用于檢測分析物或分類樣本的方法和系統(tǒng)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于檢測樣本中的一種或多種分析物和/或用于分類樣本的方法和系統(tǒng)。具體來說，本發(fā)明涉及可用于實時檢測分析物，且依賴于使一種或多種類型的傳感器分子流過微流體裝置的方法和系統(tǒng)，所述傳感器分子各自包含結合一種或多種分析物的結構域、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域的間隔和相對定向在+50％福斯特距離內(nèi)。
【專利說明】用于檢測分析物或分類樣本的方法和系統(tǒng) 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及用于檢測樣本中的一種或多種分析物和/或用于分類樣本的方法和 系統(tǒng)。具體來說，本發(fā)明涉及可用于實時檢測分析物且依賴于使一種或多種類型的傳感 器分子流過微流體裝置的方法和系統(tǒng)，所述分子各自包含結合一種或多種分析物的結構 域、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化學 發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離（Forster distance)內(nèi)。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 生物發(fā)光共振能量轉移（BRET)天然存在于如維多利亞水母（Aequorea victoria)和海洋海腎（Renillareniformis)等海洋生物體中（Morin和Hastings, 1971)。 BRET是一種形式的福斯特共振能量轉移（RET)，其是指能量從激發(fā)態(tài)供體非放射性轉移至 基態(tài)接受體。存在兩種常用的BRET原理形式，即BRET1和BRET2。兩者均使用海腎熒光素 酶（RLuc)作為能量供體。在BRET1中，底物是天然腔腸素（coelenterazine，CLZ)或腔腸 素h(CLZh)。RLuc和黃色熒光蛋白（YFP)分別是能量供體和接受體，在475nm下產(chǎn)生峰值 供體發(fā)射且在535nm下產(chǎn)生峰值接受體發(fā)射。在BRET2中，YFP置換為GFP2且使用修飾的 CLZ底物，即腔腸素-400a或（CLZ400a)。峰值供體發(fā)射和接受體發(fā)射分別變換成395nm 和 515nm(Dacres等，2009a,b;PfIeger和Eidne, 2006)。近來已建立第三種BRET形式，艮P BRET3。它使用CLZh作為底物且使用RLuc8作為能量供體并使用mOrange作為接受體，從 而導致光譜分辨率提高（De等，2009)。
[0004]RET是一種比值測量技術，其可消除由歸因于在板中的不同孔之間的測定體積、測 定條件和信號衰減變化的光輸出波動引起的數(shù)據(jù)可變性?；赗ET的反應是均質(zhì)的，通常 在無固相連接下發(fā)生在溶液中。這允許在不進行分離下檢測呈如液體、氣體乃至顆粒等不 同形式的分析物。避免固相連接使如表面等離子體共振（SPR)的許多基于表面的技術中使 用的表面再生的過程得以消除（Fang等，2005)，且連同快速反應速率一起允許它用于在線 監(jiān)測。
[0005] 然而，迄今為止，BRET的使用尚局限于使用精密檢測設備的研究實驗室。在包括 化學、生物學、醫(yī)學、感測和材料的許多領域中，微流體技術正引起關注。它們超過常規(guī)技 術的優(yōu)勢包括試劑消耗降低、反應速率快速、分析時間短、以及適合于自動化和批量生產(chǎn) (Holden和Cremer, 2005)。
[0006] 在微流體技術方面已存在實質(zhì)性研究和發(fā)展。實例包括利用熒光收集的集成生物 芯片設計（EP2221606)、使用拉曼光譜學進行芯片上生物感測（W0 2009/020479)、用于使 用表面等離子體共振技術檢測GPCR配體結合的生物感測裝置（W0 2009/018467)、利用鏡 子作為光反射器的光檢測芯片（US2011/0037077和US2008085552)、具有柱筒形式的測 定裝置（W0 2009/044088)、基于化學發(fā)光的微流體生物芯片（US2002/0123059)等。這些 裝置中的許多具有以下缺點：由于集成多個部件而使每個芯片的成本較高；由于需要表面 再生而不能進行實時監(jiān)測；以及試劑的反應緩慢；檢測靈敏度有限或信號漂移。
[0007] 此外，在電子鼻和電子舌的領域中存在大量【背景技術】，所述電子鼻和電子舌使氣 體或液體樣本與一系列固態(tài)傳感器接觸以檢測分析物和/或分類樣本。電子鼻和舌已受歸 因于傳感器的選擇性有限的不良性能、不良靈敏度、傳感器飽和和緩慢再生以及傳感器隨 時間漂移困擾。
[0008]因此，需要檢測分析物和基于樣本含有的分析物分類所述樣本的其它方法，特別 是可實時執(zhí)行并且靈敏度增加，且不遭受由于需要再生感測表面的停工時間，以及抵抗傳 感器漂移的混雜影響的方法。配置一系列以電光學方式與檢測系統(tǒng)聯(lián)用的生物源性傳感器 的多通道微流體系統(tǒng)提供對這些問題的一種新型解決方案。
[0009]發(fā)明概述
[0010] 本
【發(fā)明者】已鑒定一種檢測樣本中的分析物的改進方法。
[0011] 在一個方面，本發(fā)明提供一種檢測樣本中的分析物的方法，所述方法包括
[0012] i)使以下各物流過包括一個或多個微通道的微流體裝置，
[0013]a)所述樣本，
[0014]b)包含結合所述分析物的結構域、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的傳感器 分子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域 的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)，
[0015]c)所述化學發(fā)光供體的底物，
[0016]ii)在所述裝置中混合所述傳感器分子、樣本和底物，以及
[0017]iii)使用電光學感測裝置檢測所述化學發(fā)光供體對所述底物的修飾，
[0018] 其中當所述分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于所述 接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
[0019] 在優(yōu)選實施方案中，傳感器分子未固定于裝置。
[0020] 在另一優(yōu)選實施方案中，方法可用于實時檢測分析物。
[0021] 在另一優(yōu)選實施方案中，傳感器分子和底物通過不同微通道進入裝置。在替代性 實施方案中，傳感器分子和底物通過相同微通道進入裝置，然而，在這個實施方案中，優(yōu)選 的是傳感器分子和底物在臨進入微通道之前（例如10秒、更優(yōu)選1秒或小于1秒）混合。
[0022] 在優(yōu)選實施方案中，化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的福斯特距離是至少 5. 6nm或至少6nm。在另一優(yōu)選實施方案中，化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的福斯特 距離在約5. 6nm與約IOnm之間，或在約6nm與約IOnm之間。
[0023] 在另一優(yōu)選實施方案中，分析物結合傳感器分子或從傳感器分子釋放導致BRET 比率變化彡15%、彡20%、彡30%、彡35%、約15%至約50%、或約15%至約40%的最大 觀察BRET比率。BRET比率變化15%或大于15%會增加分析物檢測的信噪比。這導致任 何給定取樣時間的檢測限都優(yōu)越且更準確編碼分析物的濃度水平?；蛘撸诠潭z測限下， BRET比率的較大變化促使信號積分時間較短且因此檢測更快速。
[0024] 在另一優(yōu)選實施方案中，由電光學感測裝置檢測的量子產(chǎn)率小于約8%、或小于約 5%或小于約2%。
[0025] 在另一優(yōu)選實施方案中，接受體結構域具有的斯托克斯位移（StokesShift)在約 50nm與約150nm之間。在實施方案中，接受體結構域具有約IOOnm的斯托克斯位移。
[0026] 本發(fā)明的方法的一優(yōu)勢是它是高度時間分辨的。因此，在優(yōu)選實施方案中，方法是 在約Is至約IOOs內(nèi)執(zhí)行。
[0027] 樣本可呈能夠流過微流體裝置的任何形式。實例包括但不必限于液體、氣體、乳液 或混懸液。在實施方案中，樣本是已用氣體預平衡的液體。
[0028] 在一個實施方案中，混懸液是或包含無細胞組合物。在替代性實施方案中，混懸液 包含細胞。
[0029] 在實施方案中，穿過微流體裝置的流動速率在約1μ1/小時至約IOml/小時、或 1μ1/小時至約Iml/小時、或1μ1/小時至約I. 5ml/小時、或約20μ1/小時至約0. 5ml/ 小時之間，且優(yōu)選流動速率在約200μ1/小時至約lml/小時之間。
[0030] 在優(yōu)選實施方案中，包含樣本、傳感器分子和底物的微通道的區(qū)段的流動速率和 長度使得樣本、傳感器分子和底物在區(qū)段中持續(xù)至少約5秒、至少約10秒、至少約15秒、至 少約20秒、約5秒至約50秒、或約10秒至約30秒。
[0031] 在一個實施方案中，例如當傳感器分子包含如G偶聯(lián)蛋白質(zhì)受體的蛋白質(zhì)受體 時，在步驟ii)之后，傳感器分子的濃度在約InM至約10μM之間或在約InM至約1μM之 間。在另一實施方案中，例如當傳感器分子包含可裂解肽源性或周質(zhì)結合蛋白時，在步驟 ii)之后，傳感器分子的濃度在約0. 1μM至約10μM之間。
[0032] 在實施方案中，穿過微流體裝置的流動是連續(xù)流動、批式流動或停止流動。
[0033] 樣本、傳感器分子和底物可使用機械、電動、聲學或其它適合手段加以主動混 合。在優(yōu)選實施方案中，混合是通過在垂直于穿過包含樣本、傳感器分子和底物的微通道 的流動方向的維度上進行擴散來達成。舉例來說，樣本、傳感器分子和底物的高效混合 (> 20% )可便利地通過主要被動擴散（非湍流）過程來達成。典型條件包括流動速率約 為至多每小時1，000微升，共用微通道長度為約IOmm或大于10_，以及當堆積輸入物彼此 接觸在共用通道中流動時，它們的高度總和為約200微米或小于200微米（垂直于流動方 向測量）。
[0034]可通過任何適合手段使樣本、傳感器分子和底物流過微流體裝置，所述手段如但 不必限于以下一項或多項：泵送、真空、水力、抽吸、電動、化學滲透、毛細管力、聲學、電磁、 壓電學。泵送機制可用緊湊、小型化以及微米尺寸泵實現(xiàn)。在優(yōu)選實施方案中，樣本、傳感 器分子和底物是通過例如以抽取模式使用注射泵進行抽吸（負壓）來流過微流體裝置。
[0035] 在實施方案中，各微通道具有約1μm2至約Imm2的橫截面積。
[0036] 在另一實施方案中，用于樣本、傳感器分子和底物的微通道各自具有寬度 彡300μπι和高度彡60μm、寬度彡600μπι和高度彡30μπι或?qū)挾柔?200μm和高度 >15μm。在實施方案中，高度不大于約Imm或約0.5mm。在另一實施方案中，高度是約 15μm至約Imm或約15μm至約0.5mm。在另一實施方案中，寬度不大于約I. 5mm。在另一 實施方案中，寬度是約300μm至約I. 5mm或約300μm至約I. 2mm。
[0037] 用于底物、傳感器分子和樣本的輸入微通道的長度盡可能短，優(yōu)選小于10mm，且更 優(yōu)選小于5mm。
[0038]允許底物、傳感器分子和樣本混合和反應所處的共用微通道的長度可在5mm與IOOmm之間，或在IOmm與IOOmm之間，優(yōu)選在20mm與50mm之間，且可為線形的、蛇形的或直 彎曲幾何形狀的任何適合組合。在替代性實施方案中，共用微通道可被完全免除且傳感器 分子、底物和樣本可在或不在主動混合下直接引入反應室中。
[0039] 在另一實施方案中，步驟iii)是在體積約Ipl(即皮升或一萬億分之一升）至約 200μ1的反應室中進行，且優(yōu)選體積是0. 5μ1至約8μ1、或0. 5μ1至約2μ1。
[0040] 在另一實施方案中，步驟iii)包括處理至少一個來自電光學感測裝置的信號以 確定分析物是否不存在或存在于樣本中，且如果存在，那么任選測定樣本中的分析物的濃 度。
[0041] 在實施方案中，結合分析物的結構域是蛋白質(zhì)（其可為肽）或核酸。在優(yōu)選實施方 案中，結構域是蛋白質(zhì)。在實施方案中，蛋白質(zhì)是結合一種或多種分析物（配體）的天然存 在的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的保留分析物（配體）結合活性的變體。實例包括但不必限于受體、 氣味結合蛋白、信息素結合蛋白、酶、配體載體或細菌周質(zhì)結合蛋白。在實施方案中，受體是 G蛋白偶聯(lián)受體，如氣味受體或味覺受體。在另一實施方案中，氣味受體或味覺受體來自線 蟲或脊椎動物或是其突變體。
[0042] 在實施方案中，化學發(fā)光供體結構域是生物發(fā)光蛋白質(zhì)。實例包括但不必限于 熒光素酶、半乳糖苷酶、內(nèi)酰胺酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖醛酸酶 或葡萄糖苷酶。熒光素酶的實例包括但不必限于海腎熒光素酶、螢火蟲熒光素酶、腔 腸動物突光素酶、北美螢火蟲突光素酶、叩頭蟲突光素酶、蘋繞實蠅（railroadworm)突 光素酶、細菌突光素酶、長腹水蚤（Gaussia)突光素酶、水母發(fā)光蛋白（Aequorin)、蕈蚊 (Arachnocampa)熒光素酶或其任一個的生物活性變體或片段、或其兩個或更多個的嵌合 體。在優(yōu)選實施方案中，海腎熒光素酶變體是RLuc2或RLuc8。
[0043] 在實施方案中，底物是熒光素（如甲殼蟲熒光素）、鈣、腔腸素或腔腸素的衍生物 或類似物。
[0044] 在優(yōu)選實施方案中，接受體結構域是熒光接受體結構域。
[0045] 在另一實施方案中，熒光接受體結構域是蛋白質(zhì)。實例包括但不必限于綠色熒 光蛋白（GFP)、GFP的藍色熒光變體（BFP)、GFP的青色熒光變體（CFP)、GFP的黃色熒光 變體（YFP)、增強型GFP(EGFP)、增強型CFP(ECFP)、增強型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、 Venus、mOrange、Topaz、GFPuv、去穩(wěn)定化EGFP(dEGFP)、去穩(wěn)定化ECFP(dECFP)、去穩(wěn) 定化EYFP(dEYFP)、HcRecUt-HcRed、DsRecUDsRed2、t-dimer2、t-dimer2 (12)、mRFPl、 pocilloporin、海腎GFP、MonsterGFP、paGFP、Kaede蛋白或藻膽蛋白（Phycobiliprotein) 或其任一個的生物活性變體或片段。
[0046] 在替代性實施方案中，熒光接受體結構域是非蛋白質(zhì)。實例包括但不必限于 AlexaFluor染料、Bodipy染料、Cy染料、突光素（fluorescein)、丹磺酰、傘形酮、突光微 球體、發(fā)光微球體、熒光納米晶體、海藍（MarinaBlue)、級聯(lián)藍（CascadeBlue)、級聯(lián)黃 (CascadeYellow)、太平洋藍（PacificBlue)、俄勒同綠（OregonGreen)、四甲基若丹明 (Tetramethylrhodamine)、若丹明、得克薩斯紅（TexasRed)、稀土元素螯合物或其任何組 合或衍生物。
[0047] 在實施方案中，方法進一步包括提供生物發(fā)光蛋白質(zhì)的輔因子。輔因子的實例包 括但不必限于ATP、鎂、氧、FMNH2、鈣或其任何兩個或更多個的組合。
[0048] 在優(yōu)選實施方案中，
[0049]i)生物發(fā)光蛋白質(zhì)是熒光素酶或生物活性變體或片段，和/或
[0050]ii)底物是熒光素、腔腸素或腔腸素的衍生物或類似物，和/或
[0051]iii)接受體結構域是綠色突光蛋白（GFP)、Venus、mOrange或其任一個的生物活 性變體或片段。
[0052] 在另一優(yōu)選實施方案中，
[0053]i)熒光素酶是海腎熒光素酶，接受體結構域是GFP2,且底物是腔腸素400a，
[0054]ii)熒光素酶是海腎熒光素酶2,接受體結構域是GFP2,且底物是腔腸素400a，
[0055]iii)熒光素酶是海腎熒光素酶8,接受體結構域是GFP2,且底物是腔腸素400a，
[0056]iv)熒光素酶是海腎熒光素酶2,接受體結構域是Venus，且底物是腔腸素，
[0057]V)熒光素酶是海腎熒光素酶8,接受體結構域是Venus，且底物是腔腸素，
[0058]vi)熒光素酶是海腎熒光素酶8. 6-535,接受體結構域是mOrange，且底物是腔腸 素，或
[0059]vii)熒光素酶是海腎熒光素酶8,接受體結構域是mOrange，且底物是腔腸素。
[0060] 更優(yōu)選地，
[0061]i)熒光素酶是海腎熒光素酶，接受體結構域是GFP2,且底物是腔腸素400a，
[0062]ii)熒光素酶是海腎熒光素酶2,接受體結構域是GFP2,且底物是腔腸素400a，
[0063]iii)熒光素酶是海腎熒光素酶8,接受體結構域是GFP2,且底物是腔腸素400a，
[0064]iv)熒光素酶是海腎熒光素酶8. 6-535,接受體結構域是mOrange，且底物是腔腸 素，或
[0065]V)熒光素酶是海腎熒光素酶8,接受體結構域是mOrange，且底物是腔腸素。
[0066] 甚至更優(yōu)選地，
[0067]i)熒光素酶是海腎熒光素酶，接受體結構域是GFP2,且底物是腔腸素400a，
[0068]ii)熒光素酶是海腎熒光素酶2,接受體結構域是GFP2,且底物是腔腸素400a，或[0069]iii)熒光素酶是海腎熒光素酶8,接受體結構域是GFP2,且底物是腔腸素400a。
[0070] 在實施方案中，方法包括使用同一微流體裝置，例如使用如圖14b和14c中所示的 裝置同時或依序檢測兩種或更多種不同分析物。
[0071] 在實施方案中，微流體裝置包括以下一個或多個集合
[0072]a)三個輸入微通道，每一個各自用于傳感器分子、底物和樣本，或
[0073]b)兩個輸入微通道，一個用于底物且另一個用于傳感器分子和樣本的預混合物， 或
[0074]c)兩個輸入微通道，一個用于傳感器分子且另一個用于底物和樣本的預混合物。
[0075] 在另一實施方案中，至少一個微通道包括體積與至少一個其它微通道不同的反應 室。
[0076] 在另一實施方案中，至少一個微通道包括兩個或更多個體積相同或不同的反應 室。
[0077] 在優(yōu)選實施方案中，電光學感測裝置具有至少兩個可檢測重疊或非重疊波長的不 同波長通道。在替代性實施方案中，電光學感測裝置具有單一波長通道，其中在這個實施方 案中，供體淬滅來自接受體的發(fā)射。
[0078] 在實施方案中，電光學感測裝置包括纖維束或液體光導管。在實施方案中，纖維束 或液體光導管的直徑在約Imm與約l〇mm、或約Imm與約6mm之間。在實施方案中，電光學感 測裝置進一步包括快門框。
[0079] 在實施方案中，電光學感測裝置包括分叉光導管且不包括分色鏡。
[0080] 在優(yōu)選實施方案中，傳感器分子存在于無細胞提取物中。在替代性實施方案中，傳 感器分子是由細胞表達（例如存在于細胞的表面上或由細胞分泌）且以細胞完整處于其中 的細胞混懸液形式提供。
[0081] 方法可用于揀選細胞。因此，在實施方案中，使分析物暴露在細胞的表面上且方法 進一步包括使包含分析物的細胞轉向穿過不同于樣本中缺乏分析物的細胞的微通道，以及 收集包含分析物的細胞和/或收集缺乏分析物的細胞，其中如果收集兩種細胞類型，那么 將它們收集在分開的容器中。
[0082] 在另一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測樣本中的分析物的微流體系統(tǒng)，所述系統(tǒng) 包括
[0083]i)至少一個適于容納（或包含）包含結合所述分析物的結構域、化學發(fā)光供體結 構域和接受體結構域的傳感器分子的儲集器，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化 學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)，
[0084] ii)包括一個或多個微通道的微流體裝置，
[0085] iii)用于在所述裝置中混合所述傳感器分子、所述樣本和所述化學發(fā)光供體結構 域的底物的部件，
[0086] iv)用于檢測所述分析物與所述傳感器分子的結合的反應室，和
[0087] V)電光學感測裝置，
[0088] 其中當所述分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于所述 接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
[0089] 在優(yōu)選實施方案中，傳感器分子未固定于微流體裝置。
[0090] 在另一優(yōu)選實施方案中，系統(tǒng)可用于實時檢測分析物。
[0091] 在另一優(yōu)選實施方案中，傳感器分子和底物通過不同微通道進入裝置。
[0092] 在另一優(yōu)選實施方案中，微流體裝置包括至少兩個輸入微通道，其中一個輸入微 通道用于使傳感器分子流入裝置中。
[0093] 如熟練收件人將了解，關于本發(fā)明的方法的各優(yōu)選實施方案也涉及本發(fā)明的系統(tǒng) 和/或可如何操作系統(tǒng)。
[0094] 在實施方案中，電光學感測裝置包括至少兩個不同波長通道。
[0095] 在特別優(yōu)選實施方案中，電光學感測裝置能夠同時或快速連續(xù)檢測兩個不同波長 通道。舉例來說，電光學感測裝置能夠在小于1秒內(nèi)檢測兩個不同波長通道。
[0096] 在另一實施方案中，微流體裝置被設計成使得能夠檢測兩種或更多種分析物。在 實施方案中，裝置包括用于使各不同傳感器分子流入裝置中的單獨微通道。
[0097] 在實施方案中，混合發(fā)生在反應室中。
[0098] 本發(fā)明也可用于分類樣本。出于這個目的，不必已知樣本中的哪個（哪些）分析物 實際上結合一種或多種傳感器分子。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種分類樣本的方法， 所述方法包括
[0099]i)使以下各物流過包括一個或多個微通道的微流體裝置，
[0100]a)所述樣本，
[0101]b)包含結合一種或多種分析物的結構域、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的 傳感器分子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體 結構域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)，
[0102]c)所述化學發(fā)光供體的底物，
[0103] ii)在所述裝置中混合所述傳感器分子、樣本和底物，
[0104] iii)使用電光學感測裝置檢測由所述化學發(fā)光供體對所述底物的修飾，
[0105] iv)處理至少一個來自所述電光學感測裝置的信號并使電光學反應的樣式與一種 或多種目標樣本的一種或多種預定特征相關聯(lián)，以及
[0106]V)基于所述反應樣式的相關性分類所述樣本，
[0107] 其中當所述一種或多種分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域 相對于所述接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
[0108] 在優(yōu)選實施方案中，以上方法包括兩種或更多種不同傳感器分子，其各自結合不 同分析物（其可為不同組的分析物）或分析物范圍，且步驟V)包括基于各分析物或分析物 范圍的存在、不存在或濃度分類樣本。
[0109] 在實施方案中，一種或多種分析物是未知的。
[0110] 在另一實施方案中，方法可用于實時分類樣本。
[0111] 在另一實施方案中，傳感器分子未固定于裝置。
[0112] 在另一實施方案中，傳感器分子和底物通過不同微通道進入裝置。
[0113] 也提供一種用于分類樣本的微流體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括
[0114] i)至少一個適于容納（或包含）包含結合一種或多種分析物的結構域、化學發(fā)光 供體結構域和接受體結構域的傳感器分子的儲集器，其中在存在和/或不存在分析物下， 所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)，
[0115]ii)包括一個或多個微通道的微流體裝置，
[0116]iii)用于在所述裝置中混合所述傳感器分子、所述樣本和所述化學發(fā)光供體結構 域的底物的部件，
[0117]iv)用于檢測所述分析物與所述傳感器分子的結合的反應室，和
[0118]V)電光學感測裝置，
[0119] 其中當所述一種或多種分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域 相對于所述接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
[0120] 在實施方案中，系統(tǒng)包括兩種或更多種不同傳感器分子，其各自結合可為不同組 分析物的不同分析物或分析物范圍。
[0121] 在實施方案中，系統(tǒng)包括兩種或更多種不同傳感器分子，其各自在不同位點處和/ 或以不同親和力水平結合相同分析物。
[0122] 在另一實施方案中，一種或多種分析物或分析物范圍是未知的。
[0123] 在另一實施方案中，系統(tǒng)可用于實時分類樣本。
[0124] 在實施方案中，傳感器分子未固定于裝置。
[0125] 在另一實施方案中，傳感器分子和底物通過不同微通道進入裝置。
[0126] 在另一實施方案中，微流體裝置包括至少兩個輸入微通道，其中一個輸入微通道 用于使傳感器分子流入裝置中。
[0127] 在另一方面，本發(fā)明提供一種篩選結合目標分子的化合物的方法，所述方法包括
[0128] i)使以下各物流過包括一個或多個微通道的微流體裝置，
[0129] a)候選化合物，
[0130] b)包含所述目標分子、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的傳感器分子，其中 在存在和/或不存在所述候選化合物下，所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域的 間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)，
[0131] c)所述化學發(fā)光供體的底物，
[0132] ii)在所述裝置中混合所述傳感器分子、所述候選化合物和底物，
[0133] iv)使用電光學感測裝置檢測由所述化學發(fā)光供體對所述底物的修飾，
[0134]V)處理至少一個來自所述電光學感測裝置的信號以確定所述候選化合物是否結 合所述傳感器分子，以及
[0135] vi)如果化合物結合所述傳感器分子，那么選擇所述化合物，
[0136] 其中當所述候選化合物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于 所述接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
[0137] 在優(yōu)選實施方案中，方法可用于實時檢測候選化合物與傳感器分子的結合。
[0138] 在另一優(yōu)選實施方案中，傳感器分子未固定于裝置。
[0139] 在另一優(yōu)選實施方案中，傳感器分子和底物通過不同微通道進入裝置。
[0140] 在優(yōu)選實施方案中，方法進一步包括確認候選化合物結合目標分子的結合結構域 而非傳感器分子的其它結構域。如熟練人員將了解，這可使用本領域中廣泛多種技術的任 一個來進行，所述技術如使用管柱上的目標分子來捕捉候選化合物；競爭性結合測定；在 與目標分子一起孵育候選化合物之后使用凝膠色譜確定是否改變目標分子的遷移等。
[0141] 候選化合物和目標分子可為相同類型的物質(zhì)，例如兩者均可為核酸、蛋白質(zhì)（包 括肽）或小分子。在一個實施方案中，目標分子是蛋白質(zhì)，如但不限于受體、氣味結合蛋白、 信息素結合蛋白、酶、配體載體或細菌周質(zhì)結合蛋白。目標分子可為天然存在的分子或其突 變體/變體。
[0142] 在另一方面，本發(fā)明提供一種用于篩選結合目標分子的化合物的微流體系統(tǒng)，所 述系統(tǒng)包括
[0143]i)至少一個適于容納（或包含）包含所述目標分子、化學發(fā)光供體結構域和接受 體結構域的傳感器分子的儲集器，其中在存在和/或不存在候選化合物下，所述化學發(fā)光 供體結構域和所述接受體結構域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)，
[0144]ii)包括一個或多個微通道的微流體裝置，
[0145]iii)用于在所述裝置中混合所述傳感器分子、所述候選化合物和所述化學發(fā)光供 體結構域的底物的部件，
[0146] iv)用于檢測所述候選化合物與所述傳感器分子的結合的反應室，和
[0147]V)電光學感測裝置，
[0148] 其中當所述候選化合物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于 所述接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
[0149] 在優(yōu)選實施方案中，系統(tǒng)可用于實時檢測候選化合物與傳感器分子的結合。
[0150] 在另一優(yōu)選實施方案中，傳感器分子未固定于裝置。
[0151] 在另一優(yōu)選實施方案中，傳感器分子和底物通過不同微通道進入裝置。
[0152] 在另一實施方案中，微流體裝置包括至少兩個輸入微通道，其中一個輸入微通道 用于使傳感器分子流入裝置中。
[0153] 本
【發(fā)明者】也已鑒定一種不遭受BRET2的低發(fā)光特性的雜交BRET(BRETh)檢測系 統(tǒng)。因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種檢測樣本中的分析物的方法，所述方法包括
[0154]i)在腔腸素存在下使所述樣本與傳感器分子接觸，所述傳感器分子包含
[0155]a)結合所述分析物的結構域，
[0156]b)海腎熒光素酶，和
[0157]c)綠色熒光蛋白2,以及
[0158]ii)確定所述生物發(fā)光蛋白質(zhì)與所述接受體分子之間的生物發(fā)光共振能量轉移 (BRET)是否改變，
[0159] 其中當所述分析物結合所述結構域時，所述生物發(fā)光蛋白質(zhì)相對于所述接受體分 子的空間位置和/或偶極定向被改變。
[0160] 當然，以上方法可容易地用于使用微流體裝置的本發(fā)明的方法中。
[0161] 在另一方面，本發(fā)明提供一種分離的傳感器分子，其包含結合一種或多種分析物 的結構域、海腎熒光素酶和綠色熒光蛋白2。
[0162] 本
【發(fā)明者】已鑒定結合2-戊酮的多肽，且因此這些多肽可用于檢測這個化合物。
[0163] 因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種檢測樣本中的2-戊酮的方法，所述方法包括
[0164]i)使所述樣本與作為秀麗隱桿線蟲（C.elegans)str-112(SEQID41)或 str-113(SEQIDN0:42)的多肽或其結合2-戊酮的變體接觸，以及
[0165]ii)檢測任何所述多肽是否結合于2-戊酮。
[0166] 如熟練人員將了解，存在一旦已鑒定新型配體/多肽結合對，即可被配置的龐大 系列的不同測定。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于檢測樣本中的2-戊酮。
[0167]在實施方案中，str-113 的變體是str-114/str-113 融合物（SEQIDN0:43)。
[0168] 在實施方案中，多肽經(jīng)過可檢測標記。所述可檢測標記的多肽的實例包括但不限 于提供為SEQIDNO13、14、18、27、28和30的多肽。
[0169] 2-戊酮是由細菌產(chǎn)生，且因此以上方法可用于檢測例如細菌性感染或污染。
[0170] 因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種檢測樣本中的細菌的方法，其包括使用本發(fā)明 的方法檢測2-戊酮。
[0171] 在實施方案中，細菌是埃希氏菌屬（Escherichiasp.)，如大腸桿菌（E.coli)。
[0172] 除非另外明確陳述，否則本文任何實施方案都應被視為向任何其它實施方案施加 必要的變更。
[0173] 本發(fā)明在范圍上不受限于本文所述的特定實施方案，所述實施方案僅意圖出于例 示目的。功能等效產(chǎn)物、組合物和方法明確在如本文所述的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0174] 在整篇本說明書中，除非另外明確陳述或上下文另外要求，否則提及單一步驟、物 質(zhì)組成、成組步驟或成組物質(zhì)組成應視為涵蓋那些步驟、物質(zhì)組成、成組步驟或成組物質(zhì)組 成中的一個和復數(shù)個（即一個或多個）。
[0175] 在下文中，本發(fā)明是借助于以下非限制性實施例且參照附圖加以描述。
[0176] 附圖簡述
[0177] 圖1-用于執(zhí)行要求保護的方法的顯示微流體芯片（微芯片）和BRET檢測系統(tǒng)的 通用布置。DM=分色鏡，BP=帶通濾光器（波長中心以nm計，寬度以nm計）。
[0178] 圖2-通過以下方式監(jiān)測的凝血酶裂解GFP2-RG-RLuc融合蛋白傳感器分子：(A)在 添加和不添加2單位凝血酶下在添加5μM天然腔腸素至GFP2-RG-RLuc融合蛋白中后，雜 交BRET系統(tǒng)的光譜變化以及（B)對純化的His標記BRET蛋白的SDS-PAGE分析。每個泳 道裝載2. 5μg蛋白質(zhì)。從左至右；分子量標記（KDa)、RLuc、GFP2、GFP2-RG-RLuc、在30°C 下與54nM凝血酶一起孵育90分鐘之后的GFP2-RG-RLuc;條件與先前泳道相同，例外之處 是凝血酶已在室溫下與2單位水蛭素（hirudin) -起預孵育10分鐘的GFP2-RG-RLuct5
[0179] 圖3-在添加5μM天然腔腸素后，1μM融合蛋白；在用54nM凝血酶處理（90分鐘， 30°C)之后或在用2單位水蛭素預處理（10分鐘，室溫）之后用54nM凝血酶處理（90分鐘， 30°C)之后，GFP2-RG-RLuc的凝血酶裂解之后的標準化BRETh比率變化（平均值土S.D.，η =3)。對照由1μMRLuc和GFP2蛋白組成。ρ< 0. 001指示高度顯著差異，ρ= 0. 33指示 變化不顯著。
[0180] 圖4-用于芯片上檢測的實驗設置。（a)雜交BRET反應的示意圖，以及（b和c)用 于BRET信號檢測的微流體芯片系統(tǒng)（Clz=天然腔腸素，DM=分色鏡，BP=帶通，PMT=光 電倍增管）。
[0181] 圖5-隨如圖4b中標記的離Y形接合點的距離X而變的在添加腔腸素底物后 GFP2-RG-RLuc凝血酶傳感器蛋白質(zhì)的生物發(fā)光強度（AU)以及BRETh比率。符號+和▽分別 表示RLuc和GFP2通道的生物發(fā)光背景。?和X分別表示RLuc和GFP2通道的生物發(fā)光強 度。?表示BRET比率。融合蛋白濃度是3. 0μM。天然腔腸素濃度是58. 6μM;各水性流動 速率是20μ1/h;使用20Χ物鏡；GFP2和RLuc通道的濾光器帶通分別是515nm- 555nm和 430nm- 455nm;內(nèi)部門控時間200ms用于數(shù)據(jù)擷取。
[0182] 圖6-隨水性物流的總流動速率（a)和凝血酶傳感器濃度（b)而變的BRETh比率。 (a)凝血酶傳感器蛋白質(zhì)濃度是3. 0μM且天然腔腸素濃度是58. 6μM; (b)天然腔腸素濃 度是58. 6μM;各水性流動速率是20μ1/h;使用20X物鏡；GFP2和RLuc通道的濾光器帶 通分別是515nm_555nm和430nm-455nm;內(nèi)部門控時間200ms用于數(shù)據(jù)撤取。
[0183] 圖7-微流體和微板格式中的BRETh凝血酶傳感器的校準曲線（平均值土SD，η= 5)。所有微流體測量結果都在X= 2.Imm處獲得。?和□分別表示微芯片測量和微板測量 的數(shù)據(jù)。主圖顯示在低凝血酶濃度下的數(shù)據(jù)，而插圖顯示相應全范圍測量結果。線條是線 性回歸，其是y= 〇· 835Χ+1. 019(R2 = 0· 996)(對于微芯片數(shù)據(jù)）和y= 0· 1797Χ+1. 001(R2 =0. 995)(對于微板數(shù)據(jù)）。對于微芯片方法，融合蛋白濃度是3. 0μM且天然腔腸素濃度 是58. 6μΜ，各水性流動速率是20μ1/h。對于微板方法，融合蛋白和天然腔腸素濃度分別 是 1μM和 5μM。
[0184] 圖8-被動混合設計的實例（a)具有線性接觸區(qū)的Y形（b)狹窄蛇形，（c)寬蛇形， (d)螺旋狀，（e)具有尺寸變化和擋板的Y形通道，和（f)具有狹窄蛇形接觸區(qū)的三個進口。
[0185] 圖9-本發(fā)明的芯片和芯片上光學檢測系統(tǒng)的特定實例的示意圖。PMT-光電倍增 管。PDMS-聚二甲基硅氧烷芯片基質(zhì)。
[0186] 圖10 -樣本數(shù)據(jù)指示通過GFP2-RG-RLuc凝血酶傳感器的BRET2比率變化檢測凝 血酶。a.在不存在凝血酶下的GFP(綠色-頂部）和海腎熒光素酶（藍色-底部）通道發(fā) 射強度。b.在與270pM凝血酶一起孵育傳感器之后的GFP(綠色-底部）和海腎熒光素酶 (藍色-頂部）通道發(fā)射強度。C.無凝血酶和270pM凝血酶條件的BRET2比率。
[0187] 圖11-在圖9的微流體裝置中使用GFP2-RG-RLuc凝血酶傳感器，通過BRET2測量 來檢測凝血酶的靈敏度（藍線）相較于來自可商購獲得的板讀取器儀器的結果（紅線）的 直接比較。
[0188] 圖12-在混合凝血酶生物傳感器（1μM)與含有凝血酶（540nM)和腔腸素400a底 物（12. 5μM)的制劑后，用兩進口微流體裝置測量的BRET2比率。
[0189] 圖13-本發(fā)明的系統(tǒng)的子系統(tǒng)的實例。
[0190] 圖14 -單傳感器和多傳感器芯片設計的實例。
[0191] 圖15 -當三個微流體流接觸時，被動或基于擴散的試劑混合的區(qū)域的實例。
[0192] 圖16-電光學檢測系統(tǒng)的實例。
[0193] 圖17-兩個BRET光學檢測元件的設計，（a)雙凸面微透鏡在反應室的底部用于收 集來自反應室內(nèi)部的許多BRET點源的熒光且聚焦于多模光纖（核心200μm)上，（b)平凸 面微透鏡也充當反應室的底部。然而，在頂部上的非球面微小鏡子（微機械加工在套圈上） 將收集來自BRET點源的頂部的熒光且準直于微透鏡上。類似于（a)，平凸面微透鏡將接著 將熒光聚焦至光纖的核心中。
[0194] 圖18-融合于RLuc2和GFP2的0DR-10受體構建體中的共振能量轉移的原理。GFP2 被插入0DR-10的第三細胞內(nèi)環(huán)中且RLuc2在C末端（0G0R2)處。丁二酮結合導致0G0R2 生物傳感器的構象變化，從而導致距離增加或BRET2組分之間的偶極矩定向變化。Clz400a =月￡腸素400a底物。
[0195] 圖19-在添加5μΜClz400a至20nM傳感器中后，OGOR和0G0R2傳感器的生物發(fā) 光強度。
[0196] 圖20-在芯片上將12. 5μMClz400a混合至1μM傳感器中后，OGOR和0G0R2傳 感器的生物發(fā)光強度。
[0197] 圖21-在與含ΙμΜ丁二酮的水或僅水對照一起孵育之后，96孔板的各孔中的 0G0R2 的BRET2 信號（平均值土SD，η= 3)。
[0198] 圖22-微孔板格式中的0G0R2的BRET2信號的丁二酮濃度反應曲線。
[0199] 圖23-在與含IOfM丁二酮的PBS或作為對照的僅PBS-起孵育之后，用芯片上微 流體0G0R2信號測定檢測的BRET2信號變化（平均值土SD，η= 3)。
[0200] 圖24-關于芯片上（微流體）測定測量的0G0R2劑量反應。
[0201] 圖25-歷經(jīng)一定范圍的流動速率在芯片上接觸0G0R2后，使用實時微流體測量檢 測的BRET2信號的平均變化。含IfM丁二酮的PBS或僅PBS和12. 5μMClz400a底物（在 四個不同流動速率下，BRET2比率的平均值土SD)。
[0202] 圖26-在使0G0R2 (290nM)與1飛摩爾濃度丁二酮的PBS溶液以及與12. 5μM腔 腸素400a接觸后，用三進口微流體裝置在不同共用流動速率下測量的BRET2比率。
[0203] 圖27-融合于BRET2組分GFP2和RLuc2的MBP受體構建體的BRET的原理。麥芽 糖結合導致BRET2標記的MBP受體的構象變化，從而使BRET2組分更緊密鄰近，從而導致從 RLuc2至GFP2的能量轉移的效率增加。Clz400a=腔腸素400a底物。
[0204] 圖28-0.ImM各種糖對GFP2-MBP-RLuc2傳感器的BRET2比率的影響。在28°C下與 水（灰色棒條）或〇.ImM所述糖一起孵育30分鐘之后，在添加16. 7μΜ腔腸素400a至ΙμΜ GFP2-MBP-RLuc2或W140A突變體（陰影線棒條）中之后，記錄BRET2比率（平均值土SD，η=3)。通過水反應對BRET2比率進行標準化。#Ρ〈0.Ol且Ρ*〈0. 05。
[0205]圖 29-在添加 16. 67μM腔腸素 400a后，1μMGFP2-MBP-RLuc2 對 0.ImM麥芽糖的 反應時間（分鐘，平均值土S.D.，n= 3)。在與麥芽糖一起孵育任何時期之后的BRET2反應 是通過在與水一起孵育相同時期之后的BRET2反應加以標準化。
[0206]圖 30 - (A)FRET對BRET2。相較于FLIPmal-2μ的FRET反應（平均值土SD，η= 3)，在添加16. 67μM腔腸素400a后，1μMGFP2-MBP-RLuc2融合蛋白的BRET2反應（平均 值土SD，n= 11)的麥芽糖濃度依賴性（530/485-nm比率）。根據(jù)由Fehr等（2002)呈現(xiàn)的 數(shù)據(jù)重新繪制FLIPmal-2μ的劑量-反應曲線。相對于log[激動劑]對反應來擬合數(shù)據(jù)。 BRET2EC50 = 0. 4μM且FRETEC50 = 3. 2μM。（B)微流體芯片上針對麥芽糖的基于BRET2 的MBP測定相對于使用微板測定的比較。
[0207]圖31-用于從無（A)和有（B)線上光纖開關的微流體芯片系統(tǒng)收集數(shù)據(jù)的實驗設 置。BP-帶通，PMT-光電倍增管；NA-數(shù)值孔徑。
[0208] 圖32-在無（A)和有（B)光學開關下，對于三次操作收集的實時Rluc/Clz400a生 物發(fā)光信號。
[0209] 圖33-在無和有光學開關下，Rluc/Clz400a和GFP通道的平均生物發(fā)光信號比較。
[0210] 圖34-顯示通過液體光導管與光檢測器聯(lián)用的直徑增加的BRET反應室 (0 = 4mm，h= 2mm)的布置的實例。
[0211] 圖35-狹窄口徑相對于寬口徑BRET檢測室/光學系統(tǒng)的性能比較。在兩種情況 下，BRET發(fā)射均從流過微流體通道的0G0R2傳感器的1/100稀釋液測量。（a)狹窄口徑系統(tǒng) (腔室尺寸0 = 2mm，h= 2mm;纖維核心直徑=1mm，NA= 0· 48)。（b)寬口徑系統(tǒng)（腔 室尺寸0=4mm，h= 2mm，光導管核心直徑=5mm，NA= 0· 59)。
[0212] 圖36-說明使用基于更寬直徑BRET反應室（4mm)和寬口徑液體光導管的更高效 光捕捉系統(tǒng)，利用高度稀釋的0G0R2傳感器檢測1μM丁二酮。（a) 100倍傳感器稀釋液。 BRET2比率的丁二酮依賴性降低=13. 7%以及（b) 50倍傳感器稀釋液，BRET2比率的丁二酮 依賴性降低=14. 7%。誤差棒表示3個實驗的標準偏差（N= 3)。
[0213] 圖37-使用分叉光導管且無分色鏡的單一微流體通道和BRET光收集系統(tǒng)的實例。 可添加額外組的分叉光導管連同濾光器和數(shù)對光檢測器一起以適合于一個或多個其它微 流體通道和/或BRET反應室。
[0214] 圖38-具有有助于多通道測量的快門框的光學構造
[0215] 圖39-用分叉光導管或分色鏡檢測的BRET信號的強度的比較。a、b:分叉光導管， 反應室尺寸0=4mm;h=Imm,有和無反射蓋。c、d:伴有分色鏡的單一光導管,反應室尺 寸0= 4mm;h= 2mm(即a、b的體積加倍）。所有版面都顯示在t= 0時啟始流動之后， 信號隨時間增加。版面a和c藍色信道，版面b和d綠色通道。
[0216] 圖40-適于測量來自快門框的BRET輸出的多分叉光導管布置。
[0217] 圖41-在單一分色鏡上匯合的多分叉光導管相對于發(fā)散至兩個單獨濾色器中的 分叉光導管的比較。在藍色（RLuc;1、3)和綠色（GFP;2、4)通道中收集的相對光強度。1、 2:根據(jù)圖38和40的具有分配給不同微流體通道的輸入端和通過優(yōu)化分色濾光器導向一對 PMT的輸出端的多分叉光導管。3、4:根據(jù)圖37的具有分配給不同光譜通道的輸出端的分 叉光導管。
[0218] 圖42-使用真空光電倍增管技術的超低光度光檢測器的實例。來源=Hamamatsu
[0219] 圖43-使用固態(tài)技術建構的超低光度光檢測器的實例。尺寸以mm計。來源： Hamamatsu
[0220] 圖44-在兩個不同流動速率下操作的三進口微流體裝置中層流和擴散混合的直 接可視化。三種水性輸入物中的兩者用藍色或紅色食物色素著色。用以抽取模式工作的單 一注射泵操作裝置。流動方向：右至左。
[0221] 圖45-基于垂直堆疊的物流的被動混合實例設計。通道的寬度從600μm起始直至 2mm，厚度是20-60μm。長度具有靈活性，從20mm起始直至IOOmm，角度是45度（其可歷經(jīng) 從0°至接近于約170°的寬范圍加以變化，或?qū)嶋H上與微流體芯片的平面成某一角度）。
[0222] 圖46-BRET比率測量結果的比較。誤差棒反映標準偏差（η= 3)。
[0223] 圖47-用于多路檢測的微流體芯片設計實例。在頂部處的進口被指定用于底物， 而在底部處的三個進口用于引入傳感器1、樣本和傳感器2。
[0224] 圖48-用于并行檢測的微流體芯片設計實例。流動方向是底部至頂部。流動速率 是150μ1/h和1500μΙ/h。從底物進口引入紅色食物染料，且從傳感器進口引入藍色染料。 無食物色素用于樣本進口。
[0225] 圖49-通過處于抽取模式的單一抽吸泵操作的三進口微流體裝置。處于抽吸模式 的泵在裝置出口處產(chǎn)生負壓。樣本、傳感器和底物物流被吸入共用通道（顯示為蛇形布置） 且加以被動混合。使BRET反應室剛好位于出口之前。此處使用的泵是注射泵，也可使用廣 泛多種泵送方法。
[0226] 圖50-用于使用以抽取模式工作的注射泵進行并行獨立操作的構造。一實例是其 中四個傳感器通道是通過使用四個單獨注射器來獨立并行操作。這使得能夠在不同流動速 率下操作傳感器通道以滿足一定范圍的不同要求。
[0227] 圖51-a.來自以抽吸模式用多分叉光導管和優(yōu)化分色鏡操作的芯片上凝血酶傳 感器的RLuc和GFP信號。反應室0 = 2mm，H= 1mm。b.來自"a"的BRET2信號。C.基 于相等滯留時間說明具有相同直徑和不同高度的腔室的預期信號。
[0228] 圖52-在微流體形式中達成的特異性麥芽糖檢測。比較BRET2-MBP傳感器對0.ImM 麥芽糖、葡萄糖和蔗糖的BRET2反應。
[0229] 圖53-在N末端處具有GFP2且在C末端處具有RLuc2的BRET2凝血酶傳感器已被 修飾來模擬纖維蛋白溶酶的K-酪蛋白靶標序列：XKZX，其中Z=K、Y、V或E。
[0230] 圖54-在5μM腔腸素存在下，使用GfP2-FL1-RLucZ傳感器在PBS、奶c)和d)或 橙汁（a和b)的各種稀釋液中產(chǎn)生的BRET2信號強度和比率
[0231] 圖55-在5μM腔腸素A存在下，使用GFP2-FL1-RLud傳感器在未稀釋全乳中產(chǎn)生 的BRET2信號的時間過程。a.強度。b.BRET2比率。
[0232] 圖56-GTR2蛋白在凝血酶裂解緩沖液或（a)血清、（b)橙汁或（c)奶的各種稀釋 液中的生物發(fā)光強度（GFP2通道-515nm帶通30nm)。
[0233] 圖57-GTR2蛋白在凝血酶裂解緩沖液或（a)血清、（b)橙汁或（c)奶的各種稀釋 液中的BRET2比率。
[0234] 圖58-使用GTR2檢測凝血酶裂解緩沖液、稀釋的奶、橙汁或血清中的凝血酶蛋白 酶活性（2單位）。結果呈現(xiàn)為標準化BRET2比率，因為絕對BRET~2比率根據(jù)樣本和它的稀 釋液而變化。應注意的是在血清的1/10稀釋液中不存在作用可能歸因于由血清制備中使 用的肝素產(chǎn)生的殘余活化的抗凝血酶III使添加的凝血酶失活。
[0235] 圖59-用于氣液分配實驗的試樣夾具
[0236] 圖60-在時間=0時啟動風扇之后，氧氣進入除氧SASS2400樣本流體中的時間過 程。
[0237] 圖61-在時間=0時啟動風扇之后，苯酚進入SASS2400樣本流體中的時間過程。 使用任意單位指示相對苯酚濃度。
[0238] 圖62-3通L口氣動操作的球閥。這允許在活躍取樣期間將揮發(fā)性頂部空間快速 (<Is)轉換至SASS2400空氣入流。
[0239] 圖63-顯示用于以用于快速轉換進氣的三通閥進行SASS2400測試的設置的示意 圖。
[0240] 圖 64-Str112 (A)、Str114/113 (B)和Str113 (C)的選擇性。Str112 (平均值土SD， η= 3)、Strll4/113(平均值土SD，η= 14)和Strll3(平均值土SD，η= 6)對 1μΜ氣味 劑或水（灰色棒條）的BRET2 反應。##Ρ〈0· 0001，#P〈0. 001 且 *Ρ〈0· 05。
[0241] 圖65-BRET標記的SGSR-112(A)和SGSR-114/113⑶線蟲氣味受體對2-戊酮的 BRET反應。
[0242] 圖66-BRET標記的（A)Strll4/113線蟲氣味受體對丁二酮和2 -戊酮以及（B) Str-113線蟲氣味受體對1-己醇的BRET反應。
[0243] 圖67-使用GMR基于BRET2的傳感器實時、連續(xù)、芯片上檢測1μM麥芽糖。A)在 100μL/小時輸入速率下隨時間變化的通道發(fā)光度，Β)在100μL/小時輸入下隨時間變化 的BRET2比率。C)在200μL/小時輸入速率下隨時間變化的通道發(fā)光度，D)在200μL/小 時輸入速率下隨時間變化的BRET2比率。Ε)在水對照與1μM麥芽糖之間進行的在100μL/ 小時下從200至250秒平均化的BRET2比率的比較。F)在水對照與1μM麥芽糖之間進行 的在200μL/小時下從200至250秒平均化的BRET2比率的比較。
[0244] 序列檢索表
[0245] SEQIDNO: 1-編碼0G0R2融合蛋白的核苷酸序列。
[0246] SEQIDN0:2_0G0R2 融合蛋白。
[0247] SEQIDNO: 3-編碼GFP2-MBP_RLuc2融合蛋白的核苷酸序列。
[0248] SEQIDN0:4-GFP2-MBP-RLuc2 融合蛋白。
[0249] SEQIDNO: 5-編碼GFP2-MBP_RLuc2W140A融合蛋白的核苷酸序列。
[0250] SEQIDN0:6-GFP2-MBP-RLuc2W140A融合蛋白。
[0251] SEQIDNO: 7至12-寡核苷酸引物。
[0252] SEQIDN0:13-GFP2-str-112SGSR-RLuc融合蛋白。
[0253] SEQIDNO:H-GFP2-Str-113SGSR-RLuc融合蛋白。
[0254] SEQIDN0:15-GFP2-str-114SGSR-RLuc融合蛋白。
[0255] SEQIDN0:16-GFP2-str-115SGSR-RLuc融合蛋白。
[0256] SEQIDN0:17-GFP2-str-116SGSR-RLuc融合蛋白。
[0257] SEQIDN0:18-GFP2-str-114/113SGSR-RLuc融合蛋白。
[0258]SEQIDNO: 19-編碼GFP2-Str-112SGSR-RLuc融合蛋白的核苷酸序列。
[0259]SEQIDNO:20-編碼GFP2-Str-113SGSR-RLuc融合蛋白的核苷酸序列。
[0260]SEQIDNO:21-編碼GFP2-Str-IHSGSR-RLuc融合蛋白的核苷酸序列。
[0261]SEQIDNO:22-編碼GFP2-Str-115SGSR-RLuc融合蛋白的核苷酸序列。
[0262]SEQIDNO: 23-編碼GFP2-Str-116SGSR-RLuc融合蛋白的核苷酸序列。
[0263]SEQIDN0:24-編碼GFP2-str-114/113SGSR-RLuc融合蛋白的核苷酸序列。
[0264]SEQIDN0:25-GFP2-0G0R_RLuc2 融合蛋白。
[0265]SEQID NO: 26-GFP2_0G0R突變體-RLuc2 融合蛋白。
[0266]SEQID N0:27-GFP2-str-112SGSR-RLuc2 融合蛋白。
[0267]SEQID N0:28-GFP2-str-113SGSR-RLuc2 融合蛋白。
[0268]SEQID N0:29-GFP2-str-114SGSR-RLuc2 融合蛋白。
[0269]SEQIDN0:30-GFP2-str-114/113SGSR-RLuc2 融合蛋白。
[0270]SEQID N0:31-GFP2-str-115SGSR-RLuc2 融合蛋白。
[0271]SEQID N0:32-GFP2-str-116SGSR-RLuc2 融合蛋白。
[0272]SEQIDNO: 33-編碼GFP2-0G0R-RLuc2融合蛋白的核苷酸序列。
[0273]SEQIDNO: 34-編碼GFP2-OGOR突變體-RLuc2融合蛋白的核苷酸序列。
[0274]SEQIDNO:35-編碼GFP2-Str-112SGSR-RLuc2 融合蛋白的核苷酸序列。
[0275]SEQIDNO:36-編碼GFP2-Str-113SGSR-RLuc2 融合蛋白的核苷酸序列。
[0276]SEQIDNO: 37-編碼GFP2-Str-114SGSR-RLuc2 融合蛋白的核苷酸序列。
[0277]SEQIDNO:38-編碼GFP2-Str-114/113SGSR-RLuc2 融合蛋白的核苷酸序列。
[0278]SEQIDNO:39-編碼GFP2-Str-115SGSR-RLuc2 融合蛋白的核苷酸序列。
[0279]SEQIDNO: 40-編碼GFP2-Str-116SGSR-RLuc2 融合蛋白的核苷酸序列。
[0280]SEQIDN0:41_ 秀麗隱桿線蟲str-112。
[0281]SEQIDN0:42_ 秀麗隱桿線蟲str-113。
[0282]SEQIDN0:43_秀麗隱桿線蟲str-114/113嵌合蛋白。
[0283]SEQIDN0:44_編碼秀麗隱桿線蟲str-112的開放閱讀框。
[0284]SEQIDN0:45_編碼秀麗隱桿線蟲str-113的開放閱讀框。
[0285]SEQIDN0:46-編碼秀麗隱桿線蟲str-114/113嵌合蛋白的開放閱讀框。
[0286] 發(fā)明詳述
[0287] 一般件摶術和定義
[0288] 除非另外明確定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都應視為具有與由本領 域（例如在細胞培養(yǎng)、分子遺傳學、免疫學、免疫組織化學、蛋白質(zhì)化學和生物化學中）普通 技術人員通常所理解的含義相同的含義。
[0289] 除非另外指示，否則本發(fā)明中利用的重組蛋白、細胞培養(yǎng)和免疫技術是為本領 域技術人員所熟知的標準程序。所述技術是在以下出處中的文獻中進行描述和說明：如 J.Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWileyandSons(1984)； J.Sambrook等,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbour LaboratoryPress(1989) ;T.A.Brown(編），EssentialMolecularBiology:APractical Approach,第I和 2 卷，IRLPress(1991) ;D.M.Glover和B.D.Hames(編），DNACloning:A Practical Approach,第1-4卷，IRL Press (1995和1996);以及F.M. Ausubel等 (編),Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley_Interscience(1988,包括直至目前的所有更新）；Ed Harlow和David Lane(編） Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)；以及 J. E. Coligan等（編）Current Protocols in Immunology, John Wiley&Sons(包括直至 目前的所有更新）。
[0290] 術語"和/或"，例如"X和/或Y"應理解成指"X和Y"或"X或Y"且應視為提供 對兩種含義或?qū)θ我缓x的明確支持。
[0291] 除非上下文另外表明，否則以單數(shù)提及術語（如傳感器分子和受質(zhì)）也明確指復 數(shù)。舉例來說，根據(jù)邏輯，許多個別傳感器分子而非單一分子將流過裝置。
[0292] 除非相反陳述，否則如本文所用，術語約是指指定值的+/-20%、更優(yōu)選+/-10%、 甚至更優(yōu)選+/_5 %。
[0293] 在整篇本說明書中，用詞"包含（comprise) "或變化形式（如"comprises"或 "comprising"）應理解為暗示包括所述要素、整數(shù)或步驟、或成組要素、整數(shù)或步驟，而非排 除任何其它要素、整數(shù)或步驟、或成組要素、整數(shù)或步驟。
[0294] 檢測/分類/篩詵系統(tǒng)
[0295] 本發(fā)明涉及一種檢測樣本中的分析物的方法，所述方法包括
[0296] i)使以下各物流過包括一個或多個微通道的微流體裝置，
[0297] a)所述樣本，
[0298] b)包含結合所述分析物的結構域、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的傳感器 分子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域 的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)，
[0299]c)所述化學發(fā)光供體的底物，
[0300]ii)在所述裝置中混合所述傳感器分子、樣本和底物，以及
[0301]iii)使用電光學感測裝置檢測由所述化學發(fā)光供體對所述底物的修飾，
[0302] 其中當所述分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于所述 接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
[0303] 本發(fā)明也涉及一種用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的微流體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括
[0304]i)至少一個適于容納（或包含）包含結合所述分析物的結構域、化學發(fā)光供體結 構域和接受體結構域的傳感器分子的儲集器，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化 學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)，
[0305]ii)包括一個或多個微通道的微流體裝置，
[0306] iii)用于在所述裝置中混合所述傳感器分子、所述樣本和所述化學發(fā)光供體結構 域的底物的部件，
[0307]iv)用于檢測所述分析物與所述傳感器分子的結合的反應室，和
[0308] V)電光學感測裝置，
[0309] 其中當所述分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于所述 接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
[0310]如熟練人員將了解，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)可用于檢測樣本中存在或不存在分析 物，且如果存在，那么也可用于測定所述分析物的濃度。
[0311] 本發(fā)明具有超過先前技術的眾多優(yōu)勢，特別是當與傳感器分子固定于裝置的方法 和系統(tǒng)進行比較時。首先，無需再生（再設置）裝置。其次，在本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中存在 較小信號漂移。第三，因為裝置可再使用的次數(shù)比當固定傳感器分子時多許多，所以成本得 以降低。第四，本發(fā)明避免在固定構造下歸因于傳感器分子的表面積和密度的信號較低問 題。第五，當前技術是基于體積的檢測技術，而非其中傳感器分子需要連接于表面的基于表 面的技術，如表面等離子體共振。傳感器-分析物反應發(fā)生更加快速，由此甚至在不主動控 制下減少分析時間。
[0312] 此外，BRET具有超過基于熒光的技術的若干優(yōu)勢，因為它不需要用外部光源激發(fā) 供體。BRET不遭受供體的自身熒光、光散射、光致漂白和/或光致異構化或?qū)毎墓庵聯(lián)p 傷。在BRET測定中不存在外部光源導致背景極低以及因此檢測靈敏度增加。舉例來說，就 監(jiān)測凝血酶催化的蛋白水解裂解而言，BRET比FRET靈敏50倍（Dacres等，2009b)。
[0313] 關于使用本發(fā)明的方法分類樣本，傳感器分子（更通常是一組傳感器分子）可用 于檢測代表特定子群體的物質(zhì)（分析物）樣式。
[0314] 舉例來說，方法可用于分類啤酒、葡萄酒、乳酪或其它消費品的不同類型、年代、 品質(zhì)等。方法也可廣泛地與食品、飲料、香料、芳香劑等的樣本一起用于分類或定量它們 的感官性質(zhì)，如甜味、苦味、鮮味特征、例如關于辣椒素（capsaicin)或輕基-α-山椒醇 (sanshool)的"熱度"、例如關于薄荷醇（menthol)的"涼爽度"和/或適合傳感器分子可針 對其加以分離或工程改造的任何嗅覺指示。方法也可用于基于化學特征分類廣泛范圍的其 它樣本，例如基于頂部空間、呼吸、汗、尿、其它生物流體的樣本分類人、動物或植物的健康、 營養(yǎng)或疾病狀態(tài)。方法的另一用途在于基于樣本的毒性或有害性，如存在爆炸物或爆炸物 相關組分、毒性工業(yè)化學品、化學或生物學戰(zhàn)爭試劑或病原微生物來分類樣本。方法也可用 于監(jiān)測工業(yè)過程，包括與規(guī)格的一致性或存在、不存在各種水平的任何一組或多組化學品。 方法也可用于實時或以批式模式分類環(huán)境樣本，例如以確定空氣質(zhì)量、不合意氣味或毒性 化學品的存在或水平、或類似地天然或網(wǎng)狀水系統(tǒng)、污水系統(tǒng)或地下水的質(zhì)量，或分類與土 壤或巖石接觸的流體。
[0315] 通常通過基于對一組訓練樣本的電光學反應的樣式產(chǎn)生判別函數(shù)或分類器來對 樣本進行分類，所述樣本代表或涵蓋希望判別的所有類別的樣本。這可使用多變量統(tǒng)計方 法，如主成分分析、線性判別分析、逐步判別分析等來常規(guī)達成?；蛘?，可使用廣泛多種機器 學習方法，一個實例是支持向量機。一類似方法在于使用貝葉斯網(wǎng)絡（Bayesiannetwork) 或訓練人工神經(jīng)網(wǎng)絡來在測試組的樣本之中進行所述判別。一種可行方法是接著捕捉來自 測試或未知樣本的電光學反應的樣式，實時處理它們并將它們與用訓練組樣本獲得的保存 的樣式進行比較，根據(jù)最佳匹配將它們指定至已知類別或如果先前尚未觀察到類似樣式， 那么將它們指定至一個或多個新型類別。對于分類方法，并非必需的是實際分析物是已知 的，僅需要傳感器分子（或成組傳感器分子）可重現(xiàn)地產(chǎn)生與不同類別的樣本不同的信號 樣式，此使得使用者能夠分類所分析的樣本。
[0316] 關于靈敏度，可檢測低至微摩爾濃度、納摩爾濃度、飛摩爾濃度、阿托摩爾濃度或 甚至更低的分析物濃度。在實施方案中，本發(fā)明的方法比如果所述方法在相同試劑濃度下 在微孔板上所執(zhí)行的靈敏至少5倍、或至少10倍、或5倍至1，000倍、或5倍至100倍、或 5倍至50倍、或5倍至20倍，或且在一些情況下多達100至1，OOO倍。
[0317]本發(fā)明特別適用于實時檢測分析物。如本文所用，術語"實時"是指某一狀態(tài)大致 上同時以另一形式顯示（例如以顯示器上的圖像或具有處理的數(shù)據(jù)的圖形式）。在所述情 況下，"實時"滯后實際事件為數(shù)據(jù)處理所需的時間。如果所述時間滯后大致上可忽略，那么 它包括在"實時"的范圍中。所述時間滯后可通常在10秒內(nèi)，且優(yōu)選不加限制地在1秒內(nèi)。 在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的方法是在約Is至約IOOs內(nèi)執(zhí)行。
[0318]如本文所用，"福斯特距離"是能量轉移效率是（平均）50%所處的供體與接受體 之間的距離。福斯特距離（Ro)取決于許多因素，包括在不存在接受體下的供體量子產(chǎn)率、 溶液的折射率、各結構域的偶極角定向、以及供體和接受體的光譜重疊積分。
[0319]如本文所用，"量子產(chǎn)率"是指原始能量供給的最終發(fā)射的量度。
[0320]如本文所用，"斯托克斯位移"是相同電子躍遷的吸收和發(fā)射光譜的帶最大值的位 置之間的波長差異。
[0321]在實施方案中，本發(fā)明用于在裝置上分析遞增（例如通過在芯片上合成分析物） 或遞減（例如在芯片上降解或修飾分析物）濃度的分析物。通常，這將需要在裝置上的兩個 不同點處，例如在分析物所流過的第一和第二反應室中檢測底物的修飾。因此，在實施方案 中，分析物從傳感器分子釋放導致BRET比率變化彡15 %、彡20 %、彡30 %、彡35 %、約15 % 至約50%、或約15%至約40%的最大觀察BRET比率。
[0322]在另一實施方案中，傳感器分子可進入結合于配體的輸入微通道，且待檢測的分 析物（例如催化酶）裂解和/或修飾所述配體以使修飾的配體從傳感器分子釋放（不再結 合于傳感器分子）。
[0323]本發(fā)明的方法和系統(tǒng)中的BRET感測是在微流體裝置中實現(xiàn)。在一個構造中，系統(tǒng) 包括若干模塊，其包括（1)樣本遞送，（2)試劑儲存和處理，（3)微流體芯片和裝載系統(tǒng)，（4) 任選溫度控制，（5)用于光收集的電光學系統(tǒng)，（6)電光學檢測系統(tǒng)，（7)數(shù)據(jù)擷取和處理， 和（8)軟件和嵌入控制系統(tǒng)（圖13)。
[0324] 樣本遞送
[0325]"樣本"可為已知或懷疑包含待檢測的分析物或要檢測預期或需要不存在特定物 質(zhì)、一組物質(zhì)或組合物的任何物質(zhì)或組合物。樣本的實例包括空氣、液體和生物材料。樣本 可直接從環(huán)境或來源獲得，或可在執(zhí)行本發(fā)明的方法之前通過適合程序至少部分純化。
[0326]樣本可呈能夠流過微流體裝置的任何形式。實例包括但不必限于液體、氣體、乳液 或混懸液。在實施方案中，樣本是已用氣體預平衡的液體。混懸液的實例包括但不必限于 油包水、水包油和含氣體的液體。
[0327]在更特定實施方案中，使環(huán)境空氣或來自目標位置或任何目標對象或樣本的頂部 空間的其它氣體與水或水溶液緊密接觸以使分析物的快速質(zhì)量傳遞基于分析物的氣體濃 度、溶解度和分配系數(shù)以及液相的組成從氣相向液相發(fā)生。產(chǎn)生相對于液體體積具有大面 積的氣液界面的任何方法都是潛在適合的。示例性方法包括濕壁旋流器、噴霧或鼓泡系統(tǒng)。 SASS2400濕壁旋流器是適于加速揮發(fā)物從空氣分配至水相中的裝置的一特定實例。優(yōu)選 地，方法允許大體積的空氣與較小體積的液體接觸，由此允許對大體積的氣相取樣以及提 供濃縮步驟?；赟ASS2400的公布的規(guī)格，有可能在標準溫度和壓力下每分鐘使1體積的 水或水溶液與40, 000體積的氣體接觸。視所用設備的尺寸和操作特征而定，可對低得多或 高得多的氣液比進行取樣。
[0328] 在一個實施方案中，混懸液是或包含無細胞提取物。在替代性實施方案中，混懸液 包含細胞。
[0329] 可通過任何適合手段使樣本（以及傳感器分子和底物）流過微流體裝置，所述手 段如但不必限于以下一項或多項：泵送、真空、水力、抽吸、電動、化學滲透、毛細管力、聲學、 電磁、壓電學等。泵送機制可用用于各種應用的緊湊、小型化以及微米尺寸泵實現(xiàn)?？纱?在用以從樣本濾出碎片，如粒子、有機小滴等的預調(diào)裝置、和/或測量樣本的一些基本參數(shù) (如樣本的溫度、濕度、流動速率和體積）的條件監(jiān)測裝置。
[0330] 試劑儲存和處理
[0331] 可使用用于多種試劑（BRET試劑、清潔DI水、底物等）儲存的一次性和可收回液 體儲存系統(tǒng)。裝置可在實驗室中預裝載且在操作期間插入感測裝置中。
[0332] 微流體裝置和裝載系統(tǒng)
[0333] 微流體裝置（在本領域中也稱為芯片或"芯片上的實驗室（lab-on-a-chip) "）通 過在腔室和通道中操作流體試劑來進行化學或生物化學反應或分析，所述腔室和通道的橫 截面的尺寸通常是約10至50μm(微米）直至約100至1000μm，且其形成在通常平坦的具 有線性尺寸約Imm至約20cm的基板上或中。當流體反應物以從輸入儲集器通過裝置流向 出口的連續(xù)流形式，或以在操作期間大致上充滿裝置的通道和腔室的流體等分試樣的半連 續(xù)流形式來流過裝置的通道和腔室時，微流體裝置可操作流體反應物?；蛘?，微流體裝置可 操作呈單獨和離散微滴形式的流體試劑，所述微滴的特征在于具有的長度的數(shù)量級接近裝 置尺寸或小于裝置尺寸。
[0334] 一旦微流體裝置插入芯片裝載系統(tǒng)中，則微流體裝置可維持與所有樣本和試劑遞 送出口連通。這個裝載系統(tǒng)可形成為溫度控制和光學組件的一部分。單一至多個反應器可 集成至芯片中（圖14)。三種試劑（樣本、傳感器分子和底物）流可被泵送至芯片中且在混 合區(qū)中混合。在替代性構造中，存在兩個輸入微通道，一個用于底物且另一個用于傳感器分 子和樣本的預混合物。在另一構造中，存在兩個輸入微通道，一個用于傳感器分子且另一個 用于底物和樣本的預混合物。
[0335] 混合的試劑將經(jīng)受BRET反應且產(chǎn)物可在從廢物出口收集之前通過檢測腔室連續(xù) 泵送（圖15)。
[0336] 如本文所用，術語"混合"或其變化形式是指分析物、傳感器分子和底物通過任何 種類的手段接觸，無論是擴散（例如由線性（分層）流動所致）和/或通過某種主動混合 手段。因此，在一個實施方案中，"用于混合的手段"可為線性（分層）流動中的被動擴散。 在這個實施方案中，盡管未達成完全混合，但本
【發(fā)明者】已發(fā)現(xiàn)發(fā)生足量混合供本發(fā)明的方 法適當?shù)仄鹱饔谩Ｔ趯嵤┓桨钢?，擴散混合導致至少20%包含樣本、傳感器分子和底物的微 通道具有這些組分的均質(zhì)混合物。
[0337] 至少兩個微通道匯合以形成共用微通道的角度可從0°變化至接近約170°或?qū)?際上與微流體芯片（裝置）的平面成某一角度。
[0338] 如本文所用，術語"共用微通道"或其變化形式是指包含樣本、傳感器分子和底物 的微通道或其區(qū)段。
[0339] 如本文所用，術語"輸入微通道"或其變化形式是指如樣本、傳感器分子或底物等 特定試劑或試劑的組合進入微流體裝置所通過的微通道。
[0340] 在至少一些實施方案中，由于存在層流區(qū)，所以混合手段優(yōu)選在混合區(qū)中實施以 增強反應物的接觸?；旌鲜侄慰砂ū粍踊旌希▓D8和圖44)和/或主動混合，如用聲學 混合器混合（例如如W02006/105616中所述）。其它混合技術也可出于所述目的加以實施， 如TO2003/015923中所述的技術。
[0341] 如本文所用，術語"在裝置中混合傳感器分子、樣本和底物"及其變化形式涵蓋在 裝置的儲集器中混合傳感器分子，樣本和底物、在流入裝置的微通道中的管中混合傳感器 分子、樣本和底物，在裝置的微通道中混合傳感器分子、樣本和底物，或在反應室中混合傳 感器分子、樣本和底物，或其兩個或更多個組合。在優(yōu)選實施方案中，傳感器分子、樣本和底 物是在微通道中混合。優(yōu)選地，如果傳感器分子和樣本不在微通道中混合，那么它們臨在進 入微通道之前（例如10秒、更優(yōu)選1秒或小于1秒）加以混合。
[0342] 在實施方案中，混合步驟導致傳感器分子、底物和分析物形成至少20%、至少 30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%均質(zhì)的 混合物。如上所指示，對于任何給定流動速率和通道構造，主動混合將產(chǎn)生更大程度的均質(zhì) 性，但這未必為執(zhí)行本發(fā)明所需。
[0343] 本發(fā)明的方法可用于使用同一微流體裝置，例如使用如圖14b和14c中所示的裝 置同時或依序檢測兩種或更多種不同分析物。在實施方案中，不同傳感器分子是使用不同 微通道流入裝置中。為方便起見，如果待分析的樣本的各分析物相同，那么可存在進入裝 置中的單一樣本流，其接著分支且與包含不同傳感器分子的其它通道接合（參見圖14b和 14c)。如果各傳感器分子的底物相同，那么同樣適用。熟練人員可視待分析的樣本的數(shù)目、 為檢測各靶標分析物所需的傳感器分子的數(shù)目、以及鑒于所用不同傳感器分子所需的相應 底物的數(shù)目而定來容易地設計微通道的適合構造。
[0344] 微流體裝置可由具有化學相容性和機械強度的必需特征的任何材料制造。所述物 質(zhì)的實例包括但不必限于硅、玻璃（例如熔融二氧化硅、熔融石英、硼硅酸鹽或任何類型的 具有不同添加劑的玻璃）、聚二甲基硅氧烷、聚酰亞胺、聚對苯二甲酸乙二酯、聚甲基丙烯酸 甲酯、聚氨基甲酸酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯聚砜、聚碳酸酯、聚甲基戊烯、聚丙烯、聚偏二氟乙 烯、多晶硅、聚四氟乙烯、聚砜、丙烯腈丁二烯、苯乙烯、聚丙烯腈、聚丁二烯、聚（對苯二甲 酸丁二酯）、聚（醚砜）、聚（醚醚酮）、聚（乙二醇）、苯乙烯-丙烯腈樹脂、聚（對苯二甲 酸1，3-丙二酯）、聚乙烯丁醛、聚偏二氟乙烯、聚（乙烯吡咯烷酮）、環(huán)狀烯烴共聚物及其任 何組合。
[0345] 可使用本領域中的標準技術，如單一和多層軟平版印刷（MSL)技術和/或犧牲層 囊封方法構建裝置（芯片）（參見例如Unger等（2000) ;W0 01/01025)。制造微流體裝置的 其它方法包括微型機制、微型磨削、基于激光的機制、化學蝕刻、（深度）反應性離子蝕刻、 壓印技術。這些技術可連同熱壓紋和/或注射模制技術一起用于批量生產(chǎn)微型裝置。在制 造技術方面存在許多先前技術。這些技術中的一些也描述于US5, 858, 195、US5, 126, 022、 US4,891，120、US4,908，112、US5,750,015、US5,580,523、US5,571，410、US5,885,470 和US6, 793, 753中?？芍圃飒毩⒔Y構以具有相對于通道寬度和高度極薄或極厚的壁。通道 的壁以及頂部和底部可都具有不同厚度且可由相同材料或不同材料或材料的組合制得，所 述組合如玻璃、硅和可生物相容材料（如PDMS)的組合。密封通道或腔室可完全由如PDMS 等可生物相容材料制得。
[0346] 適用于本發(fā)明的裝置可具有一個或多個通道和/或反應室。舉例來說，裝置可包 括2、3、4、5、6、7、8、9、10個或大于10個通道。此外，裝置可包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個 或大于10個反應室。
[0347] 反應室和微通道可為本領域中已知的任何適合形狀，如但不限于圓柱形、矩形、半 球形或梯形。
[0348] 在實施方案中，當裝置能夠進行一個以上反應時，通道設計使得各組分流過具有 相同長度、尺寸和構造的通道，如圖47中提供的兩側對稱平行通道布局。
[0349] 在另一實施方案中，微通道的功能和反應室的功能可通過其中發(fā)生混合且從其收 集光的單一組合的微流體元件來滿足。
[0350] 微流體裝置將通常具有一個或多個約Ipl(即皮升或一萬億分之一升）至約 200μ1的反應室體積。然而，在某些應用中，約0.Olnl(即納升或十億分之一升）至約 IOOnl之間、或約0.Olnl與IOnl之間的反應室體積可為有利的。當各反應室的體積在約 0. 20nl至約5nl之間時，一些實施方案可最優(yōu)地實施。另一實施方案是其中各反應室的體 積在約0. 25nl至約2nl之間。在另一實施方案中，反應室具有約1μ1至約12μ1的體積。 適當時可使用其它可能的反應室體積。
[0351] 在優(yōu)選實施方案中，反應室的寬度大于其長度。在一個實例中，反應室具有的橫截 面積為約Imm2至Icm2且高度為至多約5mm。
[0352] 在一些情況下，可能合乎需要的是使用具有一種以上尺寸和形狀的反應室。舉例 來說，本
【發(fā)明者】已觀察到較大反應室會產(chǎn)生更多光且允許檢測更弱發(fā)射性傳感器分子，常 以在遞呈含有靶標分析物的樣本后的反應時間（達到BRET比率峰值變化的時間）較慢以 及當移除分析物時停機時間較長為代價。因此，不同通道可配備尺寸不同的反應室以匹配 傳感器分子和分析物或成組分析物的特定組合的靈敏度、精確度和時間動態(tài)。也可能以及 在一些情況下可能合乎需要的是每個傳感器通道建構一個以上反應室。這將允許在較高發(fā) 光度和定量精確度（大腔室）和較高時間分辨率（較小腔室）下接近同時檢測樣本。這可 通過光學開關或等效物使大腔室和較小腔室與它們自身的進入檢測器的光路配合，或使各 腔室與單獨固態(tài)光檢測器配合來容易地達成。
[0353] 可基于裝置的特定應用選擇微通道的尺寸。因此，微通道的寬度可在例如約0.Imm 至約IOmm的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，微通道的寬度是約0.5mm至約5_。在一些實施 方案中,微通道的寬度是約Imm至約4_。在一些實施方案中，微通道的寬度是約2. 5_。也 可基于裝置的特定應用選擇微通道的深度或高度。因此，微通道的深度可在例如約5μm至 約2000μm的范圍內(nèi)。在一些實施方案中，微通道的深度是約100μm至約1000μm。在一 些實施方案中，微通道的深度是約250μm至約750μm。在一些實施方案中，微通道的深度 是約560μm。在另一實施方案中，各微通道具有約1μm2至約Imm2的橫截面積。
[0354] 如熟練人員將了解，裝置將具有適合進口和出口以使得相關組分能夠流過裝置。
[0355] 熟練技術人員應充分了解的是流過微流體裝置取決于各種因素，包括但不限于微 通道的尺寸、流體的粘度、以及所用的檢測和方法。因此，樣本（傳感器分子和底物）可在 約1μ 1/h至約lOml/h的速率下流過芯片微通道。在一些實施方案中，樣本（傳感器分子和 底物）可在約 1μ1/h至約 100μΙ/h、約 5μΙ/h至約 200μΙ/h、約 7. 5μΙ/h至約 500μ1/ h、或約10μ1/h至約lml/h的速率下流過裝置微通道。
[0356] 在一個實施方案中，裝置包括用于感測例如相同來源（樣本）中的不同分析物的 多個反應室。由于可能需要使用不同傳感器分子來檢測不同分析物，所以在一些情況下，可 能合乎需要的是改變不同、優(yōu)選平行通道中的流動速率。就此而言，可設置各個別流動速率 以使各個別傳感器分子的靈敏度最優(yōu)化。
[0357]在一個實施方案中，在包括多個反應室的裝置中，去向和來自各反應室的流動速 率是通過單獨手段控制，例如單獨抽吸泵控制去向和來自各反應室的流動速率。這個構造 允許在潛在不同流動速率和因此速度與靈敏度之間的不同平衡下，彼此獨立地同時操作多 個傳感器通道。
[0358]微流體通道的表面可通過暴露于適合試劑的溶液（如牛血清白蛋白、稀釋哺乳動 物血清、魚皮明膠、脫脂乳蛋白的〇. 1-5% (w/v)水溶液），和/或使用非離子洗滌劑（如吐 溫-20 (Tween-20))的溶液，或通過使用酵母微粒體的混懸液加以鈍化。
[0359] 在試劑（樣本、傳感器分子、底物）已穿過裝置之后，可通過使適當流體（例如洗 滌流體，如緩沖液）流過微通道來洗滌裝置。這使得裝置能夠被再使用。因此，在一些實施 方案中，方法進一步包括在已檢測分析物之后使如緩沖液等流體流過微型裝置的步驟。待 流過微型裝置的流體的量可為任何量且可基于芯片的體積。在一些實施方案中，洗滌流體 的量是裝置中的微通道的總體積的約〇. 5倍至約10倍。在一個實施方案中，洗滌流體的量 是裝置中的微通道的總體積的約1. 5倍至約2. 5倍。
[0360] 溫度控制
[0361] 如果存在，那么這個模塊用于維持試劑儲存的所需溫度為1_8°C、優(yōu)選2-4°C;以及 BRET反應的所需溫度為20-37°C、優(yōu)選25-28°C。BRET溫度控制可與裝載機構和電光學收 集裝置集成在一起。具體來說，它們是根據(jù)使用局部電阻加熱或珀耳帖（Peltier)裝置冷 卻達成控制功能的技術來構建。舉例來說，熱控制處理器可通過溫度控制的散熱器或冷卻 元件（如珀耳帖裝置）維持在基線溫度下，其中致動器由局部化加熱控制在基線以上?；?者，可使用小型熱泵提供冷卻。局部化加熱可優(yōu)選由有利地由例如小于50、25、15或IOV的 低電壓控制的小于約1至2W的低功率電阻加熱器提供。
[0362] 用于光收集的電光學系統(tǒng)
[0363] 如本文所用的術語"信號"是指測量為吸光度變化的發(fā)光。在一些實施方案中，信 號將為"發(fā)射光"，其中檢測信號的步驟將為通過一個或多個光檢測器檢測具有特定光波長 的光子。示例性光檢測器包括可被冷卻的光電倍增管（PMT)、光電二極管、雪崩光電二極管、 娃或其它固態(tài)光電倍增管（http://en.wikipedia.org/wiki/Silicon_photomultiplier) 或CXD照相機。優(yōu)選地，光檢測器具有的光子檢測效率> 10%、更優(yōu)選> 30%且最優(yōu)選 >50%。優(yōu)選地，這些效率在光譜的藍色和綠色帶中起作用。檢測器進一步包括使檢測的 光限于特定波長或特定波長范圍的部件。這可例如為任選固定于濾光輪的適合濾光器、或 濾光滑片、或單色器、或分色鏡、或這些裝置中的兩個或更多個的組合。
[0364] 電光學系統(tǒng)可主要由光纖和光學開關組成（圖16)。光纖可替換成纖維束或液體 光導管。核心直徑約IOym至約3000μm的纖維可固定至裝載系統(tǒng)中。對于纖維束或液體 光導管，核心直徑可在0. 5_至IOmm的范圍內(nèi)。纖維的平末端可恰好位于反應室以下，其中 各纖維收集來自特定腔室的光。可設計兩種可與反應室集成的BRET電光學檢測元件（參 見圖17)。球形微透鏡可被并入反應室中以幫助將BRET光聚焦至光纖的核心中。
[0365] 在另一實施方案中，光纖/液體光導管系統(tǒng)可替換成一組透鏡和鏡子以使來自各 腔室的光被接轉至檢測器中。多通道系統(tǒng)的轉換可通過機械斷續(xù)器或其它轉換機構來實 現(xiàn)。
[0366] 為進一步增加收集的BRET信號，可將平坦或非球面鏡放置在反應室的頂部上（圖 17b)。在這個情況下，發(fā)射至頂部的大多數(shù)BRET光將被反射回光纖中。對于多通道檢測， 光學開關可用于收集來自所有通道的光。這個元件的材料可為具有出色光學、化學性質(zhì)的 玻璃或聚合材料，如聚二甲基硅氧烷、環(huán)狀烯烴共聚物（COC)等。BRET反應室將連接于以上 針對樣本遞送和混合加以設計的微流體網(wǎng)絡。
[0367] 數(shù)字光子積分
[0368] 超低水平光檢測需要高靈敏性光電倍增管（PMT)和數(shù)字信號處理單元來消除暗 電流。圖42說明用于本發(fā)明中的一示例性系統(tǒng)主要由三個單元組成：PMT、光子計數(shù)單元、 USB計數(shù)單元。H10721P-210是一種在可見光波長內(nèi)提供高靈敏度的具有超級雙堿光陰極 的電流輸出PMT。感光區(qū)域是直徑8_的圓形。當光子到達超級雙堿光陰極時，產(chǎn)生光電 子。光電子被加速朝向在各階段電子的數(shù)目以指數(shù)方式增加所處的一系列級聯(lián)電極結構。 在最后階段，PMT以光電子脈沖或電流形式輸出產(chǎn)生的電子的總和。
[0369] 暗電流定義為在不存在入射光下從PMT出現(xiàn)的電流輸出。通過鑒定和消除所謂 "暗脈沖"，有可能使暗電流最小。在這個實例中，信號處理單元（C9744光子計數(shù)單元）用 于消除暗脈沖。所述單元允許實施使用者設置的閾值以使僅將幅值高于閾值的脈沖傳送至 輸出端。剩余脈沖被濾出輸出信號。在這個單元中，通過判別準則的脈沖被轉換成5V數(shù)字 信號脈沖且傳送至輸出端。
[0370]C8855-01是一種被設計來在無死時間下計數(shù)數(shù)字信號脈沖的USB接口計數(shù)單元。 在C9744光子計數(shù)單元中產(chǎn)生的信號被輸入計數(shù)單元且結果被傳送至具有USB連接的PC 中。
[0371] 光學檢測系統(tǒng)
[0372] 檢測可使用并入裝置中或與裝置分開但與裝置的待檢測區(qū)域?qū)实臋z測器達成。
[0373] 光學檢測系統(tǒng)對來自包括各BRET反應室的各微流體通道的光輸出進行取樣。各 微流體通道可配備有專用光檢測器。舉例來說，可將單一BRET反應室的一部分光輸出引 導通過藍色帶通濾光器，而可將其余部分引導通過綠色帶通濾光器（或其它適合帶通特征 件，視在用BRET的類型而定）?？墒褂霉饫w、光纖束或液體光導管將來自這些濾光器的光引 導至單獨光電倍增管?；蛘?，可緊密鄰近于帶通濾光器放置硅或其它高靈敏性固態(tài)光電倍 增管以便對直接來自各微流體通道和BRET反應室的光發(fā)射進行取樣。在其它實施方案中， 可將一非球面透鏡或一組非球面透鏡放置在光纖、光纖束或液體光導管的末端處以在進入 PMT之前使輸出光束準直，由此降低歸因于在PMT的敏感區(qū)外部的射線發(fā)散的光學損耗。在 優(yōu)選實施方案中，帶通濾光器被放置在微流體芯片的相對側上且與它緊密接觸，且與各微 流體通道上的兩個帶通濾光器緊密接觸來放置固態(tài)光電倍增管或其它光檢測器。為各微流 體通道提供專用檢測系統(tǒng)的優(yōu)勢是這使光學系統(tǒng)的復雜度最小且使?jié)撛诠庾訐p失（包括 歸因于其中對于大部分輪詢周期而言，各微流體通道都是光學沉默的轉換死時間的光子損 失）最小。
[0374] 或者，各微流體通道可由一個或多個共享的光檢測器依序輪詢。
[0375] 在一個實施方案中，檢測系統(tǒng)可由光學或光學機械轉換裝置組成，所述裝置通過 光纖或光導管從各微流體通道接受光且通過單一光纖或光導管連續(xù)輸出這些輸入的每一 個的光學信號。從腔室至腔室的轉換時間可在納秒至數(shù)秒（例如2或3秒）的范圍內(nèi)，優(yōu)選 在10-500毫秒或小于10毫秒的范圍內(nèi)。光學轉換裝置的輸出進行碰撞且如分色鏡等光檢 測器將光拆分成分別對應于BRET供體和接受體的發(fā)射的兩個波長范圍且兩個光電倍增管 用于同時檢測在這些波長范圍的每一個內(nèi)的光（圖16)。任選地，分色鏡可由調(diào)諧至BRET 供體和接受體發(fā)射光譜的帶通濾光器加強。
[0376] 在替代性實施方案中，可使用快門框替代光學開關。在所述布置中，快門框的輸出 端可為多對一多分叉光導管，其將所有光學通道的輸出都約束至將光引導至光檢測器中的 單一光導管中。在這個布置中，操作快門以使來自各單一微流體通道的光連續(xù)穿過光檢測 器。轉換系統(tǒng)的潛在優(yōu)勢是它允許較小數(shù)目的光檢測器對較大數(shù)目的微流體通道的光學輸 出取樣，從而節(jié)約成本、重量和功率。
[0377] 在另一實施方案中，可選擇成對固態(tài)光檢測器的操作特征以使它們的峰值光子檢 測效率（PDE)對于BRET供體和接受體的峰值發(fā)射具有選擇性或半選擇性。在這個情況下， 有可能免除光譜濾光器和分色鏡且依賴不同類型的固態(tài)光檢測器的固有差異性光譜靈敏 度來產(chǎn)生BRET比率。
[0378] 數(shù)據(jù)擷取和處理
[0379] 就計數(shù)/門相對于時間而言的供體和接受體的BRET信號將由適合軟件收集。BRET 比率是基于從接受體通道收集的光與從供體通道收集的光的比率加以計算的。如果傳感器 分子和底物的流量比率保持恒定且在BRET腔室中無分析物被檢測到，那么這個BRET比率 應為恒定的。然而，在分析物存在下，BRET比率將對應于反應室中的試劑的量而變化。
[0380] 軟件和嵌入控制系統(tǒng)
[0381] 優(yōu)選地，系統(tǒng)包括可學習且判別不同化學樣本所特有的反應樣式的可訓練數(shù)據(jù)處 理和輸出軟件算法。軟件將捕捉來自各微流體通道的信號的突出特征，如基線BRET比率、 當暴露于樣本時的穩(wěn)態(tài)BRET比率以及BRET比率變化的時間過程的各種特征。來自各通道 的這些特征將被輸入多種判別算法，如主成分分析、線性判別分析、逐步判別分析、機器學 習算法（如支持向量機）、貝葉斯網(wǎng)絡分析或神經(jīng)網(wǎng)絡算法中，且與先前學習的樣本分類的 結果進行比較。優(yōu)選通過和/或聲學輸出端向控制器提供假定樣本分析或分類?；?者，各通道中的信號強度可以視覺和/或聽覺方式輸出以使控制器可使反應樣式與先前已 被訓練來認定的反應樣式匹配。
[0382] 在一個實施方案中，GW軟件用于控制所有裝置中組成部分，如取樣子系統(tǒng)的速度 和濃度比率、微流體通道的流動速率、沖洗和凈化循環(huán)的定時、泵、任何主動混合的速率和 強度、光檢測器系統(tǒng)的靈敏度和積分時間、試劑儲集器和反應室的溫度、以及數(shù)據(jù)擷取和處 理的所有方面。任選地，這些功能中的許多可通過嵌入微控制器來執(zhí)行。一些或所有功能 可在膝上計算機或平板計算機或等效裝置上執(zhí)行。
[0383] 化學發(fā)光共振能量轉移
[0384] 化學發(fā)光是由于化學反應導致的伴有有限熱發(fā)射的能量發(fā)射（發(fā)光）。術語"化 學發(fā)光"在本文中用于涵蓋依賴于酶的活性的生物發(fā)光。
[0385] 如本文所用，生物發(fā)光共振能量轉移（BRET)是一種基于生物發(fā)光蛋白質(zhì)供體與 接受體分子之間的非放射性能量轉移的鄰近測定。
[0386] 如本文所用，術語"空間位置"是指供體相對于接受體分子的三維定位，其由于分 析物結合傳感器分子或從傳感器分子釋放而變化。
[0387] 如本文所用，術語"偶極定向"是指與供體和/或接受體分子關于它們在三維空間 中的定向相關的偶極矩在三維空間中的方向。偶極矩是在分子上的電荷變化的結果。
[0388] 使用BRET作為一實例，在實施方案中，在生物發(fā)光蛋白質(zhì)與接受體分子之間發(fā)生 的能量轉移呈現(xiàn)為由使用選擇特定波長的光學濾光器（一個用于接受體分子發(fā)射且另一 個用于生物發(fā)光蛋白質(zhì)發(fā)射）測量的發(fā)射計算的比率（參見等式1)。
[0389]Ea/Ed=BRET比率 （1)
[0390] 其中Ea定義為接受體分子發(fā)射強度（發(fā)射光是使用適合于接受體的發(fā)射的特定 濾光器選擇）且Ed定義為生物發(fā)光蛋白質(zhì)發(fā)射強度（發(fā)射光是使用適合于生物發(fā)光蛋白 質(zhì)的發(fā)射的特定濾光器選擇）。
[0391] 本領域技術人員應易于了解的是光學濾光器可為允許適于BRET的波長判別的任 何類型的濾光器。舉例來說，根據(jù)本發(fā)明使用的光學濾光器可為干涉濾光器、長通濾光器、 短通濾光器等。穿過濾光器的波長的強度（通常以每秒計數(shù)（CPS)或相對發(fā)光單位（RLU) 計）可使用光電倍增管（PMT)、光電二極管（包括級聯(lián)光電二極管）、光電二極管陣列或靈 敏性照相機（如電荷耦合裝置（CCD)照相機）定量。定量的信號隨后用于計算BRET比率 且表示能量轉移效率。BRET比率隨接受體發(fā)射的強度增加而增加。
[0392] 通常，測定接受體發(fā)射強度與供體發(fā)射強度的比率（參見等式1)，其是用任意單 位表示的反映能量轉移效率的數(shù)值。比率隨能量轉移效率增加而增加（參見Xu等，1999)。
[0393] 能量轉移效率也可使用供體發(fā)射強度與接受體發(fā)射強度的反比來表示（參見等 式2)。在這個情況下，比率隨能量轉移效率增加而降低。在進行這個計算之前，相對于背景 光的存在和底物的自身發(fā)光來校正發(fā)射強度。這個校正通常是通過從含有底物，但無本發(fā) 明的生物發(fā)光蛋白質(zhì)、接受體分子或多肽的對照樣本減去在適當波長下測量的發(fā)射強度來 進行。
[0394]Ed/Ea=BRET比率 （2)
[0395] 其中Ea和Ed是如上所定義。
[0396] 生物發(fā)光蛋白質(zhì)和接受體分子發(fā)射的光強度也可使用基于單色器的儀器，如分光 熒光計、電荷耦合裝置（CCD)照相機或二極管陣列檢測器定量。使用分光熒光計，進行發(fā)射 掃描以使在添加底物后，生物發(fā)光蛋白質(zhì)發(fā)射峰與接受體分子發(fā)射峰兩者均被檢測。峰下 面積表示相對光強度且用于計算如上所概述的比率。能夠測量來自相同樣本的生物發(fā)光蛋 白質(zhì)和接受體分子的光的任何儀器都可用于監(jiān)測本發(fā)明的BRET系統(tǒng)。
[0397] 在替代性實施方案中，單獨接受體分子發(fā)射適于有效檢測和/或定量BRET。在這 個情況下，僅使用接受體發(fā)射強度表示能量轉移效率。將易于為本領域技術人員顯而易知 的是為測量能量轉移，可使用接受體發(fā)射強度而不進行任何比率計算。這是由于以下事實： 在理想情況下，只有當接受體分子吸收從生物發(fā)光蛋白質(zhì)傳遞的光，它才將發(fā)射光。在這個 情況下，僅一個濾光器是必需的。
[0398] 在相關實施方案中，單獨生物發(fā)光蛋白質(zhì)發(fā)射適于有效檢測和/或定量BRET。在 這個情況下，能量轉移效率是僅使用生物發(fā)光蛋白質(zhì)發(fā)射強度加以計算。將易于為本領域 技術人員顯而易知的是為測量能量轉移，可使用供體發(fā)射強度而不進行任何比率計算。這 是由于以下事實：當接受體分子吸收從生物發(fā)光蛋白質(zhì)轉移的光時，來自生物發(fā)光蛋白質(zhì) 的可檢測發(fā)射存在相應降低。在這個情況下，僅一個濾光器是必需的。
[0399] 在替代性實施方案中，使用僅需要一個光學濾光器來進行測量的比率測量結果表 示能量轉移效率。在這個情況下，供體或接受體的光強度是使用適當光學濾光器測定且對 樣本的另一測量是在不使用任何濾光器下進行（開放光譜的強度）。在這個后述測量中，定 量總光輸出（對于所有波長）。接著使用等式3或4進行比率計算。對于等式3,僅需要用 于接受體的光學濾光器。對于等式4,僅需要用于供體的光學濾光器。
[0400]Ea/Eo-Ea=BRET比率或=Eo-Ea/Ea (3)
[0401]Eo-Ed/Ed=BRET比率或=Ed/Eo-Ed (4)
[0402] 其中Ea和Ed是如上所定義且Eo定義為組合的所有波長的發(fā)射強度（開放光譜）。
[0403] 應易于為本領域技術人員顯而易知的是其它等式可從等式1至4導出。舉例來 說，一個所述導出式涉及相對于在生物發(fā)光蛋白質(zhì)和/或接受體分子的發(fā)射波長下存在的 背景光進行校正。
[0404] 在進行BRET測定時，可使用BRETCount測定來自各孔的光發(fā)射。BRETCount儀 器是一種改進的TopCount，其中TopCount是由PackardInstrument(Meriden,CT)銷 售的微量滴定板閃爍和發(fā)光計數(shù)器。不同于利用兩個重合光電倍增管（PMT)來消除 背景噪聲的經(jīng)典計數(shù)器，TopCount采用單一PMT技術和時間分辨的脈沖計數(shù)來降低噪 聲以允許在標準不透明微量滴定板中計數(shù)。使用不透明微量滴定板可使光學串擾降 低至可忽略水平。TopCount呈各種形式，包括分別允許同時讀取1、2、6或12個樣本 的1、2、6和12個檢測器（PMT)。除BRETCount之外，其它可商購獲得的儀器也能夠進 行BRET:Victor2(Wallac,Finland(PerkinElmerLifeSciences))和Fusion(Packard Instrument,Meriden)。BRET可使用可檢測至少接受體分子發(fā)射和優(yōu)選兩個波長（針對接 受體分子和生物發(fā)光蛋白質(zhì)）或大于兩個波長的讀取器來進行。
[0405] 化學發(fā)光
[0406] 非酶促化學發(fā)光是在催化劑存在下，有機染料與氧化劑之間的化學反應的結果。 當來自被化學誘導的有機染料的激發(fā)態(tài)的能量衰減至基態(tài)時，發(fā)生化學發(fā)光發(fā)射?；瘜W發(fā) 光發(fā)射的持續(xù)時間和強度主要取決于反應溶液中存在的化學試劑的程度。
[0407] 如本文所用，術語"生物發(fā)光蛋白質(zhì)"是指能夠作用于適合底物以產(chǎn)生發(fā)光的任何 蛋白質(zhì)。
[0408] 本領域中應了解的是生物發(fā)光蛋白質(zhì)是一種使底物轉化成活性產(chǎn)物的酶，所述活 性產(chǎn)物接著當它弛豫時釋放能量?；钚援a(chǎn)物（由生物發(fā)光蛋白質(zhì)對底物的活性產(chǎn)生）是生 物發(fā)光蛋白質(zhì)產(chǎn)生的轉移至接受體分子的發(fā)光的來源。
[0409] 存在可用于本發(fā)明中的許多不同生物發(fā)光蛋白質(zhì)（參見例如表1)。已知且從許 多發(fā)光生物體分離發(fā)光系統(tǒng)，所述生物體包括細菌、原蟲、腔腸動物、軟體動物、魚、千足蟲、 蠅、真菌、懦蟲、甲殼動物和甲殼蟲，特別是光叩甲屬（Pyrophorus)的叩頭蟲和Photinus、 Photuris和Luciola屬的螢火蟲。顯示生物發(fā)光的其它生物體列于W000/024878、WO 99/049019 和Viviani(2002)中。
[0410] 一個極其熟知的實例是一類被稱為熒光素酶的催化產(chǎn)生能量的化學反應的蛋白 質(zhì)，其中特定生物化學物質(zhì)、熒光素（天然存在的熒光團）是由具有熒光素酶活性的酶氧 化（Hastings, 1996)。多種多樣原核生物體和真核生物體（包括細菌、藻類、真菌、昆蟲、魚 和其它海洋形式的物種）可以這個方式發(fā)射光能量且各自具有在化學方面不同于其它生 物體的熒光素酶活性和熒光素的特定熒光素酶活性和熒光素。熒光素/熒光素酶系統(tǒng)在形 式、化學和功能方面極其不同。因此，具有熒光素酶活性的生物發(fā)光蛋白質(zhì)可從多種來源 或通過多種手段獲得。具有熒光素酶活性的生物發(fā)光蛋白質(zhì)的實例可見于US5, 229, 285、 5, 219, 737、5, 843, 746、5, 196, 524和5, 670, 356中。兩種最廣泛使用的熒光素酶是：（i) 海腎熒光素酶（來自海洋海腎（R.renif〇rmis))，其是一種35kDa蛋白質(zhì)，使用腔腸素作為 底物且在480nm下發(fā)射光（Lorenz等，1991);和（ii)螢火蟲熒光素酶（來自北美螢火蟲 (Photinuspyralis))，其是一種61kDa蛋白質(zhì)，使用突光素作為底物且在560nm下發(fā)射光 (deWet等，I987)。
[0411] 長腹水蚤突光素酶（來自撓足蟲（Gaussiaprinceps))已用于生物化學測定中 (Verhaegen等，2002)。長腹水蚤熒光素酶是一種在快速反應中氧化腔腸素，從而導致在 470nm下發(fā)射強光的20kDa蛋白質(zhì)。
[0412] 也已表征來自蕈蚊屬的適用于本發(fā)明的突光素酶（W02007/019634)。這些酶的大 小為約59kDa且是催化發(fā)射光譜在光譜的藍色部分內(nèi)的發(fā)光反應的ATP依賴性熒光素酶。
[0413] 天然存在的生物發(fā)光蛋白質(zhì)的生物活性變體或片段可易于由本領域技術人員產(chǎn) 生。適用于本發(fā)明的所述變體的三個實例是各自是海腎熒光素酶的變體的Rluc2(Loening 等，2006)、Rluc8(Loening等，2006)和Rluc8. 6-535(Loening等，2007)。在另一優(yōu)選實 施方案中，選擇BRET化學發(fā)光供體的序列以獲得比并有天然海腎熒光素酶傳感器的傳感 器分子更大的熱穩(wěn)定性。RLuc2或RLucS是適合選擇的適宜實例，其因此展現(xiàn)發(fā)光度高于并 有天然海腎熒光素酶序列的傳感器>5倍或> 10倍。所述增強的發(fā)光度具有顯著益處，因 為它允許使用較低檢測室體積和/或較快芯片上流動速率，同時伴有在檢測室體積和流動 速率的任何給定組合下的時間分辨率改進?；蛘撸瑢τ谌魏谓o定時間分辨率，它允許更經(jīng)濟 地使用試劑。
[0414] 表1.示例性生物發(fā)光蛋白質(zhì)。
[0415]
【權利要求】
1. 一種檢測樣本中的分析物的方法，所述方法包括 i) 使以下各物流過包括一個或多個微通道的微流體裝置， a) 所述樣本， b) 包含結合所述分析物的結構域、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的傳感器分 子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域的 間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)， c) 所述化學發(fā)光供體的底物， ii) 在所述裝置中混合所述傳感器分子、樣本和底物，以及 iii) 使用電光學感測裝置檢測所述化學發(fā)光供體對所述底物的修飾， 其中當所述分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于所述接受 體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述傳感器分子未固定于所述裝置。
3. 如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述方法可用于實時檢測所述分析物。
4. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述傳感器分子和所述底物通過不同 微通道進入所述裝置。
5. 如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受 體結構域的所述福斯特距離是至少5. 6nm。
6. 如權利要求5所述的方法，其中所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域的所 述福斯特距離在約5. 6nm與約10nm之間。
7. 如權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述分析物結合所述傳感器分子或從 所述傳感器分子釋放導致BRET比率變化> 15%的最大觀察BRET比率。
8. 如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中由所述電光學感測裝置檢測到的量子 產(chǎn)率小于約8%、或小于約5%、或小于約2%。
9. 如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述接受體結構域具有的斯托克斯位 移在約50nm與約150nm之間。
10. 如權利要求9所述的方法，其中所述接受體結構域具有約lOOnm的斯托克斯位移。
11. 如權利要求1至10中任一項所述的方法，其是在約Is至約100s內(nèi)執(zhí)行的。
12. 如權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述樣本是液體、氣體、乳液或混懸 液。
13. 如權利要求12所述的方法，其中所述樣本是已用氣體預平衡的液體。
14. 如權利要求12所述的方法，其中所述混懸液是或包含無細胞提取物。
15. 如權利要求12所述的方法，其中所述混懸液包含細胞。
16. 如權利要求1至15中任一項所述的方法，其中穿過所述微流體裝置的流動速率在 約1U1/小時至約1. 5ml/小時之間。
17. 如權利要求16所述的方法，其中穿過所述微流體裝置的所述流動速率在約 200ill/小時至約lml/小時之間。
18. 如權利要求1至17中任一項所述的方法，其中所述傳感器分子包含如G偶聯(lián)蛋白 質(zhì)受體的蛋白質(zhì)受體，且在步驟ii)之后，所述傳感器分子的濃度在約InM至約10yM之 間。
19. 如權利要求1至18中任一項所述的方法，其中穿過所述微流體裝置的流動是連續(xù) 流動、批式流動或停止流動。
20. 如權利要求1至19中任一項所述的方法，其中所述流動是通過以下一項或多項來 進行：泵送、真空、水力、抽吸、電動、化學滲透、毛細管力、聲學、電磁、壓電學。
21. 如權利要求1至20中任一項所述的方法，其中所述混合是通過在垂直于穿過包含 所述樣本、傳感器分子和底物的微通道的流動方向的維度上進行擴散來達成。
22. 如權利要求21所述的方法，其中包含所述樣本、傳感器分子和底物的所述微通道 的區(qū)段在5mm與100mm之間。
23. 如權利要求1至22中任一項所述的方法，其中各微通道具有約1iim2至約1mm2的 橫截面積。
24. 如權利要求1至23中任一項所述的方法，其中步驟iii)是在體積為約lpl至約 200yl的反應室中進行。
25. 如權利要求1至24中任一項所述的方法，其中步驟iii)包括處理至少一個來自所 述電光學感測裝置的信號以確定所述分析物在所述樣本中是不存在抑或是存在，并且如果 存在，那么任選測定所述樣本中的所述分析物的濃度。
26. 如權利要求1至25中任一項所述的方法，其中結合所述分析物的所述結構域是蛋 白質(zhì)或核酸。
27. 如權利要求26所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)是受體、氣味結合蛋白、信息素結合蛋 白、酶、配體載體或細菌周質(zhì)結合蛋白。
28. 如權利要求27所述的方法，其中所述受體是G蛋白偶聯(lián)受體。
29. 如權利要求1至28中任一項所述的方法，其中所述化學發(fā)光供體結構域是生物發(fā) 光蛋白質(zhì)。
30. 如權利要求29所述的方法，其中所述生物發(fā)光蛋白質(zhì)是熒光素酶、半乳糖苷 酶、內(nèi)酰胺酶、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、葡萄糖醛酸酶或葡萄糖苷酶。
31. 如權利要求30所述的方法，其中所述熒光素酶是海腎熒光素酶、螢火蟲熒光素酶、 腔腸動物突光素酶、北美螢火蟲突光素酶、叩頭蟲突光素酶、蘋繞實蠅（railroadworm)突 光素酶、細菌突光素酶、長腹水蚤（Gaussia)突光素酶、水母發(fā)光蛋白（Aequorin)、蕈蚊 (Arachnocampa)熒光素酶或其任一個的生物活性變體或片段、或其兩個或更多個的嵌合 體。
32. 如權利要求1至31中任一項所述的方法，其中所述底物是熒光素、鈣、腔腸素或腔 腸素的衍生物或類似物。
33. 如權利要求1至32中任一項所述的方法，其中所述接受體結構域是熒光接受體結 構域。
34. 如權利要求33所述的方法，其中所述熒光接受體結構域是蛋白質(zhì)。
35. 如權利要求34所述的方法，其中所述熒光接受體結構域是綠色熒光蛋白（GFP)、 GFP的藍色熒光變體（BFP)、GFP的青色熒光變體（CFP)、GFP的黃色熒光變體（YFP)、增強 型GFP(EGFP)、增強型CFP(ECFP)、增強型YFP(EYFP)、GFPS65T、Emerald、Venus、mOrange、 Topaz、GFPuv、去穩(wěn)定化EGFP(dEGFP)、去穩(wěn)定化ECFP(dECFP)、去穩(wěn)定化EYFP(dEYFP)、 11。1^(1、1：-11。1^(1、〇81^(1、〇81^(12、1：-(1;[1116『2、1：-(1;[1116『2(12)、1111^ 31、卩〇。;[11〇卩〇1'；[11、海腎6卩？、 MonsterGFP、paGFP、Kaede蛋白或藻膽蛋白或其任一個的生物活性變體或片段。
36. 如權利要求33所述的方法，其中所述熒光接受體結構域是非蛋白質(zhì)。
37. 如權利要求36所述的方法，其中所述熒光接受體結構域是AlexaFluor染料、 Bodipy染料、Cy染料、熒光素、丹磺酰、傘形酮、熒光微球體、發(fā)光微球體、熒光納米晶體、海 藍（MarinaBlue)、級聯(lián)藍（CascadeBlue)、級聯(lián)黃（CascadeYellow)、太平洋藍（Pacific Blue)、俄勒網(wǎng)綠（OregonGreen)、四甲基若丹明（Tetramethylrhodamine)、若丹明、得克薩 斯紅（TexasRed)、稀土元素螯合物或其任何組合或衍生物。
38. 如權利要求29至37中任一項所述的方法，其進一步包括提供所述生物發(fā)光蛋白質(zhì) 的輔因子。
39. 如權利要求38所述的方法，其中所述輔因子是ATP、鎂、氧、FMNH2、鈣或其任何兩個 或更多個的組合。
40. 如權利要求29至39中任一項所述的方法，其中 i) 所述生物發(fā)光蛋白質(zhì)是熒光素酶或生物活性變體或片段，和/或 ii) 所述底物是熒光素、腔腸素或腔腸素的衍生物或類似物，和/或 iii) 所述接受體結構域是綠色突光蛋白（GFP)、Venus、mOrange或其任一個的生物活 性變體或片段。
41. 如權利要求40所述的方法，其中 i) 所述熒光素酶是海腎熒光素酶，所述接受體結構域是GFP2,且所述底物是腔腸素 400a， ii) 所述熒光素酶是海腎熒光素酶2,所述接受體結構域是GFP2,且所述底物是腔腸素 400a， iii) 所述熒光素酶是海腎熒光素酶8,所述接受體結構域是GFP2,且所述底物是腔腸素 400a， iv) 所述熒光素酶是海腎熒光素酶2,所述接受體結構域是Venus，且所述底物是腔腸 素， v) 所述熒光素酶是海腎熒光素酶8,所述接受體結構域是Venus，且所述底物是腔腸 素， vi) 所述熒光素酶是海腎熒光素酶8. 6-535,所述接受體結構域是mOrange，且所述底 物是腔腸素，或 vii) 所述熒光素酶是海腎熒光素酶8,所述接受體結構域是mOrange，且所述底物是腔 腸素。
42. 如權利要求1至41中任一項所述的方法，其包括使用相同微流體裝置同時或依序 檢測兩種或更多種不同分析物。
43. 如權利要求1至42中任一項所述的方法，其中所述微流體裝置包括以下一個或多 個集合： a) 三個輸入微通道，每一個各自用于所述傳感器分子、底物和樣本，或 b) 兩個輸入微通道，一個用于所述底物且另一個用于所述傳感器分子和樣本的預混合 物，或 c) 兩個輸入微通道，一個用于所述傳感器分子且另一個用于所述底物和樣本的預混合 物。
44. 如權利要求1至43中任一項所述的方法，其中至少一個微通道包括體積與至少一 個其它微通道不同的反應室。
45. 如權利要求1至44中任一項所述的方法，其中至少一個微通道包括兩個或更多個 具有相同或不同體積的反應室。
46. 如權利要求1至45中任一項所述的方法，其中所述電光學感測裝置具有至少兩個 不同波長通道。
47. 如權利要求1至46中任一項所述的方法，其中所述傳感器分子存在于無細胞提取 物中。
48. 如權利要求1至47中任一項所述的方法，其中使所述分析物暴露在細胞的表面上 且所述方法進一步包括使包含所述分析物的細胞轉向穿過不同于所述樣本中缺乏所述分 析物的細胞的微通道。
49. 一種用于檢測樣本中的分析物的微流體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 i) 至少一個適于容納包含結合所述分析物的結構域、化學發(fā)光供體結構域和接受體結 構域的傳感器分子的儲集器，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化學發(fā)光供體結構 域和所述接受體結構域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)， ii) 包括一個或多個微通道的微流體裝置， iii) 用于在所述裝置中混合所述傳感器分子、所述樣本和所述化學發(fā)光供體結構域的 底物的部件， iv) 用于檢測所述分析物與所述傳感器分子的結合的反應室，和 v) 電光學感測裝置， 其中當所述分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于所述接受 體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
50. 如權利要求49所述的系統(tǒng)，其中所述傳感器分子未固定于所述裝置。
51. 如權利要求49或權利要求50所述的系統(tǒng)，其可用于實時檢測所述分析物。
52. 如權利要求49至51中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述傳感器分子和底物通過不同微 通道進入所述裝置。
53. 如權利要求49至52中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述微流體裝置包括至少兩個輸入 微通道，其中一個所述輸入微通道用于使所述傳感器分子流入所述裝置中。
54. 如權利要求49至53中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述電光學感測裝置包括至少兩個 不同波長通道。
55. 如權利要求54所述的系統(tǒng)，其中所述電光學感測裝置能夠同時或快速連續(xù)地檢測 兩個不同波長通道。
56. 如權利要求55所述的系統(tǒng)，其中所述電光學感測裝置能夠在小于1秒內(nèi)檢測兩個 不同波長通道。
57. 如權利要求49至56中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述微流體裝置被設計成使得能夠 檢測兩種或更多種分析物。
58. -種分類樣本的方法，所述方法包括 i)使以下各物流過包括一個或多個微通道的微流體裝置， a) 所述樣本， b) 包含結合一種或多種分析物的結構域、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的傳感 器分子，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構 域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)， c) 所述化學發(fā)光供體的底物， ii) 在所述裝置中混合所述傳感器分子、樣本和底物， iii) 使用電光學感測裝置檢測所述化學發(fā)光供體對所述底物的修飾， iv) 處理至少一個來自所述電光學感測裝置的信號并使電光學反應的樣式與一種或多 種目標樣本的一種或多種預定特征相關聯(lián)，以及 v) 基于所述反應樣式的相關性分類所述樣本， 其中當所述一種或多種分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對 于所述接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
59. 如權利要求58所述的方法，其包括兩種或更多種不同傳感器分子，所述傳感器分 子各自結合不同分析物或分析物范圍，且步驟v)包括基于各所述分析物或分析物范圍的 存在、不存在或濃度來分類所述樣本。
60. 如權利要求58或權利要求59所述的方法，其中一種或多種所述分析物是未知的。
61. 如權利要求58至60中任一項所述的方法，其可用于實時分類所述樣本。
62. 如權利要求58至61中任一項所述的方法，其中所述傳感器分子未固定于所述裝 置。
63. 如權利要求58至62中任一項所述的方法，其中所述傳感器分子和底物通過不同微 通道進入所述裝置。
64. -種用于分類樣本的微流體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 i) 至少一個適于容納包含結合一種或多種分析物的結構域、化學發(fā)光供體結構域和接 受體結構域的傳感器分子的儲集器，其中在存在和/或不存在分析物下，所述化學發(fā)光供 體結構域和所述接受體結構域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)， ii) 包括一個或多個微通道的微流體裝置， iii) 用于在所述裝置中混合所述傳感器分子、所述樣本和所述化學發(fā)光供體結構域的 底物的部件， iv) 用于檢測所述分析物與所述傳感器分子的結合的反應室，和 v) 電光學感測裝置， 其中當所述一種或多種分析物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對 于所述接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
65. 如權利要求64所述的系統(tǒng)，其包括兩種或更多種不同傳感器分子，所述傳感器分 子各自結合不同分析物或分析物范圍。
66. 如權利要求64或權利要求65所述的系統(tǒng)，其中一種或多種所述分析物或分析物范 圍是未知的。
67. 如權利要求64至66中任一項所述的系統(tǒng)，其可用于實時分類樣本。
68. 如權利要求64至67中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述傳感器分子未固定于所述裝 置。
69. 如權利要求64至68中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述傳感器分子和底物通過不同微 通道進入所述裝置。
70. 如權利要求64至69中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述微流體裝置包括至少兩個輸入 微通道，其中一個所述輸入微通道用于使所述傳感器分子流入所述裝置中。
71. -種篩選結合目標分子的化合物的方法，所述方法包括 i)使以下各物流過包括一個或多個微通道的微流體裝置， a) 候選化合物， b) 包含所述目標分子、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的傳感器分子，其中在存 在和/或不存在所述候選化合物下，所述化學發(fā)光供體結構域和所述接受體結構域的間隔 和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)， c) 所述化學發(fā)光供體的底物， ii)在所述裝置中混合所述傳感器分子、所述候選化合物和底物，iii)使用電光學感測裝置檢測所述化學發(fā)光供體對所述底物的修飾， v) 處理至少一個來自所述電光學感測裝置的信號以確定所述候選化合物是否結合所 述傳感器分子，以及 vi) 如果化合物結合所述傳感器分子，那么選擇所述化合物， 其中當所述候選化合物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于所述 接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
72. 如權利要求71所述的方法，其可用于實時檢測所述候選化合物與所述傳感器分子 的結合。
73. 如權利要求71或權利要求72所述的方法，其中所述傳感器分子未固定于所述裝 置。
74. 如權利要求71至73中任一項所述的方法，其中所述傳感器分子和底物通過不同微 通道進入所述裝置。
75. -種用于篩選結合目標分子的化合物的微流體系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括 i) 至少一個適于容納所述目標分子、化學發(fā)光供體結構域和接受體結構域的傳感器分 子的儲集器，其中在存在和/或不存在候選化合物下，所述化學發(fā)光供體結構域和所述接 受體結構域的間隔和相對定向在±50%福斯特距離內(nèi)， ii) 包括一個或多個微通道的微流體裝置， iii) 用于在所述裝置中混合所述傳感器分子、所述候選化合物和所述化學發(fā)光供體結 構域的底物的部件， iv) 用于檢測所述候選化合物與所述傳感器分子的結合的反應室， v) 電光學感測裝置， 其中當所述候選化合物結合所述傳感器分子時，所述化學發(fā)光供體結構域相對于所述 接受體結構域的空間位置和/或偶極定向被改變。
76. 如權利要求75所述的系統(tǒng)，其可用于實時檢測所述候選化合物與所述傳感器分子 的結合。
77. 如權利要求75或權利要求76所述的系統(tǒng)，其中所述傳感器分子未固定于所述裝 置。
78. 如權利要求75至77中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述傳感器分子和底物通過不同微 通道進入所述裝置。
79. 如權利要求75至78中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述微流體裝置包括至少兩個輸入 微通道，其中一個所述輸入微通道用于使所述傳感器分子流入所述裝置中。
80. -種檢測樣本中的分析物的方法，所述方法包括 i) 在腔腸素存在下使所述樣本與傳感器分子接觸，所述傳感器分子包含 a) 結合所述分析物的結構域， b) 海腎熒光素酶，和 c) 綠色熒光蛋白2,以及 ii) 確定所述生物發(fā)光蛋白質(zhì)與所述接受體分子之間的生物發(fā)光共振能量轉移 (BRET)是否改變， 其中當所述分析物結合所述結構域時，所述生物發(fā)光蛋白質(zhì)相對于所述接受體分子的 空間位置和/或偶極定向被改變。
81. -種分離的傳感器分子，其包含結合一種或多種分析物的結構域、海腎熒光素酶和 綠色熒光蛋白2。
82. -種檢測樣本中的2-戊酮的方法，所述方法包括 i) 使所述樣本與作為秀麗隱桿線蟲str-112(SEQIDN0:41)或str-113(SEQID NO:42)的多肽或其結合2-戊酮的變體接觸，以及 ii) 檢測任何所述多肽是否結合于2-戊酮。 83?如權利要求82所述的方法，其中str-113的所述變體是str-114/str-113融合物(SEQIDN0:43)。
84. 如權利要求83所述的方法，其中所述多肽經(jīng)過可檢測標記。
85. -種檢測樣本中的細菌的方法，其包括使用如權利要求82至84中任一項所述的方 法檢測2-戊酮。
【文檔編號】C12Q1/66GK104380085SQ201380031792
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年4月15日 優(yōu)先權日:2012年4月16日
【發(fā)明者】S·C·特羅威爾, H·戴克斯, N·C·H·黎, M·格爾, Y·朱, N·吳 申請人:聯(lián)邦科學技術研究組織