哺乳動(dòng)物細(xì)胞中使用獨(dú)特的高密度生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基與表達(dá)增強(qiáng)劑對(duì)的高產(chǎn)量瞬時(shí)表達(dá)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明大體上是針對(duì)適用于將大分子和化合物(例如核酸分子)引入到細(xì)胞(例如真核細(xì)胞)中的細(xì)胞培養(yǎng)基(尤其是無(wú)血清、非動(dòng)物來(lái)源和/或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基)。根據(jù)本發(fā)明，所述引入可以在所述培養(yǎng)基存在下進(jìn)行。含有所述經(jīng)引入的物質(zhì)的細(xì)胞可以接著在所述培養(yǎng)基中加以培養(yǎng)，且所述經(jīng)引入的物質(zhì)對(duì)所述細(xì)胞的作用可以經(jīng)測(cè)量或測(cè)定。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明允許將核酸分子(例如載體)引入到細(xì)胞(尤其真核細(xì)胞)中以及在所述細(xì)胞中表達(dá)由所述核酸分子編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明避免了每次用所述細(xì)胞執(zhí)行不同程序(例如培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞)時(shí)更換所述細(xì)胞培養(yǎng)基的需要。本發(fā)明還涉及適用于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染細(xì)胞的組合物和試劑盒。
【專利說(shuō)明】晡乳動(dòng)物細(xì)胞中使用獨(dú)特的高密度生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基與表 達(dá)增強(qiáng)劑對(duì)的高產(chǎn)量瞬時(shí)表達(dá)
[0001]【相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用】
[0002] 本申請(qǐng)根據(jù)35 U.S.C. §119(e)要求2012年5月2日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第 61/641，864號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其與本申請(qǐng)共同擁有且其全部?jī)?nèi)容特此明確以引用的方式并入， 就如同在本文中完全闡述般。 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0003] 本發(fā)明大體上涉及轉(zhuǎn)染和細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明提供一種適于在培養(yǎng) 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)量表達(dá)重組蛋白的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞 中高產(chǎn)量表達(dá)重組蛋白的系統(tǒng)和方法。 【【背景技術(shù)】】
[0004] 細(xì)胞培養(yǎng)基提供在受控制的人造和體外環(huán)境中維持和生長(zhǎng)細(xì)胞所必需的營(yíng)養(yǎng)物。 細(xì)胞培養(yǎng)基的特征和配方取決于具體細(xì)胞需求而改變。重要的參數(shù)包括滲透壓摩爾濃度、 PH和營(yíng)養(yǎng)物組成。
[0005] 細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)配物在文獻(xiàn)中已有充分記載且大量培養(yǎng)基是可商購(gòu)的。在 早期細(xì)胞培養(yǎng)工作中，培養(yǎng)基調(diào)配物是基于血液的化學(xué)組成和物理化學(xué)特性（例如 滲透壓摩爾濃度、pH等），且被稱為"生理溶液"（林格S. (Ringer，S.)，生理學(xué)雜志 (J. Physiol. )3:380-393 (1880);威茅斯 C. (Waymouth，C.)，培養(yǎng)物中的細(xì)胞和組織（Cells and Tissues in Culture),第 1卷，學(xué)術(shù)出版社（Academic Press),倫敦（London),第 99-142頁(yè)（1965)中；威茅斯C.，體外（In Vitro) 6:109-127 (1970))。然而，哺乳動(dòng)物身體 的不同組織中的細(xì)胞暴露于在氧氣/二氧化碳分壓以及營(yíng)養(yǎng)物、維生素和微量元素的濃度 方面不同的微環(huán)境；因此，成功體外培養(yǎng)不同細(xì)胞類型可能需要使用不同培養(yǎng)基調(diào)配物。細(xì) 胞培養(yǎng)基的典型組分包括氨基酸、有機(jī)和無(wú)機(jī)鹽、維生素、微量金屬、糖、脂質(zhì)和核酸，其類 型和量可能取決于給定細(xì)胞或組織類型的具體需求而改變。
[0006] 培養(yǎng)基調(diào)配物已用于培育多種細(xì)胞類型，包括動(dòng)物、植物和細(xì)菌細(xì)胞。經(jīng)培育的細(xì) 胞具有許多用途，包括研究生理過(guò)程以及產(chǎn)生有用的生物物質(zhì)。所述有用的產(chǎn)物的實(shí)例包 括單克隆抗體、激素、生長(zhǎng)因子、酶等。所述產(chǎn)物具有許多商業(yè)和治療性應(yīng)用，并且，隨著重 組DNA技術(shù)的出現(xiàn)，細(xì)胞可以經(jīng)工程改造以產(chǎn)生大量的這些產(chǎn)物。經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞還常規(guī)地 用于可以用作載體和/或疫苗的病毒的分離、鑒別和生長(zhǎng)。因此，能夠體外培育細(xì)胞不僅對(duì) 于研究細(xì)胞生理學(xué)來(lái)說(shuō)很重要，而且還是產(chǎn)生不可另外通過(guò)有成本效益的手段獲得的有用 物質(zhì)所必需的。
[0007] 在已使用體外細(xì)胞培養(yǎng)基生長(zhǎng)的各種細(xì)胞類型之中，特別令人感興趣的是來(lái)源于 上皮的細(xì)胞。上皮內(nèi)襯于高等生物體的器官和腺體的內(nèi)和外表面。由于此定位處于環(huán)境與 生物體之間的外部界面（例如皮膚）或處于器官與間質(zhì)間隙之間的內(nèi)部界面（例如腸粘膜 內(nèi)襯），故上皮在維持內(nèi)穩(wěn)定方面具有主要作用。上皮例如通過(guò)調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物和廢棄物的運(yùn)輸 和通透性來(lái)執(zhí)行此功能（弗瑞旭尼R. I. (Freshney, R. I.)，上皮細(xì)胞的培養(yǎng)（Culture of Epithelial Cells),弗瑞旭尼 R. I.編，紐約：威立-利斯公司（New York:Wiley_Liss), 第 1-23 頁(yè)（1992)中）。
[0008] 構(gòu)成上皮的細(xì)胞一般被稱為上皮細(xì)胞。這些細(xì)胞可以多層形式存在，如在皮膚中， 或以單層形式存在，如在肺泡中。如可能所預(yù)期的，上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、功能和生理學(xué)通常是 組織特異性的。舉例來(lái)說(shuō)，皮膚的表皮上皮細(xì)胞被組織為成層的鱗狀上皮且主要參與形成 生物體的保護(hù)屏障，而許多腺體的分泌性上皮細(xì)胞通常以單層的立方形細(xì)胞形式發(fā)現(xiàn)，其 在產(chǎn)生分泌性蛋白質(zhì)和糖蛋白方面具有主要作用。然而，與其位置或功能無(wú)關(guān)，上皮細(xì)胞通 常是再生性的。也就是說(shuō)，在正常條件下，或響應(yīng)于損傷或其它活化刺激，上皮細(xì)胞能夠分 裂或生長(zhǎng)。此再生能力已促進(jìn)上皮細(xì)胞的體外操縱，達(dá)到多種原代上皮細(xì)胞和細(xì)胞系已在 體外得到成功培育的程度（弗瑞旭尼，同上）。
[0009] 雖然已在文獻(xiàn)中報(bào)道了多種上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞系的分離和使用，但已證實(shí)了展 現(xiàn)出上皮形態(tài)的人類胚胎腎細(xì)胞系293( "293細(xì)胞"）尤其適用于研究外源性配體受體的 表達(dá)、病毒的產(chǎn)生以及同種異體和異種重組蛋白的表達(dá)。舉例來(lái)說(shuō)，美國(guó)專利第5, 166, 066 號(hào)描述了包含包括苯二氮卓結(jié)合位點(diǎn)的功能性GABA受體的穩(wěn)定293細(xì)胞系的構(gòu)建，已證實(shí) 其適用于鑒別和篩選精神活性的候選藥物。293細(xì)胞也已用于產(chǎn)生病毒，如天然和重組腺 病毒（加尼爾 A. (Gamier, A.)等人，細(xì)胞技術(shù)（Cytotechnol. ) 15:145-155 (1994);保特 A. (Bout, A.)等人，癌癥基因療法（Cancer Gene Therapy) 3(6): S24,摘要 P-52 (1996); 王J.-W. (Wang, J.-W.)等人，癌癥基因療法3(6): S24,摘要P-53 (1996))，所述病毒可用 于疫苗生產(chǎn)或構(gòu)建用于重組蛋白表達(dá)的腺病毒載體。最后，已證實(shí)293細(xì)胞適用于大規(guī)模 生產(chǎn)多種重組人類蛋白質(zhì)（伯格D. T (Berg, D.T.)等人，生物技術(shù)（BioTechniques) 14 (6 ):972-978(1993);佩夏 M.V. (Peshwa，M.V.)等人，生物技術(shù)與生物工程學(xué)（Biotechnol. Bioeng. )41:179-187(1993);加尼爾 A.等人，細(xì)胞技術(shù) 15:145-155(1994))。
[0010] 不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)胤Q為成纖維細(xì)胞的細(xì)胞已從許多不同組織中分離出來(lái)且被理解為結(jié)締 組織細(xì)胞。培養(yǎng)來(lái)自胚胎和成年組織的細(xì)胞系（不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)胤Q為成纖維細(xì)胞）明顯是可能的。 成纖維細(xì)胞特性上具有"紡錘體"外形。成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞具有成纖維細(xì)胞典型的形態(tài)特 征。在光學(xué)顯微鏡下，細(xì)胞在其于培養(yǎng)容器表面上生長(zhǎng)為單層時(shí)呈現(xiàn)尖和細(xì)長(zhǎng)形（"紡錘體 形狀")。細(xì)胞系在用適當(dāng)標(biāo)記物（如膠原蛋白I型）證實(shí)之后可被視為成纖維細(xì)胞或成纖 維細(xì)胞樣（弗瑞旭尼R. I.，上皮細(xì)胞培養(yǎng)，弗瑞旭尼R. I.編，紐約：威立-利斯公司，第 1-23 頁(yè)（1987))。
[0011] CHO細(xì)胞已被歸類為來(lái)源于中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢的上皮和成纖維細(xì)胞兩者。起始于中國(guó) 倉(cāng)鼠卵巢的細(xì)胞系（CH0-K1)(高F. -T. (Kao, F. -T.)和普克Τ. T. (Puck，Τ. T.)，美國(guó)國(guó)家科 學(xué)院院刊（Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 60:1275-1281 (1968))已被培養(yǎng)多年，但其身份仍未 經(jīng)證實(shí)。
[0012] 大部分原代哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、哺乳動(dòng)物成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞系和成纖維細(xì)胞 系通常以單層培養(yǎng)物形式生長(zhǎng)。然而，對(duì)于一些應(yīng)用，將所述細(xì)胞培育為懸浮培養(yǎng)物將是有 利的。舉例來(lái)說(shuō)，懸浮培養(yǎng)物生長(zhǎng)在三維空間中。然而，類似大小容器中的單層培養(yǎng)物僅可 以二維生長(zhǎng)在容器表面上。因此，與單層培養(yǎng)物相比，懸浮培養(yǎng)物可引起較高細(xì)胞產(chǎn)量，且 相對(duì)應(yīng)地引起較高生物制劑（例如病毒、重組多肽等）產(chǎn)量。另外，懸浮培養(yǎng)物通常更易于 經(jīng)由向培養(yǎng)容器中簡(jiǎn)單加入新鮮培養(yǎng)基（稀釋傳代培養(yǎng)）而非如在單層培養(yǎng)物下通常所需 的進(jìn)行胰蛋白酶消化和離心來(lái)進(jìn)料和按比例擴(kuò)大。進(jìn)料的簡(jiǎn)易性和可將懸浮培養(yǎng)物按比例 擴(kuò)大的簡(jiǎn)易性代表了在用于處理相當(dāng)數(shù)目細(xì)胞的時(shí)間和人工方面的實(shí)質(zhì)性節(jié)約。
[0013] 然而，許多錨著依賴性細(xì)胞（如原代上皮細(xì)胞、原代成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞系和成 纖維細(xì)胞系）不易于被調(diào)適成懸浮培養(yǎng)物。因?yàn)槠渫ǔＲ蕾囉阱^著于基底以實(shí)現(xiàn)最佳生 長(zhǎng)，故這些細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)可需要將其連接于微載體（如乳膠或膠原蛋白珠粒）。因此，以此 方式生長(zhǎng)的細(xì)胞雖然與傳統(tǒng)單層培養(yǎng)物相比能夠形成較高密度培養(yǎng)物，但仍在技術(shù)上連接 于表面；因此，這些細(xì)胞的傳代培養(yǎng)需要與用于傳代培養(yǎng)單層培養(yǎng)物的步驟類似的步驟。此 夕卜，在建立大批式或發(fā)酵罐培養(yǎng)物時(shí)，較大體積的微載體通常沉降到培養(yǎng)容器的底部，由此 需要更復(fù)雜的攪拌機(jī)制來(lái)保持微載體（且因此保持細(xì)胞）懸浮而不造成對(duì)細(xì)胞的剪切損傷 (佩夏M.V.等人，生物技術(shù)與生物工程學(xué)41:179-187 (1993))。
[0014] 盡管許多經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞能夠懸浮生長(zhǎng)（弗瑞旭尼R. I.，動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)：基本技 術(shù)手冊(cè)（Culture of Animal Cells:A Manual of Basic Technique)，紐約：艾倫 R.利斯 公司（New York:Alan R.Liss，Inc.)，第123-125頁(yè)（1983))，但成功的懸浮培養(yǎng)物通常需 要相對(duì)高蛋白培養(yǎng)基或用血清或血清組分（如連接因子纖維粘連蛋白和/或玻璃粘連蛋 白）補(bǔ)充培養(yǎng)基、或復(fù)雜的灌注培養(yǎng)控制系統(tǒng)（京Y. -S. (Kyung，Y. -S.)等人，細(xì)胞技術(shù) 14:183-190(1994))，這可能是不利的。另外，許多上皮細(xì)胞在以懸浮形式生長(zhǎng)時(shí)形成聚集 體或"凝集塊"，其可能會(huì)干擾成功傳代培養(yǎng)且減少生長(zhǎng)速率和培養(yǎng)物產(chǎn)生的生物制品。在 發(fā)生凝集時(shí)，暴露于培養(yǎng)基的總細(xì)胞表面積減少，且細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)且不能將廢棄物有效交 換到培養(yǎng)基中。因此，生長(zhǎng)減緩，獲得降低的細(xì)胞密度，且蛋白質(zhì)表達(dá)受損。
[0015] 通常，細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)配物用一系列添加劑補(bǔ)充，包括成分不確定的組分，如胎 牛血清（FBS) (5%-20% v/v)或來(lái)自動(dòng)物胚胎、器官或腺體的提取物（0.5%-10% v/ v)。雖然FBS是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基中最常施用的補(bǔ)充，但也常規(guī)使用其它血清來(lái)源，包 括新生小牛、馬和人類。已用于制備提取物以便補(bǔ)充培養(yǎng)基的器官或腺體包括下顎 腺體（柯亨 S. (Cohen, S.)，生物化學(xué)雜志（J. Biol. Chem.) 237:1555-1565 (1961))、 垂體（佩爾 D. M. (Peehl, D. M.)和漢姆 R. G. (Ham, R. G.)，體外 16:516-525 (1980);美 國(guó)專利第4,673,649號(hào)）、下丘腦（馬恰格T. (Maciag，T.)等人，美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院 刊76:5674-5678(1979);吉爾克里斯特B.A. (Gi lchrest，B. A.)等人，細(xì)胞生理學(xué)雜 志（J.Cell Physiol.) 120:377-383(1984))、眼視網(wǎng)膜（巴里托 D. (Barretault，D.) 等人，分化（Differentiation) 18:29-42 (1981))和腦（馬恰格Τ·等人，科學(xué) (Science) 211:1452-1454 (1981))。這些類型的化學(xué)成分不確定的補(bǔ)充劑在細(xì)胞培養(yǎng)基中 提供數(shù)個(gè)有用功能（蘭伯特K.J. (Lambert，K.J.)等人，動(dòng)物細(xì)胞生物技術(shù)（Animal Cell Biotechnology)，第1卷，施皮爾R. E. (Spier, R. Ε·)等人編，學(xué)術(shù)出版社紐約，第85-122 頁(yè)（1985)中）。舉例來(lái)說(shuō)，這些補(bǔ)充劑向不穩(wěn)定或水不溶性營(yíng)養(yǎng)物提供載劑或螯合劑；結(jié) 合并中和毒性部分；提供激素和生長(zhǎng)因子、蛋白酶抑制劑和必需的通常未經(jīng)鑒別或成分不 確定的低分子量營(yíng)養(yǎng)物；以及保護(hù)細(xì)胞免于物理應(yīng)力和損傷。因此，血清或器官/腺體提取 物常用作相對(duì)低成本補(bǔ)充劑以向動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)提供最佳培養(yǎng)基。
[0016] 令人遺憾的是，血清或器官/腺體提取物在組織培養(yǎng)應(yīng)用中的使用具有數(shù)個(gè)缺點(diǎn) (蘭伯特K. J.等人，動(dòng)物細(xì)胞生物技術(shù)，第1卷，施皮爾R. E.等人編，學(xué)術(shù)出版社紐約， 第85-122頁(yè)（1985)中）。舉例來(lái)說(shuō)，這些補(bǔ)充劑和血清的化學(xué)組成即使是來(lái)自單一制造商 也在批次之間存在變化。補(bǔ)充劑還可能會(huì)污染有感染劑（例如支原體和病毒），所述感染劑 可能會(huì)嚴(yán)重地漸漸損害所培養(yǎng)的細(xì)胞的健康和最終產(chǎn)物的品質(zhì)。成分不確定的組分（如血 清或動(dòng)物提取物）的使用也妨礙對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)和激素需求的真實(shí)定義和闡明，由 此排除了以受控制的方式研究特異性生長(zhǎng)因子或營(yíng)養(yǎng)物對(duì)培養(yǎng)物中細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的作 用的能力。此外，成分不確定的補(bǔ)充劑防礙研究人員研究所培養(yǎng)的細(xì)胞中的異常生長(zhǎng)和分 化和疾病相關(guān)的變化。最后且對(duì)于在工業(yè)生產(chǎn)生物物質(zhì)中采用細(xì)胞培養(yǎng)基者來(lái)說(shuō)最重要的 是，培養(yǎng)基的血清和器官/腺體提取物補(bǔ)充可因血清或提取物蛋白的非特異性共純化而使 從培養(yǎng)基中純化所需物質(zhì)變得復(fù)雜并增加所述純化的成本。
[0017] 相對(duì)于在生長(zhǎng)于用血清補(bǔ)充的培養(yǎng)基中的細(xì)胞中看到的表達(dá)水平，從生長(zhǎng)于無(wú)血 清培養(yǎng)基中的細(xì)胞獲得重組蛋白表達(dá)水平改進(jìn)（巴蒂斯塔P.J. (Battista，P.J.)等人，美 國(guó)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室（Am. Biotech. Lab. ) 12:64-68 (1994))。然而，無(wú)血清培養(yǎng)基可以仍含有 多種動(dòng)物來(lái)源組分中的一或多者，包括白蛋白、胎球蛋白、各種激素和其它蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì) 或肽的存在使得重組蛋白的純化困難、耗時(shí)并昂貴。
[0018] 為了克服使用血清或器官/腺體提取物的這些缺點(diǎn)，已開發(fā)了多種所謂的"成分 確定的"培養(yǎng)基。這些通常經(jīng)特定調(diào)配以支持單一細(xì)胞類型培養(yǎng)的培養(yǎng)基不含有成分不 確定的補(bǔ)充劑，并取而代之并入經(jīng)定義量的通常由血清或提取物補(bǔ)充劑提供的經(jīng)純化生長(zhǎng) 因子、蛋白質(zhì)、脂蛋白和其它物質(zhì)。因?yàn)樗雠囵B(yǎng)基中的組分（和其濃度）是精確已知的， 故這些培養(yǎng)基一般被稱為"成分確定的培養(yǎng)基"。有時(shí)與"成分確定的培養(yǎng)基"互換使用的 是術(shù)語(yǔ)"無(wú)血清培養(yǎng)基"或"SFM"。多種SFM調(diào)配物是可商購(gòu)的，如被設(shè)計(jì)成用于支持內(nèi)皮 細(xì)胞、角化細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞或肝 細(xì)胞培養(yǎng)的那些，其購(gòu)自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司（Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif·)。然而，SFM與成分確定的培養(yǎng)基之間的區(qū)別在于，SFM 是不含血清和蛋白質(zhì)部分（例如血清白蛋白）但不必不含其它成分不確定的組分（如器 官/腺體提取物）的培養(yǎng)基。實(shí)際上，已經(jīng)報(bào)道或可商購(gòu)的數(shù)種SFM含有所述成分不確 定的組分，包括支持角化細(xì)胞體外培養(yǎng)的數(shù)種調(diào)配物（博伊斯S.T. (Boyce，S.T.)和漢姆 R.G·，研究性皮膚病學(xué)雜志（J. Invest. Dermatol. )81:33 (1983);威爾 J.J. (Wille，J.J.) 等人，細(xì)胞生理學(xué)雜志（J· Cell. Physiol.) 121:31 (1984);皮特爾科 ER. (Pittelkow，Μ---·) 和斯科特 R.E. (Scott, R.E·)， 梅奧診所學(xué)報(bào) （Mayo Clin. Proc. )61:771 (1986) ; 皮里 希 L. (Pirisi，L.)等人，病毒學(xué)雜志（J. Virol.) 61:1061 (1987);希普利 G. D. (Shipley, G. D.)和皮特爾科M. R.，皮膚病學(xué)文獻(xiàn)（Arch. DermatoL) 123:1541 (1987);希普利G.D.等 人，細(xì)胞生理學(xué)雜志 138:511-518(1989);戴利 J.P. (Daley, J.P.)等人，F(xiàn)0CUS(GIBC0/ LTI) 12:68 (1990);美國(guó)專利第4, 673, 649號(hào)和第4, 940, 666號(hào)）。SFM由此在術(shù)語(yǔ)的真實(shí) 定義方面無(wú)法被視為成分確定的培養(yǎng)基。
[0019] 成分確定的培養(yǎng)基一般向使用者提供數(shù)種獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，使用成分確定 的培養(yǎng)基有助于研究特異性生長(zhǎng)因子或其它培養(yǎng)基組分對(duì)細(xì)胞生理學(xué)的作用，所述作用在 細(xì)胞培育于含血清或含提取物的培養(yǎng)基中時(shí)可被掩蔽。另外，成分確定的培養(yǎng)基與含有血 清或提取物的培養(yǎng)基相比通常含有量低得多的蛋白質(zhì)（實(shí)際上，成分確定的培養(yǎng)基通常被 稱為"低蛋白培養(yǎng)基"），使得對(duì)由在成分確定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生的生物物質(zhì)的純 化更簡(jiǎn)單且更便宜。
[0020] -些極簡(jiǎn)單的成分確定的培養(yǎng)基（其主要由維生素、氨基酸、有機(jī)和無(wú)機(jī)鹽以及 緩沖液組成）已用于細(xì)胞培養(yǎng)。然而，所述培養(yǎng)基（通常稱為"基礎(chǔ)培養(yǎng)基"）通常嚴(yán)重缺 乏大部分動(dòng)物細(xì)胞所需的營(yíng)養(yǎng)內(nèi)含物。因此，大部分成分確定的培養(yǎng)基使其它組分并入到 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中以使培養(yǎng)基在營(yíng)養(yǎng)學(xué)上更復(fù)雜，但維持培養(yǎng)基的無(wú)血清和低蛋白含量。所述 組分的實(shí)例包括牛血清白蛋白（BSA)或人類血清白蛋白（HSA);來(lái)源于天然（動(dòng)物）或重 組來(lái)源的某些生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF)或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF);脂質(zhì)，如月旨 肪酸、固醇和磷脂；脂質(zhì)衍生物和復(fù)合物，如磷酸乙醇胺、乙醇胺和脂蛋白；蛋白質(zhì)和類固 醇激素，如胰島素、氫化可的松（hydrocortisone)和孕酮；核苷酸前體；以及某些微量元素 (由威茅斯C. (Waymouth，C.)分子和細(xì)胞生物學(xué)的細(xì)胞培養(yǎng)方法（Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology),第1卷：用于無(wú)血清動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、補(bǔ)充劑 和底物的制備方法（Methods for Preparation of Media, Supplements, and Substrata for Serum-Free Animal Cell Culture),巴爾內(nèi)斯 D.W. (Barnes, D.W.)等人編，紐約：艾 倫R.利斯公司，第23-68頁(yè)（1984)和高斯泊達(dá)洛維奇D. (Gospodarowicz，D.)，同上，在 第 69-86 頁(yè)（1984)綜述）。
[0021] 然而，在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用動(dòng)物蛋白補(bǔ)充劑也具有某些缺點(diǎn)。舉例來(lái)說(shuō)，存在這樣 的風(fēng)險(xiǎn)：從其純化的培養(yǎng)基和/或產(chǎn)物可以是免疫原性的，尤其在補(bǔ)充劑是來(lái)源于不同于 所培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物時(shí)。如果從所述培養(yǎng)基中純化待用作治療劑的生物物質(zhì)，那么一 定量的這些免疫原性蛋白質(zhì)或肽可以被共純化且可在接受所述治療劑的動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫 反應(yīng)（達(dá)到且包括全身性過(guò)敏反應(yīng)）。
[0022] 為了排除這一潛在問(wèn)題，可使用來(lái)源于與待培養(yǎng)的細(xì)胞相同的物種的補(bǔ)充劑。舉 例來(lái)說(shuō)，可使用HSA作為補(bǔ)充劑促進(jìn)人類細(xì)胞的培養(yǎng)，而用于培養(yǎng)牛細(xì)胞的培養(yǎng)基將改為 使用BSA。然而，這種方法會(huì)帶來(lái)將污染物和不定的病原體引入到培養(yǎng)基中的風(fēng)險(xiǎn)（如來(lái)自 HSA制劑的克雅二氏?。–reutzfeld-Jakob Disease，CJD)，或來(lái)自BSA制劑的牛海綿狀腦 ?。?瘋牛病"）朊病毒），所述風(fēng)險(xiǎn)顯然可能會(huì)不利地影響所述培養(yǎng)基在制備動(dòng)物和人類 治療劑中的使用。實(shí)際上，為了所述安全性原因，生物技術(shù)工業(yè)和政府機(jī)構(gòu)逐漸管制、勸阻 且甚至禁止使用可含有所述病原體的含有動(dòng)物來(lái)源蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基。
[0023] 為了克服在SFM中使用動(dòng)物蛋白的局限性，已數(shù)次嘗試構(gòu)建完全不含動(dòng)物蛋白 的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基。舉例來(lái)說(shuō)，一些培養(yǎng)基已將酵母細(xì)胞的提取物并入到基礎(chǔ)培養(yǎng)基 中（參見例如英國(guó)專利申請(qǐng)第GB901673號(hào)；凱伊L. (Keay，L.)，生物技術(shù)與生物工程學(xué) 17:745-764 (1975))，從而提供氮和其它必需營(yíng)養(yǎng)物的來(lái)源。在另一種方法中，已在加入或 不加入酵母提取物的情況下使用小麥面筋的水解產(chǎn)物來(lái)促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞的體外生長(zhǎng)（日本 專利申請(qǐng)第JP 2-49579號(hào)）。已開發(fā)了其它培養(yǎng)基，其中血清經(jīng)傳統(tǒng)上已用于細(xì)菌培養(yǎng) 的肉或蛋白質(zhì)（如α-乳白蛋白或酪蛋白（例如蛋白胨））的酶促消化物替換（拉斯法爾 格E·Y·(Lasfargues，E·Y·)等人，體外 8(6):494-500(1973);凱伊L·，生物技術(shù)與生物 工程學(xué)17:745-764(1975);凱伊L.，生物技術(shù)與生物工程學(xué)19:399-411 (1977);施拉格爾 Ε.-J. (Schlager，E.-J.)，免疫學(xué)方法雜志（J. Immunol. Meth. ) 194:191-199 (1996))。然 而，這些方法中無(wú)一者提供對(duì)于培養(yǎng)多種動(dòng)物細(xì)胞最佳的培養(yǎng)基。此外，已展示出來(lái)自某些 植物（包括小麥、大麥、黑麥和燕麥）的提取物會(huì)抑制來(lái)源于動(dòng)物細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的蛋 白質(zhì)合成（科爾曼w. H. (Coleman, W. Η.)和羅伯茨W.K. (Roberts, W.K.)，生物化學(xué)與生物 物理學(xué)報(bào)（Biochim. Biophys. Acta) 696:239-244 (1982))，表明在細(xì)胞培養(yǎng)基中使用來(lái)源于 這些植物的肽可以實(shí)際上抑制而非刺激體外動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)。最近，包含大米肽的動(dòng)物細(xì) 胞培養(yǎng)SFM調(diào)配物已經(jīng)描述且展示出適用于培養(yǎng)多種正常和經(jīng)轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞（參見美國(guó) 專利第6, 103, 529號(hào)，其以全文引用的方式并入本文中）。
[0024] 不管由將動(dòng)物來(lái)源的補(bǔ)充劑加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中造成的潛在困難，所述補(bǔ)充劑是 常規(guī)使用的。時(shí)常加入到成分確定的培養(yǎng)基中的一種所述補(bǔ)充劑是轉(zhuǎn)鐵蛋白。轉(zhuǎn)鐵蛋白在 體內(nèi)起到將鐵傳遞到細(xì)胞的作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞攝取鐵的機(jī)制已經(jīng)綜述（錢Z.M. (Qian，Z. Μ.)和唐P. L. (Tang, P. L.) (1995)生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)1269, 205-214)。由于包括能 量產(chǎn)生和氧化呼吸在內(nèi)的許多代謝過(guò)程中需要鐵作為輔因子，故通常用轉(zhuǎn)鐵蛋白補(bǔ)充無(wú)血 清培養(yǎng)基，以便傳遞必需的鐵以實(shí)現(xiàn)大部分細(xì)胞體外的成功培育。關(guān)于轉(zhuǎn)鐵蛋白制備中各 種潛在不定的試劑的擔(dān)憂已刺激了對(duì)其它可用作轉(zhuǎn)鐵蛋白替代物的天然鐵載體化合物的 搜尋。這種搜尋因以下事實(shí)而復(fù)雜：天然鐵載體通常來(lái)源于血清且由此經(jīng)歷上述血清補(bǔ)充 的局限性。
[0025] 為了克服使用天然來(lái)源金屬載體的局限性，正探索某些結(jié)合金屬的化合物以用 于向所培養(yǎng)的細(xì)胞供應(yīng)金屬，尤其是鋅、鐵、錳和鎂。簡(jiǎn)單載體，如螯合劑（例如EDTA)和 某些酸或其鹽（例如檸檬酸鹽、吡啶甲酸鹽、以及苯甲酸或異羥肟酸的衍生物）已展示出 適用于某些無(wú)血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基（參見美國(guó)專利第5, 045, 454號(hào)和第5, 118, 513號(hào)；特斯 塔（Testa)等人，英國(guó)血液學(xué)雜志（Brit. J. Haematol. )60:491-502, (1985);伽內(nèi)沙咕嗜 (Ganeshaguru)等人，生物化學(xué)與藥理學(xué)（Biochem. Pharmacol. )29:1275-1279 (1980);懷 特（White)等人，血液（Blood) 48:923-929 (1976))。
[0026] 盡管這些參考文獻(xiàn)公開了一些金屬載體，但對(duì)數(shù)據(jù)的解釋因數(shù)種實(shí)驗(yàn)因素而復(fù) 雜。數(shù)據(jù)是從有限數(shù)目的細(xì)胞系搜集的且展示出單通道的結(jié)果。另外，培養(yǎng)基補(bǔ)充有血清。 血清固有地含有轉(zhuǎn)鐵蛋白和其它潛在鐵載體。即使在血清或轉(zhuǎn)鐵蛋白不存在下傳代一或兩 次之后，對(duì)已在補(bǔ)充血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)的細(xì)胞的生長(zhǎng)也有"延續(xù)作用"（參見例如基南 J. (Keenan，J.)和克萊因斯M. (Clynes，M·) (1996)體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)-動(dòng)物（In Vitro Cell Dev. Biol-Animal) 32, 451-453)。其它已知結(jié)合金屬的化合物已在醫(yī)學(xué)上用于從體內(nèi) 去除鐵且不用于傳遞。令人遺憾的是，許多這些簡(jiǎn)單鐵螯合化合物不提供足夠的可供所培 養(yǎng)的細(xì)胞使用或?yàn)樗囵B(yǎng)的細(xì)胞攝取的鐵。
[0027] -旦確定供具體細(xì)胞類型生長(zhǎng)用的適合的培養(yǎng)基調(diào)配物，就時(shí)常需要改變所討論 的細(xì)胞以便將所需生物學(xué)物質(zhì)的產(chǎn)生優(yōu)化。有效產(chǎn)生并純化生物學(xué)物質(zhì)中的關(guān)鍵步驟是將 一或多種大分子（例如肽、蛋白質(zhì)、核酸等）引入到將產(chǎn)生所述物質(zhì)的細(xì)胞中。這可通過(guò)各 種方法實(shí)現(xiàn)。一種廣泛使用的將大分子引入到細(xì)胞中的方法被稱為轉(zhuǎn)染。
[0028] 通常，目標(biāo)細(xì)胞在針對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)行優(yōu)化的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到所需細(xì)胞密度。 一旦達(dá)到所需密度，就將培養(yǎng)基更換為針對(duì)轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行優(yōu)化的培養(yǎng)基。在大部分情形下， 用于轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基并不支持細(xì)胞生長(zhǎng)，但轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基僅用于將核酸引入到細(xì)胞中的目的。 因此，所述方法一般需要從培養(yǎng)物收集細(xì)胞（通常通過(guò)離心進(jìn)行），洗滌細(xì)胞以去除生長(zhǎng)培 養(yǎng)基的痕跡，將細(xì)胞在相關(guān)大分子存在下懸浮在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中，將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中孵 育足以攝取大分子的時(shí)間段，任選地去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，并從細(xì)胞洗滌轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基的殘余物， 且接著將經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞再懸浮于生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。將生長(zhǎng)培養(yǎng)基更換為轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基、洗滌細(xì) 胞并將轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基更換回生長(zhǎng)培養(yǎng)基的步驟需要大量的細(xì)胞實(shí)際動(dòng)手操作，由此實(shí)質(zhì)上增 加重組DNA技術(shù)的時(shí)間和費(fèi)用。
[0029] 作為一個(gè)歷史實(shí)例，293細(xì)胞已以單層培養(yǎng)物形式培育在補(bǔ)充血清型復(fù)合培養(yǎng)基 (即DMEM)中。在懸浮生長(zhǎng)時(shí)，293細(xì)胞具有聚集成大細(xì)胞團(tuán)簇的傾向。這些大細(xì)胞聚集體 的形成降低了細(xì)胞的存活力。因?yàn)樵诰奂w中心的細(xì)胞并不直接暴露于培養(yǎng)基，故這些細(xì) 胞對(duì)培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的接近有限，且難以將廢棄物交換到培養(yǎng)基中。另外，這種對(duì)培養(yǎng)基的 接近減少使團(tuán)簇中的細(xì)胞不適于利用引入到培養(yǎng)基中的因子進(jìn)行遺傳操作（即，利用核酸 轉(zhuǎn)化）。由于這些困難，293細(xì)胞總體上尚未用于懸浮培養(yǎng)以用于生物物質(zhì)的產(chǎn)生。
[0030] 因此，在所屬領(lǐng)域中仍然需要允許真核細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)同時(shí)允許以減少量的操作轉(zhuǎn) 染細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。這類培養(yǎng)基應(yīng)優(yōu)選地是無(wú)血清和/或化學(xué)成分明確 和/或無(wú)蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基和/或缺乏動(dòng)物來(lái)源物質(zhì)的培養(yǎng)基，其促進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)到 高密度和/或增加重組蛋白的表達(dá)水平，減少細(xì)胞凝集，且其并不需要補(bǔ)充動(dòng)物蛋白，如血 清、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等。這類培養(yǎng)基優(yōu)選地將允許通常是錨著依賴性的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（包 括上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，如293細(xì)胞和CHO細(xì)胞）的懸浮培育。優(yōu)選地，這類培養(yǎng)基也將 能夠以比用當(dāng)前可供使用的培養(yǎng)基通?？色@得的密度高的密度培育和培養(yǎng)上述細(xì)胞類型。 另外，所述培養(yǎng)基將允許更容易且更有成本效益且有效地產(chǎn)生并純化生物技術(shù)工業(yè)中通過(guò) 經(jīng)培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生的大量商業(yè)上或科學(xué)上重要的生物學(xué)物質(zhì)（例如病毒、重組蛋 白、生物制品、重組抗體等），且將在采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培育的方法中提供更一致的結(jié)果。本 發(fā)明滿足了這些和其它需求。
[0031] 【發(fā)明概述】
[0032] 本發(fā)明提供一種細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，借此所述系統(tǒng)借助于一或多種大分子 (如，例如可表達(dá)的核酸）轉(zhuǎn)染到培養(yǎng)的多個(gè)真核細(xì)胞中并在所述細(xì)胞中后續(xù)表達(dá)來(lái)支持 引入，且進(jìn)一步支持細(xì)胞在引入/轉(zhuǎn)染之后的培育和生長(zhǎng)，其中至少一種細(xì)胞在不存在培 養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基補(bǔ)充的情況下在培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)。
[0033] 在一些實(shí)施例中，不必在細(xì)胞的引入/轉(zhuǎn)染期間從存在的細(xì)胞去除、補(bǔ)給或更換 所用培養(yǎng)基來(lái)支持其進(jìn)一步生長(zhǎng)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在引入/轉(zhuǎn)染之后，細(xì)胞的生長(zhǎng) 以及從可表達(dá)的核酸產(chǎn)生表達(dá)的蛋白質(zhì)可在一定體積的培養(yǎng)基中實(shí)現(xiàn)，所述體積是與進(jìn)行 引入/轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基的體積大致相同的體積到不超過(guò)約10倍其體積。使用本發(fā)明的培養(yǎng) 基，在已將核酸引入到細(xì)胞中之后以及在已引入核酸的細(xì)胞被進(jìn)一步培養(yǎng)以表達(dá)核酸之前 不必補(bǔ)給、更換或補(bǔ)充培養(yǎng)基。
[0034] 瞬時(shí)表達(dá)正迅速成為所選擇的用于快速的哺乳動(dòng)物蛋白產(chǎn)生的系統(tǒng)。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的 靈活性允許從概念到在手中的蛋白質(zhì)的快速實(shí)現(xiàn)時(shí)間，且許多不同蛋白質(zhì)可同步或依序產(chǎn) 生。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)的下一個(gè)關(guān)鍵發(fā)展是在不損失瞬時(shí)形式的速度和靈活性的情況下使用穩(wěn) 定表達(dá)系統(tǒng)獲得的接近或相同的表達(dá)水平。我們首次報(bào)道了新穎瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的開發(fā)，所 述系統(tǒng)利用高密度293F細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)在細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染之后7天內(nèi)產(chǎn)生表達(dá)水平>lg/L (高達(dá) 約2g/L)的人類IgG和非IgG蛋白。
[0035] 為了獲得所述高水平的蛋白質(zhì)表達(dá)，開發(fā)了一種新穎細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，其包括新高 密度生長(zhǎng)培養(yǎng)基與適宜于在所述培養(yǎng)基中高密度生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞群體的組合，所述系統(tǒng)允 許某些哺乳動(dòng)物細(xì)胞群體達(dá)到高達(dá)20 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升（更通常高達(dá)約15 X IO6個(gè)細(xì)胞 /毫升）的活細(xì)胞密度。這些超高密度培養(yǎng)物與傳統(tǒng)方案相比能夠在較高細(xì)胞密度下轉(zhuǎn)染， 顯著增加蛋白質(zhì)的容積產(chǎn)量。添加劑還發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染之后或期間加入一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑調(diào) 配物會(huì)使蛋白質(zhì)表達(dá)水平升高到比在當(dāng)前可商購(gòu)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)下可見的表達(dá)水平高多 達(dá)10到12倍的水平。親本懸浮培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞針對(duì)在高密度培養(yǎng)條件下改進(jìn)的生長(zhǎng)和 存活率特征進(jìn)行調(diào)適，且接著進(jìn)一步針對(duì)增加的蛋白質(zhì)產(chǎn)生進(jìn)行選擇。所得高密度調(diào)適的 細(xì)胞與親本細(xì)胞系相比生長(zhǎng)速率增加、細(xì)胞大小增加、且比生產(chǎn)量增加。最后，轉(zhuǎn)染方法通 過(guò)使用與一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑調(diào)配物組合使用的一或多種轉(zhuǎn)染試劑來(lái)優(yōu)化以進(jìn)一步增加 總蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
[0036] 當(dāng)所有這些改進(jìn)組合到單一表達(dá)系統(tǒng)中時(shí)，蛋白質(zhì)水平對(duì)于IgG和非IgG重組蛋 白兩者來(lái)說(shuō)與可商購(gòu)的Fr eeStyleTM293表達(dá)系統(tǒng)相比增加高達(dá)10倍，且針對(duì)多種蛋白質(zhì)獲 得>lg/L的表達(dá)水平。另外，蛋白質(zhì)功能性被證實(shí)對(duì)于在本發(fā)明的高產(chǎn)量表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá) 的數(shù)種蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō)在與流行的可商購(gòu)的Fr eeStyleTM293系統(tǒng)相比時(shí)是相當(dāng)?shù)??？傊?，這些 結(jié)果指示出可使用將許多蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)的進(jìn)展合并成單一易于使用形式的新穎瞬時(shí)哺 乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)來(lái)獲得功能蛋白產(chǎn)量的顯著增加。
[0037] 本發(fā)明還提供了一種培育真核細(xì)胞的方法，其包含：(a)使細(xì)胞與本發(fā)明的細(xì)胞 培養(yǎng)基接觸；(b)將細(xì)胞維持在適于支持細(xì)胞在培養(yǎng)物中培育的條件下；以及（c)任選地表 達(dá)核酸以形成蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0038] 本發(fā)明還提供了一種將一或多種大分子引入到培養(yǎng)物中的至少一種真核細(xì)胞中 的方法，所述方法包含：(a)在培養(yǎng)物的根據(jù)權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至少一種真核 細(xì)胞；(b)將至少一種大分子在足以使所述至少一種大分子中的一或多者引入至少一種細(xì) 胞中的條件下引入到培養(yǎng)物中；以及（C)在培養(yǎng)基中培育至少一種細(xì)胞以產(chǎn)生產(chǎn)物，所述 產(chǎn)物的產(chǎn)生受所述至少一種分子控制，其中在不存在培養(yǎng)基用新鮮培養(yǎng)基替換的情況下至 少一種細(xì)胞在培養(yǎng)基中繼續(xù)生長(zhǎng)，其中不必在引入期間從存在的至少一種細(xì)胞去除所用培 養(yǎng)基來(lái)支持所述至少一種細(xì)胞的生長(zhǎng)，和/或其中在引入之后，生長(zhǎng)是在一定體積的培養(yǎng) 基中培育中實(shí)現(xiàn)的，所述體積是與進(jìn)行引入的培養(yǎng)基的體積大致相同的體積到不超過(guò)約10 倍其體積。
[0039] 本發(fā)明還提供了一種用于體外培育和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明 的細(xì)胞培養(yǎng)基，且任選地進(jìn)一步包含以下各項(xiàng)中的一或多者：一或多種用于將至少一種分 子引入到細(xì)胞中的試劑、一或多種大分子、至少一種細(xì)胞、和關(guān)于在培養(yǎng)物中培養(yǎng)至少一種 細(xì)胞和/或關(guān)于將至少一種大分子引入到培養(yǎng)物中的至少一種細(xì)胞中的說(shuō)明書。
[0040] 本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基和至少一種選自由以下 各項(xiàng)組成的群組的組分：至少一種真核細(xì)胞、一或多種用于將至少一種大分子引入到至少 一種細(xì)胞中的試劑以及一或多種大分子。
[0041] 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的以下圖式和描述以及權(quán)利要求書將清楚本發(fā) 明的其它實(shí)施例。 【【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】】
[0042] 本文中參考隨附圖式僅借助于實(shí)例描述本發(fā)明?，F(xiàn)具體參考詳細(xì)圖式，強(qiáng)調(diào)所示 細(xì)節(jié)是作為舉例且僅出于說(shuō)明性論述本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例的目的，且以提供被認(rèn)為是對(duì)本發(fā) 明的原理和概念方面的最有用且易于理解的描述的原因呈現(xiàn)。在這點(diǎn)上，未試圖比基本理 解本發(fā)明所必需更詳細(xì)地展示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)詳情。
[0043] 在附圖中：
[0044] 圖1是展示使用根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)的細(xì)胞密度的 圖式。被調(diào)適用于高密度生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)3代緩慢調(diào)適到各種培養(yǎng)基中。細(xì)胞調(diào)適的培養(yǎng)基 包括根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的高密度培養(yǎng)基（實(shí)心圓）、測(cè)試培養(yǎng)基1 (實(shí)心三角形）、測(cè) 試培養(yǎng)基2 (空心三角形）、測(cè)試培養(yǎng)基3 (空心菱形）。將細(xì)胞在每一培養(yǎng)基中培養(yǎng)多代， 隨后以0. 2 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升接種于30ml燒瓶中。經(jīng)8天監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度和存活率；
[0045] 圖2是概述用于根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的細(xì)胞系表達(dá)優(yōu)化的 條形圖。將親本293F細(xì)胞系分割成多個(gè)傳代培養(yǎng)物，隨后將所述多個(gè)傳代培養(yǎng)物調(diào)適到高 密度培養(yǎng)基中。能夠以高密度生長(zhǎng)的各個(gè)傳代培養(yǎng)物接著針對(duì)其表達(dá)重組測(cè)試蛋白（人類 IgG)的能力進(jìn)行選擇和評(píng)估。標(biāo)記高產(chǎn)量調(diào)適的293F細(xì)胞的細(xì)胞的傳代培養(yǎng)物（右組條 形）與來(lái)源于相同親本293F細(xì)胞系的細(xì)胞的兩種不同傳代培養(yǎng)物相比表達(dá)多35 %到45 % 之間的重組IgG ;
[0046] 圖3是概述用于根據(jù)一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的各種增強(qiáng)劑的作用的條形圖。 鑒別出顯著改進(jìn)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的表達(dá)增強(qiáng)劑。組分被調(diào)配成2種穩(wěn)定增強(qiáng)劑溶液。表達(dá)增強(qiáng) 齊U 1的加入使hlgG表達(dá)加倍（比較前兩個(gè)條形）。增強(qiáng)劑2本身的加入僅展示對(duì)IgG增強(qiáng) 表達(dá)的邊際作用，但當(dāng)與增強(qiáng)劑1組合加入時(shí)，相較于對(duì)照提供多到幾乎3倍的hlgG (比較 第三和第四）；
[0047] 圖4展示使用根據(jù)一些實(shí)施例的高產(chǎn)量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和現(xiàn)有技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng) (Freestyle? 293系統(tǒng)）的4種不同且獨(dú)特蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的比較。圖4A展示在與可 商購(gòu)的Freestyle? Max系統(tǒng)相比時(shí)使用根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的人類 IgG表達(dá)的大于5倍的增加。圖4B展示在與可商購(gòu)的FreeStyle? Max系統(tǒng)相比時(shí)使用根 據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的Cripto表達(dá)的大于5. 2倍的增加。圖4C展示在 與可商購(gòu)的FreeStyle? Max系統(tǒng)相比時(shí)使用根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的 β 2-腎上腺素受體表達(dá)的幾乎4倍的增加。圖4D展示在與可商購(gòu)的FreeStyle? Max系統(tǒng) 相比時(shí)使用根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的兔IgG表達(dá)的大于11倍的增加；
[0048] 圖5是比較使用根據(jù)一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)與現(xiàn)有技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)實(shí)現(xiàn) 的EPO表達(dá)水平的條形圖。EPO使用本發(fā)明的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和Freestyle? 293系統(tǒng)表達(dá)。 本發(fā)明系統(tǒng)可從Iml (24孔板形式）按比例擴(kuò)大到1L(3L搖瓶形式）。在來(lái)自三個(gè)不同實(shí)驗(yàn) 室的三個(gè)獨(dú)立分析員的結(jié)果中可見特定蛋白質(zhì)表達(dá)水平的可靠再現(xiàn)性。 【【具體實(shí)施方式】】
[0049] 本發(fā)明提供了用于真核和原核細(xì)胞兩者生長(zhǎng)的改進(jìn)的培養(yǎng)基調(diào)配物。本發(fā)明培養(yǎng) 基支持細(xì)胞生長(zhǎng)、將大分子引入到培養(yǎng)的細(xì)胞中以及在不需要在生長(zhǎng)、引入和/或培育之 間補(bǔ)給、更換、補(bǔ)充或改變培養(yǎng)基的情況下進(jìn)行細(xì)胞培育。本發(fā)明的培養(yǎng)基可用于支持或增 強(qiáng)任何細(xì)胞的生長(zhǎng)和培育。本發(fā)明還提供了可用作一或多種非所需組分（例如動(dòng)物來(lái)源組 分）的取代物或替代所述一或多種非所需組分的化合物。替代化合物提供非所需組分的至 少一種所需功能。
[0050]【定義】
[0051] 在隨后的描述中，廣泛地使用多個(gè)用于細(xì)胞培養(yǎng)和重組DNA技術(shù)的術(shù)語(yǔ)。為了提 供對(duì)說(shuō)明書和權(quán)利要求書（包括欲給出所述術(shù)語(yǔ)的范圍）清楚且更一致的理解，提供以下 定義。
[0052] 術(shù)語(yǔ)將大分子或化合物"引入"到培養(yǎng)物中是指將大分子或化合物供應(yīng)到培養(yǎng)基 中。
[0053] 術(shù)語(yǔ)將大分子或化合物"引入"到至少一種細(xì)胞中是指將大分子或化合物供應(yīng)到 細(xì)胞，使得大分子或化合物變得內(nèi)化在細(xì)胞中。舉例來(lái)說(shuō)，大分子或化合物可使用轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn) 化、注射和/或脂質(zhì)體引入來(lái)引入到細(xì)胞中，并且還可以使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的 其它方法引入到細(xì)胞中。優(yōu)選地，大分子或化合物是通過(guò)脂質(zhì)體引入來(lái)引入到細(xì)胞中的。大 分子優(yōu)選地是蛋白質(zhì)、肽、多肽或核酸。大分子可為蛋白質(zhì)?；蛘?，大分子可為肽。或者，大 分子可為多肽。大分子還可為核酸。
[0054] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"大分子"涵蓋生物分子。在一個(gè)實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)大分子是指核 酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)大分子是指脫氧核糖核酸（DNA)和核糖核酸（RNA)。更優(yōu)選 地，術(shù)語(yǔ)大分子是指DNA。更優(yōu)選地，術(shù)語(yǔ)大分子是指互補(bǔ)DNA(cDNA)。大分子可帶電荷或 不帶電荷。DNA分子是帶電荷大分子的一個(gè)實(shí)例。在一些情況下，如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"大 分子"可與術(shù)語(yǔ)"可表達(dá)的核酸"互換使用。
[0055] 術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)染"在本文中用于指將核酸、蛋白質(zhì)或其它大分子傳遞到目標(biāo)細(xì)胞，使得 核酸、蛋白質(zhì)或其它大分子在所述細(xì)胞中得以表達(dá)或具有生物功能。
[0056] 如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"可表達(dá)的核酸"與分子量無(wú)關(guān)地包括DNA和RNA兩者，且術(shù) 語(yǔ)"表達(dá)"意指細(xì)胞內(nèi)核酸的功能性存在的任何表現(xiàn)，包括（但不限于）瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表 達(dá)兩者。功能方面包括通過(guò)寡核苷酸或蛋白質(zhì)傳遞對(duì)表達(dá)進(jìn)行抑制。
[0057] 術(shù)語(yǔ)"核酸的表達(dá)"和其等效說(shuō)法是指核酸在細(xì)胞中復(fù)制、DNA轉(zhuǎn)錄成信使RNA、 RNA翻譯成蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和/或蛋白質(zhì)在細(xì)胞中運(yùn)輸或其變化形式或組合。
[0058] 術(shù)語(yǔ)"成分"是指可在細(xì)胞培養(yǎng)基中用于維持或促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖的任何化合 物（無(wú)論是化學(xué)來(lái)源還是生物來(lái)源）。術(shù)語(yǔ)"組分"、"營(yíng)養(yǎng)物"和"成分"可互換使用且都意 欲指所述化合物。用于細(xì)胞培養(yǎng)基的典型成分包括氨基酸、鹽、金屬、糖、脂質(zhì)、核酸、激素、 維生素、脂肪酸、蛋白質(zhì)等。促進(jìn)或維持細(xì)胞離體培育的其它成分可由所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員 根據(jù)具體需要加以選擇。本發(fā)明的培養(yǎng)基可包括一或多種選自由以下各項(xiàng)組成的群組的組 分：牛血清白蛋白（BSA)或人血清白蛋白（HSA);-或多種來(lái)源于天然（動(dòng)物）或重組來(lái)源 的生長(zhǎng)因子，如表皮生長(zhǎng)因子（EGF)或成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF);-或多種脂質(zhì)，如脂肪 酸、固醇和磷脂；一或多種脂質(zhì)衍生物和復(fù)合物，如磷酸乙醇胺、乙醇胺和脂蛋白；一或多 種蛋白質(zhì)；一或多種和類固醇激素，如胰島素、氫化可的松和孕酮；一或多種核苷酸前體； 以及一或多種微量兀素。
[0059] 如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"是指包括所有類型的真核和原核細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施 例中，所述術(shù)語(yǔ)是指真核細(xì)胞，尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在某些示例性但非限制性實(shí)施例中， 術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"意欲指人類293細(xì)胞或其變異體，如可懸浮生長(zhǎng)的293變異體。尤其優(yōu)選的是 可以在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)、增殖并轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞的變異體，具體地說(shuō)是可以高密度（例如 大于約2 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升，更優(yōu)選地大于約3 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升，或甚至任選地大于約 4X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升）培養(yǎng)的那些變異體。所述變異型293細(xì)胞系的一個(gè)實(shí)例是EXPI293? F細(xì)胞。在其它示例性但非限制性實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞"意欲指CHO細(xì)胞。
[0060] 如本文中所用，當(dāng)用于根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)細(xì)胞以及出于進(jìn)行轉(zhuǎn)染工作流程的目的 采用其的本發(fā)明方法的情形時(shí)，術(shù)語(yǔ)"高密度"一般是指已知細(xì)胞系、或已知細(xì)胞系的變異 體，其可在適當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或培養(yǎng)到大于約IX IO6個(gè)細(xì)胞/毫升、更優(yōu)選地大于約 2X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升、最優(yōu)選地大于約3X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升、或甚至任選地大于約4X IO6 個(gè)細(xì)胞/毫升、或更高達(dá)約20 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升的密度，同時(shí)仍然保持以高效率轉(zhuǎn)染的能 力并且能夠以高水平（例如超過(guò)200μ g/ml到高達(dá)約lmg/ml或更高的水平）表達(dá)目標(biāo)蛋 白。
[0061] 短語(yǔ)"高密度培養(yǎng)基"在本文中用于指能夠維持哺乳動(dòng)物細(xì)胞（優(yōu)選地懸浮生長(zhǎng) 的細(xì)胞）以高達(dá)約2X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的密度生長(zhǎng)同時(shí)維持所述細(xì)胞超過(guò)約80%的存 活率且此外維持所述懸浮細(xì)胞有效轉(zhuǎn)染并表達(dá)高量重組蛋白的能力的任何培養(yǎng)基。本發(fā) 明的實(shí)踐中所用的"高密度培養(yǎng)基"可在不同應(yīng)用和用途之間變化，且可能取決于所用細(xì) 胞系、瞬時(shí)表達(dá)的所需蛋白質(zhì)的性質(zhì)、選擇用于將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染模態(tài)的性 質(zhì)以及加入到如下文所述的系統(tǒng)中的任何表達(dá)增強(qiáng)劑的量和性質(zhì)。盡管如此，預(yù)期用于 本發(fā)明瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和方法的優(yōu)選的"高密度培養(yǎng)基"將通常是無(wú)血清、無(wú)蛋白質(zhì)的，允許 懸浮細(xì)胞培育和生長(zhǎng)到高達(dá)約2X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升、更通常在約2X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升到 約I X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升之間的密度，且將進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn) 量超過(guò)至少200 μ g/mL細(xì)胞培養(yǎng)物到2mg/mL細(xì)胞培養(yǎng)物、更通常在約500 μ g/ml細(xì)胞培 養(yǎng)物到約lmg/mL細(xì)胞培養(yǎng)物之間。理想地，根據(jù)本發(fā)明使用的高密度培養(yǎng)基將有助于細(xì) 胞以在約IX IO6到約20X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升、約2X IO6到約2X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升、或約 2. 5 X IO6到約6 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升范圍內(nèi)的密度轉(zhuǎn)染。適用于本發(fā)明實(shí)踐的示例性高密 度培養(yǎng)基包括（但不限于）HuMEC基礎(chǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基、KNOCKOUT? CTStm無(wú)外來(lái)物ESC/iPSC 培養(yǎng)基、STEMPR0?-34SFM培養(yǎng)基、STEMPRO? NSC培養(yǎng)基、ESSENTIAL?-8培養(yǎng)基、培養(yǎng)基 254、培養(yǎng)基106、培養(yǎng)基131、培養(yǎng)基154、培養(yǎng)基171、培養(yǎng)基171、培養(yǎng)基200、培養(yǎng)基231、 H印toZYME-SFM、人類內(nèi)皮-SFM、GlBCO? FREESTYLE? 293 表達(dá)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基 154CF/ PRF、培養(yǎng)基154C、培養(yǎng)基154CF、培養(yǎng)基106、培養(yǎng)基200PRF、培養(yǎng)基131、Essential?-6 培養(yǎng)基、stempro?-34培養(yǎng)基、Gibco?:星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基、AIM 培養(yǎng)基CTS?、 AMINOMAX? C-100 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、AMIN0MAXtm-II 完全培養(yǎng)基、CD F0RTICH0? 培養(yǎng)基、CD CHO AGT 培養(yǎng)基、CHO-S-SFM 培養(yǎng)基、GIBCO?] FREESTYLE? CHO 表達(dá)培養(yǎng)基、CD OPTICHOtm 培養(yǎng)基、CD CHO培養(yǎng)基、CD DG44培養(yǎng)基、SF-900?培養(yǎng)基、EXPI293?表達(dá)培養(yǎng)基、LHC基 礎(chǔ)培養(yǎng)基、LHC-8培養(yǎng)基、293SFM培養(yǎng)基、CD 293培養(yǎng)基、AEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基、PER. C6?鈿 胞培養(yǎng)基、AIM V?；!培養(yǎng)基、EXPILIFE?:培養(yǎng)基、角質(zhì)細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基、LHC培養(yǎng) 基、LHC-8培養(yǎng)基、LHC-9培養(yǎng)基和其任何衍生物或修改型。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施 例中，高密度培養(yǎng)基可為CD F0RTICH0?培養(yǎng)基、CD CHO AGT培養(yǎng)基、CHO-S-SFM培養(yǎng)基、 GIBCO? I FREESTYLE? CHO 表達(dá)培養(yǎng)基、CD 0PTICH0? 培養(yǎng)基、CD CHO 培養(yǎng)基、CD DG44 培養(yǎng)基、G1BCO? FREESTYLE?293表達(dá)培養(yǎng)基、EXPI293?表達(dá)培養(yǎng)基或類似培養(yǎng)基、或 其修改型。以上列出的示例性高密度培養(yǎng)基可尤其適于CHO細(xì)胞、CHO細(xì)胞變異體、293細(xì) 胞、293細(xì)胞變異體、CapT細(xì)胞、CapT細(xì)胞變異體或經(jīng)調(diào)適用于高密度培養(yǎng)系統(tǒng)的任何其它 細(xì)胞的高密度生長(zhǎng)、繁殖、轉(zhuǎn)染和維持。
[0062] 短語(yǔ)"被調(diào)適用于高密度培養(yǎng)物的細(xì)胞"意欲指已調(diào)適成以高密度生長(zhǎng)在高密度 培養(yǎng)基中同時(shí)保持細(xì)胞存活率處于或高于約80%的細(xì)胞譜系或來(lái)源于同一親本細(xì)胞譜系 的細(xì)胞的（非克?。┤后w。所述細(xì)胞可通過(guò)經(jīng)>40、>50、>60、>70或>80次連續(xù)傳代以高 密度維持細(xì)胞且用所需高密度培養(yǎng)基逐漸更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基的比例來(lái)從親本細(xì)胞群體中分 離或選擇出。任選地，在所述方法期間，不同細(xì)胞池可個(gè)別地繁殖且經(jīng)歷選擇程序，同時(shí)同 步評(píng)估轉(zhuǎn)染效率和或蛋白質(zhì)表達(dá)效率，使得可選擇出可以高密度維持和生長(zhǎng)、以高效率轉(zhuǎn) 染且表達(dá)高水平所需重組蛋白的細(xì)胞的非克隆群體。雖然熟練的從業(yè)者將易于清楚，多種 細(xì)胞類型和譜系可經(jīng)歷這種選擇程序，但已確定來(lái)源于CHO細(xì)胞的細(xì)胞譜系、來(lái)源于293成 纖維細(xì)胞的細(xì)胞譜系和來(lái)源于CapT細(xì)胞的細(xì)胞尤其經(jīng)受所述選擇方法以便被調(diào)適成高密 度生長(zhǎng)條件。理想地，被調(diào)適用于高密度生長(zhǎng)培養(yǎng)物且適用于本發(fā)明的細(xì)胞還將能夠以高 效率轉(zhuǎn)染和/或能夠以超過(guò)至少約200 μ g/mL細(xì)胞培養(yǎng)物到約2mg/mL細(xì)胞培養(yǎng)物、更通常 在約500 μ g/ml細(xì)胞培養(yǎng)物到約lmg/mL細(xì)胞培養(yǎng)物之間的產(chǎn)量表達(dá)重組蛋白。理想地，被 調(diào)適用于根據(jù)本發(fā)明使用的高密度培養(yǎng)物的細(xì)胞能夠以在約IX IO6到約20X IO6個(gè)細(xì)胞/ 毫升、約2 X IO6到約2 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升、或約2. 5 X IO6到約6 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升范圍內(nèi) 的密度維持和轉(zhuǎn)染。
[0063] "細(xì)胞培養(yǎng)"或"培養(yǎng)"意指在人造體外環(huán)境中維持細(xì)胞。
[0064] "培育"意指在有利于生長(zhǎng)和/或分化和/或持續(xù)存活力的條件下體外維持細(xì)胞。 "培育"可與"細(xì)胞培養(yǎng)"互換使用。培育是通過(guò)每毫升培養(yǎng)基活細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)估的。在引入 大分子之后的培育優(yōu)選地包括產(chǎn)生產(chǎn)物，例如病毒上的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。
[0065] 如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"補(bǔ)給、更換或補(bǔ)充培養(yǎng)基"是指將一定體積的新鮮細(xì)胞培 養(yǎng)基加入到已存在于培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基中，和/或用新鮮培養(yǎng)基更換已存在于培養(yǎng)物中的 培養(yǎng)基，和/或用新培養(yǎng)基補(bǔ)充已存在于培養(yǎng)物中的培養(yǎng)基。新鮮培養(yǎng)基是不含待引入 到至少一種細(xì)胞中的一或多種大分子或化合物的培養(yǎng)基或尚未與細(xì)胞接觸以支持其生長(zhǎng) 培育的培養(yǎng)基。熟練的業(yè)內(nèi)人士可通過(guò)利用所屬領(lǐng)域中已知的技術(shù)（如細(xì)胞計(jì)數(shù)（手動(dòng) 或自動(dòng)）、臺(tái)盼藍(lán)拒染（trypan blue exclusion)、產(chǎn)生蛋白質(zhì)或其它物質(zhì)、阿爾瑪藍(lán)分析 (alamar blue assay)、一或多種代謝產(chǎn)物的存在或濃度、細(xì)胞粘附、形態(tài)外觀、廢培養(yǎng)基的 分析等）監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或存活率來(lái)判定去除和/或補(bǔ)給、更換或補(bǔ)充培養(yǎng)基是否有優(yōu) 點(diǎn)或有此需要。監(jiān)測(cè)技術(shù)中的一者或組合可用于判定是否需要培養(yǎng)基來(lái)支持生長(zhǎng)、引入至 少一種大分子和/或在引入至少一種大分子之后進(jìn)行培育。
[0066] "重組蛋白"是指由引入到宿主細(xì)胞中的核酸編碼的蛋白質(zhì)。所述宿主細(xì)胞表達(dá) 所述核酸。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)核酸"與"從由核酸編碼的RNA表達(dá)蛋白質(zhì)"同義。如本文中所用的 "蛋白質(zhì)"廣泛地是指聚合氨基酸，例如肽、多肽、蛋白質(zhì)、脂蛋白、糖蛋白等。
[0067] 術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)產(chǎn)量"是指由培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的量，且可例如根據(jù)每毫升培 養(yǎng)基所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)克數(shù)來(lái)測(cè)量。如果蛋白質(zhì)不由細(xì)胞分泌，那么蛋白質(zhì)可通過(guò)所屬領(lǐng)域 的技術(shù)人員已知的方法從細(xì)胞內(nèi)部分離。如果蛋白質(zhì)由細(xì)胞分泌，那么蛋白質(zhì)可通過(guò)所屬 領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法從培養(yǎng)基中分離。由細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)的量可易于由所屬領(lǐng)域 的技術(shù)人員測(cè)定。蛋白質(zhì)可為重組蛋白。
[0068] "蛋白質(zhì)產(chǎn)物"是與通過(guò)蛋白質(zhì)產(chǎn)生或通過(guò)蛋白質(zhì)起的作用有關(guān)的產(chǎn)物。蛋白質(zhì)產(chǎn) 物可為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)產(chǎn)物還可為由會(huì)產(chǎn)生產(chǎn)物的通過(guò)一或多種其它物質(zhì)的蛋白質(zhì)的作用 引起的產(chǎn)物。所述作用的一個(gè)實(shí)例是通過(guò)蛋白質(zhì)的酶促作用。
[0069] "懸浮培養(yǎng)物"意指培養(yǎng)容器中大部分或所有細(xì)胞以懸浮形式存在、且培養(yǎng)容器中 少數(shù)或沒(méi)有細(xì)胞附著于容器表面或容器內(nèi)的另一個(gè)表面的細(xì)胞培養(yǎng)物。優(yōu)選地，"懸浮培養(yǎng) 物"在培養(yǎng)容器中具有大于75%的細(xì)胞呈懸浮形式，不附著于培養(yǎng)容器之上或之中的表面。 更優(yōu)選地，"懸浮培養(yǎng)物"在培養(yǎng)容器中具有大于85%的細(xì)胞呈懸浮形式，不附著于培養(yǎng)容 器之上或之中的表面。甚至更優(yōu)選的是"懸浮培養(yǎng)物"在培養(yǎng)容器中具有大于95%的細(xì)胞 呈懸浮形式，不附著于培養(yǎng)容器之上或之中的表面。
[0070] 本發(fā)明的培養(yǎng)基、方法、試劑盒和組合物適于細(xì)胞的單層或懸浮培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和培 育，且適于蛋白質(zhì)在單層或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)。優(yōu)選地，本發(fā)明的培養(yǎng)基、方法、試劑盒 和組合物用于細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和培育，且用于蛋白質(zhì)產(chǎn)物在懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)。
[0071] "培養(yǎng)容器"意指可向培養(yǎng)細(xì)胞提供無(wú)菌環(huán)境的任何容器，例如玻璃、塑料或金屬 容器。
[0072] 短語(yǔ)"細(xì)胞培養(yǎng)基"、"組織培養(yǎng)基"、"培養(yǎng)基"（在每一種情況下復(fù)數(shù)"培養(yǎng)基"）和 "培養(yǎng)基調(diào)配物"是指用于培育細(xì)胞或組織的營(yíng)養(yǎng)性溶液。這些短語(yǔ)可互換使用。
[0073] 術(shù)語(yǔ)"組合"是指成分的混合或摻合。
[0074] 分子的衍生物包括包含基礎(chǔ)分子但具有其它或經(jīng)修飾側(cè)基的一些化合物。優(yōu)選 地，"衍生物"可通過(guò)使基礎(chǔ)分子與僅1個(gè)但可能是2、3、4、5、6個(gè)等反應(yīng)物分子反應(yīng)而形成。 單步驟反應(yīng)是優(yōu)選的，但多步驟，例如2、3、4、5、6步等反應(yīng)在所屬領(lǐng)域中已知形成衍生物。 取代、縮合和水解反應(yīng)是優(yōu)選的且可組合以形成衍生化合物?；蛘?，衍生化合物可為優(yōu)選地 在1個(gè)中但可能是2、3、4、5、6個(gè)等反應(yīng)中可形成基礎(chǔ)化合物或其取代或縮合產(chǎn)物的化合 物。
[0075] 細(xì)胞培養(yǎng)基由多種成分組成且這些成分在培養(yǎng)基間可有所不同。用于細(xì)胞培養(yǎng)基 的每一成分具有其獨(dú)特的物理和化學(xué)特征。成分的相容性和穩(wěn)定性部分地由成分在水溶液 中的"可溶性"確定。術(shù)語(yǔ)"可溶性"和"可溶"是指成分與其它成分形成且保持溶解狀態(tài)的 能力。成分由此在其可維持溶解狀態(tài)而不形成可測(cè)量或可檢測(cè)沉淀時(shí)是相容的。
[0076] "相容成分"還意指可一起維持在溶液中且形成"穩(wěn)定"組合的那些培養(yǎng)基組分。 含有"相容成分"的溶液在成分不實(shí)質(zhì)上沉淀、降解或分解使得可用于來(lái)自培養(yǎng)基的細(xì)胞的 一或多種組分的濃度降低到不再支持細(xì)胞最優(yōu)或所需生長(zhǎng)的水平時(shí)被稱為是"穩(wěn)定的"。成 分在降解無(wú)法檢測(cè)時(shí)或當(dāng)降解在與IX細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)配物中相同成分的分解相比時(shí)以較 慢速率發(fā)生時(shí)也被視為是"穩(wěn)定的"。舉例來(lái)說(shuō)，在IX培養(yǎng)基調(diào)配物中，已知谷氨酰胺降解 成吡咯烷酮羧酸和氨。谷氨酰胺與二價(jià)陽(yáng)離子的組合由于隨時(shí)間推移在存在谷氨酰胺和二 價(jià)陽(yáng)離子兩者的溶液或組合中可檢測(cè)到極少或無(wú)谷氨酰胺分解而被視為是"相容成分"。參 見美國(guó)專利第5, 474, 931號(hào)。因此，如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"相容成分"是指在作為濃縮的或 IX調(diào)配物混合于溶液中時(shí)是"穩(wěn)定"且"可溶"的具體培養(yǎng)基成分的組合。
[0077] 術(shù)語(yǔ)"IX調(diào)配物"意欲指含有以工作濃度見于細(xì)胞培養(yǎng)基中的一些或所有成分 的任何水溶液。"IX調(diào)配物"可以指例如細(xì)胞培養(yǎng)基或所述培養(yǎng)基成分的任何子組。IX 溶液中成分的濃度與用于體外維持或培育細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)調(diào)配物中可見的所述成分的濃 度大致相同。用于體外培育細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基是根據(jù)定義的IX調(diào)配物。當(dāng)存在多種成分 時(shí)，IX調(diào)配物中的每一成分的濃度約等于在細(xì)胞培養(yǎng)期間培養(yǎng)基中每一對(duì)應(yīng)成分的濃度。 舉例來(lái)說(shuō)，RPMI-1640培養(yǎng)基除了其它成分之外含有0. 2g/L L-精氨酸、0.05g/L L-天冬酰 胺和0.02g/L L-天冬氨酸。這些氨基酸的"IX調(diào)配物"在溶液中含有大致相同濃度的這 些成分。因此，當(dāng)提及"IX調(diào)配物"時(shí)，預(yù)期溶液中的每一成分具有與所述細(xì)胞培養(yǎng)基中 可見的濃度相同或大致相同的濃度。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知細(xì)胞培養(yǎng)基的IX調(diào)配物中 的成分濃度。參見例如，用于無(wú)血清動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、補(bǔ)充劑和底物的制備方法艾倫 R.利斯（Allen R. Liss), N.Y. (1984)，微生物培養(yǎng)基手冊(cè)（Handbook of Microbiological Media),第二版，羅納德Μ.阿特拉斯（Ronald M. Atlas)編勞倫斯C.帕克斯（Lawrence C. Parks) (1997)佛羅里達(dá)州波卡拉頓的CRC出版社（CRC Press, Boca Raton, Fla.)，和植 物培養(yǎng)基（Plant Culture Media),第 1卷：調(diào)配和使用（Formulations and Uses)E.F.喬 治（E. F. George)，D. J. M.帕陶克（D. J. M. Puttock)和 H. J.喬治（H. J. George) (1987)英格 蘭BA134QG威爾特郡韋斯特伯里埃丁頓的解經(jīng)公司（Exegetics Ltd. Edington, Westbury, Wilts，BA134QGEngland)，所述文獻(xiàn)中的每一者以全文引用的方式并入本文中。然而，與培 養(yǎng)基相比，I X調(diào)配物中的滲透壓摩爾濃度和/或pH可不同，尤其當(dāng)I X調(diào)配物中含有更少 成分時(shí)。
[0078] "10 X調(diào)配物"意欲指一種溶液，其中所述溶液中每一成分的濃度與在細(xì)胞培養(yǎng)期 間培養(yǎng)基中每一對(duì)應(yīng)成分的濃度相比多到約10倍。舉例來(lái)說(shuō)，RPMI-1640培養(yǎng)基的IOX調(diào) 配物除了其它成分之外可含有2.0g/L L-精氨酸、0. 5g/L L-天冬酰胺和0. 2g/L L-天冬氨 酸（比較IX調(diào)配物，上文）。"10X調(diào)配物"可含有濃度是IX培養(yǎng)調(diào)配物中所見約10倍 的多種其它成分。如將易于清楚，"25X調(diào)配物"、"50X調(diào)配物"、"100X調(diào)配物"、"500X 調(diào)配物"和"1000X調(diào)配物"分別表示如與IX細(xì)胞培養(yǎng)調(diào)配物相比含有約25、50、100、500 或1000倍濃度的成分的溶液。此外，培養(yǎng)基調(diào)配物和濃縮溶液的滲透壓摩爾濃度和PH可 以變化。
[0079] 術(shù)語(yǔ)"微量元素"或"微量元素部分"是指相對(duì)于培養(yǎng)基中存在的其它部分或組分 的量或濃度僅以極低（即"微量"）的量或濃度存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中的部分。在本發(fā)明中， 這些術(shù)語(yǔ)涵蓋 Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、C。2+、Cr 3+、Cu1+、Cu2+、Fe2+、Fe3+、Ge 4+、Se4+、Γ、Μη2+、 F_、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn 2+和Zr4+和其鹽。舉例來(lái)說(shuō)，以下鹽可用作本發(fā)明培養(yǎng)基中 的微量元素：AgN03、AlCl 3 · 6H20、Ba (C2H3O2) 2、CdSO4 · 8H20、CoCl2 · 6H20、Cr2(SO4)3 · 1H20、 Ge02、Na2Se03、H2Se03、KBr、KI、MnCl 2 · 4H20、NaF、Na2SiO3 · 9H20、NaV03、（NH4)6Mo 7O24 · 4H20、 NiSO4 · 6H20、RbCl、SnCl2和ZrOCl2 · 8H20。微量元素部分的適合濃度可由所屬領(lǐng)域的技術(shù) 人員僅使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。
[0080] 術(shù)語(yǔ)"氨基酸"是指氨基酸或其衍生物（例如氨基酸類似物）以及其D和L形式。 所述氨基酸的實(shí)例包括甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷 氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨 酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、L-羥基脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和 L-纈氨酸、N-乙?；腚装彼?。
[0081] "化學(xué)成分確定的"培養(yǎng)基是其中每一化學(xué)物質(zhì)和其對(duì)應(yīng)的量在其用于培養(yǎng)細(xì)胞 之前是已知的培養(yǎng)基?；瘜W(xué)成分確定的培養(yǎng)基在沒(méi)有化學(xué)物質(zhì)未知和/或未經(jīng)定量的溶解 產(chǎn)物或水解產(chǎn)物的情況下制得?；瘜W(xué)成分確定的培養(yǎng)基是本發(fā)明培養(yǎng)基的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施 例。
[0082] 術(shù)語(yǔ)"無(wú)血清培養(yǎng)條件"和"無(wú)血清條件"是指排除任何類型血清的細(xì)胞培養(yǎng)條件。 這些術(shù)語(yǔ)可互換使用。
[0083] "無(wú)血清培養(yǎng)基"(有時(shí)被稱為"SFM培養(yǎng)基"）是不含血清（例如胎牛血清（FBS)、小 牛血清、馬血清、山羊血清、人類血清等）的培養(yǎng)基且一般通過(guò)字母SFM表示。熟練的業(yè)內(nèi)人 士熟悉的示例性但非限制性無(wú)血清培養(yǎng)基包括HuMEC基礎(chǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基、KNOCKOUT? CTStm 無(wú)外來(lái)物 ESC/iPSC 培養(yǎng)基、STEMPR0?-34SFM 培養(yǎng)基、STEMPROtm NSC 培養(yǎng)基、ESSENTIAL?-8 培養(yǎng)基、培養(yǎng)基254、培養(yǎng)基106、培養(yǎng)基131、培養(yǎng)基154、培養(yǎng)基171、培養(yǎng)基171、培養(yǎng)基 200、培養(yǎng)基 231、H印toZYME-SFM、人類內(nèi)皮-SFM、G1BCO? FREESTYLE? 293 表達(dá)培養(yǎng) 基、培養(yǎng)基154CF/PRF、培養(yǎng)基154C、培養(yǎng)基154CF、培養(yǎng)基106、培養(yǎng)基200PRF、培養(yǎng)基131、 Essential?-6培養(yǎng)基、STEMPR0?-34培養(yǎng)基、GibC0?.星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基、AM V?;培 養(yǎng)基 cts?、AMiNOMAx? c-loo 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Aminomaxtm-II 完全培養(yǎng)基、CD forticho? 培養(yǎng) 基、CDCHO AGT 培養(yǎng)基、CHO-S-SFM 培養(yǎng)基、Gl BCO? FREESTYLE? CHO 表達(dá)培養(yǎng)基、CD 0PTICH0?培養(yǎng)基、CD CHO培養(yǎng)基、CDDG44培養(yǎng)基、SF-900?培養(yǎng)基、EXPI293?表達(dá)培養(yǎng)基、 LHC基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LHC-8培養(yǎng)基、293SFM培養(yǎng)基、CD 293培養(yǎng)基、AEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基、PER. C6? 細(xì)胞培養(yǎng)基、AIM V?培養(yǎng)基、EXPIUFE?:培養(yǎng)基、角質(zhì)細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基、LHC培養(yǎng)基、 LHC-8培養(yǎng)基、LHC-9培養(yǎng)基和其任何衍生物或修改型。
[0084] 短語(yǔ)"無(wú)蛋白質(zhì)"培養(yǎng)基是指不含蛋白質(zhì)（例如無(wú)血清蛋白（如血清白蛋白或連 接因子）、營(yíng)養(yǎng)蛋白（如生長(zhǎng)因子）或金屬離子載體蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白、銅藍(lán)蛋白）等）的 培養(yǎng)基。優(yōu)選地，如果存在肽，那么肽是較小肽，例如二肽或三肽。優(yōu)選地，長(zhǎng)度為十肽或更 長(zhǎng)的肽是存在于無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的氨基酸的不到約1 %、更優(yōu)選地不到約0. 1 %、且甚至 更優(yōu)選地不到約0.01%。
[0085] 如本文中所用的短語(yǔ)"低蛋白質(zhì)"培養(yǎng)基是指僅含有低量蛋白質(zhì)（通常是含有標(biāo) 準(zhǔn)量蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基（如補(bǔ)充有5%-10%血清的標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基）中可見的總蛋白質(zhì)的 量或濃度的不到約10%、不到約5%、不到約1%、不到約0.5%、或不到約0. 1% )的培養(yǎng) 基。
[0086] 如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"動(dòng)物來(lái)源的"物質(zhì)是指完全或部分來(lái)源于動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì)， 包括重組動(dòng)物DNA或重組動(dòng)物蛋白質(zhì)DNA。優(yōu)選的培養(yǎng)基不含有動(dòng)物所需物質(zhì)。
[0087] 術(shù)語(yǔ)"表達(dá)增強(qiáng)劑"一般是指用于補(bǔ)充根據(jù)目前所述實(shí)施例的培養(yǎng)基調(diào)配物的一 或多種液體（優(yōu)選地水性）添加劑，所述添加劑經(jīng)選擇以改進(jìn)在根據(jù)目前所述實(shí)施例的瞬 時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的所表達(dá)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。所述術(shù)語(yǔ)涵蓋了影響細(xì)胞周期進(jìn)程、抑 制細(xì)胞凋亡、減緩細(xì)胞生長(zhǎng)和/或促進(jìn)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的數(shù)種化合物中的任一或多者。在本發(fā) 明的情形下，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)增強(qiáng)劑"一般是指加入到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中的任一或多種化合物，所 述一或多種化合物的存在增強(qiáng)或促進(jìn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)高于在不存在所述表達(dá)增強(qiáng)劑下可 見的表達(dá)水平至少2倍到約10倍。適合與目前所述實(shí)施例一起使用的示例性表達(dá)增強(qiáng)劑 包括（但不限于）添加劑，如丙戊酸（VPA，酸和鈉鹽）、丙酸鈉、乙酸鋰、二甲亞砜（DMASO)、 包括半乳糖的糖、氨基酸混合物、或丁酸或上述的任何組合。每一特定表達(dá)增強(qiáng)劑的最佳濃 度可根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的個(gè)別特征和使用者的需求變化，且對(duì)在給定實(shí)驗(yàn)情境中構(gòu)成任一或多 種表達(dá)增強(qiáng)劑的最佳濃度的要素的測(cè)定充分處于在所屬領(lǐng)域中具有普通技能水平的從業(yè) 者的范圍內(nèi)。僅舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所用的丙戊酸（VPA)的最佳最 終濃度范圍可能在約0. 20mM到約25mM范圍內(nèi)。更優(yōu)選地，VPA的最終濃度可能在以下范圍 內(nèi)：約 0. 25mM 到約 24mM、約 0. 26mM 到約 23mM、0. 27mM 到約 23mM、0. 28mM 到約 23mM、0. 29mM 到約 22mM、約 0. 30mM 到約 21mM、約 0. 31mM 到約 20mM、約 0. 32mM 到約 19mM、約 0. 33mM 到約 17mM、約 0. 34mM 到約 18mM、約 0. 35mM 到約 17mM、約 0. 36mM 到約 16mM、約 0. 37mM 到約 15mM、 約 0. 40mM 到約 14mM、約 0. 41mM 到約 13mM、約 0. 42mM 到約 12mM、約 0. 43mM 到約 I ImM、約 0. 44mM 到約 10mM、約 0. 45mM 到約 9mM、約 0. 46mM 到約 8mM、約 0. 47mM 到約 7mM、約 0. 48mM 到約 6mM、約 0. 49mM 到約 5mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 55mM 到約 3mM、 0. 6mM到約2mM或0. 75到約I. 5mM。在一些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所 用的VPA的最終濃度可能在約0. 15mM到約I. 5mM之間、在約0. 16mM到約I. 5mM之間、在約 0. 17mM到約I. 5mM之間、在約0. 18mM到約I. 5mM之間、在約0. 19mM到約I. 5mM之間、在約 0. 20mM到約I. 5mM之間、在約0. 25mM到約I. 5mM之間、在約0. 30mM到約I. 5mM之間、在約 0. 40mM到約I. 5mM之間、在約0. 50mM到約I. 5mM之間、在約0. 60mM到約I. 5mM之間、在約 0. 70mM到約I. 5mM之間、在約0. 80mM到約I. 5mM之間、在約0. 90mM到約I. 5mM之間或在約 0. IOmM到約I. 5mM之間。在一些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所用的VPA 的最終濃度可能在約約〇. 20到約I. 5mM之間、在約0. 21到約I. 4mM之間、在約0. 22到約 1. 4mM之間、在約0. 23到約I. 4mM之間、在約0. 24到約I. 4mM之間、在約0. 25到約I. 3mM 之間、在約0. 25到約I. 2mM之間、在約0. 25到約I. ImM之間或在約0. 25到約I. OmM之間。
[0088] 在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所用的丙酸鈉（NaPP)的最佳最終濃度可能在 約0. 2mM到約IOOmM范圍內(nèi)。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP的最佳最終濃度可 能在以下范圍內(nèi)：約〇. 5到約80mM、約0. 4mM到約70mM、約0. 5mM到約60mM、約0. 6mM到約 50mM、約 0. 7mM 到約 40mM、約 0. 8mM 到約 30mM、約 0. 9mM 到約 20mM、約 ImM 到約 15mM、約 2mM 到約10mM、約3mM到約9mM、約4mM到約8mM或約5mM到約7mM。在某些優(yōu)選但非限制性的 實(shí)施例中，NAPP的最佳最終濃度可能在以下范圍內(nèi)：約ImM到約10mM、約ImM到約2mM、約 2mM到約3mM、約3mM到約4mM、約4mM到約5mM、約5mM到約6mM、約6mM到約7mM、約7mM至Ij 約8mM、約8mM到約9mM或約9mM到約10mM。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP的 最佳最終濃度可能是約lmM、約I. 5mM、約2mM、約2. 5mM、約3mM、約3. 5mM、約4mM、約4. 5mM、 約 5mM、約 5. 5mM、約 6mM、約 6. 5mM、約 7mM、約 7. 5mM、約 8mM、約 8. 5mM、約 9mM、約 9. 5mM 或約 IOmM0
[0089] 在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所用的乙酸鋰（LiAc)的最佳最終濃度可能在 以下范圍內(nèi)：約0. 25到約25mM、約0. 26mM到約20mM、約0. 27mM到約15mM、約0. 28mM到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0. 3mM 到約 4. 5mM、約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM到約2. 5mM、約ImM到約3mM、約I. 5mM到約2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0090] 在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所用的丁酸的最佳最終濃度可能在以下范圍 內(nèi)：約 0. 25 到約 25mM、約 0. 26mM 到約 20mM、約 0. 27mM 到約 15mM、約 0. 28mM 到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0. 3mM 到約 4. 5mM、約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 至Ij 約2. 5mM、約ImM到約3mM、約I. 5mM到約2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0091] 根據(jù)本發(fā)明使用的表達(dá)增強(qiáng)劑可在即將轉(zhuǎn)染之前或在轉(zhuǎn)染之后在收獲細(xì)胞和所 表達(dá)的蛋白質(zhì)之前加入到培養(yǎng)基中。在下文描述的一些特定但非限制性實(shí)施例中，"增強(qiáng)劑 1" 一般是指0. 25mM-lmM丙戊酸，且"增強(qiáng)劑2" 一般是指丙酸鈉。然而，如果另外 指示，那么術(shù)語(yǔ)增強(qiáng)劑1和增強(qiáng)劑2可涵蓋不同增強(qiáng)劑化合物。表達(dá)增強(qiáng)劑可依序或以混 合物形式加入到培養(yǎng)基中。
[0092] 如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"載體"打算指能夠運(yùn)輸其已連接的另一種核酸的核酸分子。 一種類型的載體是"質(zhì)粒"，其是指可接合其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA。另一種類型的載 體是噬菌體載體。另一種類型的載體是病毒載體，其中其它DNA區(qū)段可接合到病毒基因組 中。某些載體能夠在其被引入到其中的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制（例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì) 菌載體和游離型哺乳動(dòng)物載體）。其它載體（例如非游離型哺乳動(dòng)物載體）當(dāng)引入到宿主 細(xì)胞中時(shí)可整合到宿主細(xì)胞的基因組中，且由此與宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能 夠引導(dǎo)其可操作地連接的基因的表達(dá)。此類載體在本文中被稱為"重組表達(dá)載體"（或簡(jiǎn)單 地說(shuō)是"表達(dá)載體")。一般來(lái)說(shuō)，用于重組DNA技術(shù)中的表達(dá)載體通常呈質(zhì)粒形式。在本說(shuō) 明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可以可互換地使用，這是由于質(zhì)粒是最常用的載體形式。根據(jù)本 文中所述的本發(fā)明實(shí)踐使用的某些載體可為在所屬領(lǐng)域中所用的熟知載體，如PCDNA 3. 3 或其修飾型?？蛇m于本發(fā)明實(shí)踐的載體修飾類型的非限制性實(shí)例包括（但不限于）修飾， 如加入一或多種增強(qiáng)子、一或多種啟動(dòng)子、一或多種核糖體結(jié)合位點(diǎn)、一或多種復(fù)制起點(diǎn)等 的修飾。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，且本發(fā)明的實(shí)踐中所用的表達(dá)載體可包括一 或多種經(jīng)選擇以改進(jìn)所關(guān)注蛋白質(zhì)在本發(fā)明瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)的增強(qiáng)子元件。所選增 強(qiáng)子元件可位于用于表達(dá)所關(guān)注蛋白質(zhì)的可表達(dá)的核酸序列的5'或3'。尤其優(yōu)選但非限 制性的增強(qiáng)子元件是土拔鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件（WPRE)。
[0093] 如本文中所用，短語(yǔ)"含有能夠產(chǎn)生所表達(dá)蛋白質(zhì)的基因序列的表達(dá)載體"通常是 指如上所定義的載體，其除了一或多種支持其在細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)所需的核酸 序列或元件之外還能夠容納具有所需所關(guān)注蛋白質(zhì)的至少一個(gè)開放閱讀框架的可表達(dá)的 核酸序列?？纱嬖谟谌绫疚闹兴x的表達(dá)載體中的所述其它核酸序列或元件可包括一 或多種啟動(dòng)子序列、一或多種增強(qiáng)子元件、一或多種核糖體結(jié)合位點(diǎn)、一或多種翻譯起始序 列、一或多種復(fù)制起點(diǎn)或一或多種可選擇標(biāo)記物。服務(wù)這一目的的多種核酸序列或元件為 熟練的業(yè)內(nèi)人士所熟悉，且選擇其中一或多種用于本發(fā)明的實(shí)踐充分處于熟練的從業(yè)者的 范圍內(nèi)。
[0094] 如本文中所用的術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"和"核酸"是指任何核酸，包括脫氧核糖核 酸（DNA)和核糖核酸（RNA)。在優(yōu)選實(shí)施例中，"核酸"是指DNA(包括基因組DNA、互補(bǔ) DNA(cDNA))和寡核苷酸（包括寡DNA)。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，"核酸"是指 基因組DNA和/或cDNA。核苷酸可為脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修飾核苷酸或堿基 和/或其類似物、或可通過(guò)DNA或RNA聚合酶或通過(guò)合成反應(yīng)并入到聚合物中的任何底物。 多核苷酸可包含經(jīng)修飾的核苷酸，如甲基化核苷酸和其類似物。如果存在，那么可在聚合物 組裝之前或之后賦予對(duì)核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾。核苷酸的序列可間雜有非核苷酸組分。多核苷 酸可包含在合成之后進(jìn)行的修飾，如與標(biāo)簽結(jié)合。其它類型的修飾包括例如"蓋"；一或多 個(gè)天然存在的核苷酸經(jīng)類似物取代；核苷酸修飾，如具有不帶電鍵（例如甲基膦酸酯、磷酸 三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等）和具有帶電鍵（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的 修飾，含有側(cè)接部分、如蛋白質(zhì)（例如核酸酶、毒素、抗體、信號(hào)肽、聚L-賴氨酸等）的修飾， 具有嵌入劑（例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等）的修飾，含有螯合劑（例如金屬、放射性金屬、硼、氧 化金屬等）的修飾，含有烷基化劑的修飾，具有經(jīng)修飾的鍵（例如α異頭核酸等）的修飾， 以及多核苷酸的未經(jīng)修飾形式。此外，通常存在于糖中的任何羥基可例如被膦酸酯基、磷酸 酯基替代，被標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基保護(hù)，或活化以制備與額外核苷酸的額外鍵聯(lián)，或可結(jié)合于固體或 半固體支撐物。5'和3'末端OH可為經(jīng)磷酸化或經(jīng)1到20個(gè)碳原子的胺或有機(jī)封端基團(tuán) 部分而取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護(hù)基。多核苷酸還可含有所屬領(lǐng)域中通常已知的 核糖或脫氧核糖的類似形式，包括例如2' -0-甲基_、2' -0-烯丙基_、2' -氟基-或2' -疊 氮基-核糖、碳環(huán)糖類似物、α-異頭糖、差向異構(gòu)糖（如阿拉伯糖、木糖或來(lái)蘇糖）、吡喃 糖、呋喃糖、景天庚糖、非環(huán)狀類似物和堿基核苷類似物（例如甲基核糖苷）。一或多個(gè)磷 酸二酯鍵可被替代性連接基團(tuán)替代。這些替代性連接基團(tuán)包括（但不限于）其中磷酸酯基 被P (0) S ( "硫代酸酯基"）、P (S) S ( "二硫代酸酯基"）、（0) NR2 ("酰胺化物"）、P (0) R、P (0) OR'、CO或CH2 ( "甲縮醛"）替代的實(shí)施例，其中每個(gè)R或R'獨(dú)立地是H或任選地含有醚 (-〇-)鍵的經(jīng)取代或未經(jīng)取代的烷基（1-20C)、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、或芳烷基。多 核苷酸中所有的鍵不需要都一致。前面描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA 和 DNA。
[0095] 如本文中所用的"寡核苷酸"通常是指短的、通常是單鏈的、通常是合成多核苷酸， 其通常（但不必）長(zhǎng)度不到約200個(gè)核苷酸。術(shù)語(yǔ)"寡核苷酸"和"多核苷酸"并非相互排 斥。以上關(guān)于多核苷酸的描述同樣且完全適用于寡核苷酸。
[0096] 如本文中所用，短語(yǔ)"第一時(shí)間段"當(dāng)用于根據(jù)本文中所述的本發(fā)明方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的方法的情形時(shí)通常是指在細(xì)胞群體經(jīng)可表達(dá)的核酸轉(zhuǎn)染與一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑加 入到經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中之間的時(shí)間間隔。第一時(shí)間段通常將在約2小時(shí)到約4天范圍內(nèi)。在 某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，第一時(shí)間段可能在以下范圍內(nèi)：約3到約90小時(shí)、約4到 約85小時(shí)、約5到約80小時(shí)、約6到約75小時(shí)、約7到約70小時(shí)、約8到約65小時(shí)、約9 到約60小時(shí)、約10到約55小時(shí)、約11到約50小時(shí)、約12到約45小時(shí)、約13到約40小 時(shí)、約14到約35小時(shí)、約15到30小時(shí)、約16到約24小時(shí)、約17到約24小時(shí)、約18到約 24小時(shí)、約19到約24小時(shí)、約20到約24小時(shí)、約21到約24小時(shí)、約22到約24小時(shí)或 約23到約24小時(shí)。在其它優(yōu)選非限制性實(shí)施例中，第一時(shí)間段可能高達(dá)約15小時(shí)、高達(dá) 約16小時(shí)、高達(dá)約17小時(shí)、高達(dá)約18小時(shí)、高達(dá)約19小時(shí)、高達(dá)約20小時(shí)、高達(dá)約21小 時(shí)、高達(dá)約22小時(shí)、高達(dá)約23小時(shí)、高達(dá)約24小時(shí)、高達(dá)約25小時(shí)、高達(dá)約26小時(shí)、高達(dá) 約27小時(shí)、高達(dá)約28小時(shí)、高達(dá)約29小時(shí)或高達(dá)約30小時(shí)。
[0097] 如本文中所用，短語(yǔ)"第二時(shí)間段"當(dāng)用于根據(jù)本文中所述的本發(fā)明方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的方法的情形時(shí)通常是指在加入一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑與或者加入一或多種其它增強(qiáng) 劑或者收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并對(duì)其中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化或分離之間的時(shí)間間隔。第二時(shí) 間段通常將在約10小時(shí)到約10天范圍內(nèi)，但其它時(shí)間間隔在確定對(duì)于所表達(dá)蛋白質(zhì)最佳 時(shí)可以使用。在一些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，第二時(shí)間段可能在以下范圍內(nèi)：2小時(shí)到 5天、2. 5小時(shí)到4天、約3到約90小時(shí)、約4到約85小時(shí)、約5到約80小時(shí)、約6到約75 小時(shí)、約7到約70小時(shí)、約8到約65小時(shí)、約9到約60小時(shí)、約10到約55小時(shí)、約11到 約50小時(shí)、約12到約45小時(shí)、約13到約40小時(shí)、約14到約35小時(shí)、約15到30小時(shí)、約 16到約24小時(shí)、約17到約24小時(shí)、約18到約24小時(shí)、約19到約24小時(shí)、約20到約24 小時(shí)、約21到約24小時(shí)、約22到約24小時(shí)或約23到約24小時(shí)。在其它優(yōu)選非限制性實(shí) 施例中，第一時(shí)間段可能高達(dá)約15小時(shí)、高達(dá)約16小時(shí)、高達(dá)約17小時(shí)、高達(dá)約18小時(shí)、 高達(dá)約19小時(shí)、高達(dá)約20小時(shí)、高達(dá)約21小時(shí)、高達(dá)約22小時(shí)、高達(dá)約23小時(shí)、高達(dá)約24 小時(shí)、高達(dá)約25小時(shí)、高達(dá)約26小時(shí)、高達(dá)約27小時(shí)、高達(dá)約28小時(shí)、高達(dá)約29小時(shí)或高 達(dá)約30小時(shí)。
[0098] 如本文中所用，短語(yǔ)"第三時(shí)間段"當(dāng)用于根據(jù)本文中所述的本發(fā)明方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 細(xì)胞的方法的情形時(shí)通常是指在加入至少一種第一表達(dá)增強(qiáng)劑與至少一種第二表達(dá)增強(qiáng) 劑之間的時(shí)間間隔。在加入第一與第二表達(dá)增強(qiáng)劑之間的時(shí)間間隔可為約數(shù)秒到數(shù)天，但 在一些實(shí)施例中，所述第一和第二表達(dá)增強(qiáng)劑可基本上同步加入，或可任選地以單一調(diào)配 物形式提供。
[0099] 如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"復(fù)合反應(yīng)"、"復(fù)合培養(yǎng)基"等通常是指其中核酸與轉(zhuǎn)染試劑 調(diào)配物復(fù)合的生理上可接受的培養(yǎng)基或反應(yīng)。通常，被引入到細(xì)胞中以便表達(dá)蛋白質(zhì)的核 酸首先與適合的轉(zhuǎn)染試劑（如陽(yáng)離子脂質(zhì)調(diào)配物）復(fù)合成脂質(zhì)/核酸復(fù)合物或聚集體。 [0100] "過(guò)渡元素"或"過(guò)渡金屬"（其可互換使用）意指內(nèi)部電子價(jià)殼層而非外部殼層 僅經(jīng)部分填充的元素，使得所述元素充當(dāng)給定系列元素中最多與最少正電性之間的過(guò)渡連 接。過(guò)渡元素的特征通常在于高熔點(diǎn)、高密度、高偶極或磁力矩、多價(jià)以及能夠形成穩(wěn)定絡(luò) 合離子。適用于本發(fā)明的所述過(guò)渡元素的實(shí)例包括鈧（Sc)、鈦（Ti)、釩（V)、鉻（Cr)、錳 (Mn)、鐵（Fe)、鈷（Co)、鎳（Ni)、銅（Cu)、鋅（Zn)、釔（Y)、鋯（Zr)、鈮（Nb)、鑰（Mo)、锝（Tc)、 銣（Ru)、銠（Rh)、鈀（Pd)、銀（Ag)、鎘（Cd)、鑭（La)、鉿（Hf)、鉭（Ta)、鎢（W)、錸（Re)、鋨 (Os)、銥（Ir)、鉬（Pt)、金（Au)、汞（Hg)以及錒（Ac)。特別令人感興趣的是用于培養(yǎng)基組 合物的過(guò)渡元素（包括本發(fā)明的那些）是鐵的離子、螯合物、鹽以及絡(luò)合物（Fe 2+或Fe3+)。 [0101] 多種技術(shù)和試劑可用于將大分子在稱為"轉(zhuǎn)染"的過(guò)程中引入到目標(biāo)細(xì)胞中。常用 試劑包括例如磷酸鈣、DEAE-葡聚糖以及脂質(zhì)。關(guān)于使用這些類型試劑的詳細(xì)方案的實(shí)例， 許多參考文獻(xiàn)文本可用于實(shí)例，當(dāng)前分子生物學(xué)方案（Current Protocols in Molecular Biology),第9章，奧斯貝（Ausubel)等人編，約翰威利父子公司（John Wiley and Sons)，1998。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的其它方法在所屬領(lǐng)域中是已知，且可包括電穿孔（基因電轉(zhuǎn)移）、 聲孔作用、光學(xué)轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、刺穿感染（impalefection)、磁性轉(zhuǎn)染或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0102] "用于將大分子引入到細(xì)胞中的試劑"或"轉(zhuǎn)染試劑"是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已 知有助于大分子進(jìn)入到細(xì)胞中的任何物質(zhì)、調(diào)配物或組合物。舉例來(lái)說(shuō)，參見美國(guó)專利第 5, 279,833號(hào)。在一些實(shí)施例中，試劑可為"轉(zhuǎn)染試劑"且可為增加一或多種核酸攝取到 一或多種目標(biāo)細(xì)胞中的任何化合物和/或組合物。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知多種轉(zhuǎn)染試 齊U。適合的轉(zhuǎn)染試劑可包括（但不限于）一或多種化合物和/或組合物，其包含陽(yáng)離子聚 合物（如聚乙二亞胺（PEI))、帶正電荷氨基酸的聚合物（如聚賴氨酸和聚精氨酸）、帶正電 荷樹枝狀聚合物和斷裂的樹枝狀聚合物、含有陽(yáng)離子β_環(huán)糊精的聚合物（CD-聚合物）、 DEAE-葡聚糖等。在一些實(shí)施例中，用于將大分子引入到細(xì)胞中的試劑可包含一或多種可為 陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或中性脂質(zhì)的脂質(zhì)。優(yōu)選的脂質(zhì)包括（但不限于）氯化N-[I-(2, 3-二油酰 基氧基）丙基]-N，N，N-三甲銨（DOTMA)、二油?；字Ｄ憠A（DOPE)、1，2-雙（油?；?基）-3-(4'_三甲銨基）丙烷（DOTAP)、1，2-二油酰基-3-(4'-三甲銨基）丁?；?sn-甘 油（D0TB)、1，2-二油?；?3-琥珀?；?sn-甘油膽堿酯（D0SC)、（4'_三甲銨基）丁酸 膽固醇酯（ChoTB)、溴化十六烷基三甲銨（CTAB)、溴化1，2-二油?；?3-二甲基-羥乙銨 (DORI)、溴化1，2-二油?；趸?3-二甲基-羥乙銨（DORIE)、溴化1，2-二肉豆蘧氧 基丙基-3-二甲基-羥乙銨（DMRIE)、氯化雙十二烷基-N-[對(duì)（2-三甲氨基乙氧 基）苯甲?；鵠-N，N，N-三甲銨、結(jié)合于一或多種脂質(zhì)的精胺（例如5-羧基精胺基甘氨酸雙 十八烷基酰胺（DOGS)、N，N 1，N11，Nin-四甲基-N，N1，N11，N in-四棕櫚基精胺（TM-TPS)和二棕 櫚?；字；掖及?-羧基精胺基酰胺（DPPES))、脂聚賴氨酸（結(jié)合于DOPE的聚賴氨 酸）、TRIS(三（羥甲基）氨基甲烷，氨基丁三醇）結(jié)合的脂肪酸（TFA)和/或肽，如三賴氨 ?；?丙氨?；?TRIS單-、二-和三-棕櫚酸酯、（3 β - [N- (Ν'，Ν' -二甲氨基乙烷）-氨 基甲?；鵠膽固醇（DC-Chol)、氯化Ν_( α -三甲氨基乙?；雙十二烷基-D-谷氨酸酯 (TMAG)、溴化二甲基雙十八烷銨（DDAB)、三氟乙酸2, 3-二油酰基氧基-N-[2 (精胺-甲酰胺 基）乙基]-Ν，N-二甲基-1-丙銨（DOSPA)和其組合。
[0103] 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解上述脂質(zhì)的某些組合已展示出尤其適于將核酸引入 到細(xì)胞中，例如DOSPA與DOPE的3:1 (w/w)組合以商標(biāo)名LIPOFECTAMINE?購(gòu)自加利福尼 亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司（Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif·)， DOTMA與DOPE的I: I (w/w)組合以商標(biāo)名LIPOFECTIN?,購(gòu)自加利福尼亞州卡爾 斯巴德的生命技術(shù)公司，DMRIE與膽固醇的1:1 (M/M)組合以商標(biāo)名DMRIE-C試劑購(gòu)自加 利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司，TM-TPS與DOPE的1:1. 5(M/M)組合以商標(biāo)名 CellFECTIN?購(gòu)自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司，且DDAB與DOPE的 1:2. 5(w/w)組合以商標(biāo)名LipfectACE?,購(gòu)自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公 司。除了上述脂質(zhì)組合之外，包含脂質(zhì)與其它化合物的摻合物、具體來(lái)說(shuō)與包含核定位序列 的肽和蛋白質(zhì)的摻合物的其它調(diào)配物是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。舉例來(lái)說(shuō)，參見國(guó)際 申請(qǐng)第PCT/US99/26825號(hào)，作為WO 00/27795公開，其兩者都以引用的方式并入本文中。
[0104] 已發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)聚集體（如脂質(zhì)體）適用作將大分子傳遞到細(xì)胞中的試劑。具體來(lái)說(shuō)， 已證實(shí)包含一或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)聚集體在將陰離子大分子（例如核酸）傳遞到細(xì)胞 中時(shí)極其有效。一種常用陽(yáng)離子脂質(zhì)是氯化N-[l-(2,3-二油?；趸┍鵠-N，N，N-三 甲銨（DOTMA)。包含單獨(dú)DOTMA或與二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)的1:1混合物的脂質(zhì)體 已被用于將核酸引入到細(xì)胞中。D0TMA:D0PE的1:1混合物可以商標(biāo)名LIP0FECTIN?購(gòu)自 加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司。已用于將核酸引入到細(xì)胞中的另一種陽(yáng)離子脂 質(zhì)是1，2-雙（油?；趸?3-3-(三甲銨基）丙烷（DOTAP)。DOTAP與DOTMA的不同之處 在于油酰基部分在DOTAP中經(jīng)由醚鍵鍵聯(lián)到丙胺主鏈，而其在DOTMA中是經(jīng)由酯鍵鍵聯(lián)的。 DOTAP被認(rèn)為更易于被目標(biāo)細(xì)胞降解。其中三甲銨部分的一個(gè)甲基經(jīng)羥乙基替代的結(jié)構(gòu)上 相關(guān)的化合物組在結(jié)構(gòu)上與磷脂酶A的羅森塔爾抑制劑（Rosenthal inhibitor, RI)類似 (參見羅森塔爾等人，（I960)生物化學(xué)雜志（J. Biol. Chem. )233:2202-2206)。RI具有鍵 聯(lián)到丙胺核心的硬脂?；?。RI的二油?；愃莆锿ǔ：?jiǎn)稱為D0R1-醚和D0R1-酯，取決 于脂質(zhì)部分與丙胺核心的鍵聯(lián)。羥乙基部分的羥基可進(jìn)一步例如通過(guò)酯化成羧基精胺來(lái)衍 生。
[0105] 已用于將大分子引入到細(xì)胞中的另一類化合物包含與脂質(zhì)連接的羧基精胺部分 (參見貝爾（Behr)等人，（1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊（Proceedings of the National Academy of Sciences, USA) 86:6982-6986 和 EPO 0394111)。這類化合物的實(shí)例包括二 軟脂?；字Ｒ掖及?-羧基精胺基酰胺（DPPES)和5-羧基精胺基甘氨酸雙十八烷基 酰胺（DOGS)。DOGS可以商標(biāo)名TRANSFECTAM?購(gòu)自威斯康星州麥迪遜的普洛麥格公司 (Promega, Madison, Wis.) 〇
[0106] 膽固醇的陽(yáng)離子衍生物（3 β - [N-- (Ν'，Ν' -二甲氨基乙烷）-氨基甲?；鵠膽固 醇，DC-Chol)已經(jīng)合成且與DOPE-起調(diào)配到脂質(zhì)體中（參見高（Gao)等人，（1991)BBRC 179 (1) : 280-285)且用于將DNA引入到細(xì)胞中。由此調(diào)配的脂質(zhì)體據(jù)報(bào)道有效地將DNA以 低細(xì)胞毒性水平引入到細(xì)胞中。通過(guò)將聚賴氨酸結(jié)合于DOPE所形成的脂聚賴氨酸（參見 周（Zhou)等人，（1991)BBA 1065:8-14)據(jù)報(bào)道在將核酸在血清存在下引入到細(xì)胞中時(shí)有 效。
[0107] 已用于將核酸引入到細(xì)胞中的其它類型的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括高度填充聚陽(yáng)離子銨、 锍和鱗脂質(zhì)，如美國(guó)專利第5, 674, 908號(hào)和第5, 834, 439號(hào)和國(guó)際申請(qǐng)第PCT/US99/26825 號(hào)（作為WO 00/27795公開）中所述的那些。根據(jù)本發(fā)明一種尤其優(yōu)選但非限制性的用 于傳遞大分子的轉(zhuǎn)染試劑是購(gòu)自生命技術(shù)公司的LIP0FECTAMINE 2000? (參見美國(guó)國(guó)際申 請(qǐng)第PCT/US99/26825號(hào)，作為WO 00/27795公開）。適于將大分子傳遞到細(xì)胞中的另一種 優(yōu)選但非限制性轉(zhuǎn)染試劑是EXPIFECTAMINE?。其它適合的轉(zhuǎn)染試劑包括LI0FECTAMINE? RNAiMAX、LIPOFECTAMINE? LTX、0LIG0FECTAMINE?、Cellfectin?、INVIV0FECTAMINE?、 INVIVOFECTAMINE? 2.0以及楊（Yang)等人的美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2012/0136073號(hào)中所 公開的任何脂質(zhì)試劑或調(diào)配物（所述公開以引用的方式并入本文中）。多種其它轉(zhuǎn)染試劑 是熟練的業(yè)內(nèi)人士已知的且可針對(duì)其對(duì)于本文中所述的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和方法的適合性進(jìn) 行評(píng)估。
[0108] 本發(fā)明是針對(duì)一種高產(chǎn)量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其支持（a)將至少一種大分子（優(yōu)選地 是可表達(dá)的核酸分子）引入到培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞中，（b)培育其中已引入至少一種大分 子的細(xì)胞，以及任選地（c)在其中已引入至少一種大分子的細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白產(chǎn)物或表 達(dá)核酸，其中含有大分子的培養(yǎng)基并不需要在將至少一種大分子引入到細(xì)胞中之后以及在 培育并產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物或表達(dá)核酸之前從培養(yǎng)物中移出并用新鮮培養(yǎng)基更換。
[0109] 本發(fā)明的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、其根據(jù)本文中所描述方法的使用引起所關(guān)注蛋白質(zhì)在細(xì) 胞培養(yǎng)系統(tǒng)中快速且可重現(xiàn)的高水平表達(dá)。通常，本發(fā)明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和方法能夠以在約 200 μ g蛋白質(zhì)/L培養(yǎng)物到約2g蛋白質(zhì)/L培養(yǎng)物范圍內(nèi)的水平產(chǎn)生重組表達(dá)的蛋白質(zhì)， 取決于所需重組蛋白的個(gè)別表達(dá)特征和所用細(xì)胞類型。使用為本文提供的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和 方法，使用者可獲得超過(guò)目前使用標(biāo)準(zhǔn)可商購(gòu)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可獲得水平約2倍到高達(dá)約 20倍的所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平。使用為本文提供的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和方法，使用者可獲得與用 當(dāng)代瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可見水平相比約2. 5倍、約3倍、約3. 5倍、約4倍、約4. 5倍、約5倍、約 5. 5倍、約6倍、約6. 5倍、約7倍、約7. 5倍、約8倍、約8. 5倍、約9倍、約9. 5倍或高達(dá)約 10倍或更大的所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平。舉例來(lái)說(shuō)，使用本發(fā)明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生重組蛋白， 使用者可獲得比使用為在懸浮細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白而優(yōu)化的可商購(gòu)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（如 FREESTYLE?表達(dá)系統(tǒng)）獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高在約2倍到約10倍之間的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
[0110] 使用本發(fā)明的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)除了其它要素之外包括至少一種高密度培養(yǎng)基、至 少一種被調(diào)適用于高密度生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞群體、任選地一或多種表達(dá)載體、任選地一或多 種轉(zhuǎn)染試劑以及任選地一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑，在已將至少一種大分子引入到至少一種細(xì)胞 中之后以及在其中已引入至少一種大分子的細(xì)胞被進(jìn)一步培養(yǎng)以產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物或表達(dá) 核酸之前不必補(bǔ)給、更換或補(bǔ)充培養(yǎng)基。在本發(fā)明的系統(tǒng)中，培養(yǎng)基理想地是無(wú)血清培養(yǎng)基 和/或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和/或無(wú)蛋白質(zhì)或?qū)嵸|(zhì)上低蛋白質(zhì)培養(yǎng)基、和/或不含動(dòng)物 來(lái)源組分的培養(yǎng)基、或具有這些特征的組合的培養(yǎng)基。
[0111] 在本發(fā)明的一個(gè)非限制性方面，就將化合物或大分子（例如核酸）引入到培養(yǎng)物 中的細(xì)胞中來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的高產(chǎn)量培養(yǎng)基有助于與使用目前可用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)通?？色@ 得的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率相比更高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。在本發(fā)明的另一個(gè)相關(guān)但非限制性方面，系 統(tǒng)還不需要以欲在轉(zhuǎn)染之后培養(yǎng)細(xì)胞的較小體積轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在本發(fā)明的另一個(gè)相關(guān)但非限 制性方面，系統(tǒng)與目前可用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)相比有助于較高細(xì)胞存活率。在另一個(gè)相關(guān)但 非限制性方面，系統(tǒng)與目前可用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)相比有助于較高細(xì)胞密度（即每毫升培養(yǎng) 基細(xì)胞數(shù)）。在本發(fā)明的另一個(gè)相關(guān)但非限制性方面，系統(tǒng)與目前可用的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)相 比有助于培養(yǎng)物中細(xì)胞的較高重組蛋白表達(dá)水平。優(yōu)選地但未必地，相同體積的培養(yǎng)基可 用于將至少一種大分子引入到細(xì)胞中以及在不必更換、去除、補(bǔ)充或補(bǔ)給已發(fā)生細(xì)胞轉(zhuǎn)染 的培養(yǎng)基的情況下進(jìn)行的后續(xù)培育。或者，將細(xì)胞分割或培養(yǎng)基體積增加不到約2倍、約5 倍、約8倍或約10倍。
[0112] 本發(fā)明的培養(yǎng)基、方法、試劑盒以及組合物打算用于引入至少一種大分子或在任 何體積的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)細(xì)胞。所述引入優(yōu)選地以用于培養(yǎng)待轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基的量 的0.1到10倍實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積大于約一毫升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積 是約200 μ 1到100升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約2ml到約50升，最優(yōu)選地約5ml到 約5升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約IOOml到約50升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是 約500ml到約50升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約500ml到約25升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培 養(yǎng)物體積是約500ml到約10升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約500ml到約5升。更優(yōu)選 地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約500ml到約1升。
[0113] 在本發(fā)明的培養(yǎng)基、方法、試劑盒以及組合物中，培養(yǎng)基任選地不含可干擾大分子 引入或轉(zhuǎn)染的化合物，例如聚陰離子化合物，如聚磺酸化和/或聚硫酸化的化合物。優(yōu)選 地，培養(yǎng)基不含硫酸葡聚糖。
[0114] 本發(fā)明的培養(yǎng)基、方法、試劑盒以及組合物允許在不需要更換培養(yǎng)基的情況下將 化合物或大分子（尤其是大分子，例如核酸、蛋白質(zhì)以及肽）引入到所培養(yǎng)的細(xì)胞中（例如 通過(guò)轉(zhuǎn)染進(jìn)行）。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種用于培育和轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的培養(yǎng) 基。
[0115] 使用本發(fā)明的培養(yǎng)基、方法、試劑盒以及組合物，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可以將大分 子或化合物（例如核酸）引入到培養(yǎng)物中的細(xì)胞中。優(yōu)選地，大分子或化合物（例如核酸） 被引入到至少約20%細(xì)胞中。更優(yōu)選地，大分子或化合物（例如核酸）被引入到約20%到 約100%細(xì)胞中。更優(yōu)選地，大分子或化合物（例如核酸）被引入到約30%到約100%細(xì) 胞中。更優(yōu)選地，大分子或化合物（例如核酸）被引入到約50%到約100%細(xì)胞中。實(shí)際 上，大分子或化合物可被引入到約20%到約90%細(xì)胞、約20%到約80%細(xì)胞、約30%到約 60%、70%、80%或90%細(xì)胞、約20%、30%、40%或50%到約70%、75%、80%、85%、90%、 95%或98%細(xì)胞等中。甚至約60%、70%、75%或80%到約90%或接近100%的細(xì)胞可含 有所引入的分子或化合物。
[0116] 在本發(fā)明的培養(yǎng)基、方法、試劑盒以及組合物的優(yōu)選實(shí)施例中，一或多種非所需組 分（即，一或多種血清組分、一或多種成分不確定的組分、一或多種蛋白質(zhì)組分和/或一或 多種動(dòng)物來(lái)源的組分）已經(jīng)一或多種替代化合物在一或多種功能方面取代或替代。本發(fā)明 的替代化合物可任選地包括一或多種結(jié)合金屬的化合物和/或一或多種過(guò)渡元素絡(luò)合物， 所述絡(luò)合物包含與一或多種結(jié)合金屬的化合物絡(luò)合的一或多種過(guò)渡元素或其鹽或離子。優(yōu) 選地，培養(yǎng)基能夠在不存在一或多種天然來(lái)源金屬載體（如轉(zhuǎn)鐵蛋白或其它動(dòng)物來(lái)源蛋白 質(zhì)或提取物）的情況下支持細(xì)胞體外培育。結(jié)合金屬的化合物可在將結(jié)合金屬的化合物加 入到培養(yǎng)基中之前與過(guò)渡金屬絡(luò)合。在其它實(shí)施例中，結(jié)合金屬的化合物在將結(jié)合金屬的 化合物加入到培養(yǎng)基中之前不與過(guò)渡金屬絡(luò)合。優(yōu)選地，本發(fā)明的培養(yǎng)基不含轉(zhuǎn)鐵蛋白和 /或不含胰島素。
[0117] 本發(fā)明還涉及通過(guò)將培養(yǎng)基與一或多種替代化合物組合而獲得的細(xì)胞培養(yǎng)基。優(yōu) 選地，培養(yǎng)基可為無(wú)血清培養(yǎng)基和/或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和/或無(wú)蛋白質(zhì)或低蛋白質(zhì) 培養(yǎng)基和/或可為缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基優(yōu)選地不含轉(zhuǎn)鐵蛋白和/或不含胰 島素。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，培養(yǎng)基可能夠支持細(xì)胞體外培育和/或可允許將大分子引入 到細(xì)胞中。在一些實(shí)施例中，一或多種替代化合物可為結(jié)合金屬的化合物和/或可為過(guò)渡 元素絡(luò)合物，所述絡(luò)合物包含與至少一種結(jié)合金屬的化合物絡(luò)合的至少一種過(guò)渡元素或其 鹽或離子。優(yōu)選的用于本發(fā)明這一方面的過(guò)渡元素、結(jié)合金屬的化合物以及過(guò)渡元素絡(luò)合 物包括本文中詳細(xì)地描述的那些。
[0118] 本發(fā)明的替代化合物可有助于過(guò)渡金屬傳遞到體外培養(yǎng)的細(xì)胞中。在優(yōu)選實(shí)施例 中，替代化合物可傳遞鐵并替代轉(zhuǎn)鐵蛋白。優(yōu)選的替代化合物是羥基吡啶衍生物。優(yōu)選地， 羥基吡啶衍生物選自由以下各項(xiàng)組成的群組：2_羥基吡啶-N-氧化物、3-羥基-4-吡喃酮、 3-羥基哌吡啶-2-酮、3-羥基吡啶-2-酮、3-羥基吡啶-4-酮、1-羥基吡啶-2-酮、1，2-二 甲基-3-羥基吡啶-4-酮、1-甲基-3-羥基吡啶-2-酮、3-羥基-2 (IH)-吡啶酮、和吡哆醛 異煙堿基腙、煙堿酸-N-氧化物、2-羥基-煙堿酸。最優(yōu)選地，羥基吡啶衍生物是2-羥基吡 啶-N-氧化物。
[0119] 本發(fā)明的替代化合物可與任何培養(yǎng)基一起使用，包括用于培育或生長(zhǎng)真核和/或 原核細(xì)胞、組織、器官等的培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基包括（但不限于）CD F0RTICH0?培養(yǎng)基、 Expi293?表達(dá)培養(yǎng)基、杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基（Dulbecco's Modified Eagle's Medium，DMEM)、最小必需培養(yǎng)基（MEM)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基伊格爾（Basal Medium Eagle，BME)、 RPMI-1640、漢姆氏F-10(Ham's F-10)、漢姆氏F-12、α最小必需培養(yǎng)基（αΜΕΜ)、格拉斯 哥氏最小必需培養(yǎng)基（Glasgow's Minimal Essential Medium，G-MEM)和伊斯科夫氏改 良杜爾貝科氏培養(yǎng)基（Iscove's Modified Dulbecco's Medium，IMDM)。可商購(gòu)的（例如 來(lái)自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司）或所屬領(lǐng)域中另外已知的其它培養(yǎng)基可 根據(jù)本發(fā)明等效地使用，包括（但不限于）293SFM、⑶-CHO培養(yǎng)基、VP SFM、BGJb培養(yǎng)基、 布林斯特氏BM0C-3培養(yǎng)基（Brinster' s BM0C-3medium)、細(xì)胞培養(yǎng)冷凍培養(yǎng)基、CMRL培 養(yǎng)基、EHAA培養(yǎng)基、eRDF培養(yǎng)基、費(fèi)舍爾氏培養(yǎng)基（Fischer's medium)、網(wǎng)堡氏B-5培養(yǎng) 基（Gamborg' s B-5medium)、GLUTAMAX?補(bǔ)充培養(yǎng)基、格雷斯氏昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基（Grace's insect cell media)、HEPES 緩沖培養(yǎng)基、里克特氏改良 MEM(Richter's modified MEM)、 IPL-41昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、萊博維茨氏L-15培養(yǎng)基（Leibovitz's L-15media)、麥考伊氏5A 培養(yǎng)基（McCoy's 5A media)、MCDB 131培養(yǎng)基、培養(yǎng)基199、改良伊格爾培養(yǎng)基（Modified Eagle's Medium，MEM)、培養(yǎng)基 NCTC-109、施奈德氏果妮培養(yǎng)基（Schneider's Drosophila medium)、TC-100 昆蟲培養(yǎng)基、威茅斯氏MB 752/1 培養(yǎng)基（Waymouth' s MB 752/lmedia)、威 廉氏培養(yǎng)基E (William's Media E)、無(wú)蛋白質(zhì)雜交瘤培養(yǎng)基II (PFHM II)、AIM V培養(yǎng)基、 角質(zhì)細(xì)胞SFM、成分確定的角質(zhì)細(xì)胞SFM、STEMPRO? SFM、STEMPRO?完全甲 基纖維素培養(yǎng)基、HepatoZYME-SFM、Neurobasal?培養(yǎng)基、神經(jīng)基質(zhì)-A培養(yǎng)基、Hibernate. TM. A培養(yǎng)基、Hibernate E培養(yǎng)基、內(nèi)皮SFM、人類內(nèi)皮SFM、雜交瘤SFM、PFHM II、Sf 900 培養(yǎng)基、Sf 900TI SFM、EXPRESS FIVE? 培養(yǎng)基、CHO-S-SFM、AMINOMAX-II 完全培養(yǎng) 基、AMIN0MAX-C100完全培養(yǎng)基、AMINOMAX-C 100基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PB-ΜΑΧ?核型分析培養(yǎng)基、 KARY0MAX骨髓核型分析培養(yǎng)基、KNOCKOUT D-MEM和CO2非依賴性培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基從所 屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的制造商獲得，如JRH、西格瑪公司（Sigma)、?？寺」荆℉yClone) 和拜奧惠特克公司（BioWhittaker)。適用于本發(fā)明的實(shí)踐的培養(yǎng)基的其它實(shí)例可見于美國(guó) 專利第5, 135, 866號(hào)和第5, 232, 848號(hào)以及國(guó)際公開第WO 88/02774號(hào)、第WO 98/15614 號(hào)、第WO 98/08934號(hào)和歐洲專利第0282942號(hào)，所述專利的全文特別地以引用的方式并入 本文中。
[0120] 本發(fā)明還提供了一種用于將大分子引入到細(xì)胞中的方法，其包含在本發(fā)明的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)細(xì)胞且使培養(yǎng)基中的細(xì)胞與一或多種大分子在使得大分子被一或多種細(xì)胞吸收 的條件下接觸。優(yōu)選地，培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基和/或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和/或無(wú)蛋 白質(zhì)或低蛋白質(zhì)培養(yǎng)基和/或可為缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的培養(yǎng)基。優(yōu)選的細(xì)胞包括真核細(xì) 胞。更優(yōu)選地，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。培養(yǎng)基可包含一或多種替代化合物且優(yōu)選地不含轉(zhuǎn) 鐵蛋白和/或不含胰島素。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，培養(yǎng)基允許細(xì)胞在相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和 轉(zhuǎn)染。在一些實(shí)施例中，大分子可包含一或多種核酸，且使得核酸分子被細(xì)胞吸收的條件包 括使核酸與會(huì)引起核酸被引入到一或多種細(xì)胞中的試劑接觸。
[0121] 本發(fā)明還提供了一種包含本發(fā)明的培養(yǎng)基和細(xì)胞的組合物。優(yōu)選地，培養(yǎng)基是無(wú) 血清培養(yǎng)基和/或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和/或無(wú)蛋白質(zhì)或低蛋白質(zhì)培養(yǎng)基和/或缺乏動(dòng) 物來(lái)源組分的培養(yǎng)基。優(yōu)選的細(xì)胞包括真核細(xì)胞。更優(yōu)選地，細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。最優(yōu) 選的是來(lái)源于293成纖維細(xì)胞的懸浮細(xì)胞。培養(yǎng)基可包含一或多種替代化合物且優(yōu)選地不 含轉(zhuǎn)鐵蛋白和/或不含胰島素。優(yōu)選地，培養(yǎng)基支持細(xì)胞在相同培養(yǎng)基中生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)染，更優(yōu) 選地，培養(yǎng)基支持表達(dá)重組蛋白的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和培育，其中所述培養(yǎng)基并不必在 出于產(chǎn)生重組蛋白的目的引入其中可表達(dá)的核酸之后進(jìn)行補(bǔ)給、更換或另外補(bǔ)充。
[0122] 本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的培養(yǎng)基和一或多種用于將大分子引入到一或多種 細(xì)胞中的試劑的組合物。優(yōu)選地，培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基和/或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和 /或無(wú)蛋白質(zhì)或低蛋白質(zhì)培養(yǎng)基和/或缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可包含一或多 種替代化合物且優(yōu)選地不含轉(zhuǎn)鐵蛋白和/或不含胰島素。優(yōu)選地，培養(yǎng)基含有轉(zhuǎn)染試劑且 大分子是核酸。大分子還可為蛋白質(zhì)和/或肽。在一些實(shí)施例中，試劑包含一或多種脂質(zhì)， 其中一或多種可為陽(yáng)離子脂質(zhì)。更優(yōu)選地，試劑包含中性和陽(yáng)離子脂質(zhì)的混合物。在一些 實(shí)施例中，試劑包含一或多種肽和/或蛋白質(zhì)，其可單獨(dú)或與一或多種脂質(zhì)摻合提供。
[0123] 本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的培養(yǎng)基和待引入到細(xì)胞中的一或多種大分子的組 合物。優(yōu)選地，培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基和/或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和/或無(wú)蛋白質(zhì)或低蛋 白質(zhì)培養(yǎng)基和/或缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可包含一或多種替代化合物且優(yōu)選 地不含轉(zhuǎn)鐵蛋白和/或不含胰島素。大分子可為例如核酸和/或蛋白質(zhì)和/或肽，且可為 非復(fù)合的或可呈與一或多種用于將大分子引入到細(xì)胞中的試劑的復(fù)合物的形式。優(yōu)選地， 大分子是核酸且可呈與一或多種轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物形式。
[0124] 本發(fā)明還提供了一種組合物，其包含至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的群組的組分 (或其組合）：本發(fā)明的培養(yǎng)基、至少一種細(xì)胞、至少一種大分子、至少一種用于將至少一種 大分子引入到至少一種細(xì)胞中的試劑。優(yōu)選地，細(xì)胞是真核細(xì)胞。更優(yōu)選地，細(xì)胞是哺乳動(dòng) 物細(xì)胞。優(yōu)選地，培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基和/或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和/或無(wú)蛋白質(zhì)或 低蛋白質(zhì)培養(yǎng)基和/或缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可包含一或多種替代化合物且 優(yōu)選地不含轉(zhuǎn)鐵蛋白和/或不含胰島素。在一些優(yōu)選實(shí)施例中，試劑是轉(zhuǎn)染試劑且大分子 是核酸，例如RNA和/或DNA?；蛘?，大分子是蛋白質(zhì)和/或肽。
[0125] 在一些實(shí)施例中，試劑包含一或多種脂質(zhì)，其中一或多種可為陽(yáng)離子脂質(zhì)。更優(yōu)選 地，試劑包含中性和陽(yáng)離子脂質(zhì)的混合物。在一些實(shí)施例中，試劑包含一或多種肽和/或蛋 白質(zhì)，其可單獨(dú)或與一或多種脂質(zhì)摻合提供。在優(yōu)選實(shí)施例中，試劑與大分子復(fù)合以將大分 子引入到細(xì)胞中。
[0126] 本發(fā)明還提供了用于培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細(xì)胞的試劑盒，其包含至少一個(gè)包含用于培養(yǎng)和 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)基的容器。所述試劑盒還可包含至少一種選自由以下各項(xiàng)組成的群組的組 分（或其組合）：本發(fā)明的培養(yǎng)基、至少一種細(xì)胞、至少一種大分子、至少一種用于將至少一 種大分子引入到至少一種細(xì)胞中的試劑、至少一種緩沖液或緩沖鹽、以及關(guān)于使用試劑盒 來(lái)將至少一種大分子引入到至少一種細(xì)胞中的說(shuō)明書。優(yōu)選地，培養(yǎng)基是無(wú)血清培養(yǎng)基和 /或化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基和/或無(wú)蛋白質(zhì)或低蛋白質(zhì)培養(yǎng)基和/或缺乏動(dòng)物來(lái)源組分的 培養(yǎng)基。培養(yǎng)基可包含一或多種替代化合物且優(yōu)選地不含轉(zhuǎn)鐵蛋白和/或不含胰島素和/ 或不含動(dòng)物生長(zhǎng)因子。培養(yǎng)基可包含一或多種可為結(jié)合金屬的化合物的替代化合物和/或 可包含一或多種包含一或多種替代化合物的絡(luò)合物。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)基可包含一或 多種絡(luò)合物，所述絡(luò)合物包含絡(luò)合一或多種可為結(jié)合金屬的化合物的替代化合物的一或多 種過(guò)渡元素或其鹽或離子。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基能夠支持細(xì)胞體外培育且允許其 中培養(yǎng)的細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的試劑盒可以進(jìn)一步包含至少一個(gè)包含用 于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的脂質(zhì)的容器。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的試劑盒可包含至少一個(gè)包含核酸的 容器。
[0127] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，過(guò)渡元素優(yōu)選地選自由以下各項(xiàng)組成的群組：鈧、鈦、釩、 鉻、錳、鐵、鈷、鎳、銅、鋅、釔、鋯、鈮、鑰、锝、銣、銠、鈀、銀、鎘、鑭、鉿、鉭、鎢、錸、鋨、銥、鉬、 金、汞和錒或其鹽或離子，且優(yōu)選地是鐵鹽。適合的鐵鹽包括（但不限于）FeCl3、Fe(N03) 3 或FeSO4或含有Fe+++或Fe++離子的其它化合物。
[0128] 優(yōu)選的替代化合物包括（但不限于）結(jié)合金屬的化合物。參見例如國(guó)際專利申請(qǐng) 第 PCT/US00/23580 號(hào)，公開第 WO 01/16294 號(hào)。
[0129] 本發(fā)明的結(jié)合金屬的化合物包括可與過(guò)渡元素相互作用或結(jié)合且有助于其被細(xì) 胞攝取的任何大分子。所述相互作用/結(jié)合的性質(zhì)可為共價(jià)或非共價(jià)的。在本發(fā)明的這一 方面所用的結(jié)合金屬的化合物優(yōu)選地選自由以下各項(xiàng)組成的群組：多元醇、羥基吡啶衍生 物、1，3, 5-Ν，Ν'，N〃-三（2, 3-二羥基苯甲?；┌被?甲苯、乙二胺-N，Ν' -四亞甲基磷酸、 翠蘇素（trisuccin)、酸性糖類（如葡萄糖酸亞鐵）、葡糖胺聚糖、二亞乙三胺五乙酸、煙堿 酸-N-氧化物、2-羥基-煙堿酸、單、雙、三取代的2, 2'-二吡啶、異羥肟酸鹽衍生物（如乙異 輕月虧酸）、氨基酸衍生物、去鐵胺、鐵草銨（ferrioxamine)、鐵基卩卜吩和其衍生物、DOTA-賴 氨酸、德卟啉（texaphyrin)、薩普卟啉（sapphyrin)、多氨基羧酸、α-輕基羧酸、聚乙烯氨 基甲酸鹽、乙基麥芽酚、3-羥基-2-吡啶和IRC011。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，結(jié)合金屬的化 合物是多元醇，如山梨糖醇或葡聚糖，且尤其是山梨糖醇。在一個(gè)相關(guān)實(shí)施例中，結(jié)合金屬 的化合物是羥基吡啶衍生物，如2-羥基吡啶-N-氧化物、3-羥基-4-吡喃酮、3-羥基哌吡 啶-2-酮、3-羥基吡啶-2-酮、3-羥基吡啶-4-酮、1-羥基吡啶-2-酮、1，2-二甲基-3-羥 基吡啶-4-酮、1-甲基-3-羥基吡啶-2-酮、3-羥基-2 (IH)-吡啶酮、乙基麥芽酚或吡哆醛 異煙堿基腙，且優(yōu)選地是2-羥基吡啶-N-氧化物。在根據(jù)本發(fā)明這一方面的尤其優(yōu)選實(shí)施 例中，過(guò)渡金屬絡(luò)合物可為山梨糖醇-鐵絡(luò)合物或2-羥基吡啶-N-氧化物-鐵絡(luò)合物。本 發(fā)明的結(jié)合金屬的化合物還可結(jié)合二價(jià)陽(yáng)離子，如Ca++和Mg++。
[0130] 本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含一或多種可為結(jié)合金屬的化合物的替代化合物且 進(jìn)一步包含一或多種選自由以下各者組成的成分群組的成分：至少一種氨基酸（如L-丙氨 酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、 L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲 氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸或L-纈氨酸、N-乙酰基-半胱氨酸）、至少一種維生 素（如生物素、氯化膽堿、D-Ca++-泛酸鹽、葉酸、i-肌醇、煙堿酰胺、吡哆醇、核黃素、硫胺或 維生素 B12)、至少一種無(wú)機(jī)鹽（如鈣鹽、CuS04、FeS04、Fe (NO3) 3、FeCl3、KC1、鎂鹽、錳鹽、乙 酸鈉、似(：1、似!10)3、似 2即04、似2504、硒鹽、硅鹽、鑰鹽、釩鹽、鎳鹽、錫鹽、211(：1 2、21^04或其它 鋅鹽）、腺嘌呤、乙醇胺、D-葡萄糖、一或多種細(xì)胞因子、肝素、氫化可的松、硫辛酸、酚紅、磷 酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸鈉、三碘化甲腺氨酸、PLURONIC F68和胸苷。
[0131] 本發(fā)明的培養(yǎng)基可任選地包括一或多種緩沖劑。適合的緩沖劑包括（但不限于） N-[2-羥乙基]-哌嗪-Ν'- [2-乙磺酸](HEPES)、M0PS、MES、磷酸鹽、碳酸氫鹽和適用于細(xì)胞 培養(yǎng)應(yīng)用的其它緩沖劑。適合的緩沖劑是提供緩沖能力而對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)實(shí)質(zhì)性細(xì)胞毒 性的緩沖劑。對(duì)適合緩沖劑的選擇處于在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域中具普通技能者的范圍內(nèi)。
[0132] 根據(jù)本發(fā)明，適用于形成本發(fā)明細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)基可包含一或多種成分，且 可例如通過(guò)將一或多種選自由以下各項(xiàng)組成的群組的成分組合來(lái)獲得：腺嘌呤、乙醇胺、 D-葡萄糖、肝素、緩沖劑、氫化可的松、硫辛酸、酚紅、磷酸乙醇胺、腐胺、丙酮酸鈉、三碘化甲 腺氨酸、胸苷、L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、 L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙 氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、N-乙?；?半胱 氨酸、生物素、氯化膽堿、D-Ca++-泛酸鹽、葉酸、i-肌醇、煙堿酰胺、吡哆醇、核黃素、硫胺、維 生素 B12、Pluronic F68、重組胰島素、鈣鹽、CuS04、FeS04、FeCl3、Fe (NO3) 3、KCl、鎂鹽、錳鹽、 乙酸鈉、似(：1、似!10)3、似2即04、似250 4、硒鹽、硅鹽、鑰鹽、釩鹽、鎳鹽、錫鹽、211(：12、21^04或其 它鋅鹽,其中每一成分都以支持細(xì)胞體外培育的量加入。
[0133] 本發(fā)明還針對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基，其包含選自以下各者的成分：乙醇胺、D-葡萄糖、 HEPES、胰島素、亞油酸、硫辛酸、酚紅、PLURONIC F68、腐胺、丙酮酸鈉、轉(zhuǎn)鐵蛋白、L-丙氨酸、 L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、甘氨酸、L-組 氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨 酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、生物素、氯化膽堿、D-Ca++-泛酸鹽、葉酸、 i-肌醇、煙堿酰胺、批咳醇、核黃素、硫胺、維生素 B12、一或多種鈣鹽、Fe(N03)3、KCl、一或多 種鎂鹽、一或多種錳鹽、NaCl、NaHC0 3、Na2HPO4、一或多種硒鹽、一或多種釩鹽和一或多種鋅 鹽，其中每一成分都以支持哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞體外懸浮培育的量存在。本發(fā)明還針對(duì)此類 培養(yǎng)基，其可任選地進(jìn)一步包含一或多種選自由以下各項(xiàng)組成的群組的補(bǔ)充劑：一或多種 細(xì)胞因子、肝素、一或多種動(dòng)物肽、一或多種酵母肽和一或多種植物肽（最優(yōu)選地是大米、 蘆薈、大豆、玉米、小麥、豌豆、南瓜、菠菜、胡蘿卜、馬鈴薯、甘薯、木薯、鱷梨、大麥、椰子和/ 或綠豆和/或一或多種其它植物中的一或多者），例如參見國(guó)際申請(qǐng)第PCT/US97/18255號(hào)， 作為WO 98/15614公開。
[0134] 由本發(fā)明提供的培養(yǎng)基可為無(wú)蛋白質(zhì)的，且可為IX調(diào)配物或濃縮成例如10X、 20X、25X、50X、10X、500X 或 1000X 培養(yǎng)基調(diào)配物。
[0135] 本發(fā)明的培養(yǎng)基還可以不同形式制備，如干粉培養(yǎng)基（"0?1〇、顆粒狀制備物（其 需要加入水，但無(wú)其它處理，如調(diào)節(jié)pH)、液體培養(yǎng)基或呈培養(yǎng)基濃縮物形式。
[0136] 基礎(chǔ)培養(yǎng)基（即，僅適用于維持但不用于生長(zhǎng)或產(chǎn)物產(chǎn)生的培養(yǎng)基）可包含多種 成分，包括氨基酸、維生素、有機(jī)和無(wú)機(jī)鹽、糖和其它組分，每一成分都以支持哺乳動(dòng)物上皮 細(xì)胞體外培育的量存在。
[0137] 在本發(fā)明的培養(yǎng)基、方法、試劑盒以及組合物中，培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)多種細(xì)胞。優(yōu) 選地，培養(yǎng)基用于培養(yǎng)真核細(xì)胞。更優(yōu)選地，培養(yǎng)基用于培養(yǎng)植物和/或動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu) 選地，培養(yǎng)基用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞、魚細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞或禽類細(xì)胞。更優(yōu) 選地，培養(yǎng)基用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu)選地，培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括原 代上皮細(xì)胞（例如角質(zhì)細(xì)胞、頸椎上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞、腎臟上皮細(xì) 胞和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞）和建立的細(xì)胞系和其品系（例如293胚胎腎臟細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa 頸椎上皮細(xì)胞和PER-C6視網(wǎng)膜細(xì)胞、MDBK(NBL-I)細(xì)胞、911細(xì)胞、CRFK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、 CapT 細(xì)胞、CHO 細(xì)胞、BeWo 細(xì)胞、張氏細(xì)胞（Chang cell)、Detroit 562 細(xì)胞、HeLa 229 細(xì) 胞、HeLa S3 細(xì)胞、！fep-2 細(xì)胞、KB 細(xì)胞、LS180 細(xì)胞、LS174T 細(xì)胞、NCI-H-548 細(xì)胞、RPMI 2650 細(xì)胞、SW-13 細(xì)胞、T24 細(xì)胞、WI-28VA13、2RA 細(xì)胞、WISH 細(xì)胞、BS-C-I 細(xì)胞、LLC-MK2 細(xì) 胞、Clone M-3 細(xì)胞、1-10 細(xì)胞、RAG 細(xì)胞、TCMK-I 細(xì)胞、Y-I 細(xì)胞、LLC-PK1 細(xì)胞、PK (15)細(xì) 胞、GH1細(xì)胞、GH3細(xì)胞、L2細(xì)胞、LLC-RC 256細(xì)胞、MH1C1細(xì)胞、XC細(xì)胞、MDOK細(xì)胞、VSW細(xì)胞 和TH-I、Bl細(xì)胞或其衍生物）、來(lái)自任何組織或器官（包括（但不限于）心、肝、腎、結(jié)腸、 腸、食道、胃、神經(jīng)組織（腦、脊髓）、肺、血管組織（動(dòng)脈、靜脈、毛細(xì)管）、淋巴組織（淋巴腺 體、腺樣體、扁桃體、骨髓和血液）、脾）的成纖維細(xì)胞、以及成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì)胞樣細(xì) 胞系（例如CHO細(xì)胞、TRG-2細(xì)胞、頂R-33細(xì)胞、Don細(xì)胞、GHK-21細(xì)胞、瓜氨酸血癥細(xì)胞 (citrullinemia cell)、登普西細(xì)胞（Dempsey cell)、Detroit 551 細(xì)胞、Detroit 510 細(xì) 胞、Detroit 525 細(xì)胞、Detroit 529 細(xì)胞、Detroit 532 細(xì)胞、Detroit 539 細(xì)胞、Detroit 548 細(xì)胞、Detroit 573 細(xì)胞、HEL 299 細(xì)胞、頂R-90 細(xì)胞、MRC-5 細(xì)胞、WI-38 細(xì)胞、WI-26 細(xì)胞、MiCl1細(xì)胞、CHO細(xì)胞、CV-I細(xì)胞、COS-I細(xì)胞、C0S-3細(xì)胞、C0S-7細(xì)胞、Vero細(xì)胞、 DBS-FrhL-2 細(xì)胞、BALB/3T3 細(xì)胞、F9 細(xì)胞、SV-T2 細(xì)胞、M-MSV-BALB/3T3 細(xì)胞、K-BALB 細(xì)胞、 BL0-11細(xì)胞、N0R-10細(xì)胞、C3H/I0TI/2細(xì)胞、HSDM1C3細(xì)胞、KLN 2O5細(xì)胞、麥考伊細(xì)胞、小鼠 L 細(xì)胞、品系2071 (小鼠 L)細(xì)胞、L-M品系（小鼠 L)細(xì)胞、L-MTK_(小鼠 L)細(xì)胞、NCTC克隆 株2472和2555、SCC-PSAl細(xì)胞、Swiss/3T3細(xì)胞、印度麂細(xì)胞、SIRC細(xì)胞、C 11細(xì)胞和延森 細(xì)胞（Jensen cell)或其衍生物）。最優(yōu)選地，培養(yǎng)基用于培養(yǎng)選自由以下各項(xiàng)組成的群組 的哺乳動(dòng)物細(xì)胞：293細(xì)胞、293F細(xì)胞或其衍生物、PER-C6細(xì)胞或其衍生物、CHO細(xì)胞或其 衍生物、CapT細(xì)胞或其衍生物、C0S-7L細(xì)胞或其衍生物和Sp2/0細(xì)胞或其衍生物、或能夠以 如上所定義的高細(xì)胞密度培養(yǎng)的任何其它懸浮細(xì)胞系或衍生物。更優(yōu)選地，培養(yǎng)基用于培 養(yǎng)293細(xì)胞或經(jīng)修飾的293細(xì)胞系，其被專門調(diào)適用于在形成本發(fā)明基礎(chǔ)的細(xì)胞培養(yǎng)基中 最佳生長(zhǎng)。在一些優(yōu)選但非限制性方面，培養(yǎng)基用于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞。
[0138] 通過(guò)本發(fā)明的培養(yǎng)基支持的細(xì)胞可來(lái)源于任何動(dòng)物，優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，且最優(yōu) 選地是小鼠或人類。在本發(fā)明培養(yǎng)基中培育的細(xì)胞可為正常細(xì)胞或異常細(xì)胞（即，經(jīng)轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞、建立的細(xì)胞或來(lái)源于患病組織樣品的細(xì)胞）。
[0139] 本發(fā)明還提供了使用本文中所公開的培養(yǎng)基調(diào)配物培育哺乳動(dòng)物上皮或成纖維 細(xì)胞的方法，其包含（a)使細(xì)胞與本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基接觸；和（b)在適于支持細(xì)胞培育的 條件下培育細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法可任選地包括使所培養(yǎng)的細(xì)胞與包含一 或多種大分子（優(yōu)選地包含一或多種核酸）的溶液在使得所述大分子中的一或多者引入到 所述細(xì)胞中的一或多者中的條件下接觸的步驟。優(yōu)選地，根據(jù)這些方法培育的細(xì)胞（其可 包括上述細(xì)胞中的任一者）被懸浮培育。
[0140] 在一些方面，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和重組蛋白系統(tǒng)可包括適于所培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞以在約 I X IO6到約20 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升范圍內(nèi)、更優(yōu)選地在約2 X IO6到約6 X IO6范圍內(nèi)的密度 生長(zhǎng)并繁殖的高密度培養(yǎng)基。任何培養(yǎng)基都可用于本發(fā)明的實(shí)踐，其條件是所用培養(yǎng)基能 夠維持哺乳動(dòng)物細(xì)胞（優(yōu)選地懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞）以高達(dá)約2X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升的密度生 長(zhǎng)同時(shí)維持所述細(xì)胞超過(guò)約80%的存活率且此外維持所述懸浮細(xì)胞有效轉(zhuǎn)染并表達(dá)高量 重組蛋白的能力。本發(fā)明的實(shí)踐中所用的高密度培養(yǎng)基可在不同應(yīng)用和用途之間變化，且 可能取決于所用細(xì)胞系、瞬時(shí)表達(dá)的所需蛋白質(zhì)的性質(zhì)、選擇用于將表達(dá)載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞 中的轉(zhuǎn)染模態(tài)的性質(zhì)以及加入到如下文所述的系統(tǒng)中的任何表達(dá)增強(qiáng)劑的量和性質(zhì)。盡管 如此，預(yù)期用于本發(fā)明瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)和方法的優(yōu)選的高密度培養(yǎng)基將通常是無(wú)血清、無(wú)蛋 白質(zhì)的，允許懸浮細(xì)胞培育和生長(zhǎng)到高達(dá)約2 X IO7個(gè)細(xì)胞/毫升、更通常在約2 X IO6個(gè)細(xì) 胞/毫升到約IX IO7個(gè)細(xì)胞/毫升之間的密度，且將進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的 蛋白質(zhì)產(chǎn)量超過(guò)至少200 μ g/mL細(xì)胞培養(yǎng)物到2mg/mL細(xì)胞培養(yǎng)物、更通常在約500 μ g/ml 細(xì)胞培養(yǎng)物到約lmg/mL細(xì)胞培養(yǎng)物之間。理想地，根據(jù)本發(fā)明使用的高密度培養(yǎng)基將有助 于細(xì)胞以在約IX IO6到約20X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升、約2X IO6到約2X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升、或 約2. 5 X IO6到約6 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升范圍內(nèi)的密度轉(zhuǎn)染。
[0141] 適于本發(fā)明實(shí)踐的尤其優(yōu)選的高密度生長(zhǎng)培養(yǎng)基可為化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基，其 中每一化學(xué)物質(zhì)和其對(duì)應(yīng)的量在其用于培養(yǎng)細(xì)胞之前是已知的。所選化學(xué)成分確定的培養(yǎng) 基可任選地在沒(méi)有化學(xué)物質(zhì)未知和/或未經(jīng)定量的細(xì)胞或組織溶解產(chǎn)物或水解產(chǎn)物的情 況下制得。
[0142] 在本發(fā)明的一些方面，對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐尤其適合的培養(yǎng)基類型是無(wú)血清培養(yǎng) 基（有時(shí)被稱為"SFM培養(yǎng)基"），其完全不含例如胎牛血清（FBS)、小牛血清、馬血清、山 羊血清、人類血清等。熟練的業(yè)內(nèi)人士熟悉的示例性但非限制性無(wú)血清培養(yǎng)基包括HuMEC 基礎(chǔ)無(wú)血清培養(yǎng)基、KNOCKOUT? CTS?無(wú)外來(lái)物ESC/iPSC培養(yǎng)基、STEMPR0?-34SFM培養(yǎng) 基、STEMPRO? NSC培養(yǎng)基、ESSENTIAL?-8培養(yǎng)基、培養(yǎng)基254、培養(yǎng)基106、培養(yǎng)基131、 培養(yǎng)基154、培養(yǎng)基171、培養(yǎng)基171、培養(yǎng)基200、培養(yǎng)基231、H印toZYME-SFM、人類內(nèi) 皮-SFM、G丨BCO? FREESTYLE? 293表達(dá)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基154CF/PRF、培養(yǎng)基154C、培 養(yǎng)基 154CF、培養(yǎng)基 106、培養(yǎng)基 200PRF、培養(yǎng)基 131、Essential?-6 培養(yǎng)基、STEMPR0?-34 培養(yǎng)基、Gibco?.星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基、aim v?培養(yǎng)基CTS?、AMIN0MAX? C-100基礎(chǔ)培 養(yǎng)基、AmiNOMAXtm-II 完全培養(yǎng)基、CD F0RTICH0? 培養(yǎng)基、CD CHO AGT 培養(yǎng)基、CHO-S-SFM 培養(yǎng)基、Gi BCO?: FREESTYLE? CHO表達(dá)培養(yǎng)基、CD 0PTICH0?培養(yǎng)基、CD CHO培養(yǎng)基、 CD DG44培養(yǎng)基、SF-900?培養(yǎng)基、EXPI293?表達(dá)培養(yǎng)基、LHC基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LHC-8培養(yǎng)基、 293SFM培養(yǎng)基、⑶293培養(yǎng)基、AEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基、PER. C6?細(xì)胞培養(yǎng)基、AM V?:培養(yǎng)基、 EXP丨LIFE?培養(yǎng)基、角質(zhì)細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基、LHC培養(yǎng)基、LHC-8培養(yǎng)基、LHC-9培養(yǎng)基 和其任何衍生物或修改型。
[0143] 在本發(fā)明的一些方面，對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐尤其適合的培養(yǎng)基類型是無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng) 基（有時(shí)被稱為"PFM培養(yǎng)基"），其完全不含蛋白質(zhì)（例如無(wú)血清蛋白（如血清白蛋白或 連接因子）、營(yíng)養(yǎng)蛋白（如生長(zhǎng)因子）或金屬離子載體蛋白（如轉(zhuǎn)鐵蛋白、銅藍(lán)蛋白）等）。 優(yōu)選地，如果存在肽，那么肽是較小肽，例如二肽或三肽。優(yōu)選地，長(zhǎng)度為十肽或更長(zhǎng)的肽是 存在于無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基中的氨基酸的不到約1%、更優(yōu)選地不到約0. 1%、且甚至更優(yōu)選地 不到約0. 01%。
[0144] 理想地，預(yù)期用于本發(fā)明的無(wú)血清和無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基兩者將進(jìn)一步不含任何動(dòng)物 來(lái)源物質(zhì)、或任何完全或部分地來(lái)源于動(dòng)物來(lái)源的物質(zhì)，包括重組動(dòng)物DNA或重組動(dòng)物蛋 白 DNA。
[0145] 適用于本發(fā)明實(shí)踐的示例性高密度培養(yǎng)基包括（但不限于）HuMEC基礎(chǔ)無(wú)血清 培養(yǎng)基、KNOCKOUT? CTStm 無(wú)外來(lái)物 ESC/iPSC 培養(yǎng)基、STEMPR0?-34SFM 培養(yǎng)基、STEMPRO? NSC培養(yǎng)基、ESSENTIAL?-8培養(yǎng)基、培養(yǎng)基254、培養(yǎng)基106、培養(yǎng)基131、培養(yǎng)基154、培養(yǎng) 基171、培養(yǎng)基171、培養(yǎng)基200、培養(yǎng)基231、H印toZYME-SFM、人類內(nèi)皮-SFM、GIBCO? FREESTYLE? 293表達(dá)培養(yǎng)基、培養(yǎng)基154CF/PRF、培養(yǎng)基154C、培養(yǎng)基154CF、培養(yǎng)基106、培 養(yǎng)基200PRF、培養(yǎng)基131、Essential?-6培養(yǎng)基、STEMPR0?-34培養(yǎng)基、Gibco?.星形膠質(zhì) 細(xì)胞培養(yǎng)基、am V?培養(yǎng)基cts?、aminomax? c-loo基礎(chǔ)培養(yǎng)基、Aminomaxtm-II完全培養(yǎng) 基、CD F0RTICH0?培養(yǎng)基、CD CHO AGT 培養(yǎng)基、CHO-S-SFM 培養(yǎng)基、G丨 BCO? FREESTYLE? CHO表達(dá)培養(yǎng)基、CD 0PTICH0?培養(yǎng)基、CD CHO培養(yǎng)基、CD DG44培養(yǎng)基、SF-900?培養(yǎng)基、 LHC基礎(chǔ)培養(yǎng)基、LHC-8培養(yǎng)基、293SFM培養(yǎng)基、⑶293培養(yǎng)基、AEM生長(zhǎng)培養(yǎng)基、PER. C6?. 細(xì)胞培養(yǎng)基、AIM V?;培養(yǎng)基、EXPILIFE?;培養(yǎng)基、角質(zhì)細(xì)胞-SFM培養(yǎng)基、LHC培養(yǎng) 基、LHC-8培養(yǎng)基、LHC-9培養(yǎng)基和其任何衍生物或修改型。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施 例中，高密度培養(yǎng)基可為CD FORTICHO?培養(yǎng)基、CD CHO AGT培養(yǎng)基、CHO-S-SFM培養(yǎng)基、 GIBCO?: FREESTYLE? CHO 表達(dá)培養(yǎng)基、CD 0PTICH0? 培養(yǎng)基、CD CHO 培養(yǎng)基、CD DG44 培養(yǎng)基、G1BCO? FREESTYLE? 293表達(dá)培養(yǎng)基、EXPI293?表達(dá)培養(yǎng)基或類似培養(yǎng)基、 或其修改型。以上列出的示例性高密度培養(yǎng)基可尤其適于CHO細(xì)胞、CHO細(xì)胞變異體、293 細(xì)胞、293細(xì)胞變異體、CapT細(xì)胞、CapT細(xì)胞變異體或經(jīng)調(diào)適用于高密度培養(yǎng)系統(tǒng)的任何其 它細(xì)胞的高密度生長(zhǎng)、繁殖、轉(zhuǎn)染和維持。任選地，使用者可希望調(diào)配具有本文中所述特性 的新培養(yǎng)基，或可改為選擇重新調(diào)配或修改現(xiàn)有培養(yǎng)基。
[0146] 在一些方面，高密度生長(zhǎng)培養(yǎng)基可選自所述清單。所述培養(yǎng)基包括（但不限于）CD F0RTICH0?培養(yǎng)基、Expi293?表達(dá)培養(yǎng)基、杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基（DMEM)、最小必 需培養(yǎng)基（MEM)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基伊格爾（BME)、RPMI-1640、漢姆氏F-10、漢姆氏F-12、α最小 必需培養(yǎng)基U MEM)、格拉斯哥氏最小必需培養(yǎng)基（G-MEM)和伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏 培養(yǎng)基（MDM)?？缮藤?gòu)的（例如來(lái)自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司）或所屬 領(lǐng)域中另外已知的其它培養(yǎng)基可根據(jù)本發(fā)明等效地使用，包括（但不限于）293SFM、CD-CH0 培養(yǎng)基、VP SFM、BGJb培養(yǎng)基、布林斯特氏BM0C-3培養(yǎng)基、細(xì)胞培養(yǎng)冷凍培養(yǎng)基、CMRL培 養(yǎng)基、EHAA培養(yǎng)基、eRDF培養(yǎng)基、費(fèi)舍爾氏培養(yǎng)基、網(wǎng)堡氏B-5培養(yǎng)基、GLUTAMAX?補(bǔ)充培 養(yǎng)基、格雷斯氏昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基、HEPES緩沖培養(yǎng)基、里克特氏改良MEM、IPL-41昆蟲細(xì)胞 培養(yǎng)基、萊博維茨氏L-15培養(yǎng)基、麥考伊氏5A培養(yǎng)基、MCDB 131培養(yǎng)基、培養(yǎng)基199、改良 伊格爾培養(yǎng)基（MEM)、培養(yǎng)基NCTC-109、施奈德氏果蠅培養(yǎng)基、TC-100昆蟲培養(yǎng)基、威茅斯 氏MB 752/1培養(yǎng)基、威廉氏培養(yǎng)基、無(wú)蛋白質(zhì)雜交瘤培養(yǎng)基II (PFHM II)、AIM V培養(yǎng)基、 角質(zhì)細(xì)胞SFM、成分確定的角質(zhì)細(xì)胞SFM、STEMPRO? SFM、STEMPRO?.完全甲 基纖維素培養(yǎng)基、HepatoZYME-SFM、Neurobasal?培養(yǎng)基、神經(jīng)基質(zhì)-A培養(yǎng)基、Hibernate? A培養(yǎng)基、Hibernate E培養(yǎng)基、內(nèi)皮SFM、人類內(nèi)皮SFM、雜交瘤SFM、PFHM II、Sf 900培 養(yǎng)基、Sf 900TI SFM、EXPRESS FIVE? 培養(yǎng)基、CHO-S-SFM、AMIN0MAX-II 完全培養(yǎng)基、 AMIN0MAX-C100完全培養(yǎng)基、AMIN0MAX-C 100基礎(chǔ)培養(yǎng)基、PB-ΜΑΧ?核型分析培養(yǎng)基、 KARY0MAX骨髓核型分析培養(yǎng)基、KNOCKOUT D-MEM和CO2非依賴性培養(yǎng)基。以上培養(yǎng)基從所 屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的制造商獲得，如JRH、西格瑪公司、?？寺」竞桶輮W惠特克公司。 適用于本發(fā)明的實(shí)踐的培養(yǎng)基的其它實(shí)例可見于美國(guó)專利第5, 135, 866號(hào)和第5, 232, 848 號(hào)以及國(guó)際公開第W088/02774號(hào)、第WO 98/15614號(hào)、第WO 98/08934號(hào)和歐洲專利第 0282942號(hào)，所述專利的全文特別地以引用的方式并入本文中。任選地，使用者可希望調(diào)配 具有本文中所述特性的新培養(yǎng)基，或可改為選擇重新調(diào)配或修改現(xiàn)有培養(yǎng)基。
[0147] 本發(fā)明進(jìn)一步提供包含本發(fā)明培養(yǎng)基的組合物，其任選地可進(jìn)一步包含一或多種 哺乳動(dòng)物上皮或成纖維細(xì)胞，如上述那些，尤其是一或多種293細(xì)胞、293F細(xì)胞、PER-C6細(xì) 胞、CHO細(xì)胞、CapT細(xì)胞、C0S-7L細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞或其任何衍生物。
[0148] 在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明的高產(chǎn)量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可包括一或多種已被調(diào)適用 于在高密度條件下生長(zhǎng)而不實(shí)質(zhì)性損失其存活率、有效轉(zhuǎn)染的能力或其表達(dá)高水平重組蛋 白的能力的細(xì)胞或細(xì)胞系。優(yōu)選地，細(xì)胞是適用于在本發(fā)明中所培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞以在 約I X IO6到約20 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升范圍內(nèi)、更優(yōu)選地在約2 X IO6到約6 X IO6范圍內(nèi)的密 度生長(zhǎng)并繁殖的細(xì)胞系?？煞窍拗菩缘厥褂萌魏渭?xì)胞系，限制條件為細(xì)胞系能夠在如上所 定義的高密度條件下生長(zhǎng)，同時(shí)以超過(guò)約80 %的高密度維持其存活率，并保持其以高效率 轉(zhuǎn)染并以高達(dá)約2g/L培養(yǎng)物的水平表達(dá)重組蛋白的能力。所述細(xì)胞系的鑒別充分處于熟 練的業(yè)內(nèi)人士的范圍內(nèi)，且所述個(gè)人可在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下鑒別適用于 本發(fā)明的細(xì)胞系。被調(diào)適用于高密度培養(yǎng)物的細(xì)胞可為已調(diào)適成以高密度生長(zhǎng)在高密度培 養(yǎng)基中同時(shí)保持細(xì)胞存活率處于或高于約80%的細(xì)胞譜系或來(lái)源于同一親本細(xì)胞譜系的 細(xì)胞的（非克?。┤后w。所述細(xì)胞可通過(guò)經(jīng)>40、>50、>60、>70或>80次連續(xù)傳代以高密 度維持細(xì)胞且用所需高密度培養(yǎng)基逐漸更換生長(zhǎng)培養(yǎng)基的比例來(lái)從親本細(xì)胞群體中分離 或選擇出。任選地，在所述方法期間，不同細(xì)胞池可個(gè)別地繁殖且經(jīng)歷選擇程序，同時(shí)同步 評(píng)估轉(zhuǎn)染效率和或蛋白質(zhì)表達(dá)效率，使得可選擇出可以高密度維持和生長(zhǎng)、以高效率轉(zhuǎn)染 且表達(dá)高水平所需重組蛋白的細(xì)胞的非克隆群體。雖然熟練的從業(yè)者將易于清楚，多種細(xì) 胞類型和譜系可經(jīng)歷這種選擇程序，但已確定來(lái)源于CHO細(xì)胞的細(xì)胞譜系、來(lái)源于293成纖 維細(xì)胞的細(xì)胞譜系和來(lái)源于CapT細(xì)胞的細(xì)胞尤其經(jīng)受所述選擇方法以便被調(diào)適成高密度 生長(zhǎng)條件。理想地，被調(diào)適用于高密度生長(zhǎng)培養(yǎng)物且適用于本發(fā)明的細(xì)胞還將能夠以高效 率轉(zhuǎn)染和/或能夠以超過(guò)至少約200 μ g/mL細(xì)胞培養(yǎng)物到約2mg/mL細(xì)胞培養(yǎng)物、更通常在 約500 μ g/ml細(xì)胞培養(yǎng)物到約lmg/mL細(xì)胞培養(yǎng)物之間的產(chǎn)量表達(dá)重組蛋白。理想地，被調(diào) 適用于根據(jù)本發(fā)明使用的高密度培養(yǎng)物的細(xì)胞能夠以在約IX IO6到約20 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫 升、約2 X IO6到約2 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升、或約2. 5 X IO6到約6 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升范圍內(nèi)的 密度維持和轉(zhuǎn)染。
[0149] 借助于非限制性實(shí)例，根據(jù)本文中所述的實(shí)施例可被調(diào)適用于高密度培養(yǎng)的細(xì)胞 或細(xì)胞系可包括細(xì)胞，如培養(yǎng)的真核細(xì)胞，更優(yōu)選地培養(yǎng)的植物和/或動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選地 培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、魚細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、兩棲動(dòng)物細(xì)胞或禽類細(xì)胞。在某些優(yōu)選但非限制 性實(shí)施例中，根據(jù)本文中所述的實(shí)施例可被調(diào)適用于高密度培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞系可包括培 養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括原代上皮細(xì)胞（例如角質(zhì)細(xì)胞、頸椎上皮細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、氣 管上皮細(xì)胞、腎臟上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞）和建立的細(xì)胞系和其品系（例如293胚胎 腎臟細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa頸椎上皮細(xì)胞和PER-C6視網(wǎng)膜細(xì)胞、MDBK(NBL-I)細(xì)胞、911細(xì) 胞、CRFK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、CapT細(xì)胞、CHO細(xì)胞、BeWo細(xì)胞、張氏細(xì)胞、Detroit 562細(xì)胞、 HeLa 229 細(xì)胞、HeLa S3 細(xì)胞、!fep-2 細(xì)胞、KB 細(xì)胞、LS180 細(xì)胞、LS174T 細(xì)胞、NCI-H-548 細(xì) 胞、RPMI 2650 細(xì)胞、SW-13 細(xì)胞、T24 細(xì)胞、WI-28VA13、2RA 細(xì)胞、WISH 細(xì)胞、BS-C-I 細(xì)胞、 LLC-MK2 細(xì)胞、Clone M-3 細(xì)胞、1-10 細(xì)胞、RAG 細(xì)胞、TCMK-I 細(xì)胞、Y-I 細(xì)胞、LLC-PK1 細(xì)胞、 PK (15)細(xì)胞、GHl細(xì)胞、GH3細(xì)胞、L2細(xì)胞、LLC-RC 256細(xì)胞、MH1C1細(xì)胞、XC細(xì)胞、MDOK細(xì) 胞、VSW細(xì)胞和TH-I、B1細(xì)胞或其衍生物）、來(lái)自任何組織或器官（包括（但不限于）心、肝、 腎、結(jié)腸、腸、食道、胃、神經(jīng)組織（腦、脊髓）、肺、血管組織（動(dòng)脈、靜脈、毛細(xì)管）、淋巴組織 (淋巴腺體、腺樣體、扁桃體、骨髓和血液）、脾）的成纖維細(xì)胞、以及成纖維細(xì)胞和成纖維細(xì) 胞樣細(xì)胞系（例如CHO細(xì)胞、TRG-2細(xì)胞、頂R-33細(xì)胞、Don細(xì)胞、GHK-21細(xì)胞、瓜氨酸血癥 細(xì)胞、登普西細(xì)胞、Detroit 551 細(xì)胞、Detroit 510 細(xì)胞、Detroit 525 細(xì)胞、Detroit 529 細(xì)胞、Detroit 532 細(xì)胞、Detroit 539 細(xì)胞、Detroit 548 細(xì)胞、Detroit 573 細(xì)胞、HEL 299 細(xì)胞、頂R-90細(xì)胞、MRC-5細(xì)胞、WI-38細(xì)胞、WI-26細(xì)胞、MiCl1細(xì)胞、CHO細(xì)胞、CV-I細(xì)胞、 C0S-1 細(xì)胞、C0S-3 細(xì)胞、C0S-7 細(xì)胞、Vero 細(xì)胞、DBS-FrhL-2 細(xì)胞、BALB/3T3 細(xì)胞、F9 細(xì)胞、 SV-T2 細(xì)胞、M-MSV-BALB/3T3 細(xì)胞、K-BALB 細(xì)胞、BLO-Il 細(xì)胞、N0R-10 細(xì)胞、C3H/I0TI/2 細(xì) 胞、HSDM1C3細(xì)胞、KLN2O5細(xì)胞、麥考伊細(xì)胞、小鼠 L細(xì)胞、品系2071 (小鼠 L)細(xì)胞、L-M品系 (小鼠 U 細(xì)胞、L-ΜΤΓ(小鼠 L)細(xì)胞、NCTC 克隆株 2472 和 2555、SCC-PSA1 細(xì)胞、Swiss/3T3 細(xì)胞、印度麂細(xì)胞、SIRC細(xì)胞、C11細(xì)胞和延森細(xì)胞（Jensen cell)或其衍生物）。最優(yōu)選 地，培養(yǎng)基用于培養(yǎng)選自由以下各項(xiàng)組成的群組的哺乳動(dòng)物細(xì)胞：293細(xì)胞、293F細(xì)胞或其 衍生物、PER-C6細(xì)胞或其衍生物、CHO細(xì)胞或其衍生物、CapT細(xì)胞或其衍生物、C0S-7L細(xì)胞 或其衍生物和Sp2/0細(xì)胞或其衍生物、或能夠以如上所定義的高細(xì)胞密度培養(yǎng)的任何其它 懸浮細(xì)胞系或衍生物。更優(yōu)選地，培養(yǎng)基用于培養(yǎng)293細(xì)胞或經(jīng)修飾的293細(xì)胞系，其被專 門調(diào)適用于在形成本發(fā)明基礎(chǔ)的細(xì)胞培養(yǎng)基中最佳生長(zhǎng)。在本發(fā)明的一些優(yōu)選但非限制性 方面，被調(diào)適用于高密度培養(yǎng)的細(xì)胞是懸浮細(xì)胞或已被調(diào)適用于懸浮生長(zhǎng)的附著細(xì)胞。
[0150] 通過(guò)本發(fā)明的培養(yǎng)基支持的細(xì)胞可來(lái)源于任何動(dòng)物，優(yōu)選地是哺乳動(dòng)物，且最優(yōu) 選地是小鼠或人類。在本發(fā)明培養(yǎng)基中培育的細(xì)胞可為正常細(xì)胞或異常細(xì)胞（即，經(jīng)轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞、建立的細(xì)胞或來(lái)源于患病組織樣品的細(xì)胞）。
[0151] 被調(diào)適用于根據(jù)本文中所述的實(shí)施例高密度培養(yǎng)的細(xì)胞可任選地表達(dá)一或多種 表達(dá)增強(qiáng)性蛋白質(zhì)。如本文中所用，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)增強(qiáng)性蛋白質(zhì)"是指由細(xì)胞表達(dá)的任何蛋白 質(zhì)；所述蛋白質(zhì)的表達(dá)增強(qiáng)重組蛋白的表達(dá)。出于本發(fā)明實(shí)施例的目的，細(xì)胞系或細(xì)胞群體 對(duì)表達(dá)增強(qiáng)性蛋白質(zhì)的表達(dá)可為穩(wěn)定或瞬時(shí)的。多種此類表達(dá)增強(qiáng)性蛋白質(zhì)是所屬領(lǐng)域中 已知的，且可包括如PKBa、P21、P18、AKT等的蛋白質(zhì)。在本發(fā)明的一些方面，本發(fā) 明的高產(chǎn)量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可包括一或多種用于瞬時(shí)表達(dá)所關(guān)注重組蛋白的表達(dá)載體?？商?供已含有可表達(dá)的核酸的表達(dá)載體（如，評(píng)估在與優(yōu)化的對(duì)照蛋白質(zhì)相比時(shí)的表達(dá)效率的 陽(yáng)性對(duì)照），或可替代地，表達(dá)載體可以一種形式提供，借此使用者可易于插入含有所關(guān)注 蛋白質(zhì)的開放閱讀框架的可表達(dá)的核酸，使得所關(guān)注蛋白質(zhì)可以重組方式且以高效率表達(dá) 在細(xì)胞中。
[0152] 為了重組產(chǎn)生所關(guān)注蛋白質(zhì)，編碼所述蛋白質(zhì)的可表達(dá)的核酸被分離且插入到可 復(fù)制載體中以便進(jìn)一步克?。〝U(kuò)增DNA)或表達(dá)。編碼蛋白質(zhì)的DNA可易于使用常規(guī)程序 (例如通過(guò)使用能夠特異性結(jié)合編碼抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針）進(jìn)行分離并 測(cè)序。許多載體是可供使用的。載體組件通常包括（但不限于）以下各項(xiàng)中的一或多者： 信號(hào)序列、復(fù)制起點(diǎn)、一或多種標(biāo)記物基因、增強(qiáng)子元件、啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0153] 【（a)信號(hào)序列組件】
[0154] 所關(guān)注蛋白質(zhì)可以不僅直接重組地產(chǎn)生，而且以與異源多肽的融合多肽形式產(chǎn) 生，所述異源多肽優(yōu)選地是信號(hào)序列或在成熟蛋白質(zhì)或多肽的N端處具有特異性裂解位點(diǎn) 的其它多肽。所選擇的異源信號(hào)序列優(yōu)選地是會(huì)被宿主細(xì)胞識(shí)別并加工（即，通過(guò)信號(hào)肽 酶裂解）的信號(hào)序列。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌前導(dǎo)子（例 如單純皰疹病毒gD信號(hào)）是可供使用的。
[0155] 【（b)復(fù)制起點(diǎn)】
[0156] 表達(dá)載體或克隆載體都含有使得載體能夠在一或多種所選宿主細(xì)胞中復(fù)制的核 酸序列。一般來(lái)說(shuō)，在克隆載體中，這一序列是使得載體能夠獨(dú)立于宿主染色體DNA復(fù)制的 序列，并包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。所述序列對(duì)于多種細(xì)菌、酵母和病毒來(lái)說(shuō)是熟知 的。來(lái)自質(zhì)粒PBR322的復(fù)制起點(diǎn)適用于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適用于酵母， 并且各種病毒起點(diǎn)（SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載 體。一般來(lái)說(shuō)，哺乳動(dòng)物表達(dá)載體不需要復(fù)制起點(diǎn)組件（SV40起點(diǎn)可通常僅由于其含有早 期啟動(dòng)子而被使用）。
[0157] 【（c)選擇基因組件】
[0158] 表達(dá)載體和克隆載體可以含有也稱為可選擇標(biāo)記物的選擇基因。典型選擇基因 編碼如下蛋白質(zhì)：(a)賦予對(duì)抗生素或其它毒素（例如氨芐西林（ampicillin)、新霉素 (neomycin)、甲氨蝶呤（methotrexate)或四環(huán)素（tetracycline))的抗性；（b)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng) 缺陷型缺乏；或（c)供應(yīng)不可獲自復(fù)合培養(yǎng)基的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)素，例如編碼用于桿菌的D-丙氨 酸消旋酶的基因。
[0159] 選擇方案的一個(gè)實(shí)例利用藥物來(lái)遏止宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)。經(jīng)異源基因成功轉(zhuǎn)化的那 些細(xì)胞產(chǎn)生賦予耐藥性的蛋白質(zhì)并由此經(jīng)受住選擇方案。此類顯性選擇的實(shí)例使用藥物新 霉素、霉酚酸（mycophenolic acid)和潮霉素（hygromycin)。
[0160] 適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的可選擇標(biāo)記物的另一個(gè)實(shí)例是能夠鑒別有能力吸收編碼 抗體的核酸的細(xì)胞的標(biāo)記物，如DHFR、谷氨酰胺合成酶（GS)、胸苷激酶、金屬硫蛋白-I和金 屬硫蛋白-II，優(yōu)選地是靈長(zhǎng)類動(dòng)物金屬硫蛋白基因、腺苷脫氨酶、鳥氨酸脫羧酶等。
[0161] 舉例來(lái)說(shuō)，經(jīng)DHFR基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通過(guò)將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在含有甲氨蝶呤（Mtx， DHFR的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑）的培養(yǎng)基中來(lái)加以鑒別。在這些條件下，DHFR基因與任何其它共 轉(zhuǎn)化的核酸一起擴(kuò)增?？墒褂萌狈?nèi)源性DHFR活性的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO)細(xì)胞系（例如 ATCCCRL-9096)。
[0162] 或者，經(jīng)GS基因轉(zhuǎn)化的細(xì)胞通過(guò)將轉(zhuǎn)化體培養(yǎng)在含有L-甲硫氨酸磺酰亞胺（Msx， GS的抑制劑）的培養(yǎng)基中來(lái)加以鑒別。在這些條件下，GS基因與任何其它共轉(zhuǎn)化的核酸一 起擴(kuò)增。GS選擇/擴(kuò)增系統(tǒng)可與上述DHFR選擇/擴(kuò)增系統(tǒng)組合使用。
[0163] 或者，經(jīng)編碼所關(guān)注抗體的DNA序列、野生型DHFR基因和另一種可選擇標(biāo)記物 (如氨基糖苷3' -磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH))轉(zhuǎn)化或共轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞（尤其是含有內(nèi)源性DHFR 的野生型宿主）可通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)在含有針對(duì)可選擇標(biāo)記物（如氨基糖苷抗生素，例如卡 那霉素（kanamycin)、新霉素或G418)的選擇劑的培養(yǎng)基中來(lái)加以選擇。參見美國(guó)專利第 4, 965, 199 號(hào)。
[0164] 用于酵母的適合選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trpl基因（斯丁寇姆 (Stinchcomb)等人，自然（Nature)，282:39 (1979))。trpl基因向缺乏生長(zhǎng)于色氨酸中的能 力的酵母突變菌株（例如ATCC第44076號(hào)或PEP4-1)提供了選擇標(biāo)記物。瓊斯（Jones)，遺 傳（Genetics)，85:12(1977)。酵母宿主細(xì)胞基因組中存在trpl損傷則提供了有效環(huán)境以 便在不存在色氨酸的情況下生長(zhǎng)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)化。類似地，Leu2缺失型酵母菌株（ATCC 20, 622 或38, 626)用負(fù)載Leu2基因的已知質(zhì)粒補(bǔ)充。
[0165] 另夕卜，來(lái)源于1. 6 μ m環(huán)狀質(zhì)粒pKDl的載體可用于轉(zhuǎn)化克魯維酵母 (Kluyveromyces yeast)。或者，針對(duì)乳酸克魯維酵母（K. Iactis)報(bào)道了用于大 規(guī)模制造重組牛凝乳酶的表達(dá)系統(tǒng)。范登博格（Van den Berg)，生物技術(shù)（Bio/ Technology)，8:135 (1990)。用于通過(guò)工業(yè)克魯維酵母菌株分泌成熟重組人類血清白蛋白 的穩(wěn)定多拷貝表達(dá)載體也已公開。弗利爾（Fleer)等人，生物技術(shù)，9:968-975(1991)。
[0166] 【⑷啟動(dòng)子組件】
[0167] 表達(dá)載體和克隆載體通常含有啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子由宿主生物體識(shí)別且可操作地 連接于編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的核酸。真核生物的多種啟動(dòng)子序列是已知的。幾乎所有真核基 因都具有富AT區(qū)，其位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游約25到30個(gè)堿基處。在許多基因轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上 游70到80個(gè)堿基處可見的另一個(gè)序列是CNCAAT區(qū)，其中N可為任何核苷酸。在大多數(shù)真 核基因的3'端處是AATAAA序列，其可為聚A尾加入到編碼序列的3'端的信號(hào)。所有這些 序列都適合地插入到真核表達(dá)載體中。
[0168] 從哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的載體轉(zhuǎn)錄蛋白質(zhì)可例如通過(guò)從以下各者獲得的啟動(dòng)子 而受到控制：病毒基因組，所述病毒如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（如腺病毒2)、牛乳頭瘤 病毒、禽類肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、猴病毒40 (SV40);或異源哺 乳動(dòng)物啟動(dòng)子（例如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子）；熱休克啟動(dòng)子，限制條件為此 類啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容。
[0169] SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子方便地以還含有SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)的SV40限制 性片段形式獲得。人類巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子方便地以HindIII E限制性片段形 式獲得。在哺乳動(dòng)物宿主中使用牛乳頭瘤病毒作為載體表達(dá)DNA的系統(tǒng)公開于美國(guó)專利 第4, 419, 446號(hào)中。對(duì)這一系統(tǒng)的修改描述于美國(guó)專利第4, 601，978號(hào)中。也參見雷耶斯 (Reyes)，自然297:598-601(1982)關(guān)于在來(lái)自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子的控制下 在小鼠細(xì)胞中表達(dá)人類β-干擾素 cDNA?；蛘?，勞斯氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus)長(zhǎng) 末端重復(fù)序列可用作啟動(dòng)子。
[0170] 【（e)增強(qiáng)子元件組件】
[0171] 高等真核生物對(duì)根據(jù)本發(fā)明的編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)錄通常通過(guò)將增強(qiáng) 子序列插入到載體中而得以增加或增強(qiáng)。許多增強(qiáng)子序列現(xiàn)從哺乳動(dòng)物基因已知（球蛋 白、彈性蛋白酶、白蛋白、α-胎蛋白和胰島素）。通常但非排他性地，將使用來(lái)自真核細(xì)胞 病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括在復(fù)制起點(diǎn)的后側(cè)（bp 100-270)上的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒 早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、在復(fù)制起點(diǎn)的后側(cè)上的多瘤病毒增強(qiáng)子和腺病毒增強(qiáng)子。還參見亞尼 夫（Yaniv)，自然297:17-18(1982)關(guān)于用于活化真核啟動(dòng)子的增強(qiáng)元件。增強(qiáng)子可在抗體 編碼序列的5'或3'位處剪接到載體中，但優(yōu)選地位于始于啟動(dòng)子的5'位點(diǎn)處。其它增強(qiáng) 子在所屬領(lǐng)域中是已知的，且可包括例如獲自或來(lái)源于哺乳動(dòng)物或病毒基因的增強(qiáng)子。預(yù) 期在此使用的一種尤其優(yōu)選的增強(qiáng)子是土拔鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件（WPRE)。
[0172] 【（f)轉(zhuǎn)錄終止組件】
[0173] 用于真核宿主細(xì)胞（酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人類或來(lái)自其它多細(xì)胞生物體 的有核細(xì)胞）中的表達(dá)載體還將含有終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定化mRNA所需的序列。所述序列通常 可獲自真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶爾3'非翻譯區(qū)。這些區(qū)域含有作為聚腺苷酸化 片段在mRNA編碼抗體的非翻譯部分中轉(zhuǎn)錄的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止組件是牛 生長(zhǎng)激素聚腺苷酸化區(qū)。參見W094/11026和其中公開的表達(dá)載體。
[0174] 在一些方面，非常適用于本發(fā)明實(shí)踐的表達(dá)載體可為所屬領(lǐng)域中使用的熟知載體 中的任一者，如PCDNA 3. 3或其修飾型?？蛇m于本發(fā)明實(shí)踐的載體修飾類型的非限制性實(shí) 例包括（但不限于）修飾，如加入一或多種增強(qiáng)子、一或多種啟動(dòng)子、一或多種核糖體結(jié)合 位點(diǎn)、一或多種復(fù)制起點(diǎn)等的修飾。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，且本發(fā)明的實(shí)踐中 所用的表達(dá)載體可包括一或多種經(jīng)選擇以改進(jìn)所關(guān)注蛋白質(zhì)在本發(fā)明瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中的 表達(dá)的增強(qiáng)子元件。所選增強(qiáng)子元件可位于用于表達(dá)所關(guān)注蛋白質(zhì)的可表達(dá)的核酸序列的 5'或3'。尤其優(yōu)選但非限制性的增強(qiáng)子元件是土拔鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件（WPRE)。
[0175] 在一個(gè)優(yōu)選但非限制性實(shí)施例中，根據(jù)目前所述本發(fā)明使用的表達(dá)載體可為 pcDNA載體，或尤其是pcDNA 3. 3載體，更具體地說(shuō)是pcDNA 3. 3載體的變異體。載體可 任選地包括經(jīng)增強(qiáng)啟動(dòng)子，如和經(jīng)增強(qiáng)CMV啟動(dòng)子。任選地，載體可包括腺T+M區(qū)，任選 地SV40ori位點(diǎn)，任選地SV40剪接供體/受體位點(diǎn)，或任選地土拔鼠肝炎轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)元件 (WPRE) 〇
[0176] 在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明的高產(chǎn)量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可包括一或多種表達(dá)增強(qiáng) 齊IJ。表達(dá)增強(qiáng)劑可為含有一或多種會(huì)在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中增加重組蛋白表達(dá)的化合物的水溶 液。多種表達(dá)增強(qiáng)劑在所屬領(lǐng)域中是已知的，且任一或多種可非限制性地用于本發(fā)明的實(shí) 踐。
[0177] 一般來(lái)說(shuō)，一或多種轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑與表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞群體在所述細(xì)胞已經(jīng)可表達(dá) 的核酸或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染期間或之后接觸。當(dāng)使用兩種或更多種表達(dá)增強(qiáng)劑時(shí)，每一表達(dá)增 強(qiáng)劑可在實(shí)質(zhì)上同一時(shí)間與細(xì)胞接觸，或可替代地表達(dá)增強(qiáng)劑可依序與表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞 接觸，任選地在使細(xì)胞與第一表達(dá)增強(qiáng)劑接觸與使細(xì)胞與第二表達(dá)增強(qiáng)劑接觸之間過(guò)了一 段時(shí)間之后。
[0178] 雖然熟練的業(yè)內(nèi)人士將容易了解到任何數(shù)目的表達(dá)增強(qiáng)劑都可非限制性地用于 本發(fā)明的實(shí)踐，且對(duì)構(gòu)成適用于本發(fā)明實(shí)施例的表達(dá)增強(qiáng)劑的要素的鑒別充分在所述個(gè)人 的范圍內(nèi)，下文將描述多種示例性但非限制性表達(dá)增強(qiáng)劑，但應(yīng)了解其敘述并不限制可預(yù) 期用于本發(fā)明實(shí)踐的適合表述的范圍。
[0179] 在一些方面，一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑可包括用于補(bǔ)充根據(jù)目前所述實(shí)施例的培養(yǎng)基 調(diào)配物的液體（優(yōu)選地水性）添加劑，所述添加劑經(jīng)選擇以改進(jìn)在根據(jù)目前所述實(shí)施例的 瞬時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的所表達(dá)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑可包括會(huì)影響細(xì) 胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡、減緩細(xì)胞生長(zhǎng)和/或促進(jìn)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的數(shù)種化合物中的一或 多者。在本發(fā)明的情形下，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)增強(qiáng)劑"一般是指加入到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中的任一或多 種化合物，所述一或多種化合物的存在增強(qiáng)或促進(jìn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)高于在不存在所述表達(dá) 增強(qiáng)劑下可見的表達(dá)水平至少2倍到約10倍。適合與目前所述實(shí)施例一起使用的示例性 表達(dá)增強(qiáng)劑包括（但不限于）添加劑，如丙戊酸（VPA，酸和鈉鹽）、丙酸鈉、乙酸鋰、二甲亞 砜（DMSO)、包括半乳糖的糖、氨基酸混合物、或丁酸或上述的任何組合。每一特定表達(dá)增強(qiáng) 劑的最佳濃度可根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的個(gè)別特征和使用者的需求變化，且對(duì)在給定實(shí)驗(yàn)情境中構(gòu) 成任一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑的最佳濃度的要素的測(cè)定充分處于在所屬領(lǐng)域中具有普通技能 水平的從業(yè)者的范圍內(nèi)。
[0180] 在一個(gè)示例性實(shí)施例中，表達(dá)增強(qiáng)劑可以是含有丙戊酸的調(diào)配物。本發(fā)明的實(shí)踐 中所用的丙戊酸（VPA)的最佳最終濃度范圍可改變，但將優(yōu)選地在約0. 20mM到約25mM范 圍內(nèi)，或由此范圍涵蓋的任何子范圍或濃度值。更優(yōu)選地，VPA的最終濃度可能在以下范圍 內(nèi)：約 0· 25mM 到約 24mM、約 0· 26mM 到約 23mM、0. 27mM 到約 23mM、0. 28mM 到約 23mM、0. 29mM 到約 22mM、約 0. 30mM 到約 21mM、約 0. 31mM 到約 20mM、約 0. 32mM 到約 19mM、約 0. 33mM 到約 17mM、約 0. 34mM 到約 18mM、約 0. 35mM 到約 17mM、約 0. 36mM 到約 16mM、約 0. 37mM 到約 15mM、 約 0. 40mM 到約 14mM、約 0. 41mM 到約 13mM、約 0. 42mM 到約 12mM、約 0. 43mM 到約 I ImM、約 0. 44mM 到約 10mM、約 0. 45mM 到約 9mM、約 0. 46mM 到約 8mM、約 0. 47mM 到約 7mM、約 0. 48mM 到約 6mM、約 0. 49mM 到約 5mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 55mM 到約 3mM、 0. 6mM到約2mM或0. 75到約I. 5mM。在一些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中 所用的VPA的最終濃度可能在約0. 15mM到約I. 5mM之間、在約0. 16mM到約I. 5mM之間、在 約0. 17mM到約1.5mM之間、在約0. 18mM到約1.5mM之間、在約0. 19mM到約1.5mM之間、在 約0. 20mM到約I. 5mM之間、在約0. 25mM到約I. 5mM之間、在約0. 30mM到約I. 5mM之間、在 約0. 40mM到約I. 5mM之間、在約0. 50mM到約I. 5mM之間、在約0. 60mM到約I. 5mM之間、在 約0. 70mM到約I. 5mM之間、在約0. 80mM到約I. 5mM之間、在約0. 90mM到約I. 5mM之間或 在約0. IOmM到約I. 5mM之間。在一些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所用的 VPA的最終濃度可能在約0. 20到約I. 5mM之間、在約0. 21到約I. 4mM之間、在約0. 22到約 1. 4mM之間、在約0. 23到約I. 4mM之間、在約0. 24到約I. 4mM之間、在約0. 25到約I. 3mM 之間、在約0. 25到約I. 2mM之間、在約0. 25到約I. ImM之間或在約0. 25到約I. OmM之間。
[0181] 在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，表達(dá)增強(qiáng)劑可以是含有丙酸鈉（NaPP)的調(diào)配物。任選 地，NaPP可單獨(dú)或與如上丙戊酸組合提供。本發(fā)明的實(shí)踐中所用的NaPP的最佳最終濃度 范圍可能改變，但將優(yōu)選地在約范圍內(nèi)在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所用的NaPP的最 佳最終濃度可能在約0. 2mM到約IOOmM范圍內(nèi)，或此范圍內(nèi)涵蓋的任何子范圍或個(gè)別濃度。 在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP的最佳最終濃度可能在以下范圍內(nèi)：約0. 5到約 80mM、約 0. 4mM 到約 70mM、約 0. 5mM 到約 60mM、約 0. 6mM 到約 50mM、約 0. 7mM 到約 40mM、約 0. 8mM 到約 30mM、約 0. 9mM 到約 20mM、約 ImM 到約 15mM、約 2mM 到約 10mM、約 3mM 到約 9mM、 約4mM到約8mM或約5mM到約7mM。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP的最佳最終 濃度可能在以下范圍內(nèi)：約ImM到約10mM、約ImM到約2mM、約2mM到約3mM、約3mM到約 4mM、約4mM到約5mM、約5mM到約6mM、約6mM到約7mM、約7mM到約8mM、約8mM到約9mM或 約9mM到約10mM。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP的最佳最終濃度可能是約ImM、 約 I. 5mM、約 2mM、約 2. 5mM、約 3mM、約 3. 5mM、約 4mM、約 4. 5mM、約 5mM、約 5. 5mM、約 6mM、約 6. 5mM、約 7mM、約 7. 5mM、約 8mM、約 8. 5mM、約 9mM、約 9. 5mM 或約 10mM。
[0182] 在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，表達(dá)增強(qiáng)劑可以是含有乙酸鋰（LiAc)的調(diào)配物。任選 地，LiAc可能單獨(dú)或與如上NaPP或丙戊酸組合提供。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所 用的乙酸鋰（LiAc)的最佳最終濃度可能在以下范圍內(nèi)：約0. 25到約25mM、約0. 26mM到約 20mM、約 0· 27mM 到約 15mM、約 0· 28mM 到約 10mM、約 0· 29mM 到約 5mM、約 0· 3mM 到約 4. 5mM、 約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 到約 3mM、約 I. 5mM 到 約2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0183] 在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，表達(dá)增強(qiáng)劑可以是含有丁酸的調(diào)配物。本發(fā)明的實(shí)踐 中所用的丁酸的最佳最終濃度可能在以下范圍內(nèi)：約〇. 25到約25mM、約0. 26mM到約20mM、 約 0. 27mM 到約 15mM、約 0. 28mM 到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0. 3mM 到約 4. 5mM、約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 到約 3mM、約 I. 5mM 到約 2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0184] 根據(jù)本發(fā)明使用的表達(dá)增強(qiáng)劑可在即將轉(zhuǎn)染之前或在轉(zhuǎn)染期間、或在轉(zhuǎn)染之后但 在收獲細(xì)胞和所表達(dá)的蛋白質(zhì)之前加入到培養(yǎng)基中。在下文描述的一些特定但非限制性實(shí) 施例中，"增強(qiáng)劑1"一般是指〇. 25mM-lmM丙戊酸，且"增強(qiáng)劑2"一般是指丙酸鈉。 然而，如果另外指示，那么術(shù)語(yǔ)增強(qiáng)劑1和增強(qiáng)劑2可涵蓋不同增強(qiáng)劑化合物。表達(dá)增強(qiáng)劑 可依序或以混合物形式加入到培養(yǎng)基中。
[0185] 在本發(fā)明的一些方面，本發(fā)明的高產(chǎn)量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可包括一或多種用于將大分 子引入到所培養(yǎng)的細(xì)胞中的試劑（所述試劑通常被稱為"轉(zhuǎn)染試劑"）。根據(jù)目前所述實(shí)施 例使用的轉(zhuǎn)染試劑可為用于將生物分子（尤其是核酸分子）引入到細(xì)胞中的任何化合物或 其它化學(xué)模態(tài)，由此核酸可發(fā)揮生物功能，或在可表達(dá)的核酸的情況下，其中由所述可表達(dá) 的核酸編碼的基因或蛋白質(zhì)可被表達(dá)。多種適合的轉(zhuǎn)染試劑在所屬領(lǐng)域中是已知的，且任 一或多種可非限制性地用于本發(fā)明的實(shí)踐。
[0186] 用于本發(fā)明實(shí)施例的轉(zhuǎn)染試劑是所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知有助于大分子進(jìn)入到 細(xì)胞中的任何調(diào)配物或組合物。舉例來(lái)說(shuō)，參見美國(guó)專利第5, 279, 833號(hào)。在一些實(shí)施例 中，試劑可為"轉(zhuǎn)染試劑"且可為增加一或多種核酸攝取到一或多種目標(biāo)細(xì)胞中的任何化合 物和/或組合物。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知多種轉(zhuǎn)染試劑。適合的轉(zhuǎn)染試劑可包括（但不 限于）一或多種化合物和/或組合物，其包含陽(yáng)離子聚合物（如聚乙二亞胺（PEI))、帶正 電荷氨基酸的聚合物（如聚賴氨酸和聚精氨酸）、帶正電荷樹枝狀聚合物和斷裂的樹枝狀 聚合物、含有陽(yáng)離子β -環(huán)糊精的聚合物（CD-聚合物）、DEAE-葡聚糖等。在一些實(shí)施例 中，用于將大分子引入到細(xì)胞中的試劑可包含一或多種可為陽(yáng)離子脂質(zhì)和/或中性脂質(zhì)的 脂質(zhì)。優(yōu)選的脂質(zhì)包括（但不限于）氯化N-[l-(2,3-二油酰基氧基）丙基]-N，N，N-三甲 銨（DOTMA)、二油?；字Ｄ憠A（DOPE)、1，2-雙（油?；趸?3-(4' -三甲銨基）丙烷 (DOTAP)、1，2-二油?；?3-(4'-三甲銨基）丁?；?sn-甘油（DOTB)、1，2-二油?；?3-琥 珀酰基-sn-甘油膽堿酯（DOSC)、（4' -三甲銨基）丁酸膽固醇酯（ChoTB)、溴化十六烷基三 甲銨（CTAB)、溴化1，2-二油?；?3-二甲基-羥乙銨（DORI)、溴化1，2-二油?；趸?基-3-二甲基-羥乙銨（DORIE)、溴化1，2-二肉豆蘧氧基丙基-3-二甲基-羥乙銨（DMRIE)、 氯化0, 0' -雙十二烷基-N-[對(duì)（2-三甲氨基乙氧基）苯甲?；鵠-N，N，N-三甲銨、結(jié)合于一 或多種脂質(zhì)的精胺（例如5-羧基精胺基甘氨酸雙十八烷基酰胺（DOGS)、N，N 1，N11，Nin-四甲 基-N，N1，N 11，Nin-四棕櫚基精胺（TM-TPS)和二棕櫚?；字；掖及?-羧基精胺基酰 胺（DPPES))、脂聚賴氨酸（結(jié)合于DOPE的聚賴氨酸）、TRIS (三（羥甲基）氨基甲烷，氨基丁 三醇）結(jié)合的脂肪酸（TFA)和/或肽，如三賴氨酰基-丙氨?；?TRIS單-、二-和三-棕櫚 酸酯、（3 β _[Ν--(Ν'，Ν' -二甲氨基乙烷）-氨基甲?；鵠膽固醇（DC-Chol)、氯化Ν-( α -三 甲氨基乙?；?雙十二烷基-D-谷氨酸酯（TMAG)、溴化二甲基雙十八烷銨（DDAB)、三氟乙 酸2, 3-二油?；趸?Ν-[2(精胺-甲酰胺基）乙基]-Ν，N-二甲基-1-丙銨（DOSPA)和 其組合。
[0187] 所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解上述脂質(zhì)的某些組合已展示出尤其適于將核酸 引入到細(xì)胞中，例如DOSPA與DOPE的3:1 (w/w)組合以商標(biāo)名LIPOFECTAMINE?購(gòu)自 加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司，DOTMA與DOPE的l :l(w/w)組合以商標(biāo)名 LIPOFECTIN?購(gòu)自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司，DMRlE與膽固醇 的I: I (M/M)組合以商標(biāo)名DMRIE-C試劑購(gòu)自加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司， TM-TPS與dope的I: l. 5 (μ/m)組合以商標(biāo)名CellFECTIN?,購(gòu)自加利福尼亞州卡爾斯 巴德的生命技術(shù)公司，且DDAB與DOPE的1:2. 5 (w/w)組合以商標(biāo)名Lip_fectACE?購(gòu)自 加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司。除了上述脂質(zhì)組合之外，包含脂質(zhì)與其它化合 物的摻合物、具體來(lái)說(shuō)與包含核定位序列的肽和蛋白質(zhì)的摻合物的其它調(diào)配物是所屬領(lǐng)域 的技術(shù)人員已知的。舉例來(lái)說(shuō)，參見國(guó)際申請(qǐng)第PCT/US99/26825號(hào)，作為WO 00/27795公 開，其兩者都以引用的方式并入本文中。
[0188] 已發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)聚集體（如脂質(zhì)體）適用作將大分子傳遞到細(xì)胞中的試劑。具體來(lái)說(shuō)， 已證實(shí)包含一或多種陽(yáng)離子脂質(zhì)的脂質(zhì)聚集體在將陰離子大分子（例如核酸）傳遞到細(xì)胞 中時(shí)極其有效。一種常用陽(yáng)離子脂質(zhì)是氯化N-[l_(2,3-二油?；趸┍鵠-N，N，N_三 甲銨（DOTMA)。包含單獨(dú)DOTMA或與二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE)的1:1混合物的脂質(zhì)體 已被用于將核酸引入到細(xì)胞中。D0TMA:D0PE的1:1混合物可以商標(biāo)名LIP0FECTIN?購(gòu)自 加利福尼亞州卡爾斯巴德的生命技術(shù)公司。已用于將核酸引入到細(xì)胞中的另一種陽(yáng)離子 脂質(zhì)是1，2_雙（油?；趸?3-3-(三甲銨基）丙烷（DOTAP)。DOTAP與DOTMA的不同之 處在于油?；糠衷贒OTAP中經(jīng)由醚鍵鍵聯(lián)到丙胺主鏈，而其在DOTMA中是經(jīng)由酯鍵鍵聯(lián) 的。DOTAP被認(rèn)為更易于被目標(biāo)細(xì)胞降解。其中三甲銨部分的一個(gè)甲基經(jīng)羥乙基替代的結(jié) 構(gòu)上相關(guān)的化合物組在結(jié)構(gòu)上與磷脂酶A的羅森塔爾抑制劑（RI)類似（參見羅森塔爾等 人，（1960)生物化學(xué)雜志233:2202-2206)。RI具有鍵聯(lián)到丙胺核心的硬脂?；ァI的 二油?；愃莆锿ǔ：?jiǎn)稱為DORl-醚和DORl-酯，取決于脂質(zhì)部分與丙胺核心的鍵聯(lián)。羥 乙基部分的羥基可進(jìn)一步例如通過(guò)酯化成羧基精胺來(lái)衍生。
[0189] 已用于將大分子引入到細(xì)胞中的另一類化合物包含與脂質(zhì)連接的羧基精胺部分 (參見貝爾等人，（1989)美國(guó)國(guó)家科學(xué)院院刊86:6982-6986和EPO 0 394 111)。這類化 合物的實(shí)例包括二軟脂酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺（DPPES)和5-羧基精胺基甘 氨酸雙十八烷基酰胺（DOGS)。DOGS可以商標(biāo)名TRANSFECTAM?購(gòu)自威斯康星州麥迪遜的普 洛麥格公司。
[0190] 膽固醇的陽(yáng)離子衍生物（3β-[Ν-(Ν'，Ν'_二甲氨基乙烷）_氨基甲?；鵠膽 固醇，DC-Chol)已經(jīng)合成且與DOPE-起調(diào)配到脂質(zhì)體中（參見高等人，（1991)BBRC 179 (1) : 280-285)且用于將DNA引入到細(xì)胞中。由此調(diào)配的脂質(zhì)體據(jù)報(bào)道有效地將DNA以 低細(xì)胞毒性水平引入到細(xì)胞中。通過(guò)將聚賴氨酸結(jié)合于DOPE所形成的脂聚賴氨酸（參見 周等人，（1991)BBA 1065:8-14)據(jù)報(bào)道在將核酸在血清存在下引入到細(xì)胞中時(shí)有效。
[0191] 已用于將核酸引入到細(xì)胞中的其它類型的陽(yáng)離子脂質(zhì)包括高度填充聚陽(yáng)離子銨、 锍和鱗脂質(zhì)，如美國(guó)專利第5, 674, 908號(hào)和第5, 834, 439號(hào)和國(guó)際申請(qǐng)第PCT/US99/26825 號(hào)（作為WO 00/27795公開）中所述的那些。根據(jù)本發(fā)明一種尤其優(yōu)選但非限制性的用 于傳遞大分子的轉(zhuǎn)染試劑是購(gòu)自生命技術(shù)公司的LIP0FECTAMINE 2000?。參見美國(guó)國(guó)際申 請(qǐng)第PCT/US99/26825號(hào)，作為WO 00/27795公開。適于將大分子傳遞到細(xì)胞中的另一種 優(yōu)選但非限制性轉(zhuǎn)染試劑是EXPIFECTAMINE?。其它適合的轉(zhuǎn)染試劑包括LI0FECTAMINE? RNAiMAX、LIPOFECTAMINE? LTX、0LIG0FECTAMINE?、Cellfectin?、INVIV0FECTAMINE?、 INVIVOFECTAMINE? 2. 0以及楊等人的美國(guó)專利申請(qǐng)公開第2012/0136073號(hào)中所公開的任 何脂質(zhì)試劑或調(diào)配物（所述公開以引用的方式并入本文中）。多種其它轉(zhuǎn)染試劑是熟練的 業(yè)內(nèi)人士已知的且可針對(duì)其對(duì)于本文中所述的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和方法的適合性進(jìn)行評(píng)估。
[0192] 本發(fā)明在某種程度上是針對(duì)一種高產(chǎn)量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)，其支持（a)將至少一種大 分子（優(yōu)選地是可表達(dá)的核酸分子）引入到培養(yǎng)物中的真核細(xì)胞中，（b)培育其中已引入至 少一種大分子的細(xì)胞，以及任選地（c)在其中已引入至少一種大分子的細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋 白產(chǎn)物或表達(dá)核酸，其中含有大分子的培養(yǎng)基并不需要在將至少一種大分子引入到細(xì)胞中 之后以及在培育并產(chǎn)生蛋白質(zhì)產(chǎn)物或表達(dá)核酸之前從培養(yǎng)物中移出并用新鮮培養(yǎng)基更換。
[0193] 本發(fā)明的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、其根據(jù)本文中所描述方法的使用引起所關(guān)注蛋白質(zhì)在細(xì) 胞培養(yǎng)系統(tǒng)中快速且可重現(xiàn)的高水平表達(dá)。通常，本發(fā)明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和方法能夠以在約 200 μ g蛋白質(zhì)/L培養(yǎng)物到約2g蛋白質(zhì)/L培養(yǎng)物范圍內(nèi)的水平產(chǎn)生重組表達(dá)的蛋白質(zhì)， 取決于所需重組蛋白的個(gè)別表達(dá)特征和所用細(xì)胞類型。使用為本文提供的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和 方法，使用者可獲得超過(guò)目前使用標(biāo)準(zhǔn)可商購(gòu)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可獲得水平約2倍到高達(dá)約 20倍的所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平。使用為本文提供的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和方法，使用者可獲得與用 當(dāng)代瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可見水平相比約2. 5倍、約3倍、約3. 5倍、約4倍、約4. 5倍、約5倍、約 5. 5倍、約6倍、約6. 5倍、約7倍、約7. 5倍、約8倍、約8. 5倍、約9倍、約9. 5倍或高達(dá)約 10倍或更大的所表達(dá)的蛋白質(zhì)水平。舉例來(lái)說(shuō)，使用本發(fā)明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生重組蛋白， 使用者可獲得比使用為在懸浮細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白而優(yōu)化的可商購(gòu)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（如 FREESTYLE?表達(dá)系統(tǒng)）獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高在約2倍到約10倍之間的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。
[0194] 【方法】
[0195] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及表達(dá)高水平的所關(guān)注蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明的方法可包括懸 浮培育哺乳動(dòng)物細(xì)胞（尤其是上述那些且最尤其是293細(xì)胞、293F細(xì)胞、PER-C6細(xì)胞、CHO 細(xì)胞、CapT細(xì)胞、C0S-7L細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞或其任何衍生物），包含（a)獲得以懸浮形式培 育的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；和（b)使細(xì)胞與本發(fā)明的培養(yǎng)基在足以支持細(xì)胞懸浮培育的條件下接 觸，用編碼所關(guān)注蛋白質(zhì)的可表達(dá)的核酸轉(zhuǎn)染所培養(yǎng)的細(xì)胞，使經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與一或多種 表達(dá)增強(qiáng)劑接觸，在允許所關(guān)注蛋白質(zhì)表達(dá)所界定時(shí)間段的條件下培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，以 及收獲細(xì)胞。
[0196] 本發(fā)明進(jìn)一步涉及產(chǎn)生多肽的方法，以及通過(guò)這些方法產(chǎn)生的多肽，所述方法包 含（a)獲得細(xì)胞，優(yōu)選地是上述哺乳動(dòng)物細(xì)胞，且最優(yōu)選地是293細(xì)胞、293F細(xì)胞、PER-C6 細(xì)胞、CHO細(xì)胞、CapT細(xì)胞、C0S-7L細(xì)胞和Sp2/0細(xì)胞或其任何衍生物；(b)使細(xì)胞與包含 編碼多肽的核酸的溶液在引起核酸引入到細(xì)胞中的條件下接觸；以及（c)在本發(fā)明的培養(yǎng) 基中在有利于所需多肽通過(guò)細(xì)胞表達(dá)的條件下培育細(xì)胞。
[0197] 在一個(gè)方面，根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)重組蛋白的方法可包括在高密度培養(yǎng)基中獲得細(xì) 胞的培養(yǎng)物。細(xì)胞優(yōu)選地是以下各者的懸浮培養(yǎng)物：293細(xì)胞、293F細(xì)胞、PER-C6細(xì)胞、CHO 細(xì)胞、CapT細(xì)胞、C0S-7L細(xì)胞或Sp2/0細(xì)胞或其任何衍生物，所述細(xì)胞已適宜于在高密度培 養(yǎng)基中生長(zhǎng)。雖然熟練的業(yè)內(nèi)人士將容易了解在本發(fā)明的實(shí)踐中可使用任何體積的細(xì)胞培 養(yǎng)物，但培養(yǎng)物通常將為約200 μ 1到100升，更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約2ml到約50 升，最優(yōu)選地是約5ml到約5升。在一些方面，細(xì)胞培養(yǎng)物體積可以是約IOOml到約50升。 更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約500ml到約50升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約500ml到 約25升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約500ml到約10升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是 約500ml到約5升。更優(yōu)選地，細(xì)胞培養(yǎng)物體積是約500ml到約1升。在一些實(shí)施例中，細(xì) 胞培養(yǎng)物體積可以高達(dá)約100升、高達(dá)約95升、高達(dá)約90升、高達(dá)約85升、高達(dá)約80升、 高達(dá)約75升、高達(dá)約70升、高達(dá)約65升、高達(dá)約60升、高達(dá)約55升、高達(dá)約50升、高達(dá)約 45升、高達(dá)約40升、高達(dá)約35升、高達(dá)約30升、高達(dá)約35升、高達(dá)約20升、高達(dá)約15升、 高達(dá)約10升、高達(dá)約9升、高達(dá)約8升、高達(dá)約7升、高達(dá)約6升、高達(dá)約5升、高達(dá)約4升、 高達(dá)約2升或高達(dá)約1升。
[0198] 在一個(gè)方面，細(xì)胞培養(yǎng)物可以在約I. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升到約20 X IO6個(gè)細(xì)胞/ 毫升之間的細(xì)胞密度、或其中涵蓋的任何濃度、濃度范圍或子范圍維持。
[0199] 為了根據(jù)目前描述的本發(fā)明在細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)，細(xì)胞將通常稀釋到新鮮體積培 養(yǎng)基中。最佳稀釋度可以改變，但為了說(shuō)明性目的，稀釋到新鮮體積培養(yǎng)基中的細(xì)胞密度可 以在0. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升到約10 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升之間，更優(yōu)選地在I X IO6個(gè)細(xì)胞/ 毫升到約5 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升之間，更優(yōu)選地在I. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升到約3 X IO6個(gè)細(xì) 胞/暈升之間。
[0200] 在一個(gè)方面，在將細(xì)胞稀釋到新鮮體積培養(yǎng)基中之后，細(xì)胞可以所述體積培養(yǎng)一 段時(shí)間，隨后用可表達(dá)的核酸轉(zhuǎn)染。任選地，細(xì)胞可以培養(yǎng)高達(dá)2天，更優(yōu)選地高達(dá)約一天 半，最優(yōu)選地高達(dá)約一天。任選地，細(xì)胞可以培養(yǎng)在新鮮體積培養(yǎng)基中直到其中培養(yǎng)的細(xì)胞 密度已增加高達(dá)約100 %、更優(yōu)選地高達(dá)約95 %、高達(dá)約90 %、高達(dá)約85 %、高達(dá)約80 %、高 達(dá)約75 %、高達(dá)約70 %、高達(dá)約65 %、高達(dá)約60 %、高達(dá)約55 %、高達(dá)約50 %、高達(dá)約45 %、 高達(dá)約40%、高達(dá)約35%、高達(dá)約30%、高達(dá)約25%、高達(dá)約20%或高達(dá)約15%。
[0201] 在一個(gè)方面，在細(xì)胞已在高密度生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上文所述的一段時(shí)間之后， 細(xì)胞可經(jīng)可表達(dá)的核酸或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染。使用者進(jìn)行以實(shí)現(xiàn)將表達(dá)載體引入到細(xì)胞中的 步驟的精確順序可變化，取決于所選擇的特定轉(zhuǎn)染試劑、細(xì)胞系、培養(yǎng)基和各種其它實(shí)驗(yàn)參 數(shù)，如在所屬領(lǐng)域中具有普通技能水平的從業(yè)者將易于認(rèn)識(shí)到般。僅舉例來(lái)說(shuō)，在選擇基于 脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（具體來(lái)說(shuō)，具有至少一種陽(yáng)離子脂質(zhì)的轉(zhuǎn)染系統(tǒng)）的情況下，轉(zhuǎn)染試劑將 首先與核酸在水溶液中接觸以在如上所定義且并入本文中的過(guò)程（非正式地稱為"復(fù)合" 或"復(fù)合反應(yīng)"）中形成脂質(zhì)-DNA復(fù)合物。所述反應(yīng)通常將在與培養(yǎng)細(xì)胞的容器分開的反 應(yīng)容器中實(shí)現(xiàn)。
[0202] 在一個(gè)方面，在上述復(fù)合步驟中形成脂質(zhì)-DNA復(fù)合物之后，轉(zhuǎn)染復(fù)合物可與所培 養(yǎng)的細(xì)胞接觸。在細(xì)胞與轉(zhuǎn)染復(fù)合物接觸之后，細(xì)胞可在轉(zhuǎn)染復(fù)合物存在下培養(yǎng)第一時(shí)間 段。第一時(shí)間段的持續(xù)時(shí)間將根據(jù)細(xì)胞的性質(zhì)、所用轉(zhuǎn)染試劑和所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員已知 的多種其它因素變化。短語(yǔ)"第一時(shí)間段"當(dāng)用于根據(jù)本文中所述的本發(fā)明方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì) 胞的方法的情形時(shí)通常是指在細(xì)胞群體經(jīng)可表達(dá)的核酸轉(zhuǎn)染與一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑加入 到經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中之間的時(shí)間間隔。第一時(shí)間段通常將在約2小時(shí)到約4天范圍內(nèi)，或其 中涵蓋的任何范圍或子范圍。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，第一時(shí)間段可能在以下 范圍內(nèi)：約3到約90小時(shí)、約4到約85小時(shí)、約5到約80小時(shí)、約6到約75小時(shí)、約7到 約70小時(shí)、約8到約65小時(shí)、約9到約60小時(shí)、約10到約55小時(shí)、約11到約50小時(shí)、約 12到約45小時(shí)、約13到約40小時(shí)、約14到約35小時(shí)、約15到30小時(shí)、約16到約24小 時(shí)、約17到約24小時(shí)、約18到約24小時(shí)、約19到約24小時(shí)、約20到約24小時(shí)、約21到 約24小時(shí)、約22到約24小時(shí)或約23到約24小時(shí)。在其它優(yōu)選非限制性實(shí)施例中，第一 時(shí)間段可能高達(dá)約15小時(shí)、高達(dá)約16小時(shí)、高達(dá)約17小時(shí)、高達(dá)約18小時(shí)、高達(dá)約19小 時(shí)、高達(dá)約20小時(shí)、高達(dá)約21小時(shí)、高達(dá)約22小時(shí)、高達(dá)約23小時(shí)、高達(dá)約24小時(shí)、高達(dá) 約25小時(shí)、高達(dá)約26小時(shí)、高達(dá)約27小時(shí)、高達(dá)約28小時(shí)、高達(dá)約29小時(shí)或高達(dá)約30小 時(shí)。
[0203] 在一個(gè)高度優(yōu)選但非限制性實(shí)施例中，培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)染復(fù)合物引入到細(xì)胞中且維持 第一時(shí)間段的持續(xù)時(shí)間之后不經(jīng)更換、補(bǔ)充或補(bǔ)給。
[0204] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，培養(yǎng)的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞可在第一時(shí)間段之后與一或多種表達(dá) 增強(qiáng)劑接觸。表達(dá)增強(qiáng)劑可為含有一或多種會(huì)在瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)中增加重組蛋白表達(dá)的化合 物的水溶液。多種表達(dá)增強(qiáng)劑在所屬領(lǐng)域中是已知的，且任一或多種可非限制性地用于本 發(fā)明的實(shí)踐。
[0205] -般來(lái)說(shuō)，一或多種轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑與表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞群體在所述細(xì)胞已經(jīng)可表達(dá) 的核酸或表達(dá)載體轉(zhuǎn)染期間或之后接觸。當(dāng)使用兩種或更多種表達(dá)增強(qiáng)劑時(shí)，每一表達(dá)增 強(qiáng)劑可在實(shí)質(zhì)上同一時(shí)間與細(xì)胞接觸，或可替代地表達(dá)增強(qiáng)劑可依序與表達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞 接觸，任選地在使細(xì)胞與第一表達(dá)增強(qiáng)劑接觸與使細(xì)胞與第二表達(dá)增強(qiáng)劑接觸之間過(guò)了一 段時(shí)間之后。
[0206] 雖然熟練的業(yè)內(nèi)人士將容易了解到任何數(shù)目的表達(dá)增強(qiáng)劑都可非限制性地用于 本發(fā)明的實(shí)踐，且對(duì)構(gòu)成適用于本發(fā)明實(shí)施例的表達(dá)增強(qiáng)劑的要素的鑒別充分在所述個(gè)人 的范圍內(nèi)，下文將描述多種示例性但非限制性表達(dá)增強(qiáng)劑，但應(yīng)了解其敘述并不限制可預(yù) 期用于本發(fā)明實(shí)踐的適合表述的范圍。
[0207] 在一些方面，一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑可包括用于補(bǔ)充根據(jù)目前所述實(shí)施例的培養(yǎng)基 調(diào)配物的液體（優(yōu)選地水性）添加劑，所述添加劑經(jīng)選擇以改進(jìn)在根據(jù)目前所述實(shí)施例的 瞬時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生的所表達(dá)蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑可包括會(huì)影響細(xì) 胞周期進(jìn)程、抑制細(xì)胞凋亡、減緩細(xì)胞生長(zhǎng)和/或促進(jìn)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的數(shù)種化合物中的一或 多者。在本發(fā)明的情形下，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)增強(qiáng)劑"一般是指加入到瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中的任一或多 種化合物，所述一或多種化合物的存在增強(qiáng)或促進(jìn)目標(biāo)蛋白的表達(dá)高于在不存在所述表達(dá) 增強(qiáng)劑下可見的表達(dá)水平至少2倍到約10倍。適合與目前所述實(shí)施例一起使用的示例性 表達(dá)增強(qiáng)劑包括（但不限于）添加劑，如丙戊酸（VPA，酸和鈉鹽）、丙酸鈉、乙酸鋰、二甲亞 砜（DMSO)、包括半乳糖的糖、氨基酸混合物、或丁酸或上述的任何組合。每一特定表達(dá)增強(qiáng) 劑的最佳濃度可根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的個(gè)別特征和使用者的需求變化，且對(duì)在給定實(shí)驗(yàn)情境中構(gòu) 成任一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑的最佳濃度的要素的測(cè)定充分處于在所屬領(lǐng)域中具有普通技能 水平的從業(yè)者的范圍內(nèi)。
[0208] 在一個(gè)示例性實(shí)施例中，表達(dá)增強(qiáng)劑可以是含有丙戊酸的調(diào)配物。本發(fā)明的實(shí)踐 中所用的丙戊酸（VPA)的最佳最終濃度范圍可改變，但將優(yōu)選地在約0. 20mM到約25mM范 圍內(nèi)，或由此范圍涵蓋的任何子范圍或濃度值。更優(yōu)選地，VPA的最終濃度可能在以下范圍 內(nèi)：約 0· 25mM 到約 24mM、約 0· 26mM 到約 23mM、0. 27mM 到約 23mM、0. 28mM 到約 23mM、0. 29mM 到約 22mM、約 0. 30mM 到約 21mM、約 0. 31mM 到約 20mM、約 0. 32mM 到約 19mM、約 0. 33mM 到約 17mM、約 0. 34mM 到約 18mM、約 0. 35mM 到約 17mM、約 0. 36mM 到約 16mM、約 0. 37mM 到約 15mM、 約 0. 40mM 到約 14mM、約 0. 41mM 到約 13mM、約 0. 42mM 到約 12mM、約 0. 43mM 到約 I ImM、約 0. 44mM 到約 10mM、約 0. 45mM 到約 9mM、約 0. 46mM 到約 8mM、約 0. 47mM 到約 7mM、約 0. 48mM 到約 6mM、約 0. 49mM 到約 5mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 50mM 到約 4mM、約 0. 55mM 到約 3mM、 0. 6mM到約2mM或0. 75到約I. 5mM。在一些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所 用的VPA的最終濃度可能在約0. 15mM到約I. 5mM之間、在約0. 16mM到約I. 5mM之間、在約 0. 17mM到約I. 5mM之間、在約0. 18mM到約I. 5mM之間、在約0. 19mM到約I. 5mM之間、在約 0. 20mM到約I. 5mM之間、在約0. 25mM到約I. 5mM之間、在約0. 30mM到約I. 5mM之間、在約 0. 40mM到約I. 5mM之間、在約0. 50mM到約I. 5mM之間、在約0. 60mM到約I. 5mM之間、在約 0. 70mM到約I. 5mM之間、在約0. 80mM到約I. 5mM之間、在約0. 90mM到約I. 5mM之間或在約 0. IOmM到約I. 5mM之間。在一些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所用的VPA 的最終濃度可能在約約〇. 20到約I. 5mM之間、在約0. 21到約I. 4mM之間、在約0. 22到約 1. 4mM之間、在約0. 23到約I. 4mM之間、在約0. 24到約I. 4mM之間、在約0. 25到約I. 3mM 之間、在約0. 25到約I. 2mM之間、在約0. 25到約I. ImM之間或在約0. 25到約I. OmM之間。
[0209] 在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，表達(dá)增強(qiáng)劑可以是含有丙酸鈉（NaPP)的調(diào)配物。任選 地，NaPP可單獨(dú)或與如上丙戊酸組合提供。本發(fā)明的實(shí)踐中所用的NaPP的最佳最終濃度 范圍可能改變，但將優(yōu)選地在約范圍內(nèi)在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所用的NaPP的最 佳最終濃度可能在約0. 2mM到約IOOmM范圍內(nèi)，或此范圍內(nèi)涵蓋的任何子范圍或個(gè)別濃度。 在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP的最佳最終濃度可能在以下范圍內(nèi)：約0. 5到約 80mM、約 0. 4mM 到約 70mM、約 0. 5mM 到約 60mM、約 0. 6mM 到約 50mM、約 0. 7mM 到約 40mM、約 0. 8mM 到約 30mM、約 0. 9mM 到約 20mM、約 ImM 到約 15mM、約 2mM 到約 10mM、約 3mM 到約 9mM、 約4mM到約8mM或約5mM到約7mM。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP的最佳最終 濃度可能在以下范圍內(nèi)：約ImM到約10mM、約ImM到約2mM、約2mM到約3mM、約3mM到約 4mM、約4mM到約5mM、約5mM到約6mM、約6mM到約7mM、約7mM到約8mM、約8mM到約9mM或 約9mM到約10mM。在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP的最佳最終濃度可能是約ImM、 約 I. 5mM、約 2mM、約 2. 5mM、約 3mM、約 3. 5mM、約 4mM、約 4. 5mM、約 5mM、約 5. 5mM、約 6mM、約 6. 5mM、約 7mM、約 7. 5mM、約 8mM、約 8. 5mM、約 9mM、約 9. 5mM 或約 10mM。
[0210] 在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，表達(dá)增強(qiáng)劑可以是含有乙酸鋰（LiAc)的調(diào)配物。任選 地，LiAc可能單獨(dú)或與如上NaPP或丙戊酸組合提供。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明的實(shí)踐中所 用的乙酸鋰（LiAc)的最佳最終濃度可能在以下范圍內(nèi)：約0. 25到約25mM、約0. 26mM到約 20mM、約 0· 27mM 到約 15mM、約 0· 28mM 到約 10mM、約 0· 29mM 到約 5mM、約 0· 3mM 到約 4. 5mM、 約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 到約 3mM、約 I. 5mM 到 約2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0211] 在另一個(gè)示例性實(shí)施例中，表達(dá)增強(qiáng)劑可以是含有丁酸的調(diào)配物。本發(fā)明的實(shí)踐 中所用的丁酸的最佳最終濃度可能在以下范圍內(nèi)：約〇. 25到約25mM、約0. 26mM到約20mM、 約 0. 27mM 到約 15mM、約 0. 28mM 到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0. 3mM 到約 4. 5mM、約 0. 31mM 到約 4mM、約 0. 35mM 到約 3mM、約 0. 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 到約 3mM、約 I. 5mM 到約 2. 5mM或約2mM到約3mM。
[0212] 根據(jù)本發(fā)明使用的表達(dá)增強(qiáng)劑可在即將轉(zhuǎn)染之前或在轉(zhuǎn)染期間、或在轉(zhuǎn)染之后但 在收獲細(xì)胞和所表達(dá)的蛋白質(zhì)之前加入到培養(yǎng)基中。在下文描述的一些特定但非限制性實(shí) 施例中，"增強(qiáng)劑1"一般是指〇. 25mM-lmM丙戊酸，且"增強(qiáng)劑2"一般是指丙酸鈉。 然而，如果另外指示，那么術(shù)語(yǔ)增強(qiáng)劑1和增強(qiáng)劑2可涵蓋不同增強(qiáng)劑化合物。表達(dá)增強(qiáng)劑 可依序或以混合物形式加入到培養(yǎng)基中。
[0213] 在一個(gè)方面，當(dāng)使用兩種或更多種表達(dá)增強(qiáng)劑時(shí)，所述兩種或更多種表達(dá)增強(qiáng)劑 可與所轉(zhuǎn)染的經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)質(zhì)上同時(shí)接觸，或可替代地所轉(zhuǎn)染的經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞可首先與第一 表達(dá)增強(qiáng)劑接觸，且在第二時(shí)間段之后，所轉(zhuǎn)染的經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞可與第二表達(dá)增強(qiáng)劑接觸。在 一個(gè)方面，"第二時(shí)間段"當(dāng)用于根據(jù)本文中所述的本發(fā)明方法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法的情形 時(shí)通常是指在加入一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑與或者加入一或多種其它增強(qiáng)劑或者收獲經(jīng)轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞并對(duì)其中表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行純化或分離之間的時(shí)間間隔。第二時(shí)間段通常將在約10 小時(shí)到約10天范圍內(nèi)，但其它時(shí)間間隔在確定對(duì)于所表達(dá)蛋白質(zhì)最佳時(shí)可以使用。在一 些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，第二時(shí)間段可能在以下范圍內(nèi)：2小時(shí)到5天、2. 5小時(shí)到4 天、約3到約90小時(shí)、約4到約85小時(shí)、約5到約80小時(shí)、約6到約75小時(shí)、約7到約70 小時(shí)、約8到約65小時(shí)、約9到約60小時(shí)、約10到約55小時(shí)、約11到約50小時(shí)、約12到 約45小時(shí)、約13到約40小時(shí)、約14到約35小時(shí)、約15到30小時(shí)、約16到約24小時(shí)、約 17到約24小時(shí)、約18到約24小時(shí)、約19到約24小時(shí)、約20到約24小時(shí)、約21到約24 小時(shí)、約22到約24小時(shí)或約23到約24小時(shí)。在其它優(yōu)選非限制性實(shí)施例中，第一時(shí)間段 可能高達(dá)約15小時(shí)、高達(dá)約16小時(shí)、高達(dá)約17小時(shí)、高達(dá)約18小時(shí)、高達(dá)約19小時(shí)、高達(dá) 約20小時(shí)、高達(dá)約21小時(shí)、高達(dá)約22小時(shí)、高達(dá)約23小時(shí)、高達(dá)約24小時(shí)、高達(dá)約25小 時(shí)、高達(dá)約26小時(shí)、高達(dá)約27小時(shí)、高達(dá)約28小時(shí)、高達(dá)約29小時(shí)或高達(dá)約30小時(shí)。
[0214] 在經(jīng)過(guò)適當(dāng)量時(shí)間之后，使用者可以收獲細(xì)胞并任選地純化所表達(dá)的重組蛋白。
[0215] 本發(fā)明的方法允許使用者根據(jù)上述實(shí)施例瞬時(shí)表達(dá)重組蛋白而不必在所述方法 期間更換、補(bǔ)充或另外補(bǔ)給培養(yǎng)基。本文中所描述的方法允許使用者每升培養(yǎng)的細(xì)胞表 達(dá)高達(dá)約2克。在一些實(shí)施例中，使用者可以對(duì)每升培養(yǎng)的細(xì)胞表達(dá)高達(dá)約I. 9g、高達(dá)約 I. 8g、高達(dá)約I. 7g、高達(dá)約I. 6g、高達(dá)約I. 5g、高達(dá)約I. 4g、高達(dá)約I. 3g、高達(dá)約I. 2g、高達(dá) 約I. Ig或高達(dá)約Ig重組蛋白。
[0216] 本發(fā)明還針對(duì)組合物，尤其是如上所定義的高密度細(xì)胞培養(yǎng)基，其任選地包含一 或多種替代化合物。本發(fā)明還針對(duì)使用所述組合物的方法，包括例如體外培育真核細(xì)胞 (尤其是動(dòng)物細(xì)胞）的方法。本發(fā)明還涉及包含所述培養(yǎng)基和一或多種細(xì)胞（尤其是本文 中特定提及的那些細(xì)胞）的組合物，和包含上述組合物中的一或多者的試劑盒。本發(fā)明還 涉及表達(dá)載體，其包含一或多種可表達(dá)的核酸序列與一或多種啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和在如上所 定義且并入本文中的所培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)所述可表達(dá)的核酸所需的其它元件的組合。本發(fā) 明還涉及組合物，其包含一或多種表達(dá)增強(qiáng)劑組合物，尤其是經(jīng)選擇以使所述可表達(dá)的核 酸在所培養(yǎng)的細(xì)胞中的表達(dá)增強(qiáng)至少2到2. 5倍的那些。任選地，表達(dá)增強(qiáng)劑可為共同調(diào) 配或分別提供的兩種或表達(dá)增強(qiáng)劑的組合。本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)染試劑，尤其是經(jīng)優(yōu)化以有助 于一或多種核酸分子傳遞到所培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)部的那些。本發(fā)明還涉及包含上述組合物、載 體、表達(dá)增強(qiáng)劑、轉(zhuǎn)染試劑等中的一或多者的試劑盒，和包含上述組合物（尤其是本文中特 定提及的那些細(xì)胞）中的一或多者的試劑盒。
[0217] 在另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種用于體外培育細(xì)胞的試劑盒。試劑盒包含一或多 個(gè)容器，其中第一容器含有本發(fā)明的培養(yǎng)基。試劑盒可進(jìn)一步包含一或多個(gè)其它容器，每 一容器含有一或多種選自由以下各項(xiàng)組成的群組的補(bǔ)充劑：一或多種細(xì)胞因子、肝素、一或 多種動(dòng)物或動(dòng)物來(lái)源肽、一或多種酵母肽和一或多種植物肽（優(yōu)選地是來(lái)自大米、蘆薈、大 豆、玉米、小麥、豌豆、南瓜、菠菜、胡蘿卜、馬鈴薯、甘薯、木薯、鱷梨、大麥、椰子和/或綠豆 和/或一或多種其它植物的一或多種肽）。
[0218] 本發(fā)明的試劑盒可進(jìn)一步包含一或多個(gè)容器，所述一或多個(gè)容器包含核酸和/或 有助于將至少一種大分子（例如核酸）引入到培養(yǎng)在本發(fā)明培養(yǎng)基中的細(xì)胞中的試劑（即 轉(zhuǎn)染試劑）。優(yōu)選的轉(zhuǎn)染試劑包括（但不限于）陽(yáng)離子脂質(zhì)等。
[0219] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面的試劑盒可包含本發(fā)明的培養(yǎng)基、一或多種替代化合物 (其可為一或多種結(jié)合金屬的化合物）和/或一或多種過(guò)渡元素絡(luò)合物中的一或多者，且可 任選地包含一或多種核酸和轉(zhuǎn)染試劑。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面的試劑盒可包含一或多種 細(xì)胞培養(yǎng)基（其中的一者可為基礎(chǔ)培養(yǎng)基）且任選地包含一或多種替代化合物。本發(fā)明的 試劑盒還可含有關(guān)于使用試劑盒來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞和/或?qū)⒋蠓肿踊蚧衔铮ɡ绾怂?，如DNA) 引入到細(xì)胞中的說(shuō)明書。
[0220] 相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員將易于清楚的是，對(duì)本文中所述的方法和應(yīng)用的其它適合修 改和改編是顯而易見的且可在不脫離本發(fā)明或其任何實(shí)施例的范圍的情況下進(jìn)行?，F(xiàn)已詳 細(xì)描述本發(fā)明，通過(guò)參考以下實(shí)例將更清楚地理解本發(fā)明，所述實(shí)例僅出于說(shuō)明的目的隨 同包括在內(nèi)且并不打算限制本發(fā)明。
[0221] 【實(shí)施例】
[0222] 【目的】
[0223] 為了開發(fā)將蛋白質(zhì)產(chǎn)量增到最大（超過(guò)用可商購(gòu)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)（如Freestyle? 293系統(tǒng)）獲得的產(chǎn)量至少2倍）的細(xì)胞培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。系統(tǒng)應(yīng)對(duì)于多種蛋白質(zhì)類型 和在多種懸浮細(xì)胞中起作用。系統(tǒng)應(yīng)增加再現(xiàn)性且將變異性減到最少且應(yīng)是可按比例擴(kuò)大 的（多孔板到大規(guī)模）。本發(fā)明的其它實(shí)施例包括開發(fā)改進(jìn)的表達(dá)載體、被調(diào)適用于在高密 度培養(yǎng)條件下在本發(fā)明的培養(yǎng)系統(tǒng)中生長(zhǎng)的高密度細(xì)胞系、使用且并入轉(zhuǎn)染增強(qiáng)子（如丙 戊酸和丙酸鈉（除其它之外））。本發(fā)明的另一個(gè)目的是開發(fā)一種能夠以高細(xì)胞密度轉(zhuǎn)染的 方案，其并不涉及在轉(zhuǎn)染期間或之后進(jìn)行培養(yǎng)基更換，且其簡(jiǎn)單并易于使用。
[0224] 應(yīng)了解，本發(fā)明出于清楚的目的描述于分開的實(shí)施例的情形中的某些特征還可以 組合形式提供于單個(gè)實(shí)施例中。相反地，出于簡(jiǎn)潔的目的描述于單個(gè)實(shí)施例的情形中的本 發(fā)明的各種特征還可以分開地或以任何適合的子組合形式提供。
[0225] 【實(shí)施例1 :高密度培養(yǎng)基】
[0226] 評(píng)估多種可商購(gòu)的無(wú)血清、無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基維持細(xì)胞密度高達(dá)約14X IO6個(gè)細(xì)胞/ 毫升且由此用于本發(fā)明的實(shí)踐的經(jīng)調(diào)適293F細(xì)胞系的存活率的能力。選擇這樣的無(wú)血清、 無(wú)蛋白質(zhì)培養(yǎng)基：其中培養(yǎng)物細(xì)胞系經(jīng)超過(guò)一周的時(shí)間范圍存活率保持較高且甚至接近幾 乎15 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升的密度，同時(shí)還能夠以出人意料高的約3 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì) 胞密度（相較于目前可商購(gòu)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的IX IO6個(gè)細(xì)胞/毫升）轉(zhuǎn)染。結(jié)果描繪于 圖1中，其展示使用根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)的所得細(xì)胞密度的圖 式。先前被調(diào)適用于高密度生長(zhǎng)的細(xì)胞經(jīng)3代緩慢調(diào)適到各種測(cè)試的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。細(xì)胞 調(diào)適的培養(yǎng)基包括根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的高密度培養(yǎng)基（實(shí)心圓）、測(cè)試培養(yǎng)基1 (實(shí) 心三角形）、測(cè)試培養(yǎng)基2 (空心三角形）和測(cè)試培養(yǎng)基3 (空心菱形）。將細(xì)胞在每一培養(yǎng) 基中培養(yǎng)多代，隨后以〇. 2 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升接種于30ml燒瓶中。在經(jīng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程不補(bǔ)給、 更換或另外補(bǔ)充生長(zhǎng)培養(yǎng)基的情況下，經(jīng)8天監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度和存活率。所選生長(zhǎng)培養(yǎng)基之 一（高密度生長(zhǎng)培養(yǎng)基；實(shí)心圓）經(jīng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程能夠維持出人意料高密度的所培養(yǎng)的懸浮細(xì) 胞而不實(shí)質(zhì)上損失存活率。因此，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可能易于評(píng)估用于作為細(xì)胞系變異 體的特定細(xì)胞系的多種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基可基于有助于經(jīng)所界定時(shí)間段培育高 密度懸浮細(xì)胞而不必替換、補(bǔ)充或補(bǔ)給培養(yǎng)基的能力進(jìn)行選擇。這可由熟練的業(yè)內(nèi)人士在 無(wú)過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情況下實(shí)現(xiàn)。
[0227] 【實(shí)施例2 :細(xì)胞系優(yōu)化】
[0228] 盡管本發(fā)明的實(shí)踐中可使用多種懸浮細(xì)胞，但優(yōu)選的是使用已被調(diào)適用于本發(fā)明 的實(shí)施例和所選高密度生長(zhǎng)培養(yǎng)基的細(xì)胞系。另外，細(xì)胞可經(jīng)特定選擇以實(shí)現(xiàn)高密度生長(zhǎng)、 高存活率和增加的蛋白質(zhì)表達(dá)。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，親本293F成纖維細(xì)胞經(jīng)歷了廣泛的調(diào)適 過(guò)程，所述過(guò)程涉及經(jīng)數(shù)代逐漸更換培養(yǎng)基。另外，應(yīng)注意經(jīng)調(diào)適的細(xì)胞大小和表達(dá)能力伴 隨后代增加。在第72代，將細(xì)胞在ATCC庫(kù)存且通過(guò)基因分析驗(yàn)證，且將其認(rèn)證為無(wú)支原體 污染的293F細(xì)胞。將細(xì)胞解凍且檢驗(yàn)其存活率。將細(xì)胞傳30代以驗(yàn)證穩(wěn)定性、表達(dá)性能 和其在生長(zhǎng)于培養(yǎng)物中時(shí)保持高存活率和高達(dá)約20 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升的密度的能力。與 原始細(xì)胞系（系1)相比，如上文所述的針對(duì)增加的細(xì)胞密度、存活率和人IgG表達(dá)進(jìn)行選 擇的細(xì)胞群體展示出多到約1. 7倍的hlgG。高產(chǎn)量調(diào)適的細(xì)胞（系3)還具有增加的生長(zhǎng) 速率、存活率和細(xì)胞大小。
[0229] 圖2展示概述用于根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的細(xì)胞系表達(dá)優(yōu)化 的條形圖。將親本293F細(xì)胞系分割成多個(gè)傳代培養(yǎng)物，隨后將所述多個(gè)傳代培養(yǎng)物調(diào)適到 高密度培養(yǎng)基中。能夠以高密度生長(zhǎng)的各個(gè)傳代培養(yǎng)物接著針對(duì)其表達(dá)重組測(cè)試蛋白（人 類IgG)的能力進(jìn)行選擇和評(píng)估。標(biāo)記為高產(chǎn)量調(diào)適的293F細(xì)胞的細(xì)胞的傳代培養(yǎng)物（右 組條形）與來(lái)源于相同親本293F細(xì)胞系的細(xì)胞的兩種不同傳代培養(yǎng)物相比表達(dá)多35%到 45%之間的重組IgG。因此，所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員可能易于獲得已經(jīng)特定選擇以用于生長(zhǎng)培 養(yǎng)基的細(xì)胞系或細(xì)胞系衍生物，且可基于有助于經(jīng)所界定時(shí)間段培育高密度懸浮細(xì)胞而不 必替換、補(bǔ)充或補(bǔ)給培養(yǎng)基的能力進(jìn)行選擇。這可由熟練的業(yè)內(nèi)人士在無(wú)過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情況 下實(shí)現(xiàn)。
[0230] 【實(shí)施例3 :由表達(dá)增強(qiáng)劑輔助的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染】
[0231] 在組合實(shí)驗(yàn)中測(cè)試一組化學(xué)添加劑以評(píng)估每一組分或一或多種組分的組合對(duì)蛋 白質(zhì)產(chǎn)量的相對(duì)貢獻(xiàn)。鑒別出顯著改進(jìn)蛋白質(zhì)產(chǎn)生的多種轉(zhuǎn)染/表達(dá)增強(qiáng)劑。組分被調(diào)配 成2種穩(wěn)定增強(qiáng)劑溶液。轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑1(丙戊酸，如上所定義）使hlgG表達(dá)加倍。增強(qiáng)劑 2(丙酸鈉，如上所定義）單獨(dú)不具有強(qiáng)作用，但與增強(qiáng)劑1組合，提供了相較于對(duì)照（既無(wú) 增強(qiáng)劑1也無(wú)增強(qiáng)劑2)多到幾乎3倍的hlgG。
[0232] 圖3展示概述根據(jù)一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中所用的各種增強(qiáng)劑1和增強(qiáng)劑2 的作用的條形圖。組分被調(diào)配成2種穩(wěn)定增強(qiáng)劑溶液。表達(dá)增強(qiáng)劑1的加入使hlgG表達(dá) 加倍（比較前兩個(gè)條形）。增強(qiáng)劑2本身的加入僅展示對(duì)IgG增強(qiáng)表達(dá)的邊際作用，但當(dāng)與 增強(qiáng)劑1組合加入時(shí)，相較于對(duì)照提供多到幾乎3倍的hlgG(比較第三和第四）。
[0233] 【實(shí)施例4 :蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果】
[0234] 本發(fā)明的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)可以產(chǎn)生在lg/L到約2g/L之間的人IgG和Cripto。本 發(fā)明系統(tǒng)的瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)展示出在與可商購(gòu)的Freestyle? 293系統(tǒng)相比時(shí)在圖4A到4D 中所示的蛋白質(zhì)的瞬時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)方面在3. 5X-11. 8X之間的增加。圖4展示使用根據(jù) 一些實(shí)施例的高產(chǎn)量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)和現(xiàn)有技術(shù)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（Freestyle? 293系統(tǒng)）的4 種不同且獨(dú)特蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的比較。圖4A展示在與可商購(gòu)的Freestyle? Max系統(tǒng)相 比時(shí)使用根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的人類IgG表達(dá)的大于5倍的增加。圖 4B展示在與可商購(gòu)的Freestyle? Max系統(tǒng)相比時(shí)使用根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn) 染系統(tǒng)的Cripto表達(dá)的大于5. 2倍的增加。圖4C展示在與可商購(gòu)的FreeStyle? Max系 統(tǒng)相比時(shí)使用根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的β 2-腎上腺素受體表達(dá)的幾乎 4倍的增加。圖4D展示在與可商購(gòu)的FreeStyle? Max系統(tǒng)相比時(shí)使用根據(jù)本發(fā)明的一些 實(shí)施例的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的兔IgG表達(dá)的大于11倍的增加。
[0235] 【實(shí)施例5 :EP0表達(dá)、可按比例擴(kuò)大性和再現(xiàn)性】
[0236] 接下來(lái)，我們?cè)噲D探討使用具臨床重要性的廣泛使用的所表達(dá)蛋白質(zhì)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 系統(tǒng)的可按比例擴(kuò)大性和再現(xiàn)性。使用本發(fā)明的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)（圖式右側(cè)上的條形）和 Freestyle? 293系統(tǒng)（圖式左側(cè)上的條形）表達(dá)紅血球生成素（EPO)。本發(fā)明系統(tǒng)可從 Iml (呈24孔板形式）按比例擴(kuò)大到1L(3L搖瓶形式）。在來(lái)自三個(gè)不同實(shí)驗(yàn)室的三個(gè)獨(dú) 立分析員的結(jié)果中可見極好的再現(xiàn)性。
[0237] 【結(jié)論】
[0238] 使用高產(chǎn)量瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)兩種不同蛋白質(zhì)的lg/L表達(dá)。高密度培養(yǎng)基能夠 實(shí)現(xiàn)高密度轉(zhuǎn)染。經(jīng)由細(xì)胞系選擇獲得對(duì)瞬時(shí)蛋白質(zhì)表達(dá)的顯著改進(jìn)。轉(zhuǎn)染增強(qiáng)子以高細(xì) 胞密度改進(jìn)轉(zhuǎn)染和表達(dá)。結(jié)果是非?？砂幢壤龜U(kuò)大且可再現(xiàn)的。本發(fā)明的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)與 FreestyleTM293系統(tǒng)相比在蛋白質(zhì)表達(dá)方面實(shí)現(xiàn)3. 5倍-15倍增加。
[0239] 本說(shuō)明書中所提及的所有公開、專利和專利申請(qǐng)?jiān)诖艘匀恳玫姆绞讲⑷氡菊f(shuō) 明書中，達(dá)到如同每一單獨(dú)的公開、專利或?qū)＠暾?qǐng)被專門并且單獨(dú)地指示以引用的方式 并入本文中的相同程度。倘若有沖突，則將以本文說(shuō)明書（包括定義）為準(zhǔn)。對(duì)本申請(qǐng)中 任何參考文獻(xiàn)的引用或確認(rèn)不應(yīng)被解釋為承認(rèn)所述參考文獻(xiàn)可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
【權(quán)利要求】
1. 一種在培養(yǎng)的真核細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白的方法，所述方法包含： 在高密度培養(yǎng)基中獲得包含細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)物，所述懸浮培養(yǎng)物具有在約2 X 106到約 2X107個(gè)細(xì)胞/毫升之間的細(xì)胞密度； 用包含可表達(dá)的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有能夠產(chǎn)生所表達(dá)的 蛋白質(zhì)的基因序列； 將所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞孵育第一時(shí)間段； 使所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與至少一種表達(dá)增強(qiáng)劑組合物接觸； 將所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在所述轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑存在下孵育第二時(shí)間段，使得所述載體表達(dá)所 述蛋白質(zhì)；以及 在所述第二時(shí)間段之后收獲所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)的真核細(xì)胞是適宜于在高密度條件下生 長(zhǎng)的懸浮培養(yǎng)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)物包含293細(xì)胞、293細(xì)胞的衍生 物、293F細(xì)胞、293F細(xì)胞的衍生物、PER-C6細(xì)胞、PER-C6細(xì)胞的衍生物、CHO細(xì)胞、CHO細(xì)胞 的衍生物、CapT細(xì)胞、CapT細(xì)胞的衍生物、COS細(xì)胞、COS細(xì)胞的衍生物、C0S-7細(xì)胞、C0S-7 的衍生物、Sp2/0細(xì)胞或Sp2/0細(xì)胞的衍生物，其中所述細(xì)胞已適宜于在高密度條件下生 長(zhǎng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)物包含293F細(xì)胞的衍生物。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)物的體積在約200 y L到約5L范圍 內(nèi)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表達(dá)組合物包含以下各者中的至少一者：丙 戊酸（VPA，酸和鈉鹽）、丙酸鈉、乙酸鋰、二甲亞砜（DMS0)、包括半乳糖的糖、氨基酸混合物、 或丁酸、或上述的任何組合。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述表達(dá)組合物包含丙戊酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中丙戊酸（VPA)的濃度在約0. 20mM到約25mM范圍 內(nèi)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中丙戊酸濃度在以下范圍內(nèi)：約0.25mM到約24mM、 約 0? 26mM 到約 23mM、0. 27mM 到約 23mM、0. 28mM 到約 23mM、0. 29mM 到約 22mM、約 0? 30mM 至IJ 約 21mM、約 0. 31mM 到約 20mM、約 0. 32mM 到約 19mM、約 0. 33mM 到約 17mM、約 0. 34mM 到約 18mM、約 0. 35mM 到約 17mM、約 0. 36mM 到約 16mM、約 0. 37mM 到約 15mM、約 0. 40mM 到約 14mM、 約 0. 41mM 到約 13mM、約 0. 42mM 到約 12mM、約 0. 43mM 到約 1 ImM、約 0. 44mM 到約 10mM、約 0. 45mM 到約 9mM、約 0. 46mM 到約 8mM、約 0. 47mM 到約 7mM、約 0. 48mM 到約 6mM、約 0. 49mM 至IJ 約 5mM、約 0? 50mM 到約 4mM、約 0? 50mM 到約 4mM、約 0? 55mM 到約 3mM、0. 6mM 到約 2mM 或 0? 75 到約 1. 5mM、約 0? 15mM 到約 1. 5mM、約 0? 16mM 到約 1. 5mM、約 0? 17mM 到約 1. 5mM、約 0? 18mM 到約 1. 5mM、約 0. 19mM 到約 1. 5mM、約 0. 20mM 到約 1. 5mM、約 0. 25mM 到約 1. 5mM、約 0. 30mM 到約 1. 5mM、約 0? 40mM 到約 1. 5mM、約 0? 50mM 到約 1. 5mM、約 0? 60mM 到約 1. 5mM、約 0? 70mM 到約 1. 5mM、約 0. 80mM 到約 1. 5mM、約 0. 90mM 到約 1. 5mM 或約 0. lOmM 到約 1. 5mM。
10. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述表達(dá)組合物包含丙酸鈉。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述培養(yǎng)物中丙酸鈉的最終濃度在約〇. 2mM到 約lOOmM范圍內(nèi)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述培養(yǎng)物中丙酸鈉的最終濃度在以下范圍 內(nèi)：約 0. 5 到約 80mM、約 0. 4mM 到約 70mM、約 0. 5mM 到約 60mM、約 0. 6mM 到約 50mM、約 0. 7mM 到約40mM、約0. 8mM到約30mM、約0. 9mM到約20mM、約ImM到約15mM、約2mM到約10mM、約 3mM到約9mM、約4mM到約8mM或約5mM到約7mM，在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP 的最佳最終濃度可能在以下范圍內(nèi)：約ImM到約10mM、約ImM到約2mM、約2mM到約3mM、約 3mM到約4mM、約4mM到約5mM、約5mM到約6mM、約6mM到約7mM、約7mM到約8mM、約8mM至lj 約9mM或約9mM到約10mM，在某些優(yōu)選但非限制性的實(shí)施例中，NAPP的最佳最終濃度可能 是約 ImM、約 1. 5mM、約 2mM、約 2. 5mM、約 3mM、約 3. 5mM、約 4mM、約 4. 5mM、約 5mM、約 5. 5mM、 約 6mM、約 6. 5mM、約 7mM、約 7. 5mM、約 8mM、約 8. 5mM、約 9mM、約 9. 5mM 或約 10mM。
13. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述表達(dá)組合物包含乙酸鋰。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述培養(yǎng)物中LiAc的最終濃度在約0. 25到約 25mM范圍內(nèi)。
15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述培養(yǎng)物中LiAc的最終濃度在以下范圍內(nèi)： 約 0. 26mM 到約 20mM、約 0. 27mM 到約 15mM、約 0. 28mM 到約 10mM、約 0. 29mM 到約 5mM、約 0? 3mM 到約 4. 5mM、約 0? 31mM 到約 4mM、約 0? 35mM 到約 3mM、約 0? 5mM 到約 2. 5mM、約 ImM 至IJ 約3mM、約1. 5mM到約2. 5mM或約2mM到約3mM。
16. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述表達(dá)組合物包含丁酸。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述培養(yǎng)物中丁酸的最終濃度在以下范圍內(nèi)： 約 0? 25 到約 25mM、約 0? 26mM 到約 20mM、約 0? 27mM 到約 15mM、約 0? 28mM 到約 10mM、約 0? 29mM 到約5禮、約0.31111到約4.51111、約0.311111到約41111、約0.351111到約31111、約0.51111到約2.51111、 約ImM到約3mM、約1. 5mM到約2. 5mM或約2mM到約3mM。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)物的體積在約25mL yl到約50L范 圍內(nèi)。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)物的體積在約100mL yl到約1L范 圍內(nèi)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述懸浮培養(yǎng)物的體積在約200mLia到約 500mL范圍內(nèi)。
21. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)染步驟的細(xì)胞密度在約IX 106到約 20X 106個(gè)細(xì)胞/毫升之間。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)染步驟的細(xì)胞密度在約2X106到約 6X106范圍內(nèi)。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表達(dá)載體是pCDNA3. 3的衍生物。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述p⑶NA3. 3的衍生物包含WPRE元件。
25. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表達(dá)載體包含WPRE元件。
26. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法在所述轉(zhuǎn)染步驟之后并不需要更換、補(bǔ) 給或補(bǔ)充所述高密度培養(yǎng)基。
27. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高密度培養(yǎng)基在所述轉(zhuǎn)染步驟之后并不經(jīng) 更換、補(bǔ)給或補(bǔ)充。
28. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述高密度培養(yǎng)基是無(wú)血清/無(wú)蛋白質(zhì)的化學(xué)成 分確定的培養(yǎng)基，其能夠促進(jìn)經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以超過(guò)2. 5 X 106個(gè)細(xì)胞/毫升的細(xì)胞密度以保 持超過(guò)80 %的細(xì)胞存活率生長(zhǎng)。
29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述高密度培養(yǎng)基在所述轉(zhuǎn)染步驟之后并不需 要所述培養(yǎng)基的所述補(bǔ)充、更換或補(bǔ)給。
30. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含在所述第二時(shí)間段之后收獲所述經(jīng)轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞。
31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其進(jìn)一步包含純化所述經(jīng)表達(dá)的蛋白質(zhì)。
32. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述細(xì)胞表達(dá)一或多種表達(dá)增強(qiáng)性蛋白質(zhì)。
33. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述表達(dá)增強(qiáng)性蛋白質(zhì)選自由以下組成的清 單41(1'、？18、？21、8(31-父1和？1?&。
34. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)一或多種表達(dá)增強(qiáng)性蛋白 質(zhì)。
35. 根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)一或多種表達(dá)增強(qiáng)性蛋白 質(zhì)。
36. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一時(shí)間段在以下范圍內(nèi)：約2小時(shí)到約4 天、約3到約90小時(shí)、約4到約85小時(shí)、約5到約80小時(shí)、約6到約75小時(shí)、約7到約70 小時(shí)、約8到約65小時(shí)、約9到約60小時(shí)、約10到約55小時(shí)、約11到約50小時(shí)、約12到 約45小時(shí)、約13到約40小時(shí)、約14到約35小時(shí)、約15到30小時(shí)、約16到約24小時(shí)、約 17到約24小時(shí)、約18到約24小時(shí)、約19到約24小時(shí)、約20到約24小時(shí)、約21到約24 小時(shí)、約22到約24小時(shí)或約23到約24小時(shí)，在其它優(yōu)選非限制性實(shí)施例中，第一時(shí)間段 可能高達(dá)約15小時(shí)、高達(dá)約16小時(shí)、高達(dá)約17小時(shí)、高達(dá)約18小時(shí)、高達(dá)約19小時(shí)、高達(dá) 約20小時(shí)、高達(dá)約21小時(shí)、高達(dá)約22小時(shí)、高達(dá)約23小時(shí)、高達(dá)約24小時(shí)、高達(dá)約25小 時(shí)、高達(dá)約26小時(shí)、高達(dá)約27小時(shí)、高達(dá)約28小時(shí)、高達(dá)約29小時(shí)或高達(dá)約30小時(shí)。
37. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第二時(shí)間段在以下范圍內(nèi)：約10小時(shí)到約 10天、約2小時(shí)到5天、約2. 5小時(shí)到4天、約3到約90小時(shí)、約4到約85小時(shí)、約5到約 80小時(shí)、約6到約75小時(shí)、約7到約70小時(shí)、約8到約65小時(shí)、約9到約60小時(shí)、約10到 約55小時(shí)、約11到約50小時(shí)、約12到約45小時(shí)、約13到約40小時(shí)、約14到約35小時(shí)、 約15到30小時(shí)、約16到約24小時(shí)、約17到約24小時(shí)、約18到約24小時(shí)、約19到約24 小時(shí)、約20到約24小時(shí)、約21到約24小時(shí)、約22到約24小時(shí)或約23到約24小時(shí)，在其 它優(yōu)選非限制性實(shí)施例中，第一時(shí)間段可能高達(dá)約15小時(shí)、高達(dá)約16小時(shí)、高達(dá)約17小 時(shí)、高達(dá)約18小時(shí)、高達(dá)約19小時(shí)、高達(dá)約20小時(shí)、高達(dá)約21小時(shí)、高達(dá)約22小時(shí)、高達(dá) 約23小時(shí)、高達(dá)約24小時(shí)、高達(dá)約25小時(shí)、高達(dá)約26小時(shí)、高達(dá)約27小時(shí)、高達(dá)約28小 時(shí)、高達(dá)約29小時(shí)或高達(dá)約30小時(shí)。
【文檔編號(hào)】C12N5/00GK104364369SQ201380031703
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2013年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月2日
【發(fā)明者】S·K·瓦蘇, H·C·丘, J·羅杰斯, M·西斯內(nèi)羅斯, J·李, C·Y·劉, M·瓊斯 申請(qǐng)人:生命技術(shù)公司