用于產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)基的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)干粉細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。制備和使用通過(guò)共凍干法產(chǎn)生的混合顆粒產(chǎn)生了均質(zhì)混合的細(xì)胞培養(yǎng)基。
【專利說(shuō)明】用于產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)基的方法
[0001] 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)干粉細(xì)胞培養(yǎng)基的方法。制備和使用通過(guò)共凍干法產(chǎn)生的混 合顆粒產(chǎn)生了均質(zhì)混合的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0002] 發(fā)明背景
[0003]水溶液中的細(xì)胞培養(yǎng)基可W提供環(huán)境，其支持和維持細(xì)胞生長(zhǎng)和/或?yàn)槟承┊a(chǎn)物 的祀向產(chǎn)生提供維持期望的生理學(xué)細(xì)胞條件。
[0004] 取決于培養(yǎng)的生物的類型和/或應(yīng)當(dāng)支持的目標(biāo)生理學(xué)狀態(tài)，細(xì)胞培養(yǎng)基包含組 分（通常一百種W上的不同組分）的復(fù)雜混合物。
[0005] 增殖哺乳動(dòng)物、昆蟲(chóng)或植物細(xì)胞所需的細(xì)胞培養(yǎng)基通常比支持細(xì)菌、酵母或真菌 生長(zhǎng)的培養(yǎng)基復(fù)雜得多。
[0006] 研發(fā)的第一種細(xì)胞培養(yǎng)基由未確定成分組分，例如血漿、血清、胚胎提取物或其他 未確定成分生物提取物或蛋白腺組成。因此，隨著化學(xué)成分確知培養(yǎng)基的研發(fā)，培養(yǎng)基得到 了重大的改進(jìn)。化學(xué)成分確知培養(yǎng)基通常包含但不特定地限于氨基酸、維生素、金屬鹽、抗 氧化劑、馨合劑、生長(zhǎng)因子、緩沖液、激素，W及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種物質(zhì)。
[0007] -些細(xì)胞培養(yǎng)基提供為無(wú)菌水溶液。液體培養(yǎng)基的缺點(diǎn)是其減少的膽藏期限W及 難W運(yùn)輸和儲(chǔ)存。因此，目前許多細(xì)胞培養(yǎng)基都提供為精磨的干粉混合物。通常出于與其 他補(bǔ)充物一起溶解于水和/或水溶液W及設(shè)計(jì)的溶解狀態(tài)為目的而生產(chǎn)它們，用于為細(xì)胞 提供生長(zhǎng)和/或從所述細(xì)胞中產(chǎn)生生物藥物的基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
[0008]W粉末形式生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基是非常關(guān)鍵的。通常通過(guò)混合和研磨方法，例如球磨 法混合培養(yǎng)基的經(jīng)干燥組分來(lái)生產(chǎn)粉末培養(yǎng)基。
[0009] 在研磨方法中，在另一方面，通常很難產(chǎn)生均質(zhì)的混合物，因?yàn)樾枰獎(jiǎng)驖{多達(dá)9個(gè) 數(shù)量級(jí)差異濃度的成分。該意為需要將1千克培養(yǎng)基組合物中存在的微克W下的組分均質(zhì) 地分配在細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0010] 已經(jīng)通過(guò)凍干預(yù)先制備的液體培養(yǎng)基來(lái)試圖克服該些困難。然而，在凍干方法中， 一些培養(yǎng)基組分可能變得不溶或者在凍干后聚集，使得難W或者不能再增溶。此外，如果嘗 試通過(guò)例如凍干法該樣的方法來(lái)產(chǎn)生粉末補(bǔ)充物，許多培養(yǎng)基補(bǔ)充物，特別是血清補(bǔ)充物 例如FBS，都顯示出活性的基本損失或者表現(xiàn)出完全的失活。
[0011] 因此，存在提供用于生產(chǎn)干粉細(xì)胞培養(yǎng)基改進(jìn)方法的明確需求，該方法不具有上 述缺點(diǎn)。
[001引發(fā)明概述
[0013] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可W生產(chǎn)均質(zhì)地分配的尤其是W低量存在的組分的粉末細(xì)胞培養(yǎng)基。 該可W通過(guò)制備至少一種低豐度組分和W更高濃度在培養(yǎng)基中存在的一種載體組分的混 合顆粒來(lái)實(shí)現(xiàn)?？蒞通過(guò)共凍干法制備該些混合的顆粒，然后可W加入到組分的混合物中 來(lái)進(jìn)行研磨。
[0014] 因此，本發(fā)明涉及生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其包括
[0015] a)共凍干細(xì)胞培養(yǎng)基的至少兩種組分
[0016] b)將步驟a)中產(chǎn)生的一種或多種共凍干物與細(xì)胞培養(yǎng)基的其他組分混合
[0017]c)將步驟b)的混合物進(jìn)行研磨。
[0018] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟a)中一種組分（低豐度組分）的量小于其他組分（高 豐度組分）的量的5% (按重量計(jì)）。該意為，如果使用lOOg的高豐度組分，那么使用了小 于5g的低豐度組分。
[0019] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，高豐度組分是氯化軸（化C1)、氯化鐘化C1)、氯化巧 (CaCg、硫酸鎮(zhèn)（M拆〇4)或氯化鎮(zhèn)（MgCg。
[0020] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在步驟a)中，通過(guò)產(chǎn)生組分的水溶液、冷凍混合物 并在減壓下去除液體來(lái)進(jìn)行共凍干。
[0021] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在盤(pán)擊式研磨機(jī)（jetmill)、菲茲研磨機(jī)（fitz mill)或噴射式研磨機(jī)（jetmill)中研磨來(lái)自步驟b)的混合物。
[0022] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在研磨之前將來(lái)自步驟b)的混合物冷卻至0CW下 的溫度。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)分別共凍干細(xì)胞培養(yǎng)基的至少兩種組分，來(lái)產(chǎn)生兩種 或多種不同的共凍干物。
[0024] 本發(fā)明還涉及通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的粉末細(xì)胞培養(yǎng)基。
[00巧]本發(fā)明還涉及包含一種或多種共凍干物的粉末細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0026]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，粉末細(xì)胞培養(yǎng)基包含兩種或多種共凍干物。
[0027] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在至少一種共凍干物中，至少一種組分的量小于至少一種 其他組分的量的1%。
[0028] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一種共凍干物包含氯化軸（化C1)、氯化鐘 化C1)、氯化巧（CaCg、氯化鎮(zhèn)（MgCg或硫酸鎮(zhèn)（M拆〇4)。
[002引發(fā)明描述
[0030] 圖1顯示了與其他培養(yǎng)基比較，使用本發(fā)明培養(yǎng)基達(dá)到的CH0S細(xì)胞的完整存活 的細(xì)胞密度。其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)于實(shí)施例3。
[0031] 圖2顯示了與其他培養(yǎng)基比較，使用本發(fā)明培養(yǎng)基達(dá)到的表達(dá)的單克隆抗體體積 滴度。其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)于實(shí)施例3。
[0032] 圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明方法產(chǎn)生的H批細(xì)胞培養(yǎng)基的粒度分布。其他細(xì)節(jié)可見(jiàn)于 實(shí)施例3。
[0033] 本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基是維持和/或支持細(xì)胞體外生長(zhǎng)和/或支持特定生理學(xué)狀態(tài) 的組分的任意混合物。其可W是復(fù)雜培養(yǎng)基或者化學(xué)成分確知培養(yǎng)基。細(xì)胞培養(yǎng)基可W包 含對(duì)于維持和/或支持細(xì)胞體外生長(zhǎng)所必須的全部組分或者僅部分組分，W使可W分別加 入其他組分。本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基的實(shí)例是包含對(duì)于維持和/或支持細(xì)胞體外生長(zhǎng)所必須的 全部組分、培養(yǎng)基補(bǔ)充物或養(yǎng)料（feeds)的完全培養(yǎng)基（化11medium)。在優(yōu)選的實(shí)施方案 中，細(xì)胞培養(yǎng)基是完全培養(yǎng)基。
[0034] 通常，將本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基用于在生物反應(yīng)器中維持和/或支持細(xì)胞生長(zhǎng)和/或 支持特定的生理學(xué)狀態(tài)。
[00巧]哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是維持和/或支持哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外生長(zhǎng)的組分的混合物。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例是人或動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選地C冊(cè)細(xì)胞、COS細(xì)胞、IVER0細(xì)胞、BHK細(xì)胞、 AK-1細(xì)胞、SP2/0細(xì)胞、L5. 1細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞或人細(xì)胞。
[0036] 化學(xué)成分確知細(xì)胞培養(yǎng)基是不含任何在未確定成分物質(zhì)的細(xì)胞培養(yǎng)基。該意為在 培養(yǎng)基中所使用的全部化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)組成都是已知的?；瘜W(xué)成分確知培養(yǎng)基不含任何酵 母、動(dòng)物或植物組織；它們不含飼養(yǎng)細(xì)胞、血清、提取物或消化物或者用化學(xué)方法未完全確 定成分的蛋白質(zhì)引入培養(yǎng)基的其他組分?；瘜W(xué)成分未確知或用化學(xué)方法未完全確定成分的 組分是那些化學(xué)組成或結(jié)構(gòu)未知的組分，其存在于多種組合物中或者與評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)如白蛋 白或酪蛋白的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)比較，該些組成使用大量的實(shí)驗(yàn)工作僅可W進(jìn)行定義。
[0037] 粉末細(xì)胞培養(yǎng)基是由研磨方法產(chǎn)生的細(xì)胞培養(yǎng)基。該意為粉末細(xì)胞培養(yǎng)基是干 的、顆粒培養(yǎng)基-非液體培養(yǎng)基。
[0038]使用本發(fā)明培養(yǎng)基待培養(yǎng)的細(xì)胞可W是原核細(xì)胞如細(xì)菌細(xì)胞或真核細(xì)胞如植物 或動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞可W是正常細(xì)胞、永生化細(xì)胞、疾病細(xì)胞、轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、突變的細(xì)胞、體細(xì) 胞、生殖細(xì)胞、干細(xì)胞、前體細(xì)胞或胚胎細(xì)胞，所述細(xì)胞都可W是已建立的或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系 或者獲自天然來(lái)源。
[0039] 顆粒的大小意為顆粒的平均直徑。顆粒直徑在娃油中通過(guò)激光散射測(cè)定。
[0040] 本發(fā)明凍干法是冷凍干燥法，其包括冷凍物質(zhì)，然后降低圍壓，W允許物質(zhì)中凍結(jié) 的水直接從固相升華成氣相。
[0041] 如本文中所用，"共凍干的"或"共凍干物"指通過(guò)凍干、冷凍干燥或真空干燥同一 容器的溶液中一種W上化合物得到的產(chǎn)物。例如，可W在同一容器中合并兩種溶液，并將得 到的合并溶液一起凍干，從而同時(shí)凍干溶液中的組分。備選地，可W將兩種或兩種W上組分 (也稱為培養(yǎng)基組分）溶解于同一液體，然后一起凍干。得到的該共凍干的產(chǎn)物是固體物質(zhì) 組成的共凍干物，其包含已經(jīng)共凍干的全部組分的混合物。
[0042]通過(guò)用惰性氣體填充各個(gè)容器或裝置，產(chǎn)生惰性氣氛。合適的惰性氣體是稀有氣 體如氮?dú)饣騼?yōu)選地氮?dú)?。該些惰性氣體是沒(méi)有活性的，并且可W防止不期望的化學(xué)反應(yīng)發(fā) 生。在本發(fā)明方法中，產(chǎn)生惰性氣氛意為例如通過(guò)引入液氮或氮?dú)?，使氧氣的濃度降低?10% (v/v)絕對(duì)值W下。
[0043] 不同類型的研磨機(jī)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
[0044] 盤(pán)擊式研磨機(jī)，也稱為離也沖擊研磨機(jī)憑借高速旋轉(zhuǎn)的輪盤(pán)上突出的螺栓提供斷 裂能來(lái)粉碎固體。盤(pán)擊式研磨機(jī)例如由MunsonMachinery(美國(guó)）、PremiumPulman(印 度）或Sturtevant(美國(guó)）銷(xiāo)售。
[0045] 噴射式研磨機(jī)使用壓縮氣體來(lái)加速顆粒，使得它們?cè)诩庸な抑邢嗷プ矒?。噴射?研磨機(jī)例如由S^devant(美國(guó)）或PMT(澳大利亞）銷(xiāo)售。
[0046]由Fitzpatrick(美國(guó)）銷(xiāo)售的菲茲研磨機(jī)使用具有刀片的轉(zhuǎn)輪用于研磨。
[0047] 連續(xù)運(yùn)行的方法是不分批運(yùn)行的方法。如果研磨方法是連續(xù)運(yùn)行的，其意為在一 定時(shí)間，培養(yǎng)基成分是恒定地且穩(wěn)定地注入研磨機(jī)中的。
[0048] 根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的細(xì)胞培養(yǎng)基通常包含至少一種或多種糖組分、一種或多種 氨基酸、一種或多種維生素或維生素原、一種或多種鹽、一種或多種緩沖組分、一種或多種 輔因子W及一種或多種核酸組分。
[0049] 培養(yǎng)基還可W包含丙麗酸軸、膜島素、植物蛋白、脂肪酸和/或脂肪酸衍生物和/ 或普朗尼克酸（pluronicacid)和/或表面活性組分如化學(xué)制備的非離子表面活性劑。合 適的非離子表面活性劑的實(shí)例是例如可從BASF,德國(guó)，在商標(biāo)名pluronic⑧下得到的W伯 輕基結(jié)尾的雙功能嵌段共聚物表面活性劑，也稱為泊洛沙姆。
[0050] 糖組分都是單糖或二糖，如葡萄糖、半乳糖、核糖或果糖（單糖的實(shí)例）或者藏糖、 乳糖或麥芽糖（二糖的實(shí)例）。
[0051] 本發(fā)明氨基酸的實(shí)例是蛋白質(zhì)來(lái)源（proteinogenic)的氨基酸，尤其是必需氨基 酸，亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和額氨酸，W及非蛋白 質(zhì)來(lái)源的氨基酸如D-氨基酸。
[0052]維生素的實(shí)例是維生素A(視黃醇、視黃酵、多種維生素A和4種類胡蘿h素）、維 生素B1 (硫胺素）、維生素B2 (核黃素）、維生素B3 (煙酸、煙醜胺）、維生素B5 (泛酸）、維 生素B6(化唆醇、化唆胺、化唆酵）、維生素B7(生物素）、維生素B9(葉酸、亞葉酸）、維生 素B12(氯鉆氨素、輕鉆胺素、甲基鉆胺素）、維生素C(抗壞血酸）、維生素D(麥角巧化醇、 膽巧化醇）、維生素E(生育酷、生育H帰酷）和維生素K(葉綠釀、甲基蔡釀），還包括維生 素原。
[0053]鹽的實(shí)例是包含無(wú)機(jī)離子如碳酸氨根、巧、氯、鎮(zhèn)、磯、鐘和軸或者痕量元素如Co、 〇1古古6、]?11、]\1〇、化、56、51、化、81、￥和化的組分。實(shí)例為五水合硫酸銅（11)((：此〇4.5&0)、 氯化軸（化C1)、氯化巧（CaCl2 ? 2&0)、氯化鐘化C1)、硫酸鐵（III)、磯酸二氨軸（NaH2P〇4)、 無(wú)水硫酸鎮(zhèn)（M拆〇4)、無(wú)水磯酸氨二軸（sodiumphosphatedibasicanhy化OUS)(化2冊(cè)〇4)、 六水合氯化鎮(zhèn)（MgCl2 ? 6&0)、走水合硫酸鋒。
[0054]緩沖劑的實(shí)例是C〇2/肥化（碳酸鹽）、磯酸鹽、肥陽(yáng)S、PI陽(yáng)S、ACES、邸S、TES、MOPS和TRIS。
[00巧]輔因子的實(shí)例是硫胺素衍生物、生物素、維生素C、NAD/NADP、鉆胺素、黃素單核巧 酸及衍生物、谷脫甘膚、血紅素核巧酸磯酸及衍生物。
[0056] 根據(jù)本發(fā)明，核酸組分是核堿基如胞嚼巧、鳥(niǎo)嘿嶺、腺嘿嶺、胸腺嚼巧或尿嚼巧、核 巧酸如胞巧、尿巧、腺巧、鳥(niǎo)巧和胸巧，W及核巧酸如腺巧一磯酸或腺巧二磯酸或腺巧H磯 酸。
[0057] 根據(jù)本發(fā)明，冷凍意為冷卻至0CW下的溫度。
[0058] 本發(fā)明的要點(diǎn)是通過(guò)研磨提供粉末細(xì)胞培養(yǎng)基。研磨是非常簡(jiǎn)單且可靠的，因此 是生產(chǎn)粉末細(xì)胞培養(yǎng)基的有利方式。到目前為止，研磨的主要缺點(diǎn)是不能有效分配低豐度 組分?？蒞容易地理解，低豐度組分（其中將僅一種很少的結(jié)晶加入到1千克的混合物中） 或者更多的其他組分很難均質(zhì)地分配到研磨的粉末細(xì)胞培養(yǎng)基中。
[0059] 本發(fā)明提供了容易且可靠的改進(jìn)。將細(xì)胞培養(yǎng)基的一種或多種低豐度組分與用作 載體的細(xì)胞培養(yǎng)基的一種或多種優(yōu)選地的高豐度組分共凍干。由于共凍干，低豐度組分均 質(zhì)地分配到得到的固體共凍干物中。由于共凍干物的大部分質(zhì)量由高豐度組分產(chǎn)生，所W 與純的低豐度組分比較，高豐度組分可更大的量加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，因此可W容易 地測(cè)量，并且可W通過(guò)研磨更均質(zhì)地分配到得到的培養(yǎng)基中。
[0060]低豐度組分是那些在粉末細(xì)胞培養(yǎng)基中低于1%，優(yōu)選地低于0.1% (干粉末培養(yǎng) 基中的重量百分比）存在的組分。
[0061] 高豐度組分是那些在粉末細(xì)胞培養(yǎng)基中按重量計(jì)高于5%，優(yōu)選地高于10%(干 粉末培養(yǎng)基中的重量百分比）存在的組分。
[0062]低豐度細(xì)胞培養(yǎng)基組分的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。取決于細(xì)胞培養(yǎng)基的類 型，它們可w是不同的。一般的實(shí)例是：
[0063] 錫或錫鹽、猛或猛鹽、媒或媒鹽、饑或饑鹽、領(lǐng)或領(lǐng)鹽、鋼或鋼鹽、銅或銅鹽、砸或亞 砸酸鹽、生物素和娃酸鹽（metasilicate)，W及包括一種或多種上述元素的其他化學(xué)化合 物。低豐度細(xì)胞培養(yǎng)基組分或包含低豐度細(xì)胞培養(yǎng)基組分的化學(xué)組分的實(shí)例是：
[0064] 亞砸酸軸 [006引 亞砸酸
[0066] 醋酸頓
[0067] 二氧化錯(cuò) [006引楓化鐘
[0069] 硝酸銀
[0070] 二氯H氧化二鉛8&0 [00川氯化鉛，6&0
[00刮偏饑酸饋 [0073] 鋼酸饋，化0
[0074] 氯化領(lǐng)，無(wú)水
[0075]氯化鉛，6&0
[0076]氯化鉆，6&0
[0077] 硫酸猛，&〇
[0078] 硫酸觀6&0
[0079] 漠化鐘
[0080] 氯化頌
[0081] 氯化亞錫，2&0
[0082] 在本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基中通常存在的痕量元素W及由此得到的低豐度組分是例如 W亞砸酸軸或亞砸酸的形式存在的砸。
[0083] 高豐度細(xì)胞培養(yǎng)基組分的實(shí)例是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。取決于細(xì)胞培養(yǎng)基的類 型，它們可W是不同的。一般的實(shí)例是：
[0084] 葡萄糖及其他糖組分或鹽如氯化軸、氯化鐘、氯化巧（CaCl2. 2&0)、氯化鎮(zhèn)（MgCg 或硫酸鎮(zhèn)（M拆〇4)。優(yōu)選的是鹽，特別優(yōu)選的是氯化軸。
[0085] 優(yōu)選地通過(guò)將至少一種低豐度組分與至少一種高豐度組分共凍干。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，將一種低豐度組分與一種高豐度組分共凍干。
[0086] 進(jìn)行共凍干的低豐度組分的量少于高豐度組分的量。優(yōu)選地，低豐度組分的量少 于高豐度組分的量的5%。該意為如果使用lOOg的高豐度組分，那么使用小于5g的低豐度 組分。由于低豐度組分可鹽的形式存在，其中僅鹽的化學(xué)組分部分是細(xì)胞生長(zhǎng)所需的 低豐度組分，所W上文計(jì)算和給出的量與細(xì)胞生長(zhǎng)所需的低豐度化學(xué)組分的純質(zhì)量相關(guān)。 例如，所使用的組分為水合硫酸領(lǐng)（3CdS〇4X8H2〇)，但領(lǐng)是細(xì)胞生長(zhǎng)所需的低豐度組分。該 意為水合硫酸領(lǐng)的分子量為769. 51g/mol，而領(lǐng)的分子量為337. 23g/mol。因此，技術(shù)人員 應(yīng)當(dāng)基于所述組分中存在的領(lǐng)的百分比來(lái)計(jì)算所需的低豐度組分的量。
[0087] 對(duì)于共凍干，在第一步中，將待共凍干的全部組分溶解在溶劑中。
[0088] 可W將組分溶解在一種溶劑中。備選地，可W將每一組分溶解在分離的溶劑中，然 后將得到的不同組分的兩種或多種溶液混合。通常，待混合的全部溶液具有相同的溶劑。
[0089] 合適的溶劑是其中全部組分都是可溶的那些溶劑。合適的溶劑的實(shí)例是有機(jī)溶劑 或水或其混合物。優(yōu)選地是水。
[0090] -旦選擇了溶劑，并且已經(jīng)溶解了組分，那么冷凍得到的混合物并凍干至干燥。有 時(shí)，將其他的溶劑加入到混合物中，W協(xié)助凍干。通常，凍干在-2(TCW下，優(yōu)選地-8(TC左 右的溫度進(jìn)行。通常通過(guò)應(yīng)用減壓來(lái)去除液體?？蓪⒌玫降墓矁龈晌锓Q為混合顆粒或混合 固體。
[0091] 然后，優(yōu)選地例如在球磨機(jī)中研磨混合固體，W產(chǎn)生同質(zhì)大小的顆粒。得到的顆粒 通常具有200ymW下的粒度。優(yōu)選地，粒度低于100ym。有利的粒度在15ym至100ym 之間。
[0092] 然后，將研磨的共凍干物進(jìn)行痕量元素定量，W測(cè)定共凍干物中低豐度組分的濃 度。根據(jù)需要，可W通過(guò)混合更多的高豐度組分來(lái)降低低豐度組分的濃度。
[0093] 然后可W將具有確定濃度的低豐度組分的最終共凍干物儲(chǔ)存或者用于生產(chǎn)細(xì)胞 培養(yǎng)基。
[0094] 對(duì)于后者，將合適量的共凍干物與細(xì)胞培養(yǎng)基的其他組分混合。還有可能產(chǎn)生兩 種或兩種W上的共凍干物，并將兩種或兩種W上的共凍干物與細(xì)胞培養(yǎng)基的其他組分混 合。組分的混合對(duì)于通過(guò)研磨生產(chǎn)干粉細(xì)胞培養(yǎng)基領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的。優(yōu)選地， 徹底混合全部組分，W使混合物的全部部分具有幾乎相同的組成。就同質(zhì)的細(xì)胞生長(zhǎng)而言， 組合物的均勻度越高，得到的培養(yǎng)基的質(zhì)量越好。
[0095] 可W使用適合于生產(chǎn)粉末細(xì)胞培養(yǎng)基的任何類型的研磨機(jī)進(jìn)行研磨。一般的實(shí)例 是球磨機(jī)、菲茲研磨機(jī)或噴射式研磨機(jī)，非常優(yōu)選的是盤(pán)擊式研磨機(jī)。
[0096] 本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉如何運(yùn)行此類研磨機(jī)。
[0097] 具有約40cm的視盤(pán)直徑的大規(guī)模研磨機(jī)是例如W1-6500轉(zhuǎn)/分鐘（在盤(pán)擊式研 磨機(jī)的情況下）運(yùn)行的研磨機(jī)，優(yōu)選地1-3000轉(zhuǎn)/分鐘運(yùn)行的研磨機(jī)。
[009引研磨可W在產(chǎn)生具有10至300ym之間，最優(yōu)選地25至100ym之間粒度的粉末 的標(biāo)準(zhǔn)研磨條件下進(jìn)行。
[009引優(yōu)選地，進(jìn)行研磨的混合物的全部組分都是干的。該意為，如果它們包含水，那么 它們僅包含結(jié)晶水，而且按重量計(jì)不會(huì)多于10%，優(yōu)選地不多于5%，最優(yōu)選地不多于2% 的非結(jié)合水或者未配位的（uncoordinated)水分子。通過(guò)研磨該干組分得到的培養(yǎng)基也稱 為干粉細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0100] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在惰性氣氛中進(jìn)行研磨。優(yōu)選的惰性保護(hù)氣體是氮?dú)狻?br> [0101] 在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在研磨前冷凍混合物的全部組分?？蒞通過(guò)確保成 分冷卻至0CW下和最優(yōu)選地-2(TCW下的溫度的任何方法進(jìn)行研磨前成分的冷凍。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，用液氮進(jìn)行冷凍。該意指使用液氮處理成分，例如在引入到研磨機(jī)之前， 通過(guò)將液氮灌注到儲(chǔ)存成分的容器中。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該容器是給料機(jī)。如果容器 是給料機(jī)，那么優(yōu)選地在給料機(jī)引入成分一側(cè)或者靠近給料機(jī)引入成分一側(cè)引入液氮。
[0102] 通常，用液氮處理成分2砂至20砂。
[0103] 優(yōu)選地，進(jìn)行成分的冷卻，W使進(jìn)入研磨機(jī)的全部成分都處于0CW下，最優(yōu)選 地-2(TCW下的溫度。
[0104] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將全部成分加入到容器中，從該容器中將混合物轉(zhuǎn)移到給 料機(jī)，最優(yōu)選地劑量螺旋給料機(jī)。在給料機(jī)中，取決于給料機(jī)的類型，有時(shí)進(jìn)一步混合并另 外冷卻成分。然后，將冷凍的混合物從給料機(jī)轉(zhuǎn)移到研磨機(jī)中，W使在研磨機(jī)中研磨的混合 物優(yōu)選地仍具有〇°CW下，更優(yōu)選地-2(TCW下的溫度。
[0105] 通常，混合時(shí)間（意為成分的混合物在給料機(jī)中的停留時(shí)間）在1分鐘W上，優(yōu)選 地在15至60分鐘之間。
[0106] 計(jì)量螺旋給料機(jī)也稱為劑量潤(rùn)形輪（dosagesnail)，通常W10至200轉(zhuǎn)/分鐘的 速度運(yùn)行，優(yōu)選地W40至60轉(zhuǎn)/分鐘運(yùn)行。
[0107] 通常，研磨機(jī)的溫度保持在-50至+3CTC。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，溫度保持在1(TC 左右。
[010引研磨期間氧水平優(yōu)選地低于10% (v/v)。
[0109] 可W例如分批地或者連續(xù)地運(yùn)行該方法。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)在一段時(shí)間， 將成分的混合物持續(xù)地填充到用于冷卻的給料機(jī)中，并將冷卻的混合物從給料機(jī)持續(xù)地填 充到研磨機(jī)中，來(lái)連續(xù)地進(jìn)行本發(fā)明方法。
[0110] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與其他研磨方法相反，即使一種或多種低豐度組分W每千克細(xì)胞培養(yǎng) 基小于1yg的量存在的情況下，本發(fā)明方法也提供均質(zhì)的混合物。
[0111] 本發(fā)明還涉及包含至少一種共凍干物的干細(xì)胞培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可通過(guò)本發(fā)明方 法獲得。
[0112] 通常，共凍干物是一種低豐度和一種高豐度組分的共凍干物。
[0113] 優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)基包含1至10種不同的共凍干物。
[0114] 對(duì)于研磨的粉末培養(yǎng)基的使用，將溶劑，優(yōu)選地水（最特別地蒸觸水和/或去離子 水或純水或注射用水）或者含水緩沖液加入到培養(yǎng)基中，并混合組分直到培養(yǎng)基完全溶解 于溶劑中。
[0115] 溶劑還可W包含鹽、提供1. 0-10. 0的抑的可溶性酸或堿離子、穩(wěn)定劑、表面活性 齊U、防腐劑，W及醇或其他極性有機(jī)溶劑。
[0116] 還可W將其他物質(zhì)如用于調(diào)整抑的緩沖物質(zhì)、胎牛血清、糖等加入到細(xì)胞培養(yǎng)基 和溶劑的混合物中。然后，將得到的液體細(xì)胞培養(yǎng)基與待培養(yǎng)或維持的細(xì)胞接觸。
[0117] 因此，本發(fā)明還涉及培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括
[0118] a)提供根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基
[0119] b)將所述細(xì)胞培養(yǎng)基與水或含水緩沖液混合
[0120] C)在生物反應(yīng)器中將待培養(yǎng)的細(xì)胞與步驟b)的細(xì)胞培養(yǎng)基混合
[0121] d)培養(yǎng)步驟C)的混合物。
[0122] 生物反應(yīng)器是其中可W培養(yǎng)基細(xì)胞的任何容器、器皿或儲(chǔ)罐。培養(yǎng)通常在合適的 條件如合適的溫度等下進(jìn)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉用于支持或維持細(xì)胞生長(zhǎng)/培養(yǎng)的合適 培養(yǎng)條件。
[0123] 通過(guò)將共凍干物用于培養(yǎng)基的生產(chǎn)，痕量元素（低豐度組分）的整體量仍與配方 中所述的量保持一致，但由于低豐度組分與載體鹽組合，所W在更大量的物質(zhì)W及混合的 低豐度組分中，其重量的精確度顯著更高了。
[0124] 還通過(guò)W下附圖和實(shí)施例進(jìn)行了進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明，但本發(fā)明不受附圖和實(shí)施 例的限制。
[0125] 將上文和下文引用的全部申請(qǐng)、專利和出版物W及相應(yīng)的在2012年6月15日提 交的EP申請(qǐng)EP12004517. 4的全部公開(kāi)并入本文作為參考。 實(shí)施例
[0126]W下實(shí)施例表示了本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用。
[0127] 1.共凍干物的制備 [012引
【權(quán)利要求】
1. 生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)基的方法，其包括： a) 共凍干所述細(xì)胞培養(yǎng)基的至少兩種組分 b) 將所述步驟a)產(chǎn)生的一種或多種共凍干物與所述細(xì)胞培養(yǎng)基的其他組分混合 c) 將所述步驟b)的混合物進(jìn)行研磨。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述步驟a)中至少一種組分，即低豐度組分的 量以重量計(jì)小于至少一種其他組分，即高豐度組分的量的5%。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于所述高豐度組分是氯化鈉（NaCl)、氯化鉀 (KC1)、氯化鈣（CaCl2)、氯化鎂（MgCl2)或硫酸鎂（MgS04)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其特征在于在所述步驟a)中通過(guò)產(chǎn)生所述組 分的水溶液、冷凍所述混合物并在減壓下去除液體來(lái)進(jìn)行所述共凍干。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其特征在于在盤(pán)擊式研磨機(jī)、菲茲研磨機(jī)或噴 射式研磨機(jī)中研磨來(lái)自所述步驟b)的混合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其特征在于在研磨之前，將由所述步驟b)產(chǎn) 生的混合物冷卻至〇°C以下的溫度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)的方法，其特征在于在所述步驟a)中，通過(guò)分別共凍 干所述細(xì)胞培養(yǎng)基的至少兩種組分，來(lái)產(chǎn)生兩種或多種不同的共凍干物。
8. 包含一種或多種共凍干物的粉末細(xì)胞培養(yǎng)基。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8的粉末細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于包含兩種或多種共凍干物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9的粉末細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于在所述至少一種共凍干物中， 至少一種組分的量小于至少一種其他組分的量的1%。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的粉末細(xì)胞培養(yǎng)基，其特征在于所述至少一種共凍 干物包含氯化鈉（NaCl)、氯化鉀（KC1)、氯化鈣（CaCl2)、氯化鎂（MgCl2)或硫酸鎂（MgS0 4)。
12. 培養(yǎng)細(xì)胞的方法，其包括： a) 提供根據(jù)權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)的細(xì)胞培養(yǎng)基 b) 將所述細(xì)胞培養(yǎng)基與水或含水緩沖液混合 c) 在生物反應(yīng)器中將待培養(yǎng)的所述細(xì)胞與所述步驟b)的細(xì)胞培養(yǎng)基混合 d) 培養(yǎng)所述步驟c)的混合物。
【文檔編號(hào)】C12N5/02GK104395459SQ201380031513
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2013年5月17日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月15日
【發(fā)明者】J·馮哈根 申請(qǐng)人:默克專利有限公司