物"CellulaseProductionbyContinuousCultureofTrichoderma reeseiRutC30usingacidhydrolysatepreparedtoretainmoreoligosaccharides forinduction"，Lo等人，BioresourceTechnology101 (2010) 717-723 教導(dǎo)了通 過(guò)由酸水解纖維素產(chǎn)生的寡糖的誘導(dǎo)，所述水解物（由C6糖寡聚物構(gòu)成）在中和之前通過(guò) Ca(OH)2溶液變?yōu)閴A性。由C6寡糖尤其是纖維二糖所起的誘導(dǎo)物作用也是已知的。
[0016] 本發(fā)明的一個(gè)目標(biāo)是提出易于獲得的誘導(dǎo)物碳的新來(lái)源，其能夠產(chǎn)生具有適合于 水解木質(zhì)纖維素材料的活性的酶混合物。相比于專利EP1 690 944,本發(fā)明要求保護(hù)還 含有寡聚物的半纖維素級(jí)分的有利用途，這意味著可以免去添加誘導(dǎo)物底物。相比于專利 W009 026716,本發(fā)明推薦使用非合成碳的單一來(lái)源，所述非合成碳的單一來(lái)源尤其適合于 酶混合物的表達(dá)，其對(duì)于待水解的生物質(zhì)的處理完全有效。本發(fā)明還使得聯(lián)產(chǎn)物能夠內(nèi)部 改進(jìn)。
[0017] 本發(fā)明的概述和優(yōu)點(diǎn) 本發(fā)明涉及通過(guò)分解纖維素的微生物生產(chǎn)酶混合物的方法，其特征在于它使用來(lái)自預(yù) 處理木質(zhì)纖維素材料的液體殘余物作為用于誘導(dǎo)產(chǎn)生酶混合物的誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物。
[0018] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是減少或免去向轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素材料的生物化學(xué)過(guò)程中添加 外部來(lái)源的碳質(zhì)底物。另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是用于生產(chǎn)酶混合物的來(lái)自所述生物化學(xué)轉(zhuǎn)化過(guò)程的液 體殘余物得到改進(jìn)。以這樣的方式改進(jìn)意味著在排出或儲(chǔ)存前需要被再處理的所產(chǎn)生的流 出液的量可以降低。
[0019] 由于含有誘導(dǎo)物寡聚物的液體殘余物得到改進(jìn)以產(chǎn)生酶混合物，因此所述混合物 的成本降低。
[0020] 本發(fā)明的方法的另一個(gè)額外的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)生尤其適合于酶促水解在生物化學(xué)轉(zhuǎn)化 過(guò)程中轉(zhuǎn)化的預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的酶混合物。具體而言，C5寡聚物對(duì)所獲的酶的纖 維素酶活性的積極作用已被發(fā)現(xiàn)。
[0021] 發(fā)明詳述 本發(fā)明是用分解纖維素的微生物生產(chǎn)酶混合物的方法，其包括兩個(gè)階段： 籲階段a)，其為在碳質(zhì)生長(zhǎng)溶液存在的情況下在密閉反應(yīng)器中生長(zhǎng)所述微生物； ?階段b)，其為通過(guò)供應(yīng)碳質(zhì)生產(chǎn)溶液(其碳質(zhì)底物的濃度范圍為150-400g/L)進(jìn)行 所述酶混合物的生產(chǎn)，所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液含有碳質(zhì)誘導(dǎo)物底物； 其特征在于所述碳質(zhì)誘導(dǎo)物底物為獲自木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理步驟的液體殘余物 (其使用時(shí)無(wú)需滅菌或調(diào)節(jié)所述液體殘余物的PH)，其C5糖寡聚物占存在于所述液體殘余物 中的總糖的至少1重量％，和占存在于所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液中的總糖的至少〇. 3重量％。
[0022] 優(yōu)選地，所述階段a)中所用的碳質(zhì)生長(zhǎng)溶液以范圍為10-90g碳質(zhì)底物/升反應(yīng) 體積的起始濃度。
[0023] 優(yōu)選地，所述預(yù)處理步驟為用硫酸水溶液預(yù)先浸漬所述木質(zhì)纖維素材料的酸水 解、酸蒸煮或蒸汽爆破（steamexplosion)。
[0024] 優(yōu)選地，所述液體殘余物使用時(shí)既不需滅菌也不需要調(diào)節(jié)所述液體殘余物的pH。 更優(yōu)選地，所述液體殘余物使用時(shí)既不需滅菌也不需要解毒或調(diào)節(jié)所述液體殘余物的pH。
[0025] 優(yōu)選地，C5糖寡聚物占所述液體殘余物中存在的總糖的1重量％ -50重量％的范 圍。
[0026] 優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物單獨(dú)使用或作為與至少一種其他非誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物 的混合物來(lái)使用。
[0027] 優(yōu)選地，所述其他非誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物(單獨(dú)地或作為混合物）選自葡萄糖、木糖和 蔗糖。
[0028] 優(yōu)選地，所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液由液體殘余物和至少一種非誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物組成，所 述非誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物(單獨(dú)地或作為混合物）選自葡萄糖、木糖和蔗糖，所述液體殘余物獲 自木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理步驟，且使用時(shí)無(wú)需滅菌或解毒或調(diào)節(jié)pH，所述液體殘余物由 C5糖寡聚物組成，由CjPC6糖單體組成，和由糖單體降解產(chǎn)物組成，其中C5糖單體占所述液 體殘余物中存在的總糖的至少1重量％，和占所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液中存在的總糖的至少〇. 3 Sfi %O
[0029] 優(yōu)選地，供應(yīng)階段b)的碳質(zhì)生產(chǎn)溶液的比流速范圍為35-65 mg碳質(zhì)底物/克微 生物/小時(shí)。
[0030] 優(yōu)選地，分解纖維素的微生物選自屬于屬木霉屬（fricAoofe/ma)、曲霉屬 (Aspergillus)、青霉屬（Penicillium)或裂裙菌屬（Schizophyllum)的真菌的菌株。
[0031] 優(yōu)選地，分解纖維素的微生物屬于里氏木霉種。
[0032] 所述用于生產(chǎn)酶混合物的方法使用深層培養(yǎng)進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)"深層培養(yǎng)"意指培養(yǎng)在 液體培養(yǎng)基中。
[0033] 本發(fā)明的用于生產(chǎn)酶混合物的方法中所用的分解纖維素的微生物為纖維素 分解真菌的菌株，例如屬于屬木霉屬曲霉屬（Aspergillus)、青霉屬 (Penicillium)或裂裙菌屬（Schizophyllum),優(yōu)選屬于里氏木霉種。最佳性能工業(yè)菌株 為屬于里氏木霉種的菌株，通過(guò)突變選擇方法進(jìn)行修飾以改進(jìn)酶混合物，諸如例如菌株IFP CL847 (法國(guó)專利FR-B-2 555 803)。通過(guò)遺傳重組技術(shù)改進(jìn)的菌株也可以使用。這些菌 株在與其生長(zhǎng)和酶的生產(chǎn)相容的條件下在攪拌、通氣的反應(yīng)器中培養(yǎng)。
[0034] 術(shù)語(yǔ)"碳質(zhì)底物"意指包含于碳質(zhì)溶液中的所有糖。
[0035] 本發(fā)明的方法的所述階段a)中使用的所述微生物的碳質(zhì)生長(zhǎng)底物為有利地包含 碳質(zhì)底物(單獨(dú)地或作為混合物使用）的含水溶液，所述碳質(zhì)底物選自可溶性工業(yè)糖，優(yōu)選 選自葡萄糖、木糖、來(lái)自木質(zhì)纖維素材料的酶水解物的糖單體的乙醇發(fā)酵后獲得的液體殘 余物和來(lái)自于獲自預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料的以單體形式的半纖維素級(jí)分的提取物。根據(jù) 其性質(zhì)，在滅菌前將所述碳質(zhì)生長(zhǎng)溶液引入密閉的反應(yīng)器中，或?qū)⑵浞珠_(kāi)地滅菌并在密閉 的反應(yīng)器滅菌后引入密閉的反應(yīng)器中。
[0036] 優(yōu)選地，所述階段a)中的所述碳質(zhì)生長(zhǎng)溶液以范圍為10-90g碳質(zhì)底物/升反應(yīng) 體積的起始濃度使用。
[0037] 優(yōu)選地，所述階段a)進(jìn)行范圍為30-70h的時(shí)期，優(yōu)選范圍為30-40h。
[0038] 優(yōu)選地，所述階段a)在4. 8的pH下和在27°C的溫度下操作。
[0039] 優(yōu)選地，所述階段a)在密閉、通氣且攪拌的反應(yīng)器中進(jìn)行。調(diào)節(jié)通氣使得獲得范圍 為0. 1-1的VVM(空氣的體積流速，Nm3/min，除以m3計(jì)的反應(yīng)體積)，優(yōu)選范圍為0. 3-0. 7， 且更優(yōu)選以獲得〇. 5的VVM。調(diào)整攪拌以獲得范圍為理論飽和的20% -80%的溶解氧的分 壓，優(yōu)選范圍為30%-50%，且更優(yōu)選為40%的值。
[0040] 生產(chǎn)本發(fā)明的所述階段b)中使用的所述微生物的碳質(zhì)溶液為包含誘導(dǎo)物碳質(zhì)底 物的含水溶液。所述誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物為獲自包含C5糖寡聚物的木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理 步驟的液體殘余物。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明，所述C5糖寡聚物占所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液中包含的總糖的至少0. 3重 量％。優(yōu)選地,所述C5糖寡聚物占所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液中包含的總糖的0. 3重量％-50重量％ 的范圍，優(yōu)選范圍為0. 3重量％ -20重量％，更優(yōu)選范圍為0. 3重量％ -10重量％，且仍更 優(yōu)選范圍為0. 3重量％ -6重量％。
[0042] 優(yōu)選地，所述誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物單獨(dú)使用或作為與至少一種其他非誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物 的混合物來(lái)使用。
[0043] 優(yōu)選地，所述其他非誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物(單獨(dú)地或作為混合物）選自非誘導(dǎo)物糖，優(yōu) 選選自葡萄糖、蔗糖和木糖。高度優(yōu)選地，所述其他碳質(zhì)底物(單獨(dú)地或作為混合物)選自葡 萄糖和蔗糖。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明的所述階段b)中使用的所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液以150-400g碳質(zhì) 底物/升碳質(zhì)生產(chǎn)溶液的濃度制備。供應(yīng)所述階段b)的碳質(zhì)生產(chǎn)溶液的比流速的范圍有利 地為35-65mg/碳質(zhì)底物/克微生物/小時(shí)，優(yōu)選35-45mg碳質(zhì)底物/克微生物/小時(shí)。
[0045] 優(yōu)選地，所述階段b)進(jìn)行至少30h或更長(zhǎng)的時(shí)期，優(yōu)選至少100h或更長(zhǎng)。
[0046] 優(yōu)選地，所述階段b)在范圍為3-5. 5的pH下和范圍為20°C_30°C的溫度下進(jìn) 行。
[0047] 優(yōu)選地，所述階段b)在通氣且攪拌的反應(yīng)器中進(jìn)行。調(diào)節(jié)通氣以獲得范圍為 0. 1-1的VVM，優(yōu)選范圍為0. 3-0. 7,且更優(yōu)選以獲得0. 5的VVM。調(diào)整攪拌以獲得范圍為 20% -80%的溶解氧的分壓，優(yōu)選范圍為30%-50%，且更優(yōu)選為40%的值。
[0048] 所述階段b)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分批補(bǔ)料和恒化器模式進(jìn)行。
[0049] 在所述階段b)中使用的碳質(zhì)生產(chǎn)溶液中用作誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物的C5糖寡聚物包含 在獲自木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理步驟的液體殘余物中。
[0050] 所述木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理步驟可以用于改進(jìn)纖維素級(jí)分對(duì)酶水解的易感性。 所述預(yù)處理步驟為物理預(yù)處理步驟，諸如例如，蒸汽爆破步驟，或化學(xué)或物理化學(xué)步驟。優(yōu) 選地，所述預(yù)處理步驟為酸或堿預(yù)處理步驟，諸如例如用堿性水溶液預(yù)先浸漬所述材料的 堿水解、堿蒸煮或蒸汽爆破。優(yōu)選地，所述預(yù)處理步驟為酸預(yù)處理步驟，優(yōu)選為用硫酸水溶 液預(yù)先浸漬所述材料的酸水解、酸蒸煮或蒸汽爆破。高度優(yōu)選地，所述預(yù)處理步驟為蒸汽爆 破。
[0051] 將來(lái)自所述預(yù)處理步驟的流出物分離為兩相：構(gòu)成固體殘余物的相和構(gòu)成液體殘 余物的相。所述分離可通過(guò)技術(shù)人員已知的任何方法獲得。作為實(shí)例，所述分離可以通過(guò) 離心、壓濾機(jī)、傾析、或任何允許液相和固相分離的其他技術(shù)手段來(lái)獲得。
[0052] 在酸預(yù)處理的情況下，技術(shù)人員隨待預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料和所用的技術(shù)而 調(diào)節(jié)操作條件(酸的量、濕度、溫度、壓力、持續(xù)時(shí)間）。例如，所述操作條件將對(duì)于芒草比對(duì) 于小麥秸桿更嚴(yán)格。這些調(diào)整旨在使得以單體形式的半纖維素完全水解，同時(shí)將降解產(chǎn) 物(尤其是糠醛、5-HMF)的形成降到最低。為此，預(yù)處理步驟還可以細(xì)分為兩個(gè)階段：釋放 C5糖寡聚物的第一階段，隨后為從釋放的寡聚物中產(chǎn)生單體的階段（ProcessDesignand EconomicsforBiochemicalConversionofLignocellulosicBiomasstoEthanol, Humbird等人，NREL/TP-5100-57764,May2011)。
[0053] 根據(jù)本發(fā)明，所述預(yù)處理步驟使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來(lái)操作，使得液體 殘余物包含C5糖寡聚物。
[0054] 為了從所述預(yù)處理步驟中獲得液體殘余物中的C5糖寡聚物，可以降低所述預(yù)處理 步驟中所用的酸的量。還可以相比于優(yōu)化的條件降低所述預(yù)處理步驟操作的溫度和/或壓 力，以僅釋放單體。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明，包含于獲自木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理步驟的所述液體殘余物中的所 述C5糖寡聚物占所述液體殘余物中存在的總糖的1重量％ -100重量％，優(yōu)選范圍為1重 量％ -50重量％，并且更優(yōu)選范圍為1重量％ -30重量％。
[0056] 獲自所述預(yù)處理步驟的包含C5糖寡聚物的所述液體殘余物用作誘導(dǎo)物碳的來(lái)源， 而無(wú)需滅菌所述液體殘余物或調(diào)節(jié)所述殘余物的pH。
[0057] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)應(yīng)于稱為"固體"的級(jí)分的預(yù)處理的木質(zhì)纖維素材料在酶 水解步驟中水解。來(lái)自該步驟的流出物隨后在酶水解物的糖單體的乙醇發(fā)酵步驟中處理。 這些處理在相同設(shè)備或在不同設(shè)備中進(jìn)行。
[0058] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)酵步驟和至少一部分水解步驟同時(shí)進(jìn)行。例如，這 通過(guò)在酶水解步驟中添加乙醇酵母來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0059] 以下實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，而不限制其范圍。
[0060] 實(shí)施例I(與本發(fā)明不一致）：在葡萄糖上生產(chǎn)酶混合物 實(shí)施例1呈現(xiàn)使用葡萄糖作為碳質(zhì)生產(chǎn)底物的培養(yǎng)。它是纖維素酶生產(chǎn)的阻遏物。該實(shí)施例導(dǎo)致酶的低產(chǎn)量。
[0061] 在機(jī)械攪拌的反應(yīng)器中產(chǎn)生酶混合物。礦物培養(yǎng)基(稱為4N)具有以下組成：Κ0Η 1.66g/L,85%H3PO42mL/L, (NH4)2SO42.8g/L, MgSO4.7H2O0.6g/L,CaCl2 0.6g/L, MnSO43. 2mg/L, ZnSO4.7H2O2. 8mg/L,CoCl2.10H2O4. 0mg/L, FeSO4.7H2O10mg/L, 玉米漿I.2g/L，消泡劑0. 5mL/L。
[0062] 液體預(yù)培養(yǎng) 通過(guò)使用濃度為30g/L的葡萄糖作為碳質(zhì)生長(zhǎng)底物預(yù)培養(yǎng)，使微生物(里氏木霉CL847菌株）生長(zhǎng)。預(yù)培養(yǎng)的礦物培養(yǎng)基為補(bǔ)充有5g/L鄰苯二甲酸鉀（以緩沖pH)的4N 培養(yǎng)基。接種物生長(zhǎng)持續(xù)3天并在30°C下在搖動(dòng)培養(yǎng)箱中進(jìn)行。如果剩余葡萄糖濃度低 于15g/L，則轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器中。
[0063] 生長(zhǎng)階段 將含有4N培養(yǎng)基的反應(yīng)器在120°C下滅菌20分鐘。將葡萄糖碳質(zhì)生長(zhǎng)底物120°C滅菌20分鐘，隨后以無(wú)菌方式加入到反應(yīng)器中，以達(dá)到30g/L的濃度。反應(yīng)器用里氏木霉 CL847菌株的液體預(yù)培養(yǎng)物接種至10% (v/v)。操作條件為27°C的溫度和4. 8的pH(使 用5.5mol/L氨水調(diào)節(jié))。通氣在0.5VVM且攪拌隨p02 (溶解氧壓）而變?cè)黾又?00-800 rpm之間，其維持在30 %。
[0064] 生產(chǎn)階段 當(dāng)反應(yīng)器的碳質(zhì)生長(zhǎng)底物耗盡時(shí)，將250g/L葡萄糖碳質(zhì)生產(chǎn)底物持續(xù)以35-45mg/g微生物/小時(shí)的流速注入，持續(xù)164小時(shí)。操作條件為：25°C的溫度和4的pH(用5. 5 mol/L的氨水調(diào)節(jié)，該后者還提供合成分泌的蛋白所必需的氮)。通過(guò)調(diào)節(jié)攪拌將溶解氧含 量維持在30%。
[0065] 通過(guò)過(guò)濾或離心分離出微生物后通過(guò)使用Lowry法和標(biāo)準(zhǔn)BSA測(cè)定胞外酶來(lái)監(jiān)測(cè) 酶的生產(chǎn)。確定的纖維素分解活性如下： ?濾紙活性（FPU:濾紙單位）以測(cè)定內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶酶混合物的總體 活性； ?芳基β-葡萄糖苷酶活性的比活性。
[0066]FPU活性在Whatmanη° 1紙（由IUPAC生物技術(shù)委員會(huì)推薦的程序)上以50g/L 的起始濃度測(cè)量；確定待分析的酶溶液的樣品（其在60分鐘內(nèi)釋放等同于2g/L的葡萄糖 (比色測(cè)定)）。濾紙活性的原理是通過(guò)DNS測(cè)定(二硝基水楊酸）（由IUPAC生物技術(shù)委員會(huì) 推薦的程序）確定獲自Whatmann° 1紙的還原的糖的量。
[0067] 待用于確定芳基β -葡萄糖苷酶活性的底物為對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷 (PNPG)。其被β-葡萄糖苷酶切割，這釋放對(duì)硝基苯酚。
[0068] 一芳基β-葡萄糖苷酶活性單位定義為每分鐘從PNPG產(chǎn)生IMmol的對(duì)硝基苯酚 所需的酶的量，并表示為IU/ml。
[0069] 比活性通過(guò)將活性(表示為IU/ml)除以蛋白濃度來(lái)獲得。它們表示為IU/mg。
[0070] 實(shí)施例1的最終醪液的分析測(cè)定產(chǎn)生以下結(jié)果：
【權(quán)利要求】
1. 用分解纖維素的微生物生產(chǎn)酶混合物的方法，其包括兩個(gè)階段： 籲階段a)，其為在碳質(zhì)生長(zhǎng)溶液存在的情況下在密閉反應(yīng)器中生長(zhǎng)所述微生物； ?階段b)，其為通過(guò)供應(yīng)碳質(zhì)生產(chǎn)溶液進(jìn)行所述酶混合物的生產(chǎn)，所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液 的碳質(zhì)底物的濃度范圍為150-400 g/L，所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液含有碳質(zhì)誘導(dǎo)物底物； 其特征在于所述碳質(zhì)誘導(dǎo)物底物為獲自木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理步驟的液體殘余物， 使用時(shí)無(wú)需滅菌或調(diào)節(jié)所述液體殘余物的PH，其C5糖寡聚物占存在于所述液體殘余物中的 總糖的至少1重量％，和占存在于所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液中的總糖的至少〇. 3重量％。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述階段a)中使用的碳質(zhì)生長(zhǎng)溶液為范圍為10-90 g碳質(zhì) 底物/升反應(yīng)體積的起始濃度。
3. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的方法，其中所述預(yù)處理步驟為用硫酸水溶液預(yù)先浸漬所 述木質(zhì)纖維素材料的酸水解、酸蒸煮或蒸汽爆破。
4. 權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述液體殘余物使用時(shí)無(wú)需滅菌或解毒，或調(diào) 節(jié)所述液體殘余物的pH。
5. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述C5糖寡聚物占所述液體殘余物中存在的總 糖的1重量％ -50重量％的范圍。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物單獨(dú)使用或作為與至少一 種其他非誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物的混合物使用。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述其他非誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物單獨(dú)地或作為混合物選自葡萄 糖、木糖和蔗糖。
8. 權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法，其中所述碳質(zhì)生產(chǎn)溶液由液體殘余物和至少一種非 誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物組成，所述非誘導(dǎo)物碳質(zhì)底物單獨(dú)地或作為混合物選自葡萄糖、木糖和蔗 糖，所述液體殘余物獲自木質(zhì)纖維素材料的預(yù)處理步驟，且使用時(shí)無(wú)需滅菌或解毒或調(diào)節(jié) pH,所述液體殘余物由C5糖寡聚物組成，由C5和C6糖單體組成，和由糖單體降解產(chǎn)物組成， 其中所述仏糖寡聚物占所述液體殘余物中存在的總糖的至少1重量％，和占所述碳質(zhì)生產(chǎn) 溶液中存在的總糖的至少〇. 3重量％。
9. 權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法，其中供應(yīng)階段b)的碳質(zhì)生產(chǎn)溶液的比流速范圍為 35-65 mg碳質(zhì)底物/克微生物/小時(shí)。
10. 權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法，其中分解纖維素的微生物選自屬于屬木 霉屬（[ricAoofe/ma)、曲霉屬青霉屬或裂裙菌屬 的真菌的菌株。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述分解纖維素的微生物屬于里氏木霉 reesei )種。
【文檔編號(hào)】C12P21/00GK104428422SQ201380031444
【公開(kāi)日】2015年3月18日 申請(qǐng)日期:2013年6月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月18日
【發(fā)明者】F.本沙巴納, S.盧雷 申請(qǐng)人:Ifp 新能源公司