植物調(diào)控元件及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供可用于調(diào)節(jié)植物中的基因表達的DNA分子和構(gòu)建體及其核苷酸序列。還提供包含與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸可操作地連接的DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物、植物細胞、植物部分和種子以及它們的使用方法。
【專利說明】植物調(diào)控元件及其用途
[0001] 相關(guān)申請的引用
[0002] 本申請要求2012年4月20日提交的美國臨時申請No. 61/635, 945和2013年3 月14日提交的美國非臨時申請No. 13/830,403的權(quán)益，其通過引用全文合并到本文中。
[0003] 序列表的并入
[0004] 包含在2013年4月10日建立的22千字節(jié)（如在Microsoft Windows?中測 量的）的名稱為"M0NS326W0_ST25. txt"的文件中的序列表通過電子提交與本申請一起提 交并通過引用合并到本文中。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明涉及植物分子生物學和植物遺傳工程領(lǐng)域。更特別地，本發(fā)明涉及可用于 調(diào)節(jié)植物中的基因表達的DNA分子。
[0006] 發(fā)明背景
[0007] 調(diào)控元件是通過調(diào)節(jié)與可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)基因 活性的遺傳元件。這樣的元件包括啟動子、前導序列、內(nèi)含子和3'非翻譯區(qū)且可用于植物 分子生物學和植物遺傳工程領(lǐng)域中。
[0008] 表達賦予植物在冷和濕應激條件下萌發(fā)過程中的優(yōu)勢的轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因作物需 要具有在最有利于表達這樣的轉(zhuǎn)基因的組織中的表達模式的調(diào)控元件。這樣的調(diào)控元件應 當在發(fā)育的種子中充分地表達以使得能夠儲存可以在種子于冷和/或濕條件下萌發(fā)時快 速發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物以及提供在萌發(fā)和出苗的早期階段中的表達。因此，本發(fā)明提供 在發(fā)育和萌發(fā)的種子中表現(xiàn)出較高表達水平且可用于驅(qū)動在冷和/或濕萌發(fā)條件下提供 益處的轉(zhuǎn)基因表達的新型調(diào)控元件。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供用于植物中的新型基因調(diào)控元件。本發(fā)明還提供包含該調(diào)控元件的 DNA構(gòu)建體。本發(fā)明還提供包含該調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因植物細胞、植物和種子。可以提供與可 轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接的序列。在一個實施方案中，可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子相對于 本文中提供的調(diào)控序列可以是異源的。在特定的實施方案中，本發(fā)明提供的調(diào)控元件序列 因此可以定義為與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接。本發(fā)明還提供制備和使用該調(diào) 控元件、包含該調(diào)控元件的DNA構(gòu)建體及包含與可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接的該調(diào) 控元件的轉(zhuǎn)基因植物細胞、植物和種子的方法。
[0010] 在一個方面中，本發(fā)明提供包含選自下組的DNA序列的DNA分子：(a)與SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一具有至少85%序列同一性的序列；(b)包含SEQIDN0 :l、2、3、4、 6或8中任一的序列；和（C)SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有 基因調(diào)控活性，其中所述序列與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接。在一個實施方案 中，DNA分子與SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一的DNA序列具有至少約90%序列同一性。 在另一個實施方案中，DNA分子與SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的DNA序列具有至少 95%序列同一性。在另一個實施方案中，DNA序列包含基因調(diào)控活性。在又另一個實施方 案中，異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子包含具有農(nóng)學意義的基因。在其它實施方案中，具有農(nóng)學意 義的基因賦予植物的除草劑耐受性或害蟲抗性。
[0011] 在另一個方面中，本發(fā)明提供包含異源DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞，該異源DNA分 子包含選自下組的序列：（a)與SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一具有至少約85%序列同 一性的序列；(b)包含 SEQ ID N0:l、2、3、4、6 或 8 中任一的序列；和（c)SEQ ID N0:l、2、3、 4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有基因調(diào)控活性，其中所述序列與異源可轉(zhuǎn)錄多核 苷酸分子可操作地連接。在多個實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物細胞可以是單子葉植物細胞或雙 子葉植物細胞。
[0012] 在其它實施方案中，本發(fā)明提供轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其包含選自下組的DNA分 子：（a)與SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一具有至少約85%序列同一性的序列；(b)包 含 SEQ ID N0:l、2、3、4、6 或 8 中任一的序列；和（c)SEQ ID N0:l、2、3、4、6 或 8 中任一的片 段，其中所述片段具有基因調(diào)控活性，其中所述序列與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地 連接。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供這種轉(zhuǎn)基因植物的任何代的后代植物或其部分， 其中所述后代植物或部分包含如上所述的DNA分子。在又另一個實施方案中，本發(fā)明提供 轉(zhuǎn)基因種子，其中所述種子包含如上所述的DNA分子。
[0013] 在另一個方面中，本發(fā)明提供包含選自SEQ ID NO: 1、6和8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件 組的轉(zhuǎn)基因盒，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組與異源編碼序列可操作地連接，該異源編碼 序列與選自SEQ ID N0:10、ll、12和13的3'UTR可操作地連接。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因 盒包含如SEQ ID NO: 1所示的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組,其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組與異源 編碼序列可操作地連接，該異源編碼序列與如SEQ ID NO: 10所示的3' UTR可操作地連接。 在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因盒包含如SEQ ID N0:6所示的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組，其中所述 轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組與異源編碼序列可操作地連接，該異源編碼序列與選自SEQ ID NO: 11 和12的3'UTR可操作地連接。在又另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因盒包含如SEQ ID NO: 8所示 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組，其中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組與異源編碼序列可操作地連接，該 異源編碼序列與選自SEQ ID N0:12和13的3'UTR可操作地連接。在另一個實施方案中，本 發(fā)明提供生產(chǎn)商品的方法，包括獲得包含選自下組的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植物或其部分：(a) 與SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一具有至少約85%序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一的序列；和（c)SEQIDN0:l、2、3、4、6或8中任一的片段，其中所 述片段具有基因調(diào)控活性，其中所述序列與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接；和從 該轉(zhuǎn)基因植物或其部分生產(chǎn)商品。在一個實施方案中，所述商品是蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分 離物、籽粒、淀粉、種子、粗粉、面粉、生物質(zhì)或種子油。
[0014] 在另一個方面中，本發(fā)明提供表達可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的方法，包括獲得包含選 自下組的DNA序列的轉(zhuǎn)基因植物：（a)與SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一具有至少約85% 序列同一性的序列；(b)包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的序列；和（c)SEQ ID NO: 1、 2、3、4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有基因調(diào)控活性，其中所述序列與異源可轉(zhuǎn)錄 多核苷酸分子可操作地連接；和栽培植物，其中所述可轉(zhuǎn)錄多核苷酸被表達。
[0015] 附圖簡要說明
[0016] 圖1 -顯示通過不同轉(zhuǎn)基因盒結(jié)構(gòu)賦予的轉(zhuǎn)基因發(fā)育玉米胚和胚乳組織中的 β-葡萄糖醛酸苷酶（⑶s)表達。各轉(zhuǎn)基因盒結(jié)構(gòu)由與轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組EXP-Zm. Nac+Os. FBA:I:I(SEQ ID NO:6)和 EXP-Zm. Nac+Os. Cab-1:1:1(SEQ ID NO:8)及 3' UTR T-〇s.CLUS33428J-l:l:l(SEQ ID N0:ll)、T-0s.Mth-l:l:l(SEQ ID N0:12)和！^^· Ara5-1:1:1 (SEQ ID NO: 13)可操作地連接的⑶S編碼序列組成，如實施例3的表3中所示。
[0017] 圖2-顯示通過不同轉(zhuǎn)基因盒結(jié)構(gòu)賦予的所選擇轉(zhuǎn)基因玉米組織中的β-葡 萄糖醛酸苷酶（⑶S)表達。各轉(zhuǎn)基因盒結(jié)構(gòu)由與轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組EXP-Zm. Nac+Os. FBA:1:1(SEQ ID NO:6)和 EXP-Zm. Nac+Os. Cab-1:1:1(SEQ ID NO:8) &3'UTRT-〇s. CLUS33428j-l:l:l(SEQ ID N0:ll)、T-0s.Mth_l:l:l(SEQ ID N0:12)和1'-〇8· Ara5-1:1:1 (SEQ ID NO: 13)可操作地連接的⑶S編碼序列組成，如實施例3的表3中所示。
[0018] 序列的簡要說明
[0019] SEQ ID NO: 1-轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組或 EXP(EXP-Zm. Nac+Zm. DnaK: 1:1)的序 列，其由與前導序列L-Zm.Nac-l:l:l(SEQ ID N0:4)可操作地5'連接的啟動子P-Zm. Nac-1:1:2(SEQ ID N0:3)組成，該前導序列與內(nèi)含子I-Zm. DnaK-1:1:1 (SEQ ID N0:5)可操 作地連接。
[0020] SEQ ID NO:2-由與前導序列 L-Zm. Nac-1:1:1 (SEQ ID NO:4)可操作地 5' 連接的 啟動子 P-Zm. Nac-1:1:2 (SEQ ID NO:3)組成的序列。
[0021] SEQ ID NO:3-啟動子 P-Zm. Nac-1:1:2 的序列。
[0022] SEQ ID NO:4-前導序列 L-Zm. Nac-1:1:1 的序列。
[0023] SEQ ID NO:5-內(nèi)含子 I-Zm. DnaK-1:1:1 的序列。
[0024] SEQ ID N0:6-轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組或 EXP(EXP-Zm.Nac+0s.FBA:l:l)的序 列，其由與前導序列L-Zm.Nac-l:l:l(SEQ ID N0:4)可操作地5'連接的啟動子P-Zm. Nac-1:1:2(SEQ ID N0:3)組成，該前導序列與內(nèi)含子 Ι-Os. FBA-1-1:1:1(SEQ ID N0:7)可 操作地連接。
[0025] SEQ ID NO:7-內(nèi)含子 Ι-Os. FBA-1-1:1:1 的序列。
[0026] SEQ ID NO:8_ 轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組或 EXP(EXP-Zm. Nac+0s. Cab-1:1:1)的序 列，其由與前導序列L-Zm.Nac-l:l:l(SEQ ID N0:4)可操作地5'連接的啟動子P-Zm. Nac-1:1:2(SEQ ID N0:3)組成，該前導序列與內(nèi)含子 I-〇s.Cab-l-l:l:l(SEQ ID N0:9)可 操作地連接。
[0027] SEQ ID NO:9-內(nèi)含子 Ι-Os. Cab-1-1:1:1 的序列。
[0028] SEQ ID NO: 10-3，UTR T-AGRtu. nos-1:1:13 的序列。
[0029] SEQ ID N0:ll-3，UTR T-Os. CLUS33428_1-1:1:1 的序列。
[0030] SEQ ID NO: 12-3，UTR T-Os. Mth-1:1:1 的序列。
[0031] SEQ ID NO: 13-3, UTR T-Os. Ara5-1:1:1 的序列。
[0032] SEQ ID NO: 14-β-葡萄糖醛酸苷酶標記基因的編碼序列。
[0033] SEQ ID NO: 15-轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組或EXP(EXP-CaMV. 35S: 1:1)的序列，其包含花 椰菜花葉病毒（CaMV) 35S啟動子和前導序列。
[0034] SEQ ID NO: 16-轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組或EXP(EXP-Os. Actl: 1:1)的序列，其包含水 稻肌動蛋白1啟動子、前導序列和內(nèi)含子。
[0035] 本發(fā)明的詳細說明
[0036] 本發(fā)明提供來自植物物種的具有有益的基因調(diào)控活性的新型多核苷酸分子。本發(fā) 明還提供包含調(diào)控元件的DNA構(gòu)建體以及包含調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因植物細胞、植物和種子。 這些多核苷酸分子的核苷酸序列提供為SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8。本發(fā)明提供了這些多 核苷酸分子的設(shè)計、構(gòu)建和用途。這些多核苷酸分子能夠例如影響植物組織中可操作地連 接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達，并因此選擇性地調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因植物中編碼的基因產(chǎn)物的基 因表達或活性。本發(fā)明還提供制備和使用該調(diào)控元件的方法、包含啟動子和/或其它公開 的核苷酸序列的DNA構(gòu)建體及制備和使用該DNA構(gòu)建體的方法。本發(fā)明還提供包含與可轉(zhuǎn) 錄多核苷酸分子可操作地連接的調(diào)控元件的轉(zhuǎn)基因植物細胞、植物和種子以及轉(zhuǎn)化的宿主 細胞。
[0037] 可以提供與可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接的根據(jù)本發(fā)明的DNA序列。在一個 實施方案中，可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子相對于本文中提供的調(diào)控序列可以是異源的。在特定實 施方案中，本發(fā)明提供的調(diào)控元件序列因此可以定義為與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作 地連接。
[0038] 以下定義和方法提供用于更好地限定本發(fā)明和指導本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實施本 發(fā)明。除非另外注明，術(shù)語按照相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的常規(guī)用法來理解。
[0039] DNA 分子
[0040] 如本文中使用的，術(shù)語"DNA"或"DNA分子"是指基因組或合成來源的雙鏈DNA分 子，即脫氧核糖核苷酸堿基的聚合物或多核苷酸分子，其從5'（上游）末端至3'（下游）末 端閱讀。如本文中使用的，術(shù)語"DNA序列"是指DNA分子的核苷酸序列。本文中使用的專門 術(shù)語對應于美國聯(lián)邦管理法規(guī)§ 1. 822的法令37的專門術(shù)語，且在WIPO標準ST. 25 (1998) 附件2,表1和3的表格中給出。
[0041] 如本文中使用的，術(shù)語"分離的DNA分子"是指至少部分地與在其原始或天然狀態(tài) 中正常相關(guān)的其它分子分離的DNA分子。在一個實施方案中，術(shù)語"分離的"是指至少部分 地與在其原始或天然狀態(tài)中正常側(cè)鄰DNA分子的部分核酸分離的DNA分子。因此，與通常 不相關(guān)的調(diào)控或編碼序列融合（例如，作為重組技術(shù)的結(jié)果）的DNA分子在本文中被認為 是分離的。這樣的分子在整合到宿主細胞的染色體中或存在于具有其它DNA分子的核酸溶 液中時被認為是分離的，因為它們不是處于其原始狀態(tài)。
[0042] 本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法可用于分離和操作DNA分子或其片段，如本發(fā)明 中公開的。例如，聚合酶鏈反應（PCR)技術(shù)可用于擴增特定起始DNA分子和/或產(chǎn)生原始 分子的變體。DNA分子或其片段也可以通過其它技術(shù)獲得，如通過化學手段直接合成片段， 如通常通過使用自動寡核苷酸合成儀實施的。
[0043] 如本文中使用的，術(shù)語"序列同一性"是指兩個最佳比對的多核苷酸序列或兩個最 佳比對的多肽序列相同的程度。最佳序列比對通過人工比對兩個序列（例如，參比序列和 另一序列）以最大化具有適宜內(nèi)部核苷酸插入、刪除或空位的序列比對中核苷酸匹配的數(shù) 目而產(chǎn)生。如本文中使用的，術(shù)語"參比序列"是指如SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8的多核苷 酸序列提供的序列。
[0044] 如本文中使用的，術(shù)語"百分序列同一性"或"百分同一性"或" ％同一性"是同一 性分數(shù)乘以1〇〇。與參比序列最佳比對的序列的"同一性分數(shù)"是最佳比對中核苷酸匹配的 數(shù)目除以參比序列中核苷酸的總數(shù)，例如整個參比序列的全長中核苷酸的總數(shù)。因此，在一 個實施方案中，本發(fā)明提供包含與參比序列（本文中提供為SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8)最 佳比對時具有與參比序列的至少約85 %同一性、至少約90 %同一性、至少約95 %同一性、 至少約96%同一性、至少約97%同一性、至少約98%同一性或至少約99%同一性的序列。 在特定實施方案中，這樣的序列可以定義為具有基因調(diào)控活性。
[0045] 調(diào)控元件
[0046] 調(diào)控元件是具有基因調(diào)控活性的DNA分子，即具有影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多 核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能力的DNA分子。術(shù)語"基因調(diào)控活性"因此指的是通過影 響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯來影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄 多核苷酸分子的表達模式的能力。如本文中使用的，轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組（EXP)可以由可 操作地連接的表達元件如增強子、啟動子、前導序列和內(nèi)含子組成。因此，轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元 件組可以由例如與前導序列可操作地5'連接的啟動子連接，而前導序列依次可操作地5' 連接內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列可以由在原始序列的第一內(nèi)含子/外顯子剪接結(jié)合點處開始 的序列組成并可以進一步由包含第二內(nèi)含子/外顯子剪接結(jié)合的小前導序列片段組成，從 而提供正確的內(nèi)含子/外顯子加工以有助于所得轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)錄和正確加工。前導序列和內(nèi) 含子可以正向影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄以及所得的轉(zhuǎn)錄RNA的翻 譯。預加工的RNA分子包含前導序列和內(nèi)含子，其可以影響轉(zhuǎn)錄RNA的轉(zhuǎn)錄后加工和/或 轉(zhuǎn)錄RNA分子從細胞核到細胞質(zhì)的輸出。在轉(zhuǎn)錄RNA分子的轉(zhuǎn)錄后加工后，前導序列可以 保留作為最終信使RNA的部分且可以正向影響信使RNA分子的翻譯。
[0047] 調(diào)控元件如啟動子、前導序列、內(nèi)含子和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)是具有基因調(diào)控活性并在活 細胞中基因的總體表達中發(fā)揮總體部分的DNA分子。術(shù)語"調(diào)控元件"是指具有基因調(diào)控 活性的DNA分子，即具有影響可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的能 力的DNA分子。在植物中具有功能的分離的調(diào)控元件如啟動子和前導序列因此可用于通過 遺傳工程的方法改變植物表型。
[0048] 調(diào)控元件可以特征在于其表達模式效應（定性地和/或定量地），例如，正或負效 應和/或組成型或其它效應，如特征在于其時間、空間、發(fā)育、組織、環(huán)境、生理、病理、細胞 周期和/或化學反應表達模式及其任何組合，以及特征在于定量或定性指示。啟動子可以 用作用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達的調(diào)控元件。
[0049] 如本文中使用的，"基因表達模式"是可操作地連接的DNA分子轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)錄RNA分 子的任何轉(zhuǎn)錄模式。轉(zhuǎn)錄RNA分子可以被翻譯以產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子或可以提供反義或其它調(diào) 控 RNA 分子，如 mRNA、dsRNA、tRNA、rRNA、miRNA 等等。
[0050] 如本文中使用的，術(shù)語"蛋白質(zhì)表達"是轉(zhuǎn)錄RNA分子翻譯成蛋白質(zhì)分子的任何翻 譯模式。蛋白質(zhì)表達可以特征在于其時間、空間、發(fā)育或形態(tài)特性，以及特征在于定量或定 性指示。
[0051] 如本文中使用的，術(shù)語"啟動子" 一般是指參與RNA聚合酶II和其它蛋白質(zhì)（反 式作用轉(zhuǎn)錄因子）的識別和結(jié)合以啟動轉(zhuǎn)錄的DNA分子。啟動子最初可以從基因的基因組 拷貝的5'非翻譯區(qū)（5'UTR)分離?；蛘?，啟動子可以是合成產(chǎn)生或操作的DNA分子。啟動 子也可以是嵌合的，即通過兩個或更多個異源DNA分子的融合產(chǎn)生的啟動子。用于實施本 發(fā)明的啟動子可以包括SEQ ID N0:3或其片段或變體。在本發(fā)明的特定實施方案中，如本 文中描述的這樣的分子及其任何變體或衍生物進一步定義為包含啟動子活性，即能夠在宿 主細胞中（如在轉(zhuǎn)基因植物中）作為啟動子發(fā)揮作用。在再進一步的特定實施方案中，片 段可以定義為表現(xiàn)出其所來源的起始啟動子分子所具有的啟動子活性，或者片段可以包含 提供基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄水平且由TATA盒或用于RNA聚合酶II的識別和結(jié)合以啟動轉(zhuǎn)錄的等同序列 組成的"最小啟動子"。
[0052] 在一個實施方案中，本發(fā)明提供如本文中公開的啟動子序列的片段。啟動子片段 可以包含如上所述的啟動子活性，且可以單獨地或與其它啟動子和啟動子片段結(jié)合使用， 如用于構(gòu)建嵌合啟動子。在特定實施方案中，提供了包含本文中公開的具有啟動子活性的 多核苷酸分子的至少約50、95、150、250、500、750或至少約1000個連續(xù)核苷酸或更長的啟 動子片段。
[0053] 例如，由如SEQ ID N0:3所示的啟動子衍生的組合物如內(nèi)部或5'刪除可以使用本 領(lǐng)域中已知的方法產(chǎn)生以改善或改變表達，包括通過移除對表達具有正或負效應的元件、 重復對表達具有正或負效應的元件和/或重復或移除對表達具有組織或細胞特異性效應 的元件。由如SEQ ID NO: 3所示的啟動子衍生的、由其中TATA盒元件或其等同序列及下游 序列被移除的3'刪除組成的組合物可以例如用于形成增強子元件。可以進行進一步的刪 除以移除對表達具有正或負、組織特異性、細胞特異性或時間特異性（例如，但不限于晝夜 節(jié)律）效應的任何元件。如SEQ ID N0:3所示的啟動子及由該啟動子衍生的片段或增強子 可以用于形成包含與其它增強子和啟動子可操作地連接的如SEQ ID N0:3所示的啟動子及 由該啟動子衍生的片段或增強子的嵌合轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件組合物。本文中描述的修飾、重復或 刪除對于特定轉(zhuǎn)基因的所需表達特征的效率可以在穩(wěn)定和瞬時植物分析（如本文中工作 實施例中描述的那些）中經(jīng)驗地測試以驗證結(jié)果，其可以根據(jù)所進行的變化和起始分子中 變化的目標而改變。
[0054] 如本文中使用的，術(shù)語"前導序列"是指從基因的基因組拷貝的5'非翻譯區(qū) (5'UTR)分離并一般定義為轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS)和蛋白質(zhì)編碼序列起始位點之間的核苷酸 片段的DNA分子。或者，前導序列可以是合成產(chǎn)生或操作的DNA元件。前導序列可以用作用 于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達的5'調(diào)控元件。前導序列分子可以與 異源啟動子或與其原始啟動子一起使用。本發(fā)明的啟動子分子因此可以與其原始前導序列 可操作地連接或可以與異源前導序列可操作地連接。可用于實施本發(fā)明的前導序列如SEQ ID N0:4或其片段或變體所示。在特定實施方案中，可以提供定義為能夠在宿主細胞（包 括，例如轉(zhuǎn)基因植物細胞）中作為前導序列發(fā)揮作用的這樣的序列。在一個實施方案中，這 樣的序列解碼為包含前導序列活性。
[0055] 如SEQ ID N0:4所示的前導序列（5'UTR)可以由調(diào)控元件組成或可以采取可具有 對轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的效應的二級結(jié)構(gòu)。這一前導序列可以按照本發(fā)明用于形成影響轉(zhuǎn) 基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的嵌合調(diào)控元件。另外，如SEQ ID N0:4所示的前導序列可以用于形成 影響轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯的嵌合前導序列。
[0056] 外源基因引入新的植物宿主中不總是導致引入基因的高表達。此外，如果處理復 雜性狀，有時有必要調(diào)節(jié)具有空間或時間上不同的表達模式的幾個基因。內(nèi)含子可以主要 地提供這種調(diào)節(jié)。但是，在一個植物中相同內(nèi)含子的多重使用已經(jīng)證明表現(xiàn)出不利。在這 些情況中，有必要具有用于構(gòu)建適宜重組DNA元件的基礎(chǔ)控制元件的集合。本領(lǐng)域中已知 具有表達增強性質(zhì)的內(nèi)含子數(shù)目是有限的，且因此替代物是需要的。
[0057] 由如SEQ ID N0:5、7和9所示的任何內(nèi)含子衍生的組合物可以由順式調(diào)控元件的 內(nèi)部刪除或重復組成。另外地，包含內(nèi)含子/外顯子剪接接合的5'和3'序列的改變可以 在與啟動子+前導序列或嵌合啟動子+前導序列和編碼序列可操作地連接時用于改善表達 或表達特異性。包含內(nèi)含子/外顯子剪接接合的5'和3'區(qū)域的改變也可以形成以降低在 信使RNA加工和剪接后所得轉(zhuǎn)錄物中引入產(chǎn)生的錯誤起始和終止密碼子的可能性。內(nèi)含子 可以如工作實施例中所述經(jīng)驗地測試以確定內(nèi)含子對轉(zhuǎn)基因的表達的效應。
[0058] 按照本發(fā)明，啟動子或啟動子片段可以分析已知啟動子元件的存在，即DNA序列 特征，如TATA-盒和其它已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點基序。這樣的已知啟動子元件的鑒定可以 被本領(lǐng)域技術(shù)人員用于設(shè)計具有與原始啟動子相似的表達模式的啟動子變體。
[0059] 如本文中使用的，術(shù)語"增強子"或"增強子元件"是指順式作用轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件（順 式元件），其賦予總體表達模式的方面，但其通常不足以單獨地驅(qū)動可操作地連接的多核苷 酸序列的轉(zhuǎn)錄。與啟動子不同，增強子元件通常不包括轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS)或者TATA盒或 等同序列。啟動子可以天然地包含影響可操作地連接的多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄的一個或多個 增強子元件。分離的增強子元件也可以與啟動子融合以產(chǎn)生嵌合啟動子順式元件，其賦予 基因表達的總體調(diào)節(jié)的方面。啟動子或啟動子片段可以包含影響可操作地連接的基因的轉(zhuǎn) 錄的一個或多個增強子元件。許多啟動子增強子元件據(jù)信結(jié)合DNA結(jié)合蛋白質(zhì)和/或影 響DNA拓撲結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生選擇性地允許或限制RNA聚合酶訪問DNA模板或者幫助選擇性 開放轉(zhuǎn)錄起始位點處的雙鏈的局部構(gòu)象。增強子元件可以起到結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子的 功能。一些增強子元件結(jié)合超過一個轉(zhuǎn)錄因子，且轉(zhuǎn)錄因子可以以不同親和力與超過一個 增強子域相互作用。增強子元件可以通過多種技術(shù)鑒定，包括刪除分析（即從啟動子的5' 末端或內(nèi)部刪除一個或多個核苷酸）、使用DNA酶I足跡的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)分析、甲基化干 擾、電泳遷移率變換分析、通過連接介導的PCR的體內(nèi)基因組足跡和其它常規(guī)分析；或者通 過利用常規(guī)DNA序列比較方法如BLAST的使用已知順式元件基序或增強子元件作為靶序列 或靶序列的DNA序列相似性分析。增強子域的精細結(jié)構(gòu)可以進一步通過一個或多個核苷酸 的誘變（或取代）或通過其它常規(guī)方法研究。增強子元件可以通過化學合成或通過從包括 這樣的元件的調(diào)控元件分離獲得，且它們可以與包含可用的限制性酶位點的附加側(cè)翼核苷 酸一起合成以幫助后續(xù)操作。因此，根據(jù)本文中公開的方法設(shè)計、構(gòu)建和使用用于調(diào)節(jié)可操 作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達的增強子元件包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0060] 在植物中，在基因構(gòu)建體中包括一些內(nèi)含子導致相對于缺乏內(nèi)含子的構(gòu)建 體提高的mRNA和蛋白質(zhì)累積。這一效應稱為基因表達的"內(nèi)含子介導的增強"（IME) (Mascarenhas 等，（1990)Plant Mol. Biol. 15:913-920)。已知刺激植物中的表 達的內(nèi)含子已經(jīng)在玉米基因中（例如，tubAl、Adhl、Shi、Ubil) (Jeon等，Plant Physiol. 123:1005-1014, 2000 ;Callis等，Genes Dev. 1:1183-1200, 1987 ;Vasil 等，Plant Physiol. 91:1575-1579, 1989 !Christiansen 等，Plant Mol.Biol. 18:675-689, 1992)和 在水稻基因中（例如，salt, tpi:McElroy 等，Plant Cell 2:163-171, 1990 ;Xu 等，Plant Physiol. 106:459-467, 1994)鑒定。類似地，來自雙子葉植物基因如矮牽牛（例如，rbcS)、 土豆（例如，st-1 si)和擬南芥（例如，ubq3和pat 1)的內(nèi)含子已發(fā)現(xiàn)提高基因表達 率（Dean 等，Plant Cell 1:201-208, 1989 ;Leon 等，Plant Physiol. 95:968-972, 1991; Norris 等，Plant Mol Biol 21:895-906, 1993 ;Rose 和 Last, Plant J. 11:455-464, 1997)。 已證明內(nèi)含子的剪接位點內(nèi)的刪除或突變降低基因表達，表明剪接可能是ME需要 的（Mascarenhas 等，Plant Mol Biol. 15:913-920,1990 ;Clancy 和 Hannah, Plant Physiol. 130:918-929,2002)。但是，這樣的剪接不是雙子葉植物中特定ME需要的， 如來自擬南芥的pat 1基因的剪接位點內(nèi)的點突變證明的（Rose和Beliakoff，Plant Physiol. 122:535-542, 2000)。
[0061] 基因表達通過內(nèi)含子增強不是普遍的現(xiàn)象，因為一些內(nèi)含子插入到重組表達盒 中不能增強表達（例如，來自雙子葉植物基因（如來自豌豆的rbcS基因、來自大豆的 云扁豆蛋白（phaseolin)基因和來自馬鈴薯（Solanum tuberosum)的stls-1基因）的 內(nèi)含子）和來自玉米基因的內(nèi)含子（adhl基因的第九內(nèi)含子和hsp81基因的第一內(nèi)含 子）（Chee 等，Gene41:47-57, 1986 ;Kuhlemeier 等，Mol Gen Genet 212:405-411,1988; Mascarenhas 等，Plant Mol.Biol.15:913-920， 1990 ;Sinibaldi 和 Mettler， In WE Cohn,K Moldave, eds, Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology，Vol 42. Academic Press，New York, pp 229-257, 1992 ;Vancanneyt 等，Mol. Gen. Genet. 220:245-250, 1990)。因此，不是每個內(nèi)含子可以用于操作轉(zhuǎn)基因植物中非內(nèi)源基因 或內(nèi)源基因的基因表達水平。什么特性或特定序列特征必須存在于內(nèi)含子序列中以增強給 定基因的表達率是現(xiàn)有技術(shù)中未知的，且因此不可能預測給定植物內(nèi)含子在異源使用時是 否引起ME。
[0062] 如本文中使用的，術(shù)語"嵌合的"是指通過融合第一 DNA分子與第二DNA分子產(chǎn)生 的單一 DNA分子，其中第一 DNA分子和第二DNA分子正常情況下都不以該構(gòu)型（即與另一 DNA分子融合）存在。因此嵌合DNA分子是另外通常不在自然界中存在的新DNA分子。如 本文中使用的，術(shù)語"嵌合啟動子"是指通過DNA分子的這種操作產(chǎn)生的啟動子。嵌合啟動 子可以結(jié)合兩個或更多個DNA片段，例如啟動子與增強子元件的融合。因此，根據(jù)本文中公 開的方法設(shè)計、構(gòu)建和使用嵌合啟動子用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表 達包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0063] 如本文中使用的，術(shù)語"變體"是指組成上與第一 DNA分子相似但與第一 DNA分子 不同的第二DNA分子，然而第二DNA分子仍保持第一 DNA分子的總體功能性，即相同或相似 的表達模式。變體可以是第一 DNA分子的更短或截短形式和/或第一 DNA分子的序列的改 變形式，如具有不同限制性酶位點和/或內(nèi)部刪除、取代和/或插入的變體。"變體"也可 以包括具有含有參比序列的一個或多個核苷酸的取代、刪除和/或插入的核苷酸序列的調(diào) 控元件，其中衍生的調(diào)控元件具有與對應的母體調(diào)控分子相比更高或更低的或等同的轉(zhuǎn)錄 或翻譯活性。調(diào)控元件"變體"也包括由天然存在于細菌和植物細胞轉(zhuǎn)化中的突變產(chǎn)生的 變體。在本發(fā)明中，如SEQ ID N0:l、2、3、4、6和8提供的多核苷酸序列可以用于形成組成 上與原始調(diào)控元件的多核苷酸序列相似但與原始調(diào)控元件的多核苷酸序列不同的而仍保 持原始調(diào)控元件的總體功能性（即相同或相似的表達模式）的變體。本發(fā)明的這種變體的 產(chǎn)生根據(jù)本公開在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技能范圍內(nèi)且包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。嵌合調(diào)控元件 "變體"包含與參比序列相同的組成元件，但構(gòu)成嵌合調(diào)控元件的組成元件可以通過本領(lǐng)域 中已知的各種方法可操作地連接，如限制性酶消化和連接、非連接依賴性的克隆、擴增期間 PCR產(chǎn)物的模塊化組裝或調(diào)控元件的直接化學合成，以及本領(lǐng)域中已知的其它方法。所得的 嵌合調(diào)控元件"變體"可以由參比序列的相同組成元件或相同組成元件的變體組成但包含 允許組成部分可操作地連接的一個或多個連接序列的一個或多個序列不同。在本發(fā)明中， 如SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8提供的多核苷酸序列提供了參比序列，其中包含參比序列的 組成元件可以通過本領(lǐng)域中已知的方法接合且可以包含天然存在于細菌和植物細胞轉(zhuǎn)化 中一個或多個核苷酸的取代、刪除和/或插入或者突變。
[0064] 構(gòu)建體
[0065] 如本文中使用的，術(shù)語"構(gòu)建體"意思是源自任何來源的能夠基因組整合或自主復 制的任何重組多核苷酸分子如質(zhì)粒、粘粒、病毒、自主復制的多核苷酸分子、噬菌體或者線 性或環(huán)狀單鏈或雙鏈DNA或RNA多核苷酸分子，其包含多核苷酸分子，其中一個或多個多核 苷酸分子以功能上操作的方式連接（即可操作地連接）。如本文中使用的，術(shù)語"載體"意思 是可以用于轉(zhuǎn)化目的（即將異源DNA引入宿主細胞中）的任何重組多核苷酸構(gòu)建體。按照 本發(fā)明的載體可以包括從任何前述分子分離的表達盒或轉(zhuǎn)基因盒?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的表 達盒或轉(zhuǎn)基因盒由與異源編碼序列可操作地連接的如SEQ ID N0:l、6或8所示的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 表達元件組（"EXP"）組成，該異源編碼序列與如SEQ ID NO: 10、11、12或13所示的3' UTR 可操作地連接。
[0066] 如本文中使用的，術(shù)語"可操作地連接的"是指與第二分子接合的第一分子，其中 所述分子如此排列以使得第一分子影響第二分子的功能。兩個分子可以是或不是單一連續(xù) 分子的部分且可以是或不是相鄰的。例如，如果啟動子調(diào)節(jié)細胞中目標可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分 子的轉(zhuǎn)錄，則啟動子與可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接。例如，當前導序列能夠用作編碼 序列編碼的多肽的前導序列時，該前導序列與編碼序列可操作地連接。
[0067] 在一個實施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體可以提供為具有包含T-DNA的從根癌農(nóng)桿菌 分離的右邊界（RB或AGRtu. RB)和左邊界（LB或AGRtu. LB)區(qū)域的雙Ti質(zhì)粒邊界DNA構(gòu) 建體，其連同根癌農(nóng)桿菌細胞提供的轉(zhuǎn)移分子一起允許T-DNA整合到植物細胞的基因組中 (參見，例如，U.S.專利No. 6, 603, 061)。構(gòu)建體也可以包含在細菌細胞中提供復制功能和 抗生素選擇的質(zhì)粒骨架DNA片段，例如大腸桿菌復制起點如ori322、廣譜宿主范圍復制起 點如oriV或oriRi和選擇標記的編碼區(qū)域如Spec/Strp (其編碼賦予對壯觀霉素或鏈霉素 的抗性的Tn7氨基糖苷腺苷?；D(zhuǎn)移酶）（aadA)或者慶大霉素（Gm，Gent)選擇標記基因。 為了植物轉(zhuǎn)化，宿主細菌菌株通常是根癌農(nóng)桿菌ABI、C58或LBA4404 ;但是，植物轉(zhuǎn)化領(lǐng)域 的技術(shù)人員已知的其它菌株可以在本發(fā)明中發(fā)揮功能。
[0068] 本領(lǐng)域中已知以可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄成功能性mRNA分子的方式用于將構(gòu)建 體組裝和引入到細胞中的方法，該功能性mRNA分子翻譯和表達為蛋白質(zhì)產(chǎn)物。對于本發(fā)明 的實施，用于制備和使用構(gòu)建體和宿主細胞的常規(guī)組合物和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的 (參見，例如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd edition Volumes I, 2, and 3, J.Sambrook, D. W. Russell 和 N. Irwin, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000)。 用于制備特別適合于植物轉(zhuǎn)化的重組載體的方法包括，但不限于U. S.專利No. 4, 971，908、 4, 940, 835、4, 769, 061和4, 757, 011中整體描述的那些。這些類型的載體也在科技文獻 中綜述（參見，例如 Rodriguez 等，Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, 1988 和 Glick 等，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton, FL·，1993)?？捎糜谠诟叩戎参镏斜?達核酸的典型載體是本領(lǐng)域中公知的且包括來源于根瘤農(nóng)桿菌的腫瘤誘導（Ti)質(zhì)粒的載 體（Rogers 等，Methods in Enzymology 153:253-277, 1987)。可用于植物轉(zhuǎn)化的其它重組 載體，包括PCaMVCN轉(zhuǎn)移控制載體，也已經(jīng)描述在科技文獻中（參見，例如Fromm等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824-5828, 1985)。
[0069] 各種調(diào)控元件可以包括在構(gòu)建體中，包括本文中提供的那些的任一種。任何這類 調(diào)控元件可以與其它調(diào)控元件組合提供。這樣的組合可以設(shè)計或改變以產(chǎn)生所需的調(diào)控特 征。在一個實施方案中，本發(fā)明的構(gòu)建體包含與可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接的至少 一個調(diào)控元件，該可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接3'轉(zhuǎn)錄終止分子。
[0070] 本發(fā)明的構(gòu)建體可以包括本文中提供的或本領(lǐng)域中已知的任何啟動子或前導序 列。例如，本發(fā)明的啟動子可以可操作地連接異源非翻譯5'前導序列如源自熱休克蛋白基 因的前導序列（參見，例如U.S.專利No. 5, 659, 122和5, 362, 865)?；蛘?，本發(fā)明的前導序 列可以可操作地連接異源啟動子如花椰菜花葉病毒（CaMV) 35S轉(zhuǎn)錄啟動子（參見，U.S.專 利 No. 5, 352, 605)。
[0071] 如本文中使用的，術(shù)語"內(nèi)含子"是指可以從基因的基因組拷貝分離或鑒定的且可 以一般地定義為在翻譯前的mRNA加工過程中剪接出來的DNA分子?；蛘撸瑑?nèi)含子可以是合 成地產(chǎn)生或操作的DNA元件。內(nèi)含子可以包含影響可操作地連接的基因的轉(zhuǎn)錄的增強子元 件。內(nèi)含子可以用作用于調(diào)節(jié)可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達的調(diào)控元件。DNA 構(gòu)建體可以包含內(nèi)含子，且內(nèi)含子相對于可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子序列可以是或不是異源的。 本領(lǐng)域中內(nèi)含子的實例包括水稻肌動蛋白內(nèi)含子（U. S.專利No. 5, 641，876)和玉米HSP70 內(nèi)含子（U.S.專利No. 5, 859, 347)?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的內(nèi)含子包括SEQ ID NO: 5、7和9。 另外，當修飾內(nèi)含子/外顯子邊界序列時，可能優(yōu)選的是避免使用核苷酸序列AT或者恰在 剪接位點（GT)的5'末端之前的核苷酸A及緊接剪接位點（AG)的3'末端之后的分別核苷 酸G或核苷酸序列TG以消除在信使RNA加工成最終轉(zhuǎn)錄物的過程中形成不需要的起始密 碼子的可能性。因此內(nèi)含子的5'或3'末端剪接接合位點周圍的序列可以以這種方式修飾。
[0072] 如本文中使用的，術(shù)語"3'轉(zhuǎn)錄終止分子"或"3' UTR"是指在轉(zhuǎn)錄過程中使用以 產(chǎn)生mRNA分子的3'非翻譯區(qū)（3'UTR)的DNA分子。mRNA分子的3'非翻譯區(qū)可以通過特 定的切割和3'聚腺苷酸化（polyA尾）生成。3'UTR可以可操作地連接可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分 子和位于其下游且可以包括提供聚腺苷酸化信號和能夠影響轉(zhuǎn)錄、mRNA加工或基因表達的 其它調(diào)控信號的多核苷酸。PolyA尾被認為發(fā)揮mRNA穩(wěn)定性和翻譯起始方面的功能。本 領(lǐng)域中3'轉(zhuǎn)錄終止分子的實例是胭脂氨酸合成酶3'區(qū)域（參見，F(xiàn)raley等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，80:4803-4807, 1983)、小麥hspl73'區(qū)域、豌豆核酮糖二磷酸羧化酶-加氧 酶（rubisco)小亞基 3' 區(qū)域、棉花 E63' 區(qū)域（U.S.專利 No.6,096,950)、W0/0011200A2 中 公開的 3' 區(qū)域和薏苡辛（coixin) 3'UTR(U.S.專利 No. 6,635,806)。
[0073] 3'UTR通常具有用于特定基因的重組表達的有益用途。在動物系統(tǒng)中， 3' UTR 的機制已很好地定義（例如，Zhao 等，Microbiol Mol Biol Rev 63:405 -445，1999;Proudfoot，Nature 322:562-565, 1986 ;Kim 等，Biotechnology Progress 19:1620-1622,2003 ;Yonaha 和 Proudfoot，EMBO J. 19:3770-3777,2000 ;Cramer 等，F(xiàn)EBS Letters 498:179-182, 2001 ;Kuerstem 和 Goodwin, Nature Reviews Genetics 4:626-637,2003)。RNA轉(zhuǎn)錄的有效終止是防止不需要的性狀不相關(guān)（下游）序列的轉(zhuǎn)錄 (其可能干擾性狀性能）所需要的。多個基因表達盒彼此接近（例如在一個T-DNA內(nèi)）的 排列可以引起所述構(gòu)建體中一個或多個基因的基因表達與獨立插入相比的抑制（Padidam 和Cao, BioTechniques 31:328-334, 2001)。這可以妨礙獲得足夠的表達水平，例如在其中 希望所有盒的強基因表達的情況中。
[0074] 在植物中，明確定義的聚腺苷酸化信號序列是未知的。Hasegawa等（Plant J. 33:1063-1072,2003)未能在Nicotiana sylvestris的體外和體內(nèi)系統(tǒng)中確認保守的 聚腺苷酸化信號序列和確定原始（非聚腺苷酸化的）轉(zhuǎn)錄物的實際長度。弱3'UTR可以 產(chǎn)生通讀，其可以影響位于相鄰表達盒中的基因的表達（Padidam和Cao, BioTechniques 31:328-334, 2001)。轉(zhuǎn)錄終止的適當控制可以防止通讀到位于下游的序列（例如，其它表 達盒）中且可以進一步允許RNA聚合酶的高效循環(huán)以改善基因表達。轉(zhuǎn)錄的有效終止（RNA 聚合酶II從DNA釋放）是轉(zhuǎn)錄重新起始的必要條件且因此直接影響總體轉(zhuǎn)錄水平。在轉(zhuǎn) 錄終止后，成熟mRNA從合成位點和模板釋放到胞質(zhì)中。真核mRNA在體內(nèi)以poly (A)形式 累積，使得難以通過常規(guī)方法檢測轉(zhuǎn)錄終止。但是，通過生物信息學方法預測功能性的和有 效的3' UTR是困難的，因為不存在保守的序列以使得能夠容易地預測有效的3' UTR。
[0075] 從實踐的觀點，可能有益的是用于轉(zhuǎn)基因盒中的3'UTR具有特定特征。例如，根據(jù) 本發(fā)明可用的3'UTR可以高效地和有效地終止轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄和防止轉(zhuǎn)錄物通讀到任何相 鄰DNA序列中，其可以由另一轉(zhuǎn)基因盒（如在存在于一個T-DNA中的多個盒的情況中）或 T-DNA插入其中的相鄰染色體DNA組成。最佳情況下，3' UTR不應受到用于驅(qū)動轉(zhuǎn)基因的表 達的啟動子、前導序列和內(nèi)含子影響而引起轉(zhuǎn)錄活性的降低。在植物生物技術(shù)中，3'UTR通 常用于啟動從轉(zhuǎn)化的植物提取的反轉(zhuǎn)錄RNA的擴增反應且可以用于（1)在轉(zhuǎn)基因盒一旦整 合到植物染色體中時評價轉(zhuǎn)基因盒的轉(zhuǎn)錄活性或表達；（2)評價植物DNA內(nèi)插入序列的拷 貝數(shù)；和（3)評價在育種后所得種子的接合性。3'UTR也可以用于從轉(zhuǎn)化的植物提取的DNA 的擴增反應中以表征插入的盒的完整性。
[0076] 可用于在植物中提供轉(zhuǎn)基因表達的3' UTR可以基于從信使RNA形成的cDNA文庫 中已表達序列標簽（EST)的表達來鑒定，該信使RNA從來源于例如大須芒草（Andropogon gerardii)> 鹿茅[Saccharum ravennae (Erianthus ravennae)]> 狗尾草(Setaria viridis)、墨西哥玉蜀黍（Zea mays 亞種 mexicana)、粟（Setaria italica)或薏該（Coix lacryma-jobi)的種子、花或任何其它組織分離。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，cDNA 文庫可以使用花組織、種子、葉、根或其它植物組織從分離自植物物種的組織制備。所得 的cDNA使用本領(lǐng)域中已知的各種測序方法測序。所得的EST使用生物信息學軟件如 clc_ref_assemble_complete 版本 2. OL 37139 (CLC bio USA, Cambridge, Massachusetts 02142)組裝成簇。各簇的轉(zhuǎn)錄物豐度通過計數(shù)各簇的cDNA閱讀片段的數(shù)目確定。所鑒 定的3'UTR可以由源自cDNA序列的序列以及源自基因組DNA的序列組成。cDNA序列可 以用于設(shè)計引物，其然后可以用于按照制造商的方案構(gòu)建的GenomeWalker?(Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA)文庫以克隆相應基因組DNA序列的3'區(qū)域而提供 更長的終止序列。相對轉(zhuǎn)錄物豐度通過直接計數(shù)或?qū)τ诟鹘M織文庫的觀察序列閱讀片段的 標準化計數(shù)進行分析可以用于推斷關(guān)于表達模式的性質(zhì)。例如，一些3' UTR可以在根組織 中而不是在葉組織中更豐富的轉(zhuǎn)錄物中發(fā)現(xiàn)。這表明轉(zhuǎn)錄物在根中高度地表達且根表達的 性質(zhì)可能歸因于啟動子、前導序列、內(nèi)含子或3' UTR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。通過特定器官、組織或 細胞類型中的表達性質(zhì)鑒定的3' UTR的經(jīng)驗測試可以導致增強這些特定器官、組織或細胞 類型中的表達的3'UTR的鑒定?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的3'UTR提供為SEQ ID N0:9、10、ll和 12〇
[0077] 構(gòu)建體和載體也可以包括轉(zhuǎn)運肽編碼序列，其表達可用于將蛋白質(zhì)產(chǎn)物靶向于特 別是葉綠體、白色體或其它質(zhì)體細胞器；線粒體；過氧化物酶體；液泡或細胞外位置的連接 肽。對于葉綠體轉(zhuǎn)運肽的應用的描述，參見u. S.專利No. 5, 188, 642和5, 728, 925。許多 葉綠體定位的蛋白質(zhì)作為前體由核基因表達并通過葉綠體轉(zhuǎn)運肽（CTP)靶向于葉綠體。 這樣的分離葉綠體蛋白質(zhì)的實例包括，但不限于與核酮糖-1，5,-二磷酸羧化酶的小亞基 (SSU)、鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白氧化還原酶、獲光復合物蛋白I和蛋白II、硫氧還蛋白F、 烯醇丙酮酸莽草酸磷酸合成酶（EPSPS)以及描述于U. S.專利No. 7, 193, 133的轉(zhuǎn)運肽類 相關(guān)的那些。已在體內(nèi)和體外證明，通過與異源CTP的蛋白質(zhì)融合可將非-葉綠體蛋白質(zhì) 靶向于葉綠體，并且CTP足以將蛋白質(zhì)靶向于葉綠體。適合的葉綠體轉(zhuǎn)運肽（例如擬南芥 EPSPS CTP (CTP2)(參見，Klee 等人，Mol. Gen. Genet.，210:437-442 (1987))或矮牽牛 EPSPS CTP (CTP4)(參見，della-Cioppa 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:6873-6877 (1986))) 的引入已顯示在轉(zhuǎn)基因植物中將異源EPSPS蛋白質(zhì)序列靶向于葉綠體（參見，U. S.專 利 No. 5, 627, 061、5, 633, 435 和 5, 312, 910 及 EP 0218571、EP 189707、EP 508909 和 EP 924299)。
[0078] 可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子
[0079] 如本文中使用的，術(shù)語"可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子"是指任何能夠被轉(zhuǎn)錄為RNA分子的 DNA分子，包括但不局限于具有蛋白質(zhì)編碼序列的那些以及產(chǎn)生具有用于基因抑制的序列 的RNA分子的那些。"轉(zhuǎn)基因"是指與至少相對于其基因組中的位置對于宿主細胞異源的可 轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子和/或人工并入當前或任何前代細胞的宿主細胞基因組中的可轉(zhuǎn)錄多 核苷酸分子。
[0080] 本發(fā)明的啟動子可以可操作地連接相對于啟動子分子為異源的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸 分子。如本文中使用的，術(shù)語"異源的"是指當兩個或更多個多核苷酸分子的組合通常不存 在于自然界中時的這種組合。例如，兩個分子可來源于不同物種和/或兩個分子可源自不 同基因，例如，來自相同物種的不同基因，或來自不同物種的相同基因。因此，如果這種組合 通常不存在于自然界中，則啟動子相對于可操作地連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子為異源的， 即與該啟動子分子組合的該可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子不是天然發(fā)生地可操作地連接的。
[0081] 可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子通常可為其RNA轉(zhuǎn)錄體的表達為所需的任何DNA分子。RNA 轉(zhuǎn)錄體的這種表達可導致所得到的mRNA分子的翻譯以及因此蛋白質(zhì)的表達?？蛇x地，例 如，可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可設(shè)計為最終導致特定基因或蛋白質(zhì)的表達降低。在一個實施方 案中，這可通過使用以反義方向定向的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子來實現(xiàn)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員熟悉這種反義技術(shù)的使用。簡而言之，當反義可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子被轉(zhuǎn)錄時，RNA產(chǎn)物在 細胞中與互補RNA分子雜交并且隔絕（sequester)互補RNA分子。這一雙鏈RNA分子不能 通過細胞的翻譯機制翻譯為蛋白質(zhì)，并且在細胞中降解。任何基因可以這種方式反向調(diào)控。
[0082] 因此，在本發(fā)明的一個實施方案中，調(diào)控元件（提供為SEQ ID NO: 1、2、3、4、6和8) 可操作地連接可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子，從而當將構(gòu)建體整合到植物細胞的基因組中時以需要 的水平或以需要的模式調(diào)節(jié)可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的轉(zhuǎn)錄。在一個實施方案中，可轉(zhuǎn)錄多核 苷酸分子包含基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)域，并且啟動子影響被翻譯和表達為蛋白質(zhì)產(chǎn)物的RNA 分子的轉(zhuǎn)錄。在另一個實施方案中，可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子包含基因的反義區(qū)域，并且啟動子 影響反義RNA分子、雙鏈RNA或其他相似抑制性RNA分子的轉(zhuǎn)錄以抑制靶宿主細胞中特定 目的RNA分子的表達。
[0083] 具有農(nóng)學意義的基因
[0084] 根據(jù)本發(fā)明的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可以是具有農(nóng)學意義的基因。如本文中使用 的，術(shù)語"具有農(nóng)學意義的基因"是指當在特定的植物組織、細胞或細胞類型中表達時賦予 所需特征例如與植物形態(tài)學、生理學、生長、發(fā)育、產(chǎn)量、產(chǎn)物、營養(yǎng)分布、疾病或害蟲抗性和 /或環(huán)境或化學耐受性相關(guān)的特征的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子。具有農(nóng)學意義的基因包括，但 不限于編碼產(chǎn)量蛋白、應激抗性蛋白、發(fā)育控制蛋白、組織分化蛋白、分生組織蛋白、環(huán)境響 應蛋白、衰老蛋白、激素響應蛋白、脫落蛋白（abscission protein)、源蛋白、SINK蛋白、花 調(diào)控蛋白、種子蛋白、除草劑抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成 酶、氨基酸生物合成酶、殺蟲蛋白或任何其他試劑例如用于抑制的靶向特定基因的反義或 RNAi分子的基因。具有農(nóng)學意義的基因的產(chǎn)物可在植物中起作用以引起對植物生理學或代 謝的作用，或可在以植物為食的害蟲的食物中作為殺蟲劑起作用。
[0085] 在本發(fā)明的一個實施方案中，啟動子被并入構(gòu)建體中，以使啟動子可操作地連接 作為具有農(nóng)學意義的基因的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子。為了獲得農(nóng)學有益性狀，具有農(nóng)學意義 的基因的表達是需要的。有益農(nóng)學性狀可以特別地包括，但不限于，例如除草劑耐受性、昆 蟲控制、改良的產(chǎn)量、真菌疾病抗性、病毒抗性、線蟲抗性、細菌疾病抗性、植物生長和發(fā)育、 淀粉產(chǎn)生、改良的油產(chǎn)生、高油產(chǎn)量、改良的脂肪酸含量、高蛋白質(zhì)產(chǎn)量、果實成熟、提高的 動物和人類營養(yǎng)、生物聚合物、環(huán)境應激抗性、藥用肽和可分泌肽、改善的加工性狀、改善的 消化性、酶產(chǎn)生、味道、固氮、雜交種子產(chǎn)生、纖維產(chǎn)生和生物燃料產(chǎn)生。本領(lǐng)域已知的農(nóng)學 意義的基因的實例包括具有除草劑抗性（U. S.專利No. 6, 803, 501、6, 448, 476、6, 248, 876、 6, 225, 114、6, 107, 549、5, 866, 775、5, 804, 425、5, 633, 435 和 5, 463, 175)、提高的產(chǎn)量 (U.S.專利 N〇.USRE38,446、6,716,474、6,663,906、6,476,295、6,441，277、6,423,828、 6,399,330、6,372,211、6,235,971、6,222,098 和 5,716,837)、昆蟲控制（仄5.專利 No. 6, 809, 078、6, 713, 063、6, 686, 452、6, 657, 046、6, 645, 497、6, 642, 030、6, 639, 054、 6, 620, 988、6, 593, 293、6, 555, 655、6, 538, 109、6, 537, 756、6, 521，442、6, 501，009、 6, 468, 523、6, 326, 351、6, 313, 378、6, 284, 949、6, 281，016、6, 248, 536、6, 242, 241、 6, 221，649、6, 177, 615、6, 156, 573、6, 153, 814、6, 110, 464、6, 093, 695、6, 063, 756、 6, 063, 597、6, 023, 013、5, 959, 091、5, 942, 664、5, 942, 658、5, 880, 275、5, 763, 245 和 5, 763, 241)、真菌疾病抗性（U. S.專利 No. 6, 653, 280、6, 573, 361、6, 506, 962、6, 316, 407、 6,215,048、5,516,671、5,773,696、6，121，436、6,316,407 和 6,506,962)、病毒抗性 (U. S.專利 No. 6, 617, 496、6, 608, 241、6, 015, 940、6, 013, 864、5, 850, 023 和 5, 304, 730)、 線蟲抗性（U.S.專利No. 6, 228, 992)、細菌疾病抗性（U.S.專利No. 5, 516, 671)、植物生 長和發(fā)育（U. S.專利 No. 6, 723, 897 和 6, 518, 488)、淀粉生產(chǎn)（U. S.專利 No. 6, 538, 181、 6, 538, 179、6, 538, 178、5, 750, 876和 6, 476, 295)、改良的油生產(chǎn)（U. S.專利No. 6, 444, 876、 6, 426, 447 和 6, 380, 462)、高油產(chǎn)量（U. S.專利 No. 6, 495, 739、5, 608, 149、6, 483, 008 和 6, 476, 295)、改良的脂肪酸含量（U. S.專利 No. 6, 828, 475、6, 822, 141、6, 770, 465、 6, 706, 950、6, 660, 849、6, 596, 538、6, 589, 767、6, 537, 750、6, 489, 461 和 6, 459, 018)、高蛋 白質(zhì)產(chǎn)量（u. S.專利No. 6, 380, 466)、果實成熟（U. S.專利No. 5, 512, 466)、提高的動物和 人類營養(yǎng)（U. S.專利 No. 6, 723, 837、6, 653, 530、6, 5412, 59、5, 985, 605 和 6, 171，640)、生 物聚合物（U. S.專利 No. USRE37, 543、6, 228, 623、5, 958, 745 和 6, 946, 588)、環(huán)境應激抗 性（U. S.專利 No. 6, 072, 103)、藥用肽和可分泌肽（U. S.專利 No. 6, 812, 379、6, 774, 283、 6, 140, 075和6, 080, 560)、改善的加工性狀（U. S.專利No. 6, 476, 295)、改善的消化性 (U. S.專利No. 6, 531，648)、低棉子糖（U. S.專利No. 6, 166, 292)、工業(yè)酶產(chǎn)生（U. S.專利 No. 5, 543, 576)、改良的味道（U. S.專利 No. 6, 011，199)、固氮（U. S.專利 No. 5, 229, 114)、 雜交種子產(chǎn)生（U. S.專利 No. 5, 689, 041)、纖維產(chǎn)生（U. S.專利 No. 6, 576, 818、6, 271，443、 5, 981，834 和 5, 869, 720)和生物燃料產(chǎn)生（U. S.專利 No. 5, 998, 700)。
[0086] 可選地，具有農(nóng)學意義的基因可以通過編碼引起內(nèi)源基因的基因表達的靶向調(diào) 節(jié)的RNA分子而影響以上所述的植物特征或表型，例如通過反義物（參見，例如，U.S.專 利5, 107, 065)、抑制性RNA ( "RNAi "，包括通過miRNA、siRNA、反式作用siRNA和相 控sRNA介導的機理的基因表達調(diào)節(jié)，例如，如描述于公開的申請US2006/0200878和US 2008/0066206及U. S.專利申請No. 11/974, 469中），或共抑制介導的機理。RNA也可以為 催化的RNA分子（例如，核酶或核開關(guān)；參見例如，US 2006/0200878)，其經(jīng)工程化以切割 所希望的內(nèi)源性mRNA產(chǎn)物。因此，編碼影響農(nóng)學重要表型或目的形態(tài)學變化的轉(zhuǎn)錄RNA分 子的任何可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可用于實施本發(fā)明。用于構(gòu)建構(gòu)建體和將構(gòu)建體引入細胞 內(nèi)從而將可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子轉(zhuǎn)錄至能夠引起基因抑制的分子中的方法在本領(lǐng)域中是已 知的。例如，在植物中使用具有反義定向的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)錄后基因 抑制以調(diào)控基因表達公開于U. S.專利No. 5, 107, 065和5, 759, 829中，并且在植物中使用 具有正義定向的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的構(gòu)建體進行轉(zhuǎn)錄后基因抑制以調(diào)控基因表達公開 于U.S.專利No. 5, 283, 184和5, 231，020中。在植物細胞中表達可轉(zhuǎn)錄多核苷酸也可用 于抑制以該植物細胞為食的植物害蟲，例如，從鞘翅目害蟲分離的組合物（U.S.專利公開 No. US2007/0124836)和從線蟲害蟲分離的組合物（U. S.專利公開No. US2007/0250947)。植 物害蟲包括，但不限于節(jié)肢類害蟲、線蟲害蟲和真菌或微生物害蟲。用于并入本發(fā)明的構(gòu)建 體中的示例性可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子包括，例如，來自于不同于目標物種之外物種的DNA分 子或基因，或起源于或存在于相同物種但通過遺傳工程方法而不是經(jīng)典繁殖或育種技術(shù)并 入受體細胞中的基因。多核苷酸分子的類型可以包括，但不限于已經(jīng)存在于植物細胞中的 多核苷酸分子、來自另一植物的多核苷酸分子、來自不同生物體的多核苷酸分子或外部產(chǎn) 生的多核苷酸分子（例如含有基因的反義信息的多核苷酸分子，或編碼人工的、合成的或 另外修飾形式的轉(zhuǎn)基因的多核苷酸分子）。
[0087] 選擇標記
[0088] 如本文中使用的術(shù)語"標記"是指任何可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子，其表達或其缺乏可 以某種方式篩選或評分。用于實施本發(fā)明的標記基因包括，但不限于編碼葡萄糖醛酸 酶0^3，描述于。5.專利5,599,670中）、綠色熒光蛋白及其變體（6--，描述于。5.專 利5, 491，084和6, 146, 826中）、賦予抗生素抗性的蛋白質(zhì)或賦予除草劑耐受性的蛋白質(zhì) 的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子?？捎玫目股啬退幮詷擞?，包括編碼賦予卡那霉素（nptll)、潮霉 素 B(aph IV)、鏈霉素或壯觀霉素（aad，spec/strep)和慶大霉素（aac3和aacC4)耐藥性 的蛋白質(zhì)的那些標記是本領(lǐng)域公知的。已證實轉(zhuǎn)基因植物的耐受性并且本發(fā)明方法可應 用的除草劑可以包括，但不限于：氨基-甲基-膦酸、草甘膦、草丁膦、磺酰脲類、咪唑啉酮、 溴草腈、茅草枯、麥草畏、環(huán)己二酮、原卟啉原氧化酶抑制劑和異卩惡唑草酮（isoxasfIutole) 除草劑。編碼參與除草劑耐受性的蛋白質(zhì)的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子在本領(lǐng)域是已知的，并且 可以包括，但不局限于編碼5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（用于草甘膦耐受性的 EPSPS，描述于 U. S.專利 5, 627, 061、5, 633, 435、6, 040, 497 和 5, 094, 945 中）的可轉(zhuǎn)錄多 核苷酸分子；編碼草甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶（G0X，描述于U. S.專利 5,463, 175中、GAT，描述于美國專利公開No. 2003/0083480中）以及麥草畏單加氧酶（描述 于U. S.專利公開No. 2003/0135879中）的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子；編碼溴草腈腈水解酶（用 于溴草腈耐受性的Bxn，描述于U. S.專利4, 810, 648中）的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子；編碼用 于達草滅耐受性的八氫番茄紅素去飽和酶（crtl)的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子（描述于Misawa 等人，Plant Journal, 4:833-8401993 和 Plant Journal, 6:481-4891994 中）、編碼用于橫 酰脲類除草劑耐受性的乙酰羥酸合成酶（AHAS，也就是ALS)的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子（描述 于 Sathasiivan 等人，Nucl. Acids Res.，18:2188-21931990 中），以及用于草丁勝和雙丙 氨磷耐受性的bar基因（描述于DeBlock等人，EMBO Journal, 6:2513-25191987中）。本 發(fā)明的啟動子分子可表達連接的可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子，其編碼草胺膦（phosphinothricin) 乙?；D(zhuǎn)移酶、草甘膦抗性EPSPS、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶、羥苯基丙酮酸酯脫氫酶、潮霉素磷 酸轉(zhuǎn)移酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、茅草枯脫齒素酶、溴草腈抗性腈水解酶、鄰氨基苯甲酸合成 酶、芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶、乙酰CoA羧化酶、草甘膦氧化還原酶和草甘膦-N-乙酰基轉(zhuǎn) 移酶。
[0089] 包括于術(shù)語"選擇標記"中的也有編碼選擇標記的基因，其分泌可作為識別或選擇 轉(zhuǎn)化細胞的方式檢測。其實例包括編碼可通過抗體相互作用識別的可分泌抗原的標記或甚 至編碼可催化地檢測的可分泌酶?？蛇x擇的分泌標記蛋白質(zhì)劃分為多個類別，包括（例如， 通過ELISA)可檢測的小的可擴散的蛋白質(zhì)、可在細胞外溶液中檢測的小的活性酶（例如， α -淀粉酶、β -內(nèi)酰胺酶、草胺膦轉(zhuǎn)移酶）或插入或禁閉在細胞壁中的蛋白質(zhì)（例如包括 在例如延伸表達單元中發(fā)現(xiàn)的前導序列的蛋白質(zhì)或者與煙草致病性相關(guān)的蛋白質(zhì)，也稱為 煙草PR-S)。其他可能的選擇標記基因?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員是明顯的并且包含在本發(fā)明中。 [0090] 細胞轉(zhuǎn)化
[0091] 術(shù)語"轉(zhuǎn)化"是指將核酸引入受體宿主中。如本文中使用的，術(shù)語"宿主"是指細 菌、真菌或植物，包括細菌、真菌或植物的任何細胞、組織、器官或后代。例如，根據(jù)本發(fā)明 的宿主細胞可以是任何細胞或生物體如植物細胞、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌、細菌細 胞、昆蟲細胞等等。在一個實施方案中，宿主和轉(zhuǎn)化的細胞可以包括來自以下的細胞：植物、 曲霉屬、酵母、昆蟲、細菌和藻類。具有特定興趣的植物組織和細胞包括，但不限于原生質(zhì) 體、愈傷組織、根、塊莖、種子、莖、葉、幼苗、胚和花粉。
[0092] 如本文中使用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)化的"是指其中被引入外源多核苷酸分子（例如構(gòu)建 體）中的細胞、組織、器官或生物體。引入的多核苷酸分子可被整合至受體細胞、組織、器官 或生物體的基因組DNA中，以使得被引入的多核苷酸分子被遺傳至后續(xù)的后代。"轉(zhuǎn)基因的" 或"轉(zhuǎn)化的"細胞或生物體也包括細胞或生物體的后代，以及產(chǎn)生于在雜交中應用這種轉(zhuǎn)基 因生物體作為母本并且顯示由外源多核苷酸分子的存在導致的改變表型的育種程序的后 代。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"是指含有一個或多個異源多核酸分子的細菌、真菌或植物。
[0093] 存在許多將多核酸分子引入植物細胞中的方法。該方法通?？梢园ㄟx擇合適的 宿主細胞、使用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞以及獲得轉(zhuǎn)化的宿主細胞的步驟。合適的方法包括 細菌感染（例如農(nóng)桿菌）、雙元細菌人工染色體載體、DNA的直接遞送（例如，通過PEG-介 導的轉(zhuǎn)化）、干燥/抑制介導的DNA攝取、電穿孔、用碳化硅纖維攪拌以及DNA涂覆顆粒的加 速等（綜述在 Potrykus等，Ann.Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. ,42:2051991 中）。
[0094] 將DNA分子引入細胞中的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。在本發(fā)明的實施中，通 過將植物DNA構(gòu)建體引入植物基因組中來轉(zhuǎn)化植物細胞的方法和材料可包括任何公知的 和證實的方法。任何轉(zhuǎn)化方法可以用于用本發(fā)明的一個或多個啟動子和/或構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿 主細胞。
[0095] 再生的轉(zhuǎn)基因植物可以進行自花授粉以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物。可選地， 從再生的轉(zhuǎn)基因植物獲得的花粉可與非轉(zhuǎn)基因植物雜交，優(yōu)選為農(nóng)學重要物種的自 交系。通常用于不同性狀和作物的育種方法的描述可見于幾本參考書中的一本， 參見，例如，Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley&Sons，NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98, 1960 ；Simmonds, Principles of crop improvement, Longman, Inc. , N Y, 369-399, 1979 ;Sneep 和 Hendriksen, Plant breeding perspectives, Wageningen(ed), Center for Agricultural Publishing and Documentation, 1979 ；Fehr, Soybeans:Impro vement, Production and Uses, 2nd Edition, Monograph. , 16:249, 1987 ；Fehr, Principles of variety development, Theory and Technique, (Vol I)和Crop Species Soybean(Vol 2) ,Iowa State Univ., Macmillan Pub. Co·, NY, 360-376, 1987。相反地，來自非轉(zhuǎn)基因植 物的花粉可用于給再生的轉(zhuǎn)基因植物授粉。
[0096] 可以分析轉(zhuǎn)化的植物的目標基因的存在以及本發(fā)明調(diào)控元件所賦予的表達水 平和/或表達譜。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道許多可用于分析轉(zhuǎn)化的植物的方法。例如，植物 分析的方法包括，但不限于Southern印跡法或northern印跡法、基于PCR的方法、生 化分析、表型篩選方法、田間評估以及免疫診斷分析。可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的表達可用 TaqMan⑧（Applied Biosystems, Foster City, CA)試劑和制造商描述的方法測量和 使用 TaqMan? Testing Matrix 確定 PCR 循環(huán)次數(shù)?？蛇x地，Invader? (Third Wave Technologies, Madison, WI)試劑和制造商描述的方法可用于評估轉(zhuǎn)基因表達。
[0097] 本發(fā)明植物的種子可從能繁殖的轉(zhuǎn)基因植物收獲并且用于生長本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植 物后代世代，包括包含本發(fā)明構(gòu)建體和表達具有農(nóng)學意義的基因的植物雜交系。
[0098] 本發(fā)明還提供本發(fā)明植物的部分。植物部分包括，但不限于葉、莖、根、塊莖、種子、 胚乳、胚珠和花粉。本發(fā)明還包括和提供包含本發(fā)明的核酸分子的轉(zhuǎn)化的植物細胞。
[0099] 轉(zhuǎn)基因植物可將轉(zhuǎn)基因多核苷酸分子傳遞至其后代。后代包括包含源自祖代植物 的轉(zhuǎn)基因的任何可再生的植物部分或種子。轉(zhuǎn)基因植物優(yōu)選對轉(zhuǎn)化的多核苷酸分子為純合 的，并且作為有性繁殖的結(jié)果將該序列傳遞至所有后代。后代可從產(chǎn)生于轉(zhuǎn)基因植物的種 子生長。然后，這些另外的植物可以進行自花授粉以產(chǎn)生植物的純育品系。來自這些植物 的后代特別地評估基因表達?；虮磉_可通過例如western印跡法、northern印跡法、免 疫沉淀和ELISA的幾種常見方法檢測。
[0100] 盡管已概括地描述了本發(fā)明，通過參考以下實施例將會更加容易地理解本發(fā)明， 除非特別說明，這些實施例僅是示例性的且并不意圖限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理 解，以下實施例中公開的技術(shù)代表了本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的技術(shù)以很好地實施本發(fā)明。但是，本領(lǐng) 域技術(shù)人員應該理解，根據(jù)本發(fā)明公開的內(nèi)容，可以對公開的【具體實施方式】做出許多改變， 并仍然會得到相同或相似的結(jié)果而不偏離本發(fā)明的精神和范圍，因此提出或顯示在所附附 圖中的所有內(nèi)容應被理解為示例性的而不是限制性的。 實施例
[0101] 實施例1
[0102] 從玉米分離的調(diào)控元件和相應的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組
[0103] 調(diào)控元件從玉米分離，且構(gòu)建包含玉米調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組（EXP)序 列。
[0104] 玉米種子在美國北部在早至四月初的早植對玉米種子造成潛在有害的風險。例 如，長期的冷和濕田間條件可能阻止最佳萌發(fā)和成苗（seedling establishment)。通過轉(zhuǎn) 錄物譜分析和后續(xù)的表征，鑒定了幾種候選基因，其顯示可用于種子發(fā)育和萌發(fā)的表達模 式。來自候選基因的啟動子和前導序列（此處分別稱為P-Zm. Nac-1:1:2 (SEQ ID N0:3)和 L-Zm. Nac-1:1:1(SEQ ID NO:4))從玉米基因組DNA擴增并克隆和測序。
[0105] 基于專有和公共的基因組和EST序列設(shè)計擴增引物，其然后用于按照制造商的方 案構(gòu)建的GenomeWalker?(Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, CA)文庫以克隆相 應基因組DNA序列的5'區(qū)域。使用這一序列，調(diào)控元件通過生物信息學方式在基因的5' 區(qū)域內(nèi)鑒定。利用這一分析的結(jié)果，調(diào)控元件定義在基因編碼序列上游的5'序列內(nèi)。然后 設(shè)計引物以擴增調(diào)控元件。各調(diào)控元件的相應DNA分子使用包含獨特限制性酶位點的引物 和從玉米分離的基因組DNA利用標準PCR條件擴增。這一克隆的序列包含玉米基因的蛋白 質(zhì)編碼區(qū)域上游的啟動子和5' UTR序列。所得的DNA片段使用標準DNA克隆方法接合到基 礎(chǔ)植物表達載體中并測序。
[0106] 鑒定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組（"EXP"）的序列在本文中提供為SEQ ID NO: 1、6和 8,如以下表1中所列的。啟動子序列在本文中提供為SEQ ID N0:2。前導序列在本文中提 供為SEQ ID N0:3。內(nèi)含子序列在本文中提供為SEQ ID N0:4、6和8。
[0107] 表1.從各種草物種分離的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組（"EXP")、啟動子、前導序列和內(nèi) 含子
[0108]

【權(quán)利要求】
1. 一種DNA分子，其包含選自下組的DNA序列： a) 與SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一具有至少85%序列同一性的序列； b) 包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的序列；和 c) SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有基因調(diào)控活性； 其中所述序列與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接。
2. 權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述序列與SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的DNA 序列具有至少90 %的序列同一性。
3. 權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述序列與SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的DNA 序列具有至少95 %的序列同一性。
4. 權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述DNA序列包含基因調(diào)控活性。
5. 權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子包含具有農(nóng)學意義的基 因。
6. 權(quán)利要求5的DNA分子，其中所述具有農(nóng)學意義的基因賦予植物除草劑耐受性。
7. 權(quán)利要求5的DNA分子，其中所述具有農(nóng)學意義的基因賦予植物害蟲抗性。
8. -種轉(zhuǎn)基因植物細胞，包含含有選自下組的序列的異源DNA分子： a) 與SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一具有至少85%序列同一性的序列； b) 包含SEQ ID NO: 1、2、3、4、6或8中任一的序列；和 c) SEQ ID N0:l、2、3、4、6或8中任一的片段，其中所述片段具有基因調(diào)控活性； 其中所述序列與異源可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子可操作地連接。
9. 權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述轉(zhuǎn)基因植物細胞是單子葉植物細胞。
10. 權(quán)利要求8的轉(zhuǎn)基因植物細胞，其中所述轉(zhuǎn)基因植物細胞是雙子葉植物細胞。
11. 一種轉(zhuǎn)基因植物或其部分，其包含權(quán)利要求1的DNA分子。
12. 權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物的后代植物或其部分，其中所述后代植物或其部分包含 所述DNA分子。
13. -種轉(zhuǎn)基因種子，其中所述種子包含權(quán)利要求1的DNA分子。
14. 一種轉(zhuǎn)基因盒，其包含選自SEQ ID NO: 1、6和8的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組，其中 所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組與異源編碼序列可操作地連接，該異源編碼序列與選自SEQ ID NO: 10、11、12和13的3'UTR可操作地連接。
15. 權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因盒，其包含如SEQ ID NO: 1所示的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組，其 中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組與異源編碼序列可操作地連接，該異源編碼序列與如SEQ ID NO: 10所示的3' UTR可操作地連接。
16. 權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因盒，其包含如SEQ ID N0:6所示的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組，其 中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組與異源編碼序列可操作地連接，該異源編碼序列與選自SEQ ID NO: 11和12的3' UTR可操作地連接。
17. 權(quán)利要求14的轉(zhuǎn)基因盒，其包含如SEQ ID N0:8所示的轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組，其 中所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達元件組與異源編碼序列可操作地連接，該異源編碼序列與選自SEQ ID NO: 12和13的3' UTR可操作地連接。
18. -種生產(chǎn)商品的方法，包括獲得根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物或其部分，和從該 轉(zhuǎn)基因植物或其部分生產(chǎn)所述商品。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述商品是蛋白質(zhì)濃縮物、蛋白質(zhì)分離物、籽粒、淀粉、種 子、粗粉、面粉、生物質(zhì)或種子油。
20. -種表達可轉(zhuǎn)錄多核苷酸分子的方法，包括獲得根據(jù)權(quán)利要求11的轉(zhuǎn)基因植物并 栽培植物，其中所述可轉(zhuǎn)錄多核苷酸被表達。
【文檔編號】C12N5/14GK104364370SQ201380031796
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2013年4月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年4月20日
【發(fā)明者】J·阿倫斯, S·徹里安, P·J·羅伊達, L·L·路非亞, W·吳, 謝嘉麗 申請人:孟山都技術(shù)公司