用于cd4+t細(xì)胞群之抗原特異性擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)化離體平臺的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及出于免疫診斷或治療目的，用于以抗原特異性的方式分離和擴(kuò)增人T細(xì)胞群的方法、肽、核酸和細(xì)胞。本發(fā)明還涉及衍生自人多能干細(xì)胞的專職抗原呈遞細(xì)胞，以及通過所述抗原呈遞細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的可定制抗原呈遞。
【專利說明】用于CD4+T細(xì)胞群之抗原特異性擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)化離體平臺
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年5月8日提交的序列號為61/644265的美國申請的優(yōu)先權(quán)，并 且其公開內(nèi)容通過引用包括在本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及出于免疫診斷或治療目的，用于以抗原特異性的方式分離和擴(kuò)增人 T細(xì)胞群的方法、肽、核酸和細(xì)胞。本發(fā)明還涉及衍生自人多能干細(xì)胞的專職抗原呈遞 細(xì)胞（professional antigen presenting cell),以及通過抗原呈遞細(xì)胞實(shí)現(xiàn)的可定制 (customizable)抗原呈遞。

【背景技術(shù)】
[0004] CD4+T細(xì)胞在適應(yīng)性免疫中作為炎癥、耐受性的介導(dǎo)者和作為B細(xì)胞成熟的促進(jìn)者 發(fā)揮重要作用（Pao等，1996 ;Klein等，2010)。人⑶4+T細(xì)胞庫包含以百萬計的不同的細(xì)胞， 這些細(xì)胞表達(dá)不同的T細(xì)胞受體（TCR)。的確，許多人類病癥涉及CD4+T細(xì)胞的離散亞群， 其響應(yīng)于高特異性抗原而增殖，并且分離可能與特定疾病相關(guān)的小比例的CD4+細(xì)胞是一項 艱巨的任務(wù)。因此，在臨床或治療條件（setting)中尚未能實(shí)現(xiàn)具有應(yīng)答特定肽之TCR的 CD4+T細(xì)胞的常規(guī)分離或表征。
[0005] 由T細(xì)胞群所示出的巨大TCR庫是在胸腺發(fā)育期間存在于胸腺的未成熟T細(xì)胞 的阿爾法（α)和貝塔（β)，或者伽馬（ Y)和德爾塔（S)TCR基因體細(xì)胞重組事件的結(jié)果 (Haas等，1993 ;Hayday等，1995)。該重組過程產(chǎn)生了具有以百萬計的不同TCR組合的T細(xì) 胞庫，其集體地與每個可能的氨基酸序列結(jié)合（Haas等，1993 ;Hayday等，1995)。該庫在靜 息狀態(tài)通過血管和淋巴系統(tǒng)循環(huán)，直到T細(xì)胞遇到具有組織相容性復(fù)合物（HLA II類）的 專職APC(例如樹突細(xì)胞（DC))，所述專職APC呈遞以適當(dāng)?shù)挠H和力與其TCR結(jié)合的肽（Wen 等，1998 ;Sakaguchi等，2000 ;Huang等，2012)。細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞之間形成的免疫突觸刺 激增殖，從而產(chǎn)生數(shù)十到數(shù)千個克隆。新產(chǎn)生的T細(xì)胞離開次級淋巴器官，借助循環(huán)通過身 體并且在呈遞抗原的部位積聚?；罨腃D4+T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，所述細(xì)胞因子作用于鄰 近的細(xì)胞并協(xié)調(diào)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。數(shù)天后，在抗原的來源被減弱后，大多數(shù)克隆通過激活誘 導(dǎo)的細(xì)胞死亡而消除，少數(shù)作為記憶細(xì)胞（準(zhǔn)備好只要抗原（病原體）再次出現(xiàn)即觸發(fā)快 速應(yīng)答）保留的克隆除外（Wen等，1998 ;Villadangos等，2005)。
[0006] 從新鮮全血中分離的許多CD4+T細(xì)胞將分裂一次或兩次，但為了臨床應(yīng)用目的的 實(shí)現(xiàn)需要額外的增殖周期。例如，在測定期間相對穩(wěn)健地分裂（例如，超過5次）的CD4+T 細(xì)胞的比例可用于指示對未知肽的反應(yīng)性。包含單一的蛋白質(zhì)或肽的不同片段的組可以用 來創(chuàng)建與響應(yīng)于該抗原的CD4+T細(xì)胞有關(guān)的增殖譜。然后從這些結(jié)果推導(dǎo)的信息可用于確 定多種人類病癥的狀態(tài)和可能的作用進(jìn)程。然而，CD4+T細(xì)胞的臨床表征受到成功擴(kuò)增抗原 特異性CD4+T細(xì)胞群所需的適當(dāng)?shù)腁PC之制備的可用性和可變性的限制。
[0007] 使分離或表征抗原特異性CD4+T細(xì)胞群的診斷和治療方法的開發(fā)進(jìn)一步復(fù)雜化的 是人群中的人HLA-DR受體的異質(zhì)性。簡言之，II類HLA復(fù)合物包含HLA-DRB和HLA-DRA 受體的異源二聚體，其形成含有肽的結(jié)合口袋（binding pocket)。人群中包含數(shù)十種，也 許數(shù)百種不同的HLA-DRB等位基因。因此，在人群中，大量的HLA II類等位基因與以百萬 計的可能的TCR組合相組合，使得技術(shù)上難以從病源T細(xì)胞驅(qū)動的自身免疫病癥中分離抗 原特異性CD4+T細(xì)胞（Villdangos等，2005 ;Huang等，2012)，例如I型糖尿?。℉askins等， 2011 ;Goianovich 等，2012 ;Delong 等，2012)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Nikken 等，2011 ;Albani 等，2011)和多發(fā)性硬化（McFarland 等，2007 ;Codarri 等，2012 ;Sallusto 等，2012)。簡而 言之，在一個人中與給定肽結(jié)合的TCR在另一人中可能不與相同的肽結(jié)合，這是因為個體 表達(dá)不同的HLA-DRB等位基因，從而致使通用探針的開發(fā)復(fù)雜化而且在某種程度上難以再 現(xiàn)。然而，HLA-DRA等位基因只有兩個，其中一個見于98%的人群中。因此，利用廣泛表達(dá) 的HLA-DRA等位基因評估特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的方法將適用于絕大部分人群。
[0008] 因此，鑒于上述討論，本文中描述的組合物和方法用于提供對⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行 標(biāo)準(zhǔn)化分析的平臺。這些方法和組合物包括一個分化方案，其由人胚胎干細(xì)胞（hESC)有效 地產(chǎn)生髓系樹突細(xì)胞（DC)，其可用于刺激從全血中分離的抗原特異性⑶4+T細(xì)胞?？傊?，雖 然CD4+T細(xì)胞的臨床表征受到原代樹突細(xì)胞（DC)制備的可變性的限制，但是使用干細(xì)胞衍 生的DC，通過提供一種充分表征的并且功能上可修改的APC群來分析T細(xì)胞對任何給定抗 原的應(yīng)答避免了這個問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了利用人胚胎干細(xì)胞（hESC)衍生的樹突細(xì)胞以抗原特異性的方式離 體刺激CD4+T細(xì)胞群增殖的組合物和方法。本發(fā)明的樹突細(xì)胞是可定制的，因為任何可想到 的驅(qū)動抗原特異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的肽抗原均可被呈遞到樹突細(xì)胞的表面，并用于表征特 異性CD4+T細(xì)胞應(yīng)答。因此，本發(fā)明包括任何用于對在多個對象個體中對特定抗原的免疫應(yīng) 答進(jìn)行比較或者在同一對象中在不同時間對特定抗原的免疫應(yīng)答進(jìn)行比較的標(biāo)準(zhǔn)化方法。 類似地，本發(fā)明提供了為了多種其他目的擴(kuò)增抗原特異性CD4+T細(xì)胞群的方法，例如用作細(xì) 胞疫苗或作為可以被重新引入到患者的活化的CD4+T細(xì)胞群以治療可通過增強(qiáng)對特定肽靶 標(biāo)之免疫應(yīng)答緩解的疾病。例如，在某一抗原特異性CD4+T細(xì)胞群被認(rèn)為有利但數(shù)目不足 的情況下，可以體外擴(kuò)增那些細(xì)胞并將其返回至對象。此外，在其中高增殖性⑶4+T細(xì)胞被 認(rèn)為有害（例如，自身免疫）的情況下，可體外擴(kuò)增那些細(xì)胞并將其重編程為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 (Treg)，其在返回到對象時將抑制那些特異性T細(xì)胞應(yīng)答。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)包括但不限于，使用相對少量的血液從任何人中鑒別和分離人 CD4+T細(xì)胞亞群的能力。本發(fā)明的用途可包括但不限于，表征對疫苗的應(yīng)答，以及診斷和/或 治療涉及CD4+T細(xì)胞應(yīng)答和/或CD4+T細(xì)胞庫變化的人疾病。例如，本發(fā)明提供了用于診斷 和治療以下疾病的方法和組合物：阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化、狼瘡、銀屑病、獲得性免疫缺 陷綜合征（AIDS)、重癥綜合性免疫缺陷綜合征（SCID)、重癥肌無力、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型 糖尿病、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、橋本腦炎、多肌炎、舍格倫綜合征、克羅恩病、橫貫性脊 髓炎、血管炎、韋格納肉芽腫病、帕金森病、肌營養(yǎng)不良、白癜風(fēng)、自身免疫性心臟病、腹腔疾 病、吉蘭-巴雷綜合征、發(fā)作性睡病、病因不明的自身免疫性疾病、自閉癥和過敏。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1舉例說明了 hESC向共同髓系祖細(xì)胞的分化，其包括：
[0012] (A)示出光滑邊緣的多能hESC (H9)集落的顯微照片；(B)表明H9細(xì)胞多能性的 SSEA4免疫染色的流式細(xì)胞術(shù)直方圖；（C)平板接種（plating)后不久30至50個hESC細(xì) 胞的小團(tuán)塊附著到0P9細(xì)胞上；(D)hESC/0P9共培養(yǎng)4天后分化的集落；(E)共培養(yǎng)8天 后示出大的分化集落；(F)流式細(xì)胞術(shù)直方圖示出共培養(yǎng)8天后，分離自集落的CD34+細(xì)胞 (紅色），同種型對照是黑色；(G)在平板接種到pHEM包被的培養(yǎng)瓶1天后，單細(xì)胞懸液重 新形成聚集體；(H)是（G)的插圖，示出具有南瓜形無顆粒形態(tài)的髓系細(xì)胞的大聚集體，且 0P9細(xì)胞沒有附著在經(jīng)包被的培養(yǎng)瓶上并經(jīng)歷細(xì)胞凋亡；（I)在含GM-CSF的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3天后，大多數(shù)髓系細(xì)胞開始從聚集體分離，培養(yǎng)物中出現(xiàn)單個的CMP ; (J-L)流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn) 狀圖示出⑶34和⑶45的相對表達(dá)，包括（J)⑶341。/⑶45hi群由第一天的2-4%增加至（K) 第三天的20-30%，以及（L)第12天的60-70% ; (M) J-L的同種型對照；(N) 12天后CD45+ 染色的直方圖；和（O)CMP分化和擴(kuò)增12天后CD43+免疫染色的直方圖。標(biāo)尺=10微米。
[0013] 圖2舉例說明了由圖1中舉例說明的干細(xì)胞標(biāo)志物（HSC)向共同髓系祖細(xì)胞分化 的十二天期間內(nèi)，HSC的表達(dá)減少而髓系細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)增加。在直方圖中，抗原和同種 型對照分別用紅色和黑色表示。
[0014] 圖3舉例說明了 hESC衍生的樹突細(xì)胞（DC)的形態(tài)和功能活性，包括：(A)用 GM-CSF和IL-4培養(yǎng)10天后，顯著比例的細(xì)胞分化為未成熟（i)DC，其（箭頭）比未分化的 CMP (楔形）更大更亮；(B)顯微照片顯示被iDC吞噬羧化物修飾的紅色熒光乳膠珠（2微米 大?。?，明場圖像的熒光疊加示出iDC中的熒光珠（箭頭）；(C)前側(cè)散射和側(cè)向散射（FSC/ SSC)的點(diǎn)狀圖示出具有內(nèi)化珠的iDC ;⑶流式細(xì)胞術(shù)的直方圖顯示由iDC內(nèi)化的紅色熒 光珠（FL4通道）；(E)用TNF- α和LPS刺激了 72個小時的iDC的圖像；(F)是B框住的細(xì) 胞的插圖，箭表示長突起（processes)以及成熟DC的形態(tài)；(G)使用霍夫曼光學(xué)顯示的成 熟DC的DIC圖像；(H)成熟DC的蘇木精染色示出長樹枝狀突起（箭）和暗紫色的核；（I) 流式細(xì)胞術(shù)顯示用TNF- α和LPS誘導(dǎo)成熟iDC的DC標(biāo)志（DCsign)免疫染色（紅色）和 未用TNF- α和LPS誘導(dǎo)成熟iDC的DC標(biāo)志免疫染色（藍(lán)色）；（J)流式細(xì)胞術(shù)示出DC成 熟之后CD80+免疫染色增加；(K) TNF- α和LPS誘導(dǎo)成熟后CD86+免疫染色；和（L)在成熟 DC上HLA-DR的表面表達(dá)。
[0015] 圖4舉例說明了流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果，示出在CMP向DC分化期間的第8、12、和14天， DC標(biāo)志物的表達(dá)。在第12天時給出了 DC成熟的因素。在該直方圖中，抗原和同種型對照 分別用紅色和黑色表示。
[0016] 圖5舉例說明了 hESC衍生的DC需要兩個群以形成激活島（islandsof activation，Ι0Α)，包括：(A)用于處理DC以與T細(xì)胞共培養(yǎng)的方案的示意圖；(B)iDC的 流式細(xì)胞術(shù)點(diǎn)狀圖，示出FSC/SSC點(diǎn)狀圖上選通的群；(C)在B中選通之群的DC標(biāo)志/ FSC圖，Q1-UR(42.8%)是DC標(biāo)志+細(xì)胞。（D)在圖B中選通之群的⑶14+/FSC點(diǎn)狀圖， Q5-UR(51.3% ); (E)DC標(biāo)志的點(diǎn)狀圖：CD14示出 CDHltVDC標(biāo)志 hi 與 CD14hi/DC標(biāo)志 lQ 的 比例為1 : 1.5,定義為比例均衡的DC; (F)DC與成熟因子混合的顯微照片，示出激活島 (IOA) ; (G)IOA的高倍率明場圖像；(H)IOA的相差圖像，注意薄的邊緣；（I)用抗-⑶14的磁 性微珠純化的DC不包括DC標(biāo)志hV⑶141°群，（J)不形成IOA; (K)用抗-DC標(biāo)志MACS微珠 純化的DC不包括DC標(biāo)志VCDHhi群，和（L)不形成IOA。
[0017] 圖6舉例說明了⑶4+T細(xì)胞的純化和用成熟DC刺激，其包括：(A)概述從全血中 純化T細(xì)胞的示意圖；(B)流式細(xì)胞術(shù)的點(diǎn)狀圖（FSC/SSC)顯示選通的T細(xì)胞群，和（C)直 方圖顯示選通之群的抗CD4免疫染色；(D)經(jīng)純化T細(xì)胞的低倍率顯微照片顯示出均一的 形態(tài)。（E)直方圖示出第0天CD4+T細(xì)胞的CFSE免疫染色及（F)與DC和IL-2共培養(yǎng)十天 后，其示出隨著每次細(xì)胞分裂，子代細(xì)胞的熒光減半，如在從1至7次每次的細(xì)胞分裂由紅 色數(shù)字所指示；(G)由Dil標(biāo)記的T細(xì)胞和DC組成的激活島的照片；(H)使用DAPI對細(xì)胞 進(jìn)行核染色，將假著色的紅色作為對照，示出中間的大DC核和周界附近的小T細(xì)胞核；（I) 是（G)和⑶的合并圖像；(J)用IL-2和來自標(biāo)準(zhǔn)制備物的DC孵育的CD4+T細(xì)胞中CFSE 熒光的直方圖，和（K)DC標(biāo)志純化的制備物，和（L)CDH純化的制備物。
[0018] 圖7舉例說明了 DC-誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的分析，包括：(A)三個直方圖顯示在接種 疫苗之前從人對象（對象1至3)中分離的并且已與hESC衍生的DC共培養(yǎng)之⑶4+T細(xì)胞的 CFSE熒光，所述hESC衍生的DC已被預(yù)先加載（pre-loaded) 了流感肽（INF，藍(lán)色）或無肽 (對照，紅色）；(B)三個直方圖顯示接種流感疫苗1周后從同一對象中分離的并且已與已 被預(yù)先加載流感肽（INF，藍(lán)色）或無肽（對照，紅色）的DC共培養(yǎng)之CD4+T細(xì)胞的CFSE熒 光；（C)與對照DC(對照）共培養(yǎng)的疫苗接種后CD4+T細(xì)胞CFSE熒光的三個直方圖，其中虛 線表示從含IL-2的同伴培養(yǎng)物（companion culture)計算的第五次細(xì)胞分裂；(D)與已被 預(yù)先加載流感肽（INF)的DC共培養(yǎng)的疫苗接種后CD4+T細(xì)胞的CFSE熒光；(E)柱狀圖示出 在接種流感疫苗之前和之后三個人對象的CD4+T細(xì)胞的相對增殖（分裂5至7次）。白色 柱表示在含預(yù)先加載流感肽（INF)之DC的培養(yǎng)物中CD4+T細(xì)胞的增殖；黑色柱表示含有未 加載肽（對照）之DC培養(yǎng)物中⑶4+T細(xì)胞的增殖；(F)柱狀圖顯示在三個對照對象（cl至 3)和六個診斷推定為患有阿爾茨海默病的對象（AD1至6)中CD4+T細(xì)胞的增殖（5到7次 分裂）。白色柱表示在含有預(yù)先加載人A β 1-42肽之DC的培養(yǎng)物中CD4+T細(xì)胞的增殖（5 至7次分裂）；黑色柱表示含有未預(yù)先加載肽之DC的培養(yǎng)物中CD4+T細(xì)胞的增殖（5至7次 分裂）。
[0019] 圖8示出pCR8/GW-T0P0-HLADRA+接頭載體的質(zhì)粒圖譜。
[0020] 圖9示出HLA-DRA的全長DNA和氨基酸序列。
[0021] 圖10示出[Genbank登錄號CAI18477. 1](人淀粉樣蛋白β )的全長DNA序列和 氨基酸序列。
[0022] 圖11示出HLA-DRA/Αβ 1-13融合蛋白的氨基酸序列，其包含信號肽（No. 1)、信號 肽切割位點(diǎn)（No. 2)、A β 1-13 (No. 3)、接頭（No. 4)和 HLA-DRA (No. 5)。
[0023]圖12示出HLA-DRA/Αβ 7-13融合蛋白的氨基酸序列，其包含信號肽（No. 1)、信號 肽切割位點(diǎn)（No. 2)、A β 7-13 (No. 3)、接頭（No. 4)和 HLA-DRA (No. 5)。
[0024]圖13示出HLA-DRA/A β 16-30融合蛋白的氨基酸序列，其包含信號肽（No. 1)、信號 肽切割位點(diǎn)（No. 2)、A β 16-30 (No. 3)、接頭（No. 4)和 HLA-DRA (No. 5)。
[0025]圖14示出HLA-DRA/A β 24-35融合蛋白的氨基酸序列，其包含信號肽（No. 1)、信號 肽切割位點(diǎn)（No. 2)、A β 24-35 (No. 3)、接頭（No. 4)和 HLA-DRA (No. 5)。
[0026]圖15示出HLA-DRA/Αβ 31-42融合蛋白的氨基酸序列，其包含信號肽（No. 1)、信 號肽切割位點(diǎn)（No. 2)、Αβ 31-42 (No. 3)、接頭（No. 4)和 HLA-DRA(No. 5)。該 Αβ 31-42 包含 T411替換。
[0027]圖16示出HLA-DRA/Αβ 7-23融合蛋白的氨基酸序列，其包含信號肽（No. I)、信號 肽切割位點(diǎn)（No. 2)、A β 7-23 (No. 3)、接頭（No. 4)和 HLA-DRA (No. 5)。
[0028] 圖17示出HLA-DRA/A β 1-13融合構(gòu)建體的DNA和氨基酸序列。
[0029] 圖18示出HLA-DRA/Aβ7-13融合構(gòu)建體的DNA和氨基酸序列。
[0030] 圖19示出HLA-DRA/A β 16-30融合構(gòu)建體的DNA和氨基酸序列。
[0031] 圖20示出HLA-DRA/A β 24-35融合構(gòu)建體的DNA和氨基酸序列。
[0032] 圖21示出HLA-DRA/A β 31-42融合構(gòu)建體的DNA和氨基酸序列。
[0033] 圖22示出HLA-DRA/A β 7-23融合構(gòu)建體的DNA和氨基酸序列。
[0034] 圖23示出感染了改造為表達(dá)任一綠色熒光蛋白（GFP)(其充當(dāng)載體對照，泳道1) 和下面的各HLA-DRA/Αβ融合蛋白之慢病毒的293細(xì)胞之細(xì)胞裂解物的Western印跡，分 別是出1^-〇狀/^0 1-13(泳道2);!11^-〇狀/^0 7-13(泳道3);!11^-〇狀/^0 16-3〇(泳道4); HLA-DRA/A β 24-35 (泳道 5)，和 HLA-DRA/A β 31-42 (泳道 6)。
[0035] 圖24示出在人樹突細(xì)胞系KG-I中表達(dá)的重組HLA-DRA構(gòu)建體的表面表達(dá)。左上 方顯示具有所示選通的KG-I細(xì)胞的FDC/SSC散點(diǎn)圖。上部中圖顯示，在無刺激的條件下， KG-I細(xì)胞的抗HLA-DRA免疫染色。右上圖顯示，LPS刺激后KG-I細(xì)胞的抗HLA-DRA免疫染 色。與感染了表達(dá)HLA-DRA/Ai3 7-13的慢病毒的細(xì)胞（藍(lán)色）相比，對照細(xì)胞（紅色）示 出較少的HLA-DRA染色。同種型對照染色在所有圖中用黑色顯示。下方四個圖示出感染含 有上述 HLA-DRA/A β 7-13、HLA-DRA/A β 16-30、HLA-DRA/A β 24-35 和 HLA-DRA/A β 31-42 之 慢病毒載體的KG-I細(xì)胞的HLA-DRA免疫染色類似的增加。
[0036] 圖25示出：(A)FSC/SSC散點(diǎn)圖表示在那些細(xì)胞的混合物中檢測到hESC-衍生的 髓系樹突細(xì)胞（DC)和從一個或更多個新鮮血液樣品分離的T細(xì)胞。在流式細(xì)胞儀分析之 前，用CFSE預(yù)先標(biāo)記T細(xì)胞，然后與DC混合，接著混合物中的所有細(xì)胞用與熒光綴合的抗 ⑶4染色。在這一步中fsc/ssc用來將潛在的T細(xì)胞與其它選通出來的群（包括DC和非 DC)分離。我們未證明它們是DC。熒光標(biāo)記的⑶4+細(xì)胞從一個較小的亞群中選通。并不 是所有在DC群中的檢測事件都是實(shí)際上的DC; (B)僅（A)所示的CD4+T細(xì)胞群的T細(xì)胞 選通的FSC/SSC散點(diǎn)圖；(B)中描述了⑶4+T細(xì)胞群的散點(diǎn)圖（X軸為CFSE熒光，y軸為抗 ⑶4)顯示已分裂（S卩，增殖）的T細(xì)胞中包含較少的CFSE，從而由圖左側(cè)表示細(xì)胞群，并且 在實(shí)驗開始時沒有可測量的增殖，因此在左邊沒有細(xì)胞；(D)示出（C)中所示的散點(diǎn)圖，只 是T細(xì)胞和DC的混合物在進(jìn)行分析之前在對照條件下（T細(xì)胞與不表達(dá)HLA-DRA(Ab)構(gòu)建 體的DC-起培養(yǎng)）或試驗條件下（T細(xì)胞與表達(dá)HLA-DRA(Ab)構(gòu)建體的DC-起培養(yǎng)）一 起培養(yǎng)十天。對照的細(xì)胞群，其被表示為綠色的事件，具有其CD4+T細(xì)胞總?cè)旱?. 6% (圖 左側(cè)描繪的），即，圖的這一側(cè)示出的是分裂的細(xì)胞。實(shí)驗的細(xì)胞群，其被表示為紅色的事 件，具有其⑶4+T細(xì)胞總?cè)旱?. 6% (圖左側(cè)描繪的）。3. 8和2. 6之間的差異表示Αβ特 異性T細(xì)胞群。圖25(E)示出已感染了被改造以表達(dá)HLA-DRA構(gòu)建體（分別含有全長Αβ、 Al (Α β 1-13)、Β2 (Α β 7-13)、C3 (Α β 16-30)、D4 (Α β 24-35)或 Ε5 (Α β 1-42))之慢病毒的 CD4+T細(xì)胞群的FSC/SSC散點(diǎn)圖（χ軸為CFSE熒光，y軸為抗CD4)。
[0037] 圖26顯示從具有Ap〇E3/E3基因型，并且沒有癡呆跡象的47歲男性之血液中分離 的⑶4+T細(xì)胞的細(xì)胞增殖響應(yīng)的柱狀圖。該⑶4+T細(xì)胞與hESC衍生的已感染了被改造以 表達(dá)HLA-DRA構(gòu)建體之慢病毒的DC共培養(yǎng)，所述HLA-DRA構(gòu)建體分別包含僅HLA-DRA (對 照）、A1 (A β 1-13)、B2 (A β 7-13)、C3 (A β 16-30)、D4 (A β 24-35)或 E5 (A β 1-42)。柱代表經(jīng) 歷5次或更多次細(xì)胞分裂的細(xì)胞的比例，S卩，指示一個持續(xù)和特定的增殖響應(yīng)。
[0038] 圖27示出與圖26所示相同類型的數(shù)據(jù)，只是供血者是一位具有Αρ 〇Ε3/Ε3基因型 的、沒有阿爾茨海默病跡象的88歲男性。
[0039] 圖28示出與圖26所示相同類型的數(shù)據(jù)，只是供血者是一位具有Αρ 〇Ε4/Ε4基因型 的、已被診斷出患有阿爾茨海默病14年的86歲女性。
[0040] 圖29示出與圖26所示相同類型的數(shù)據(jù)，只是供血者是一位具有ΑΡΟΕ3/Ε4基因型 的58歲的女性，并且是一位患有晚期阿爾茨海默病的母親的女兒。該供血者是圖30和圖 31中供血者的姐姐/妹妹。
[0041] 圖30示出與圖26所示相同類型的數(shù)據(jù)，該供血者是圖29圖和圖31中供血者56 歲的妹妹，和她姐姐一樣，具有ΑΡ0Ε3/Ε4基因型。
[0042] 圖32示出與圖26所示相同類型的數(shù)據(jù)，該供血者是圖30和圖31中供血者的61 歲的姐姐。和她妹妹一樣，具有ΑΡ0Ε3/Ε4基因型。

【具體實(shí)施方式】
[0043] 本文所公開的本發(fā)明的方法和組合物涉及到評估人對象對多種肽抗原的免疫應(yīng) 答。換言之，本發(fā)明涉及一種用于對多個對象個體中對特定抗原免疫應(yīng)答進(jìn)行比較或者在 同一對象中在不同的時間對特定抗原的免疫應(yīng)答進(jìn)行比較的標(biāo)準(zhǔn)化方法。本發(fā)明包括在人 II類白細(xì)胞（HLA)的環(huán)境下對通過抗原呈遞細(xì)胞（APC)呈遞之任何肽抗原的免疫應(yīng)答的分 析。本發(fā)明還特別涉及評估免疫應(yīng)答的CD4+T細(xì)胞組分。
[0044] 在多個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法將人胚胎干細(xì)胞（hESC)分化為成熟的專 職APC。例如，本發(fā)明的方法可以誘導(dǎo)hESC分化為共同的髓系祖細(xì)胞，其進(jìn)而可以分化 為未成熟樹突細(xì)胞，并且然后進(jìn)一步分化為成熟樹突細(xì)胞。在多個實(shí)施方案中，本發(fā)明 使H9hESC分化；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇使用本領(lǐng)域中已知的任何人多能干細(xì) 胞。例如，胚胎干細(xì)胞可以選自胚胎干細(xì)胞系或者可以直接獲自原代胚胎組織。已經(jīng)建立 了多種胚胎干細(xì)胞系，包括但不限于：HI、H7、H9、H13和H14(Thompson等）；hESBGN-01、 hESBGN-02、hESBGN-03 (BresaGen 公司，Athens，Ga.) ;HES-l、HES-2、HES-3、HES-4、HES-5、 HES_6(ES Cell International 公司，Singapore) ;HSF-1、HSF_6(舊金山加利福尼亞大 學(xué));13、14、16(Technion-Israel Institute of Technology, Haifa, Israel) ;UCSF_1 和 UCSF-2(Genbacev 等，F(xiàn)ertil.Steril. 83(5) :1517-29,2005) ;HUES 1-17 系（Cowan 等，NEJM 350(13) :1353-56,2004);和 ACT-14 系（Klimanskaya 等，Lancet，365 (9471): 1636-41,2005)〇
[0045] 如上所述，本發(fā)明的hESC衍生的成熟樹突細(xì)胞在HLA II類分子的情況中主要呈 遞單個肽抗原的片段。在本發(fā)明的APC上呈遞的肽可以是由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇的為了 評估針對包含該肽之抗原的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答特異性的任意肽。在多個實(shí)施方案中，所述抗 原包含的肽是疫苗組合物的組分。例如，在多個實(shí)施方案中，抗原性肽包含流感HA的氨 基酸126至138(即，NH 2-HNTNGVTAACSHE-〇H)，并且可在本發(fā)明的方法中用以評估已施用 FUJIAVAL·? ( 一種由GlaxoSmithKline,PLC銷售的流感病毒疫苗）之對象中的CD4+T 細(xì)胞應(yīng)答。
[0046] 然而，由于本發(fā)明的方法涉及可用于對任何可引起CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的肽 的免疫應(yīng)答進(jìn)行評估的標(biāo)準(zhǔn)平臺，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本發(fā)明的方法來評 估⑶4+T細(xì)胞對任何可在對象中引起這樣的應(yīng)答的疫苗的應(yīng)答。因此，本發(fā)明可包 括本領(lǐng)域中已知的疫苗的實(shí)例，還包括用于炭疽病的AVA(BioThrax);用于水痘的 VAR(Varivax)和 MMRV(ProQuad);用于白喉的 DTaP (Daptacel、Infanrix、Tripedia)、 Td (Decavaca、generic)、DT (-generic-)、Tdap (Boostrix、Adacel)、DTaP-IPV (Kinrix)、 DTaP-IfepB-IPV(Pediarix)、DTaP-IPV/Hib (Pentacel)和 DTaP/Hib (TriHIBit);用于甲型 肝炎的 HepA(Havrix、Vaqta)和 HepA-HepB(Twinrix);用于乙型肝炎的 HepB (Engerix-B、 RecombiVaxHB)、Hib-HepB(Comvax)、DTaP-HepB-IPV(Pediarix)和 HepA-HepB(Twinrix); 用于 B 型流感嗜血桿菌的 Hib (ActHIB、PedvaxHIB、Hiberix)、Hib-HepB (Comvax)、DTaP/ Hib(TriHIBit)和 DTaP-IPV/Hib (Pentacel);用于人乳頭瘤病毒（HPV)的 HPV4 (Gardasil) 和 HPV2 (Cervarix);用于流行性感冒的 TIV (Afluria，Agriflu、Fluarix、Fluviriru Fluzone)和 LAIV(FluMist);用于日本腦炎（JE)的 JE (Ixiaro 和 JE-Vax);用于麻疫 的 MMR(M-M-RII)和 MMRV(ProQuad);用于腦膜炎的 MCV4 (Menactra)、MPSV4 (Menomune) 和MODC (Menveo);用于流行性腮腺炎的MMR(M-M-RII)和MMRV (ProQuad);用于百日咳 的 DTaP (Daptacel、Infanrix、Tripedia)、Tdap (Adacel、Boostrix)、DTaP-IPV(Kinrix)、 DTaP-HepB-IPV (Pediarix)、DTaP-IPV/Hib (Pentacel)和 DTaP/Hib (TriHIBit);用 于細(xì)菌性肺炎的 PCVT(Prevnar)、PCV13(Prevuarl3)和 PPSV23(Pneumovax 23);用 于脊髓灰質(zhì)炎的 Polio(Ipol)、DTaP-IPV(Kinrix)、DTaP-H印B-IPV(Pediarix)和 DTaP-IPV/Hib (Pentacel);狂犬病（Imovax Rabies 和 RabAvert);用于輪狀病毒的 RVl (Rotarix)和 RV5 (RotaTeq);用于風(fēng)疹的 MMR(M-M-RII)和 MMRV(ProQuad);用于帶 狀皰疫的ZOS(Zostavax);用于天花和猴痘的Vaccinia(ACAM2000、Dryvax);用于破傷 風(fēng)的 DTaP (Daptacel、Infanrix、Tripedia)、Td(Decavac、generic)、DT (-generic-)、 TT(-generic-) >Tdap(Boostrix>Adacel)>DTaP-IPV(Kinrix)>DTaP-HepB-IPV(Pediarix)> DTaP-IPV/Hib (Pentacel)和 DTaP/Hib (TriHIBit);用于肺結(jié)核（TB)的 BCG (TICE BCG、 Mycobax);用于傷寒的 Typhoid Oral (Vivotif)和 Typhoid Polysaccharide(Typhim Vi) 和用于黃熱病的YF (YF-Vax)。
[0047] 除了涉及疫苗的肽之外，本發(fā)明的方法也基于CD4+T細(xì)胞對與指定的自身免疫疾 病狀態(tài)相關(guān)聯(lián)的特定肽的反應(yīng)來對多種自身免疫疾病的治療進(jìn)展進(jìn)行診斷和追蹤。如本 文中所理解的，"自身免疫疾病"是由個體自身組織產(chǎn)生并且針對個體自身組織的疾病或 病癥。自身免疫性疾病或病癥的實(shí)例包括，但不限于：關(guān)節(jié)炎（類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、幼年型類 風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎）、卡普蘭綜合征、費(fèi)爾蒂氏綜合征、銀屑病、皮炎、舍 格倫綜合征、施蒂林病、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮壞死松解癥、全身性硬皮病和硬化、 與炎性腸病有關(guān)的口向應(yīng)（responses associated with inflammatory bowel disease)、 克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、呼吸窘迫綜合征、成人呼吸窘迫綜合征（ARDS)、腦膜炎、腦炎、葡 萄膜炎、結(jié)腸炎、腎小球腎炎、過敏性疾病、濕疹、哮喘、涉及T細(xì)胞的浸潤和慢性炎癥響應(yīng) 的病癥（conditions involving infiltration of T cells and chronic inflammatory responses)、動脈粥樣硬化、自身免疫性心肌炎、白細(xì)胞粘附缺陷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、 幼年型糖尿病、多發(fā)性硬化、過敏性腦脊髓炎、與由細(xì)胞因子和T-淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的急性和 遲發(fā)型超敏反應(yīng)相關(guān)的免疫應(yīng)答、結(jié)核病、結(jié)節(jié)病、包括韋格納肉芽腫病的肉芽腫病、粒 細(xì)胞缺乏癥、血管炎（包括ANCA)、再生障礙性貧血、戴-布貧血、包括自身免疫性溶血性 貧血（MBA)的免疫性溶血性貧血、惡性貧血、純紅細(xì)胞再生障礙（PRCA)、因子VIII缺乏 癥、血友病A、自身免疫性中性白細(xì)胞減少、全血細(xì)胞減少、白細(xì)胞減少、涉及白細(xì)胞滲出 的疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)炎性疾病、多器官損傷綜合征、重癥肌無力、抗原-抗體復(fù)合 物介導(dǎo)的疾病、抗腎小球基底膜病、抗磷脂抗體綜合征、變應(yīng)性神經(jīng)炎、白塞氏?。˙echet disease)、卡斯?fàn)柭C合征、古德帕斯丘綜合征、蘭伯特-伊頓肌無力綜合征、雷諾氏綜合 征（ReynaucT s syndrome)、舍格倫綜合征、史-約綜合征、實(shí)體器官移植排斥、移植物抗宿 主?。℅VHD)、類天皰瘡（pemphigoid bullous)、天皰瘡、自身免疫性多內(nèi)分泌腺病、萊特爾 氏病、僵人綜合征、巨細(xì)胞動脈炎、免疫復(fù)合物腎炎、IgA腎病、IgM多神經(jīng)病或IgM介導(dǎo)的神 經(jīng)病、特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP)、血栓性血小板減少性紫癜（TTP)、自身免疫性血小 板減少、睪丸和卵巢的自身免疫性疾病（包括自身免疫性睪丸炎和卵巢炎）、原發(fā)性甲狀腺 功能減退癥；自身免疫性內(nèi)分泌疾病，包括自身免疫性甲狀腺炎、慢性甲狀腺炎（橋本氏甲 狀腺炎）、亞急性甲狀腺炎、特發(fā)性甲狀腺功能減退癥、阿狄森氏病、格雷夫斯氏病、自身免 疫性多腺體綜合征（或者多腺體內(nèi)分泌病綜合征）、1型糖尿病也被稱為胰島素依賴性糖尿 ?。↖DDM)和席漢氏綜合征；自身免疫性肝炎、淋巴細(xì)胞間質(zhì)性肺炎（HIV)、閉塞性細(xì)支氣管 炎（非移植）和非特異性間質(zhì)肺炎（NSIP)、吉-巴綜合征、大血管血管炎（包括風(fēng)濕性多肌 痛和巨細(xì)胞（高安）動脈炎）、中血管血管炎（包括川崎氏病和結(jié)節(jié)性多動脈炎）、強(qiáng)直性 脊柱炎、貝爾熱病（IgA腎?。?、急進(jìn)性腎小球腎炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、口炎性腹瀉（麩質(zhì) 腸病）、冷球蛋白血癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥（ALS)、冠狀動脈疾病等。
[0048] 在多個實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法可用于評估CD4+T細(xì)胞庫對阿爾茨海 默肽淀粉樣蛋白-β (Αβ)的應(yīng)答。簡言之，Αβ是具有來源于蛋白水解處理淀粉樣前體 蛋白（APP)得到的42個氨基酸的多肽。如本文中所理解的，Αβ蛋白質(zhì)還包括突變體和 其通過氨基酸交換而衍生的等位基因變體。在多個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法使用可包含 A β 1-13、A β 7-13、A β 16-30、A β 24-35、A β 31-42 和 A β 7-23 的肽來替代全長 A β。
[0049] 在多個實(shí)施方案中，對所有Αβ肽廣泛和強(qiáng)烈的應(yīng)答表明正在進(jìn)行對Αβ和Αβ 所有片段的免疫應(yīng)答。本領(lǐng)域技術(shù)人員能解釋這樣的應(yīng)答是對積累的Αβ病理持續(xù)響應(yīng)的 指示，最終變得像無反應(yīng)性開始一樣變得較低強(qiáng)健，最終導(dǎo)致在阿爾茨海默病后期階段較 低強(qiáng)健的CD4+應(yīng)答。也就是說，對Αβ或者某些Αβ片段具有相對強(qiáng)健CD4+響應(yīng)的個體即 便可能沒有發(fā)現(xiàn)認(rèn)知上或行為上的改變，也將被認(rèn)為患前阿爾茨海默病。
[0050] 通常，在本發(fā)明的方法中可使用任何可使APC優(yōu)選地呈遞特定單一肽片段的方 法。例如，在多個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法通過直接向APC培養(yǎng)物中添加足量的肽以以使 APC的HLA II類分子呈遞該肽或其片段來加載APC。在本發(fā)明的多種另外的方法中，肽抗 原在其中已引入編碼該肽之核酸的APC表面呈遞。例如，可以在病毒或質(zhì)粒載體中編碼該 肽。
[0051] 在本發(fā)明的多種實(shí)施方案中，由APC呈遞的肽是作為融合蛋白的肽組分來被呈遞 的，所述融合蛋白還包括至少一部分HLA-II蛋白。例如，本發(fā)明的融合蛋白可包含來源于 人白細(xì)胞抗原（HLA)II類-DRA(HLA II類α鏈的旁系同源）的核酸和氨基酸序列。在多 種另外的實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包括包含Αβ片段的HLA-DRA融合構(gòu)建體。例如， 作為全長A β的替代，融合蛋白可包含A β 1-13、A β 7-13、A β 16-30、A β 24-35、A β 31-42 和 Αβ 7-23。
[0052] HLA-DRAa鏈約33_35kDa并且它的基因含有5個外顯子。外顯子1編碼前 導(dǎo)肽，外顯子2和外顯子3編碼兩個胞外結(jié)構(gòu)域，和外顯子4編碼跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾 區(qū)。HLA-DRA在該肽結(jié)合部分不具有多態(tài)性，并且作為用于β鏈DRB1、DRB3、DRB4和 DRB5的唯一的α鏈。HLA-DRA序列是公開可得的。例如，核苷酸和氨基酸序列可見于： GenBank 登錄號 CAI18477. 1 (氨基酸序列）、Μ60334. I (DNA 序列）、ΝΡ_061984. 2 (氨基酸 序列）、ΑΑΑ36275. 1 (氨基酸序列）、ΑΑΑ59785. 1 (氨基酸序列）、ΑΑΑ36302. 1 (氨基酸序 列）、ΑΑΑΗ71659. 1、CAI18476. 1(氨基酸序列）和G13122(基因序列）；以及在EMBL登 錄號 AL935032. 13(DNA 序列）、CAG33294. 1(氨基酸序列）、CAQ08811. 1(DNA 序列）和 EAX03629. I (DNA序列）。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，HLA-DRA核酸和蛋白質(zhì)分子可不同于這 些可公開獲得的，例如導(dǎo)致一個或更多個替換、缺失、插入或其組合同時仍保持了 HLA-DRA 之生物活性的多態(tài)性。因此，在本發(fā)明的多個實(shí)施方案中，本發(fā)明融合蛋白的HLA-DRA組分 的氨基酸序列可以與圖2中示例的HLA-DRA序列或其片段有約90%、約91 %、約92%、約 93%、約 94%、約 95%、約 96%、約 97%、約 98%、約 99%的同一性。
[0053] 在多個實(shí)施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含接頭。通常接頭是位于所述HLA-DRA 和融合蛋白所需的融合肽組分之間的柔性肽接頭元件。接頭元件優(yōu)選具有25個氨基酸或 更小的長度。在某些實(shí)施方案中，接頭元件的長度為3至30個氨基酸，特別是長度為3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12 至 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 30 個氨 基酸。在一個實(shí)施方案中，接頭元件的長度是5至25個氨基酸、8至20個氨基酸或10至 20個氨基酸。更優(yōu)選地，接頭的長度為9至15個氨基酸。通常本文所用的接頭元件可以 由任何已知的氨基酸或人工氨基酸衍生物組成。在某些實(shí)施方案中，接頭元件由小的并且 親水的非帶電氨基酸構(gòu)成。通常，根據(jù)本發(fā)明的接頭元件可以包含選自G、S、A和T的氨基 酸。接頭元件優(yōu)選為甘氨酸/絲氨酸接頭，即，基本上由氨基酸甘氨酸和絲氨酸組成的肽接 頭，如聚甘氨酸。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，接頭序列是IGGGSGGGGSGGGGS。
[0054] 如上所述，本發(fā)明還涉及擴(kuò)增肽抗原限定性CD4+T細(xì)胞群的方法。在多個實(shí)施方 案中，如上所示，本發(fā)明的方法涉及CD4+T細(xì)胞群的抗原特異性擴(kuò)增以對例如疫苗、自身免 疫疾病、以及與Aβ沉積相關(guān)的認(rèn)知疾病產(chǎn)生免疫應(yīng)答。
[0055] 通常，本發(fā)明的方法可從使用標(biāo)準(zhǔn)的放血方法分離的全血中獲得人CD4+T細(xì)胞。初 始的純化去除了大多數(shù)髓系細(xì)胞和B細(xì)胞，富集T細(xì)胞群。然后用羧基熒光素二乙酸琥珀 酰亞胺酯（CFSE)將T細(xì)胞染色，然后與表達(dá)一組HLA-A β融合蛋白的APC混合并共培養(yǎng)7 至10天。在這個孵育期后，細(xì)胞混合物用CD4-特異性熒光抗體染色并通過流式細(xì)胞儀，例 如熒光激活細(xì)胞掃描儀或分選儀。用CD4-陽性（CD4+)熒光來鑒別CD4+T細(xì)胞，并使用CFSE 的強(qiáng)度來確定自試驗開始經(jīng)歷了多少次增殖。
[0056] 如上所述，本發(fā)明的方法在APC中表達(dá)HLA-DRA融合蛋白。因此，本發(fā)明的方法和 組合物包括能夠在APC中表達(dá)本發(fā)明的融合構(gòu)建體的DNA或RNA載體。通常載體包含啟動 子、待表達(dá)核苷酸序列的下游終止子。在本發(fā)明的多個實(shí)施方案中，所述載體編碼重組病 毒。例如，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述載體包含來自慢病毒基因組的序列，例如FUW 慢病毒載體（描述于 Science. 2002 年 2 月 1 日· 295(5556) :868-72. Epub2002 年 1 月 10 日）。
[0057] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物和方法可以用作直接免疫方案的一部分。例 如，病毒載體、脂質(zhì)體或其它遞送方法可用來將HLA-DRA融合蛋白構(gòu)建體直接遞送到淋巴 結(jié)內(nèi)。這種方法將允許在內(nèi)源性APC的HLA類II復(fù)合物中快速呈遞未知肽。因此，本發(fā)明 提供了傳統(tǒng)疫苗方法的理想替代方案，所述傳統(tǒng)方法引入肽作為輔助復(fù)合物，其必須由APC 細(xì)胞進(jìn)行處理然后搬運(yùn)至淋巴結(jié)，這個過程可能需要進(jìn)行三到七天。未知結(jié)合HLA-DRA融 合蛋白的直接遞送和及時表達(dá)在產(chǎn)生對迅速致死的病原體（如埃博拉病毒）的免疫反應(yīng)中 尤其有用。
[0058] 實(shí)施例
[0059] 實(shí)施例1.使用加載了流感抗原的hESC-衍生的DC來評估⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答的方法。
[0060] hESC的造血干細(xì)胞（HSC)分化。在具有5X補(bǔ)充劑的mTeSR培養(yǎng)基（Stem Cell Technologies)中培養(yǎng)H9 (NSCB代碼WA09,第23代）hESC細(xì)胞系，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有額外的 bFGF (4微克/毫升，Life Technologies)。使用標(biāo)準(zhǔn)的方法在基質(zhì)膠（matrigel)中培養(yǎng)多 能性H9hESC的集落（圖1A)，并且每5代用SSEA4染色檢測多能性，通過顯微鏡和流式細(xì)胞 術(shù)對其進(jìn)行評估（圖1B)。輕柔地將集落刮為30至60個細(xì)胞的團(tuán)塊，并將其收集到15毫 升試管中，然后以300 X g離心5分鐘，并重懸于HSC分化培養(yǎng)基中（HDM:α -MEM，10% FBS， 100 μ M的單硫代甘油）。
[0061] 在收獲Η9細(xì)胞進(jìn)行分化之前，清洗大約70 %匯合的0Ρ9小鼠基質(zhì)細(xì)胞（ATCC)的 培養(yǎng)瓶并用HDM預(yù)孵育。0Ρ9細(xì)胞在經(jīng)凝膠化的（G1393, Sigma) Τ75培養(yǎng)瓶中于0Ρ9生長培 養(yǎng)基（0P9M:a-MEM (Life Technologies)，含有 20 % FBS (HyClone))中培養(yǎng)。將含有 hESC 細(xì)胞團(tuán)塊的HDM直接加入到培養(yǎng)瓶中。在第4天將所有的HDM更換為新鮮的HDM，并在第6 天和第8天，將一半HDM培養(yǎng)基更換為新鮮的HDM。
[0062] 在HDM中共培養(yǎng)2天后，H9集落的含HSC團(tuán)塊的初始造血分化附著到0P9飼養(yǎng)層 并開始（bega)(圖1C)。共培養(yǎng)4天后，集落形態(tài)類似于hESC集落，但細(xì)胞大小更易變（圖 1D)。8天后，含有HSC之集落的形態(tài)是高度可變的，并且明顯不同于光滑邊緣，甚至出現(xiàn)了 多能性hESC集落（圖1E)。CD34的免疫染色示出了共培養(yǎng)8天后從集落分離的細(xì)胞的表 達(dá)分析（圖1F)。
[0063] 共同髓系祖細(xì)胞的分化。在pHEM包被的（Sigma)的T25培養(yǎng)瓶內(nèi)維持髓系細(xì)胞。 為了誘導(dǎo)HSC分化為共同髓系祖細(xì)胞（CMP)，將細(xì)胞用膠原酶IV(1毫克/毫升）在KnockOut DMEM/F-12 (Life Technologies)中于 37°C處理 20 分鐘，接著用 0.05%胰蛋白酶-EDTA 在 37°C處理15分鐘。用10%的FBS淬滅胰蛋白酶活性，沉淀（300Xg)，重懸于髓系分化培養(yǎng) 基（Myeloid differentiation medium，MDM)中，并平板接種于pHEMA包被的培養(yǎng)瓶中。髓 系擴(kuò)增進(jìn)行10至12天。MDM包含α-MEM、10 % FBSU00納克/毫升GM-CSF、100 μ M的單 硫代甘油。MDM也可用來擴(kuò)增髓系細(xì)胞數(shù)目。在重新平板接種的一天之內(nèi)，分化的CMP前體 重新形成具有南瓜形核的團(tuán)塊（圖1G，H) ;3天后，團(tuán)塊開始分解然后單細(xì)胞出現(xiàn)（圖11)。 包括CD34在內(nèi)的HSC標(biāo)志物的表面表達(dá)降低的同時CMP標(biāo)志物表達(dá)增加，所述CMP標(biāo)志物 包括〇)14、〇)1113(512)、〇)45(圖1了-的和〇)43(圖10 ;圖2)。
[0064] 未成熟樹突細(xì)胞（iDC)的產(chǎn)生。為了在髓系擴(kuò)增后產(chǎn)生髓系DC，將細(xì)胞通過70微 米的過濾器過濾并用25%丨JeiXoIIκ .分級以去除死細(xì)胞和細(xì)胞團(tuán)塊（圖5A)。用含5%FBS的PBS清洗細(xì)胞，并重新平板接種于DC分化培養(yǎng)基（DDM)中8至10天。DDM是StemSpan? SFEM培養(yǎng)基（StemCellTechnologies)，補(bǔ)充有丨(X-CytCli.生長補(bǔ)充劑（Millipore)、100 納克/毫升的GM-CSF、100納克/毫升的IL-4 (Endogen)。每四天用新鮮的DDM更換iDC培 養(yǎng)物中一半體積的DDM。為了擴(kuò)大iDC的數(shù)目，使它們在相同的條件下分裂和維持。在補(bǔ) 充有TNF- α (1〇〇納克/毫升）和LPS (250納克/毫升）的DDM中誘導(dǎo)DC成熟，保持3天。 在DC分化條件下8天后，iDC具有皺的形態(tài)（圖3Α)，并示出DC標(biāo)志、⑶80和⑶86的表面 表達(dá)（圖3I-K)。iDC的特征行為是病原體和細(xì)胞碎片的吞噬作用，這是使用人免疫球蛋白 包被的熒光膠乳珠測定的（Dagenault等，2010)。更具體地說，將平均直徑為2微米的羧化 物修飾的紅色熒光膠乳珠（L3030, Sigma)在具有PBS的50%人AB血清中在37°C調(diào)理30 分鐘。在孵育后，將這些經(jīng)調(diào)理的乳膠珠添加到DC培養(yǎng)物中并且在37°C輕柔搖動30分鐘 進(jìn)行孵育。相同的對照在4°C孵育。30分鐘后，通過加入2毫升的冰冷的PBS終止吞噬作 用，隨后用冰冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次。使DC重懸于1毫升冷的PBS中，且通過加入等體積 的4%多聚甲醛來固定，保持在4°C的暗處直到成像。iDC內(nèi)化了這些珠子（圖3B)且流式 細(xì)胞術(shù)顯示大部分iDC具有吞噬的珠子（圖3C，D)。
[0065] 樹突細(xì)胞的成熟。在用補(bǔ)充有100納克/毫升的TNF- a (PeproTech)和250納克 /毫升的LPS (Sigma)的DDM觸發(fā)成熟之前，未成熟DC被預(yù)先加載了目的肽。用相差顯微術(shù) (圖3E，F(xiàn))、蘇木精和伊紅（H&E)染色的光學(xué)顯微術(shù)（圖3G)以及DIC顯微術(shù)（圖3H)觀察 到成熟DC具有分叉的樹枝狀突起。使用由細(xì)胞離心涂片器（Cytospin)鋪展到玻片上的經(jīng) 固定細(xì)胞（2%多聚甲醛）進(jìn)行H&E染色。用H&E溶液覆蓋具有iDC和成熟DC的載玻片并 孵育15分鐘，隨后用酸和藍(lán)化溶液（bluing solutions) (Vector Laboratories)處理。用 水清洗載玻片，經(jīng)過醇系列（50%、70%、95%、100%乙醇）并用Permount (Fisher)封裝蓋 玻片。H&E染色的圖像用安裝在Nik〇n#顯微鏡上的彩色CCD攝像頭捕捉。
[0066] 流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)iDC和成熟DC兩者都表達(dá)DC標(biāo)志（圖31)。更具體地，iDC培養(yǎng) 物用Percoll分離進(jìn)行純化（圖5A)，含有表達(dá)高水平DC標(biāo)志（圖5B，C)或⑶14 (圖OT) 的群。一個群是DC標(biāo)志hV⑶141。，另一個群是DC標(biāo)志V⑶H hi (圖5E)。這些群通常分別 是約1 : 1.5的比例。為了比例平衡的研究，用抗-⑶14或抗-DC標(biāo)志的磁珠純化iDC。簡 言之,將DC用70微米過濾器過濾以去除聚集體并用髓系樹突細(xì)胞的試劑盒純化，用以分離 表達(dá)⑶14的細(xì)胞，隨后通過MACS柱（Miltenyi)純化。將分離的細(xì)胞在DDM中培養(yǎng)4周。 為了富集分離的DC標(biāo)志 hi細(xì)胞，我們使用人DC標(biāo)志試劑盒（Miltenyi)來純化細(xì)胞并且它 們也在DDM中擴(kuò)增4周。
[0067] 當(dāng)將成熟DC與原代T細(xì)胞進(jìn)行混合時，培養(yǎng)物在3到5天內(nèi)形成了細(xì)胞聚集體， 稱為"激活島"（Islands of activation，Ι0Α)(圖5F-H)。IOA通過第一熒光標(biāo)記的DC成 像，將它們在預(yù)熱的含有Dil (2 μ M，Life Technologies)的無血清培養(yǎng)基中在37°C孵育20 分鐘，且經(jīng)分離的T細(xì)胞用DiO(IyM)以相同的方式標(biāo)記。孵育后，加入10倍體積的T細(xì) 胞培養(yǎng)基并在300Xg離心5分鐘沉淀細(xì)胞。然后用含有0. 1% BSA的PBS洗滌細(xì)胞兩次。 將熒光標(biāo)記的DC (紅色）和T細(xì)胞（綠色）混合，并在一個pHEM包被的培養(yǎng)瓶中過夜（16 小時）培養(yǎng)，然后通過加入等體積的4%多聚甲醛固定并靜置30分鐘。通過直接將DAPI添 加到定影溶液（20 μ M的終濃度）中來用DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。不對細(xì)胞進(jìn)行洗滌，因為離心 和重懸可能會破壞ΙΟΑ，所以用顯微鏡挑取IOA并放置于蓋玻璃底下的室來成像。IOA的圖 像由Nik?丨Γ Cl共聚焦顯微鏡捕捉。
[0068] iDC的純化，用抗DC標(biāo)志的磁珠富集DC標(biāo)志hVCDH 1t5群并去除大部分DC標(biāo)志1Y ⑶1儼群（圖51)，但防止IOA的形成（圖5J)。互補(bǔ)性研究中，用抗⑶14磁珠富集DC標(biāo) 志VCDH hi細(xì)胞，降低了 DC標(biāo)志hVCDH1t5群（圖5K)，并且還防止了 IOA的形成（圖5L)。
[0069]流式細(xì)胞術(shù)也證實(shí)，iDC和成熟DC兩者都表達(dá)⑶80 (圖3J)、⑶86 (圖3K)以及 ⑶Ilc (圖3)。HLA II類復(fù)合物在iDC的內(nèi)體（endosome)中隔離，并隨著DC成熟被運(yùn)輸?shù)?表面（圖3L)。
[0070] 為了確定hESC-衍生的DC是否可以刺激T細(xì)胞增殖，從全血中分離人T細(xì)胞（圖 6A)，用CFSE標(biāo)記，并與加載抗原的成熟DC共培養(yǎng)7至10天。之后，⑶4+T細(xì)胞用抗⑶4 進(jìn)行免疫染色并通過⑶4+群的CFSE熒光評估其增殖（圖6B，C)。使用與DC和IL-2 (Life Technologies) -起孵育的T細(xì)胞（圖6D)作為陽性對照，以確定連續(xù)細(xì)胞分裂的CFSE熒 光（圖6E，F(xiàn))。為了檢測Ι0Α，我們在將T細(xì)胞與成熟DC混合前，用具有親脂性的DiI熒 光標(biāo)記T細(xì)胞。第二天可以看到具有T細(xì)胞圍繞較大DC的Ι0Α，（圖6G-I)。與成熟DC和 IL-2混合的T細(xì)胞的增殖多達(dá)7代（圖6J)，用抗DC標(biāo)志（圖6K)或抗⑶14 (圖6L)磁珠 純化的DC僅發(fā)生了 5代增殖。
[0071] hESC-衍生的DC刺激流感HA肽特異性⑶4+T細(xì)胞的增殖。T細(xì)胞是從通過肌肉內(nèi) 注射接受市售流感疫苗（FLU..vW\I...,H ,由GlaxoSmithKline分布）之前和一周后的 人對象中抽取的20毫升全血樣品收集的。從對象抽取的全血在含EDTA的血管（#366643，BDBiosciences)。在無菌條件下用PBS將血樣稀釋至1:1，并且40毫升的稀釋樣品在 30毫升的KicoH-hypaqucK的頂部分層，并以4〇〇Xg旋轉(zhuǎn)30分鐘。收集外周血淋巴細(xì) 胞（PBL)層（圖6A)并用PBS稀釋（1 : 7)，隨后以300Xg離心10分鐘。細(xì)胞用在通過 將沉淀重懸在PBS中再清洗細(xì)胞兩次。存活的細(xì)胞用臺盼藍(lán)排除法（exclusion)計數(shù)。除 去貼壁細(xì)胞以使用尼龍羊毛柱富集T細(xì)胞。簡言之，用T細(xì)胞培養(yǎng)基（RPMI1640,具有10% FBS)洗滌尼龍羊毛柱并在37°C孵育一小時。然后，將IO 7個細(xì)胞/毫升的PBL添加到預(yù)熱 的柱中并在37°C孵育1小時，在這之后通過打開柱的旋塞來收集非貼壁細(xì)胞。該柱用5毫 升T細(xì)胞培養(yǎng)基洗滌兩次以收集總流出物。T細(xì)胞富集的級分用CFSE溶液（4 μ M，在PBS 中）在37°C水浴中孵育8分鐘。孵育后，將溶液用10倍體積的T細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋，通過離 心（300Xg，10分鐘）沉淀，并用含有0. 1% BSA的PBS洗滌兩次。對CFSE標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn) 行重懸、計數(shù)，并且一部分被用來通過流式細(xì)胞術(shù)（ACfUrl·', BDBiosciences)評估CFSE 熒光。在流式細(xì)胞術(shù)之前，細(xì)胞用Λ丨exaK· 647綴合的抗CD4抗體（BD Biosciences)進(jìn)行 免疫染色以允許分析CD4+群中的CFSE熒光。另外流式細(xì)胞儀的數(shù)據(jù)和直方圖的分析已由 FCS express 4流式細(xì)胞儀軟件（全新的軟件（De Novo Software))完成。
[0072] 將CFSE標(biāo)記的T細(xì)胞與成熟DC共培養(yǎng)，所述成熟DC已被預(yù)先加載了流感HA的 免疫原性肽（氨基酸 126 至 138, H-HNTNGVTAACSHE-OH，Anaspec)。（Le N0U&1 等，2010 ; Schmidt等，2012)。DC的肽加載包含在水中重懸凍干的流感HA肽和十分之一體積的 10XPBS以中和pH值。在培養(yǎng)基中用終濃度為每毫升10微克的流感肽加載未成熟DC，在 濕潤的含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天。然后用如前所述的TNF- α和LPS使未成熟DC成 熟。
[0073]對CD4+T細(xì)胞增殖的分析顯示在疫苗前樣品中對對照DC幾乎沒有應(yīng)答（圖7Α)， 但疫苗接種后樣品示出CD4+T細(xì)胞增殖的顯著增加（圖7Β，C)，可能是由于疫苗中佐劑的非 特異性效應(yīng)（Fox等，2012 Jetsutani等，2012;Caproni等，2012)。被預(yù)先加載了流感肽的 成熟DC也對疫苗接種前的CD4+T細(xì)胞幾乎沒有刺激作用（圖7A)，但疫苗接種后的T細(xì)胞 以增加的增殖來應(yīng)答，該應(yīng)答遠(yuǎn)高于對對照DC的應(yīng)答（7B-E)。在疫苗接種后測定中使用 對照DC和流感-DC之間的唯一區(qū)別是流感肽的預(yù)先加載，提示應(yīng)答增加是由于流感特異性 ⑶4+T細(xì)胞的增殖。
[0074]簡言之，涉及人對象的所有程序都是在健康科學(xué)西部大學(xué)（Pomona，CA)、箭頭地區(qū) 醫(yī)療中心（Colton, CA)和Casa科利納（Pomona, CA)倫理審查委員會的批準(zhǔn)下進(jìn)行的。向 所有參與者解釋了知情同意書，并由所有對象和/或法定監(jiān)護(hù)人簽字。
[0075] 實(shí)施例2.阿爾茨海默病患者的A β -特異性⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答的分析
[0076] 為了評價hESC-衍生的DC是否可以檢測慢性病癥中的⑶4+Τ細(xì)胞應(yīng)答，我們招募 了六個推定診斷患有阿爾茨海默病（AD)的對象和三個年齡匹配的對照者。根據(jù)與實(shí)施例1 中所述相同的方法采集全血、處理并分離T細(xì)胞。通過對根據(jù)上述用流感HA肽加載DC的 相同方法預(yù)先加載有10毫克/毫升的A β 1-42肽（BioMer Technology)的成熟DC的應(yīng)答 來評估⑶4+T細(xì)胞增殖。
[0077]這種肽的不溶性沉積物積聚成神經(jīng)炎腦斑（neuritic brain plaque)，是阿爾茨 海默病的病理的明確標(biāo)志（Braak和Braak，1997)。Αβ特異性的⑶4+T細(xì)胞減弱了疾病的 小鼠模型中阿爾茨海默病的病理和行為（Ethell等，2006 ;Cao等，2009)。嘗試用A β 1-42 疫苗接種作為阿爾茨海默病的治療方案，雖然有前景，但是由于對象子集（6%)中的腦膜 炎癥，該試驗被叫停（Orgogozo等，2003)。至今仍不清楚，在AD病因中是否出現(xiàn)了 Αβ特異 性的T細(xì)胞應(yīng)答，以及他們是否可以提供隨著病情的發(fā)展而淹沒的早期有益影響（Ethell 等，2002 ;Ethell和Buhler，2003 ;Cao等，2009年）。按照上述實(shí)施例1來制備T細(xì)胞，并將 其與預(yù)先加載A β 1-42的成熟DC共培養(yǎng)。6個AD對象中的5個示出響應(yīng)呈遞A β之DC的 CD4+T細(xì)胞增殖比對照DC高三倍，然而對照對象均未表現(xiàn)出高于2倍對照的響應(yīng)（圖7F)。 對加載Αβ之DC沒有增殖反應(yīng)的一個AD對象（AD4)，可能是由于不正確診斷，因為AD的確 診只能通過死后的大腦病理做出（Alzheimer, 1907 ;Fischer，1907)。
[0078] 實(shí)施例3.用轉(zhuǎn)染了改造為表達(dá)HLA-DRA-Aβ融合蛋白之慢病毒構(gòu)建體之hESC衍 生的DC來評估⑶4+T細(xì)胞應(yīng)答的方法。
[0079] 本發(fā)明的組合物和方法已被用來在36個人對象中評估CD4+T細(xì)胞庫對阿爾茨海 默病的肽、淀粉樣蛋白（Αβ)的應(yīng)答。CD4+T細(xì)胞是從使用標(biāo)準(zhǔn)放血的方法得到的全血中獲 得的。初始的基于尼龍羊毛的純化方法除去大部分的髓系細(xì)胞和B細(xì)胞，從而富集了 T細(xì)胞 群。然后用羧化物熒光二乙酸琥珀酰亞胺酯（CFSE)將T細(xì)胞染色，然后與表達(dá)HLA-DRA-Αβ 融合蛋白的APC組混合并共培養(yǎng)7至10天。融合蛋白的組包括全長Αβ、Αβ 1-13、Αβ 7-13、 A β 16-30、Α β 24-35、Α β 31-42、和A β 7-23。在孵育期后，將細(xì)胞混合物用CD4特異性熒光 抗體進(jìn)行染色，并通過流式細(xì)胞儀。利用CD4特異性熒光來鑒別CD4+T細(xì)胞，并利用CFSE強(qiáng) 度來確定那些CD4+T細(xì)胞都經(jīng)歷了多少次增殖，因為T細(xì)胞最初是用CFSE染色的。以下實(shí) 施例舉例說明了本發(fā)明的多個步驟。
[0080] HLA-DRA/淀粉樣蛋白β融合構(gòu)建體。人HLA II類α鏈（HLA-DRA，提供了 基因庫入口）是按照如下方法克隆的：采用標(biāo)準(zhǔn)方法從1毫升全血的人血外周血單核 細(xì)胞（PBMC)中分離RNA，然后使用標(biāo)準(zhǔn)的反轉(zhuǎn)錄方法來建立HLA-DRA cDNA模板。接 著通過向含校對DNA聚合酶"Phusion"（New England Biolabs)的標(biāo)準(zhǔn)聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)中添加）HLA-DRA cDNA模板來擴(kuò)增HLA-DRA核苷酸序列（引物是由發(fā)明人Doug Ethell 設(shè)計的 HLA-DRAF(正向）：5 ' -TTATTCTTGTCTGTTCTGCCTC ;HLA-DRAR(反向）： 5 ^ -CTTCTCTCTAAGAAACACCATCACCTC。PCR的產(chǎn)物溶解在瓊脂糖凝膠上，并且從凝膠中分離 出正確大?。s2kb)的單一條帶來，然后按照制造商的說明連接到p〇l'8)丨 TA 載體上（Invitrogen，Life Technologies，Carisbad，CA)。選擇一個包含有正確序列并 且無突變之HLA-DRA克隆的pClHlOPO 1" TA質(zhì)粒。用定點(diǎn)誘變（SDM)在HLA-DRA序 列的5'末端引入編碼多聚甘氨酸/絲氨酸接頭的核苷酸序列。從SDM得到的后續(xù)克隆的 標(biāo)準(zhǔn)DNA測序來鑒定具有正確的序列的克隆。圖9示出所得到的丨)(._丨1 8/GW HLA-DRA+接頭質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜。SDM被用來與該質(zhì)粒一起用于生成在這些研究中使用的各 個淀粉樣蛋白β (Αβ)的融合構(gòu)建體。具體地說，制造的Αβ+接頭+HLA-DRA融合構(gòu)建體包 含以下 Αβ 片段：Αβ 1-13(圖 11)、Αβ 7-13(圖 12)、Αβ 16-30(圖 13)、Αβ 24-35(圖 14)、 A β 31-42 (圖 15)和 A β 7-23 (圖 16)。
[0081] 使用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)克隆方法在FUW載體的多克隆位點(diǎn)EcoRI位點(diǎn)處將各個上 述A β +接頭+HLA-DRA融合構(gòu)建體從它們各自的pCR?8/GW TOPO*1:載體亞克隆到FUW 慢病毒載體上（在 Science. 2002 年 2 月 1 日· 295 (5556) :868-72. Epub 2002 Jan 10 中描 述的）。在插入到FUW載體之前，對每個A β +接頭+HLA-DRA融合限制性片段進(jìn)行凝膠純 化。Αβ +接頭+HLA-DRA插入的方向由限制性酶切消化來驗證。具體地，使用核酸酶XbaI 和PstI來確認(rèn)插入片段的方向。
[0082] Αβ +接頭+HLA-DRA融合蛋白的蛋白表達(dá)由存在于FUW質(zhì)粒上的泛素化啟動子 驅(qū)動。Western印跡分析表明當(dāng)構(gòu)建體被引入到293細(xì)胞中時，F(xiàn)UW構(gòu)建體表達(dá)Αβ +接頭 +HLA-DRA融合蛋白。參見圖15。細(xì)胞裂解物的Western印跡分析是通過使用HLA-DRA特 異性抗體（Abnova目錄#MAB7134,克隆L243)探測印跡進(jìn)行的。
[0083] 人類胚胎干細(xì)胞（hESC)衍生的樹突細(xì)胞。通過在37°C水浴中持續(xù)地輕輕搖晃 凍存管直到只有小冷凍塊（pellet)殘留使冷凍小瓶的hESC之H9系（WiCell/國家干細(xì) 胞庫）迅速解凍。然后從水浴中取出凍存管并擦干，用異丙醇擦拭。使用1毫升移液槍頭 (pepitte tip)將凍存管中的內(nèi)容物轉(zhuǎn)移到15毫升錐形管中。將9毫升預(yù)熱的干細(xì)胞培 養(yǎng)基（完全 mTeSR，來自 Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)逐滴加入到該管 中，隨著培養(yǎng)基的加入輕柔地混合。然后將細(xì)胞在室溫（25°C)，300 Xg離心5分鐘。將培 養(yǎng)基吸出，讓細(xì)胞沉淀保持完整。使用1毫升移液槍頭，將細(xì)胞沉淀輕輕地重懸，同時小心 維持細(xì)胞為聚集體。確保團(tuán)塊均勻分布，將1毫升細(xì)胞聚集體的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到包被有基質(zhì)膠 (Becton-Dickinson，根據(jù)制造商的說明制備的）的T25培養(yǎng)瓶中。然后將培養(yǎng)瓶快速地從 一邊到另一邊晃動，隨后前后晃動直到細(xì)胞聚集體均勻地分布在培養(yǎng)基中。在濕潤的培養(yǎng) 箱（37°C，5% CO2)中培養(yǎng)細(xì)胞。每隔一天向每個T25培養(yǎng)瓶（4毫升）的hESC培養(yǎng)物供給， 用新鮮mTeSR培養(yǎng)基100%更換。在解凍后約5至7天，檢查hESC培養(yǎng)物中存在準(zhǔn)備好傳 代的hESC集落（即致密居中具有光滑的邊緣）。
[0084] 未分化的hESC的傳代。用顯微鏡檢查如上所述準(zhǔn)備傳代的hESC的集落以鑒定未 分化的集落區(qū)域，其用移液槍頭刮基質(zhì)膠表面來移除。在此步驟中，每個培養(yǎng)瓶的表面面積 的至多20%被刮下。脫落的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至基質(zhì)膠包被的含有4毫升的mTeSR培養(yǎng)基的T25 培養(yǎng)瓶中。在未分化的細(xì)胞被轉(zhuǎn)移到一個新的T25培養(yǎng)瓶中之后，存在的任何相對較大的 集落均通過用1毫升移液槍頭輕輕上下吹吸集落而被打散（breakup)。未分化的細(xì)胞通過 搖動T25培養(yǎng)瓶輕柔地混合，然后將培養(yǎng)瓶放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。未分化的hESC集落可通 過不存在粗糙的集落邊緣來識別，由每隔一天供給培養(yǎng)物4毫升的mTeSR培養(yǎng)基來維持。未 分化的hESC在傳代后5至6天后被用于實(shí)驗中。
[0085] 0P9細(xì)胞的培養(yǎng)。使用0P9骨髓基質(zhì)細(xì)胞（ATCC目錄號CRL-2749)來刺激hESC的 造血干細(xì)胞（HSC)系的分化，盡管其它的骨髓基質(zhì)細(xì)胞在此過程中可以取代。0P9細(xì)胞保 持在0P9培養(yǎng)基中：1X的a-MEM(Life Technologie)培養(yǎng)基中補(bǔ)充有20%FBS(未加熱 滅活）、L-谷氨酰胺。0P9培養(yǎng)物維持在T75培養(yǎng)瓶中，所述T75培養(yǎng)瓶在濕潤的培養(yǎng)箱中 37°C和5% CO2，如在ATCC方案中所描述的。簡言之，0P9的培養(yǎng)物每2天供給一次，每4天 傳代一次。為了使0P9培養(yǎng)物傳代，將培養(yǎng)基從培養(yǎng)瓶中吸出，并用8毫升PBS清洗0P9單 層細(xì)胞。為了使0P9細(xì)胞從培養(yǎng)瓶表面脫落，將TrypLE表達(dá)（Life Technologies)溶液（4 毫升）加入到該培養(yǎng)瓶中，并將培養(yǎng)瓶置于37°C培養(yǎng)箱中5分鐘。通過加入4毫升含0. 5% BSA的PBS終止TRYPLE處理。將經(jīng)處理的細(xì)胞和溶液轉(zhuǎn)移到15毫升的試管中，將試管以 300Xg離心5分鐘。離心后，吸出上清液，并將細(xì)胞重懸于1毫升0P9培養(yǎng)基中。細(xì)胞溶液 重懸于30毫升0P9培養(yǎng)基中并將10毫升的重懸細(xì)胞分別加入到3個新的T75培養(yǎng)瓶中。 在約4天后，當(dāng)0P9細(xì)胞生長至85%匯合度時，按照上述方法再次對它們進(jìn)行分離。
[0086] hESC通過與0P9基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行造血分化。為了準(zhǔn)備hESC分化，T75培養(yǎng)瓶 中的0P9細(xì)胞過度生長（S卩，分離后4至5天）。將培養(yǎng)基吸出并將10毫升的hESC-HSC分 化培養(yǎng)基（IX a-MEM中補(bǔ)充有10% FBS(未加熱滅活的）和100 μ M的單硫代甘油（MTG， Sigma目錄#Μ6145))加入到培養(yǎng)瓶中，并將培養(yǎng)物孵育20分鐘。當(dāng)用hESC-HSC分化培養(yǎng) 基孵育0P9細(xì)胞時，將mTeSR培養(yǎng)基從hESC集落（分離后5-6天）的T25培養(yǎng)瓶中除去， 并用5毫升的PBS清洗hESC培養(yǎng)物。用3毫升補(bǔ)充有5% FBS的PBS覆蓋細(xì)胞，然后用細(xì) 胞刮（BD Falcon目錄#353085)使hESC集落從T25培養(yǎng)瓶的表面脫落并被打散。接著用 移液管將脫落的hESC集落轉(zhuǎn)移到15毫升錐形管中。然后用另外3毫升的PBS/5% FBS清 洗培養(yǎng)瓶，將其添加到含有刮下來的集落同一個15毫升試管中。將含有分散的hESC集落 的15毫升試管以300 X g離心5分鐘。吸出上清液，將沉淀輕輕懸浮于1毫升的hESC分化 培養(yǎng)基中，通過輕敲該培養(yǎng)瓶并用1毫升移液管輕柔地磨碎，并小心不要打碎細(xì)胞團(tuán)塊。細(xì) 胞懸液的體積為1. 5毫升至2毫升，并且通常含有約IO6個細(xì)胞/毫升。將另外的9毫升的 hESC-HSC分化培養(yǎng)基輕柔地加入到hESC細(xì)胞懸液中，并小心保持hESC細(xì)胞團(tuán)塊的完好。 然后將10毫升含hESC的hESC-HSC培養(yǎng)基均勻地分布到如上文所述已用10毫升hESC-HSC 分化培養(yǎng)基孵育的OP9培養(yǎng)瓶中。然后將培養(yǎng)瓶放置在一個溫潤的培養(yǎng)箱（37°C和5% CO2) 中。孵育1天后，所有的培養(yǎng)基都吸走。將20毫升新鮮hESC-HSC分化培養(yǎng)基加入到培養(yǎng) 瓶中，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱中。合并的hESC/0P9培養(yǎng)物自起始平板接種起的第4天和第6 天供給，每次供給用新鮮的hESC-HSC分化培養(yǎng)基更換50%的培養(yǎng)基（10毫升）。在第4天 開始時，在顯微鏡下檢查共培養(yǎng)物，以觀察hESC集落的分化。好的HSC分化的特點(diǎn)是與未 分化的hESC集落形成對比的畸形集落并且培養(yǎng)基不含有成脂肪的（含大液泡）0P9細(xì)胞。 在初始平板接種后7至8天收獲HSC集落。
[0087] 在GM-CSF批量培養(yǎng)物中髓系祖細(xì)胞的擴(kuò)增。用pHEM包被塑料表面。通過在50 毫升試管中向10毫升含有IOmM NaOH的95%乙醇中加入4克的pHEMA制備聚（2-羥乙基 甲基丙烯酸酯VpHEMA(Sigma目錄#P3932)包被溶液。并且在37°C培養(yǎng)箱中使其旋轉(zhuǎn)過 夜。為了包被T25培養(yǎng)瓶，使用2毫升的pHEM包被溶液，并且旋轉(zhuǎn)傾斜該培養(yǎng)瓶，直到整 個底部表面被覆蓋。將培養(yǎng)瓶側(cè)立放置，過量的PHEMA包被溶液被排入一個角落，并用吸管 除去。培養(yǎng)瓶立即置于水平位置且將蓋子取下，并使其在組織培養(yǎng)罩中干燥過夜（無UV)。 第二天將蓋子蓋在培養(yǎng)瓶上，并在室溫下儲存直到使用。第8天的hESC/0P9共培養(yǎng)物的單 細(xì)胞懸液是通過如下的用膠原酶-胰蛋白酶溶液連續(xù)的酶處理而制備的。首先，將hESC/ 0P9共培養(yǎng)的培養(yǎng)基吸出并用10毫升PBS清洗。然后每個T75培養(yǎng)瓶中加入5毫升的膠 原酶溶液（在DMEM/F12 (1毫克/毫升）中無菌過濾的IV型膠原酶，Life Technologies 17104-019號），并將培養(yǎng)瓶在37°C孵育20分鐘。將膠原酶溶液從培養(yǎng)瓶中移出，并轉(zhuǎn)移 到一個50毫升錐形管中。然后將5毫升的胰蛋白酶-EDTA溶液（在0. 5mM EDTA溶液中含 0.05%胰蛋白酶，Life Technologies#25300-054)加入到相同的hESC/0P9共培養(yǎng)培養(yǎng)瓶 中，將培養(yǎng)瓶在37°C下孵育20分鐘。將5毫升的PBS-5% FBS加入到含有胰蛋白酶-EDTA 溶液的培養(yǎng)瓶中，并用10毫升的血清移液管（serological pipet)通過吹吸將脫落的細(xì)胞 重懸。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含有所收集的膠原酶溶液的同樣的50毫升收集管中，通過封閉收 集管并使其顛倒來使細(xì)胞混合。將細(xì)胞在同一管中以400Xg離心10分鐘。除去上清液， 將細(xì)胞用PBS-5% FBS洗滌，并再次以400Xg離心10分鐘。再重復(fù)這個洗滌步驟兩次，并 在最后一次洗滌后，將上清液除去。將細(xì)胞重懸于10毫升的髓系細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基（MCEM。 MCEM 含補(bǔ)充有 10% 非加熱滅活的 Hyclone FBS(Hyclone)、lXMTG(100yM)、和 100 納克 / 毫升的GM-CSF(R&D系統(tǒng)目錄215-GM)的α-MEM。GM-CSF是在臨用前加入的。在MCEM中重 懸細(xì)胞后，將細(xì)胞懸液通過安裝到一個50毫升試管上的70微米的尼龍過濾器來過濾。過 濾步驟后，用血細(xì)胞計數(shù)器和臺盼藍(lán)來計算細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞最終以2至3Χ IO6個細(xì) 胞/毫升的濃度懸浮。將包括hESC衍生的共同髓系祖細(xì)胞的懸浮細(xì)胞分配到pHEM包被 的T25培養(yǎng)瓶中（5毫升/T25培養(yǎng)瓶），并在37°C和5% CO2下孵育。在平板接種后第4、 8和12天，通過用新鮮的MCEM更換每個培養(yǎng)瓶50%的培養(yǎng)基來供給培養(yǎng)物新的MCEM。在 每次供給時，取出2. 5毫升的培養(yǎng)基，并以300Xg離心10分鐘。將上清液完全除去，將細(xì) 胞沉淀重懸于新鮮的MCEM中，并返回到培養(yǎng)瓶中。在建立共培養(yǎng)后11天或12天后收集細(xì) 胞。
[0088] 髓系在細(xì)胞分化成DC。在直接從T25培養(yǎng)瓶中收集以上步驟中描述的髓系祖細(xì) 胞，然后通過70微米尼龍篩過濾，轉(zhuǎn)移到15毫升錐形管中，并以400 X g離心10分鐘。使 用移液管來除去上清液，然后將細(xì)胞在5毫升的PBS中重懸。將細(xì)胞懸液用5毫升25%的 Percoll(Sigma目錄.No. P1644)懸起，然后以400Xg離心15分鐘。將細(xì)胞用PBS-5%FBS 洗滌兩次并以450 X g離心10分鐘，小心保持細(xì)胞沉淀完好。在最后一次洗滌后，將細(xì)胞重 懸于8毫升的樹突細(xì)胞分化培養(yǎng)基（DCDM)中。DCDM包括由StemSpan無血清擴(kuò)增培養(yǎng)基 (SFEM) (Stem Cell Tech目錄#09650)構(gòu)成，并補(bǔ)充有1/500稀釋的EX-CYTE生長增強(qiáng)補(bǔ) 充劑（Millipore，目錄#81-129-N)、100納克/毫升的重組人GM-CSF (Sigma)和100納克/ 毫升的重組人IL-4(R&D Biosystems)。向兩個T25培養(yǎng)瓶的每一個中加入一半的含有細(xì)胞 的溶液。每個培養(yǎng)瓶中細(xì)胞懸液的最終濃度為每毫升DCDM2X IO5至IX IO6個細(xì)胞。在平 板接種后4天和8天通過更換50%的DCDM供給細(xì)胞。從每個培養(yǎng)瓶中取出2毫升培養(yǎng)基 并以400 Xg離心10分鐘。除去上清液并將細(xì)胞重懸于2毫升的新鮮DCDM中，并將該溶液 加回到培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱中。
[0089] 樹突細(xì)胞（DC)的成熟（一般的成熟過程）。使用標(biāo)準(zhǔn)的胰蛋白酶溶液細(xì)胞分離 的方法，將10至12天的樹突細(xì)胞培養(yǎng)物收集到15毫升錐形管中，并以400Xg離心10分 鐘。通過移液管吸除去上清液，將沉淀重懸，并與4毫升新鮮制備的DC成熟培養(yǎng)基（補(bǔ)充 有EX-CYTE生長增強(qiáng)補(bǔ)充劑（Millipore，目錄#81-129-N)的SFEM)輕柔地混合。將重懸的 DC轉(zhuǎn)移到pHEM包被的T25培養(yǎng)瓶中，并在37°C和5% CO2下孵育。DC從平板接種細(xì)胞2 至3天后開始形成樹枝狀突起。
[0090] 樹突細(xì)胞的感染與成熟。慢病毒的制備。慢病毒是通過在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì) 粒產(chǎn)生的。在濕潤的培養(yǎng)箱37°C，5% CO2下，于293培養(yǎng)基（杜爾貝科最低必需培養(yǎng)基 (Dulbecco Minimal Essential Medium，DMEM)，補(bǔ)充有 10% FBS 和 L-谷氨酰胺）中培養(yǎng) 人胚胎腎293細(xì)胞/HEK293(以下簡稱為293)細(xì)胞。在細(xì)胞80%匯合時，吸除培養(yǎng)基，用 PBS (直徑10厘米的培養(yǎng)皿用5毫升）清洗細(xì)胞，并將胰蛋白酶-EDTA放在細(xì)胞上3至4分 鐘（直徑10厘米的培養(yǎng)皿用5毫升）以將細(xì)胞分開。經(jīng)胰蛋白酶-EDTA處理后，將5毫升的 293培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)皿中，通過上下吹吸溶液輕柔地移動細(xì)胞。將重懸的293細(xì)胞和培養(yǎng) 基轉(zhuǎn)移到15毫升試管中，并以500 X g離心5分鐘。吸除上清液，將細(xì)胞團(tuán)塊重懸于1毫升 的PBS中，并用血細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞計數(shù)。在293培養(yǎng)基中稀釋細(xì)胞并且在6孔板的每個孔 中平板接種2毫升的5 X IO5個細(xì)胞。將該板放置在培養(yǎng)箱中過夜，并在第二天用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 細(xì)胞。用脂質(zhì)體2000 (Life Technologies)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到293細(xì)胞中。使用以下方式分別 在不同孔中制成所有表達(dá)融合蛋白的慢病毒。將50微升的0ptiMEM(Life Technologies) 放到兩個I. 5毫升的微量離心管中，并使其在組織培養(yǎng)罩中升溫至室溫10分鐘。在一個 試管加入下面的質(zhì)粒：2微克表達(dá)A β -HLA-DRA融合蛋白構(gòu)建體的慢病毒、2微克的VSVG、2 微克的Δ 8. 9。所有質(zhì)粒都是用使用Endo-Free Maxi試劑盒（Qiagen)的氨節(jié)青霉素抗性 的大腸桿菌培養(yǎng)物制備的。在第二試管中加入10毫升的脂質(zhì)體2000。將兩個管中的內(nèi)容 物加到一起，混合并留在組織培養(yǎng)罩中20分鐘。在這段時間后，按照制造商的脂質(zhì)體方案 (Life Technologies)將溶液逐滴加入到293細(xì)胞的孔中，。在將含有脂質(zhì)體的溶液加入 到各孔之后，將平板返回培養(yǎng)箱中。第二天，從293細(xì)胞除去培養(yǎng)基，并用1毫升的DCDM更 換。將細(xì)胞再孵育2天，此時含有病毒的培養(yǎng)基被除去，并準(zhǔn)備好感染未成熟DC。在DCDM 中10天后，收集樹突細(xì)胞，并在15毫升錐形管中以400Xg進(jìn)行沉淀。用移液管除去上清 液，并用1毫升的DCDM重懸含DC的沉淀物，并用血細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞計數(shù)。通常，每個A β 融合的慢病毒感染和實(shí)驗對照（即，IL-2, Aβ肽，未處理的對照）使用5X IO5個細(xì)胞。24 孔板中總共有10個孔被準(zhǔn)備成PHEMA包被用于感染和對照。按照如上所述完成pHEM包 被，只是每孔中使用500微升的pHEM包被溶液。將來自于轉(zhuǎn)染有融合蛋白載體之293的 含有慢病毒的培養(yǎng)基出〇〇微升）加入到7個孔中。將來自于已轉(zhuǎn)染有空的FUGW慢病毒 載體或含六3融合蛋白0嫩序列仏3 1-13、六3 7-13、六3 16-30、六3 24-35和六3 31-42)的 FUGW載體的293細(xì)胞的條件培養(yǎng)基分別加入到6個孔中。剩下的三個孔做如下處理：1)用 含10微克/毫升A β 1-42多膚的DC的分化培養(yǎng)基（Biomer Technology，Pleasanton CA) 處理；2)用含IL-2的DC分化培養(yǎng)基處理；和3)僅用DC分化培養(yǎng)基處理。然后向每個孔 加入5X IO5個分化的DC。在加入分化的DC后，將平板來回晃動，然后在37°C和5% CO2孵 育2天。在開始感染后的第2天，從各孔移除培養(yǎng)基，并用1毫升DC成熟培養(yǎng)基（DCMM)更 換。DCMM由補(bǔ)充有100微克/毫升的重組人TNF- α和250納克/毫升的脂多糖（LPS)的 DCDM構(gòu)成。用DCMM另外孵育感染的DC3天。
[0091] T細(xì)胞的分離。使用標(biāo)準(zhǔn)的放血技術(shù)從志愿者采集全血。從每個對象采集約20 毫升的全血置于紫色頂EDTA包被的放血管中（Becton-Dickinson)。將血液用PBS (Gibco 目錄#14040) 1 : 1稀釋，并且在50暈升錐形管中，使24暈升的稀釋血液在18暈升 白勺 Ficoll_Paque Plus( I：匕{歹|J I : I. 4, GE Healthcare Biosciences, Upsala, SE,目錄 #17-1440-02)上成層。包含經(jīng)稀釋的血液和Ficoll-Paque Plus的試管在室溫下以400Xg 離心30分鐘。將上清液（即黃色血漿成分）吸走并棄去。小心地移出血漿成分和Ficoll 層之間的界面層并轉(zhuǎn)移到新試管中。此界面層包含有外周血淋巴細(xì)胞（PBL)和單核細(xì)胞。 在含PBL的試管中填充25毫升1XPBS，混合然后以1500Xg離心10分鐘。通過抽吸除去 上清液，并用10毫升PBS將沉淀物重懸。再重復(fù)兩次1500 Xg離心10分鐘和洗滌步驟。 在最后清洗后，將細(xì)胞重懸于1毫升的PBS中，并用血細(xì)胞計數(shù)器計數(shù)。然后將細(xì)胞重懸于 RPMI中達(dá)到20-50 X IO6個細(xì)胞/毫升的細(xì)胞濃度。
[0092] 通過PBL傳代并在無菌尼龍羊毛柱（Polysciences公司，目錄號21759)中孵育它 們而從貼壁細(xì)胞（例如B細(xì)胞和單核細(xì)胞）純化T細(xì)胞。簡言之，通過將5毫升的RPMI培 養(yǎng)基加入到柱的頂部使10毫升的尼龍羊毛柱變濕，并通過打開柱底部的旋塞使培養(yǎng)基通 過該柱。還用5毫升的RPMI培養(yǎng)基完成第二次洗滌，然后通過在頂部加入培養(yǎng)基同時關(guān)閉 旋塞，將5毫升的RPMI培養(yǎng)基留在柱中。然后用注射器柱塞密封該柱的頂部，隨后將含有 RPMI培養(yǎng)基的柱于37°C孵育1小時。在該孵育后，將該柱夾持在堅直位置并打開旋塞，以 允許RPMI培養(yǎng)基穿過該柱。然后用另外5毫升的RPMI清洗該柱并使打開旋塞。將4毫升 的細(xì)胞懸液（2-5 X IO6個細(xì)胞/毫升）加入到柱的頂部（總共4毫升的PBL)，并使溶液進(jìn) 入該柱，關(guān)閉旋塞。然后使1毫升的RPMI在柱的頂部分層，并使其進(jìn)入尼龍羊毛柱。關(guān)閉 旋塞，將柱的頂部用注射器柱塞密封，并且使該柱在37°C孵育1小時。在孵育1小時后，將 柱堅直地安裝在組織培養(yǎng)罩中，移走柱塞。打開旋塞，靠重力收集流出柱的流出物。此流出 物由T細(xì)胞富集的級分組成。用10毫升的RPMI培養(yǎng)基再洗滌該柱一次，并且靠重力流動 來收集流出物。將兩種流出物合并在50毫升錐形管中，并以1500Xg離心10分鐘。吸出 上清液，并將T細(xì)胞富集的制備物重懸于1毫升PBS中。用血細(xì)胞計數(shù)器對細(xì)胞計數(shù)。在 細(xì)胞懸液中僅相對比較大的細(xì)胞作為目的T細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。
[0093] T細(xì)胞的羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯（CFSE)染色。在對從尼龍柱收集的T細(xì) 胞懸液進(jìn)行了計數(shù)之后，將該懸液以1500 X g離心10分鐘，并重懸于4毫升含有0. I % BSA 的PBS (預(yù)先溫?zé)嶂?7°C )中。然后將4毫升含8 μ M CFSE (CellTrace? CFSE細(xì)胞增殖試 劑盒，Invitrogen)的PBS/BSA加入到4毫升細(xì)胞懸液中，并將該混合物在37°C水浴中孵 育8分鐘。孵育后立即用10毫升含10% hyclone胎牛血清（FBS)的RPMI稀釋細(xì)胞溶液。 然后將細(xì)胞懸液在25°C以1500 Xg離心10分鐘。用10毫升含有0. 1% BSA的PBS (牛血 清白蛋白級分V，Calbiochem目錄#2930)洗滌CFSE染色的T細(xì)胞兩次，在25°C以1500Xg 離心5分鐘。在最后一次洗滌后，將T細(xì)胞重懸于1毫升的RPMI中并計數(shù)。通過流式細(xì)胞 術(shù)（Accuri/BD)分析CFSE染色的重懸T細(xì)胞的等分試樣來確認(rèn)CFSE染色。通過流式細(xì)胞 術(shù)（FL1通道）進(jìn)行分析以確認(rèn)CFSE染色的均勻強(qiáng)度。在被感染的3天前從成熟DC除去 成熟分化培養(yǎng)基。
[0094] 將成熟的呈遞HLA-DRA-A β的樹突細(xì)胞和來自診斷患有AD之對象的具有CFSE 標(biāo)記的T細(xì)胞共培養(yǎng)。然后將一百萬（IX IO6)個CFSE染色的T細(xì)胞加入到已被表達(dá) HLA-DRA-Aβ融合蛋白之慢病毒感染的成熟樹突細(xì)胞的各孔中，預(yù)先加載有Aβ 1-42肽（10 微克/毫升），或兩個未處理的孔。通過從一邊到另一邊晃動、隨后前后晃動24孔板來混 合細(xì)胞，以使T細(xì)胞均勻地分布在孔中。將平板放回培養(yǎng)箱中。在第二天，每個孔中加入1 微升的人IL_2(GIBC0,目錄號PHC0026)。IL-2的終濃度為200納克/毫升。通過使平板 經(jīng)受從一側(cè)到另一側(cè)的溫柔晃動將IL-2分散開來，然后將細(xì)胞在37°C孵育9天。在第10 天，如下面所述，通過ACCURItm流式細(xì)胞儀測定CD4陽性T細(xì)胞群。
[0095]用抗CD4免疫染色。通過對每個孔中用新的1毫升移液槍頭將每孔中的培養(yǎng)基轉(zhuǎn) 移到一個單獨(dú)的15毫升錐形管中，收集10天的T細(xì)胞和改造的DC的共培養(yǎng)物。用1毫升 PBS洗滌平孔板的表面，并且將洗滌液與對應(yīng)孔中先前的洗滌液合并。一旦所有孔中的細(xì)胞 被收集，將該試管在450 X g離心10分鐘。棄去上清液，將細(xì)胞用5毫升PBS洗滌一次，然后 以450Xg再離心10分鐘。棄去上清液，收集沉淀物。將細(xì)胞用熒光綴合的抗CD4抗體進(jìn) 行免疫染色（活）并通過流式細(xì)胞術(shù)測定。孵育后，將50微升的每種細(xì)胞懸液（即，IXlO 6 個細(xì)胞）轉(zhuǎn)移到新的流式細(xì)胞管中。每個管中加入1微升氟Alexa647綴合的抗CD4抗體 (Alexa奶|1〇|**'_647小鼠抗人⑶4抗體，BD Biosciences,目錄號557707)。將剩余的50微 升匪S-封閉的T細(xì)胞用作抗體的同種型對照。將1微升的同種型對照抗體（Alexa 647小鼠IgGlk同種型對照，BD Biosciences目錄號557714)加到用于每個實(shí)驗條件下的 同種型對照的細(xì)胞中?？笴D4標(biāo)記的細(xì)胞和同種型對照的細(xì)胞在4°C于黑暗中孵育1小時。 孵育后，在每個試管中加入1毫升冷的含0. 5% BSA的PBS (Calbiochem目錄號2930)，并將 試管以200Xg離心5分鐘。棄去上清液，并且重復(fù)兩次洗滌步驟。在最后一次的洗滌液中 僅包含PBS而無0. 5% BSA。用200微升冰冷的IXPBS重懸各管中的細(xì)胞。
[0096] 通過ACXURI?流式細(xì)胞儀測量⑶4+T細(xì)胞增殖。用Accuri流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞。 使用前向散射（FSC)和側(cè)向散射（SSC)的點(diǎn)狀圖來創(chuàng)建圍繞含T細(xì)胞的群的選通，其是在 初步研究中所確定。該選通內(nèi)的細(xì)胞事件繪制在直方圖FL2上，其示出Alexa647熒光（紅 色）。由抗CD4抗體標(biāo)記的細(xì)胞在直方圖中具有顯著更多的熒光并且選通被用于分離那個 群。FLl (綠色）熒光直方圖顯示CD4+細(xì)胞中的CFSE標(biāo)記。最強(qiáng)烈的標(biāo)記見于（最右邊） 沒有分裂的細(xì)胞中。進(jìn)行細(xì)胞分裂之細(xì)胞的CFSE熒光逐步減少。IL-2處理條件CFSE圖被 用來確定每個步驟（即分裂）的熒光程度。這些標(biāo)志物被轉(zhuǎn)移到每個實(shí)驗條件的CFSE圖 來確定在實(shí)驗過程中已分裂5次以上的CD4+T細(xì)胞。在每種條件下的T細(xì)胞增殖譜的比較 被用來確定各血液樣品中Αβ -特異性CD4+T細(xì)胞的相對豐度和響應(yīng)性。
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【權(quán)利要求】
1. 將人胚胎干細(xì)胞（hESC)分化為成熟的專職抗原呈遞細(xì)胞（APC)的方法，其包括： 誘導(dǎo)所述hESC分化為共同髓系祖細(xì)胞； 誘導(dǎo)所述髓系祖細(xì)胞分化為未成熟樹突細(xì)胞；和 誘導(dǎo)所述未成熟樹突細(xì)胞分化為成熟樹突細(xì)胞，其中所述成熟樹突細(xì)胞是成熟的專職 抗原呈遞細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的將hESC分化為成熟的專職APC的方法，其中所述成熟樹突細(xì) 胞在其HLA II類分子的環(huán)境下主要呈遞單一肽抗原的片段。
3. 擴(kuò)增肽抗原限定性CD4+T細(xì)胞群的方法，其包括以下步驟： 從對象的全血分離⑶4+T細(xì)胞群； 用權(quán)利要求1所述的成熟樹突細(xì)胞培養(yǎng)所述CD4+T細(xì)胞足夠長的時間以允許CD4+T細(xì) 胞經(jīng)歷至少3個細(xì)胞分裂周期，其中由所述成熟樹突細(xì)胞呈遞的單一肽抗原特異性地與至 少一種⑶4+T細(xì)胞的T細(xì)胞受體相互作用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增肽抗原限定性CD4+T細(xì)胞群的方法，其中所述肽抗原包 含疫苗組合物之肽的抗原性氨基酸序列，并且其中所述CD4+T細(xì)胞群擴(kuò)增至少三個周期表 明對象對所述疫苗組合物的肽產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的擴(kuò)增肽抗原限定性CD4+T細(xì)胞群的方法，其中所述疫苗組合 物是流感病毒疫苗組合物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的擴(kuò)增肽抗原限定性CD4+T細(xì)胞群的方法，其中所述肽抗原包 含所述對象已對其產(chǎn)生免疫應(yīng)答的肽的抗原性氨基酸序列，并且其中所述免疫應(yīng)答是疾病 或病癥發(fā)生或發(fā)展的指示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)增肽抗原限定性CD4+T細(xì)胞群的方法，其中所述疾病或病 癥是阿爾茨海默病。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的擴(kuò)增肽抗原限定性CD4+T細(xì)胞群的方法，其中，所述肽是淀粉 樣蛋白(1-42)或其片段。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的將hESC分化為成熟的專職APC的方法，其中所述成熟樹突細(xì) 胞包含編碼融合蛋白的重組核酸，所述融合蛋白包含肽抗原的氨基酸序列、肽接頭和與圖9 中所示氨基酸序列有至少90 %同一性的氨基酸序列。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的將hESC分化為成熟的專職APC的方法，其中所述肽抗原包 含淀粉樣蛋白(1-42)或其片段的氨基酸序列。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的將hESC分化為成熟的專職APC的方法，其中所述淀粉樣蛋 白-3 (1-42)的片段選自 A 3 1-13、A 3 7-13、A 3 16-30、A 3 24-35、A 3 31-42、A 3 7-23，或 其任何組合。
【文檔編號】C12N5/0784GK104428411SQ201380033983
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年5月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月8日
【發(fā)明者】道格拉斯·韋恩·埃特爾 申請人:健康科學(xué)西部大學(xué)