基于木質纖維原料產糖發(fā)酵生產微生物油脂的高新技術的制作方法
【專利摘要】提供了幫助從木質纖維原料中糖釋放和利用這些糖來生產微生物油脂(例如，生物燃料)的方法。這些方法包含了利用多種氧化劑(臭氧，超氧水，等)在不超過50℃的溫度和不超過1.5大氣壓的壓強下對木質纖維原料預處理，使原材料更容易進行酶水解降解成糖和通過產油微生物利用這些可溶性糖發(fā)酵生產微生物油脂。
【專利說明】基于木質纖維原料產糖發(fā)酵生產微生物油脂的高新技術

【技術領域】 這項發(fā)明是關于一個高效地從木質纖維原料中釋放糖類，并且利用這些糖為原料發(fā)酵 生產生物能源和生物化學品，例如微生物油脂的方法。這項發(fā)明的特別之處在于不僅提供 了木質纖維原料預處理，在高固含量下用不同酶水解預處理后的生物質，利用含有從纖維 原料中釋放出的糖的酶解液來發(fā)酵產油酵母生產微生物油脂，即木質纖維原料分步水解發(fā) 酵法，而且包含了用同步糖化發(fā)酵（即預處理后的纖維原料酶解和產油微生物發(fā)酵同時進 行）生產微生物油脂的方法。

【背景技術】 木質纖維原料，例如農業(yè)和林業(yè)中的殘留物是具有吸引力的生產生物能源和生物化學 產品原料。因為它們量大，價格低（Cardona&S<inChez，2007)并且對環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展有好 處（Demirba§, 2003)。木質纖維原料是由纖維素，半纖維素和木質素組成的復雜性網絡結 構，并且它們在其中所占比例隨著種，屬，甚至原產地的不同而改變（Carere et al.，2008 ; Chandra et al.，2007)。因為這些復雜的聚合物的難以處理的天然屬性，需要用強熱化學 處理（例如，預處理）來使原料易于被商業(yè)纖維酶或者微生物產生的酶水解，來釋放其中的 糖進行后續(xù)發(fā)酵。 不同的木質纖維原料對纖維素酶有不同程度的抵抗能力。如木質素含量，纖維素結晶 度，排列結構以及半纖維素分支等因素影響整體原料的糖化能力。預處理可以通過木質素 脫除（Jeoh et al.，2007)和纖維素結晶度降低（Mosier et al.，2005)來達到促進植物原 料降解的目的。然而，預處理階段是在植物原料轉變成生物能源或生物化學品過程中比較 昂貴的階段之一?？梢越邮艿念A處理方法應該滿足高糖得率、低酶用量、低成本和最小碳水 化合物降解量。與此同時，預處理過程不能產生高濃度的對后續(xù)糖化和發(fā)酵產生抑制作用 的抑制物（Lynd et al.，1999;Tao et al.，2011)。許多的預處理方法，例如稀酸，蒸汽爆 破，熱水，氨爆破，堿水解，氧化脫木質素，有機溶劑法，生物預處理法臭氧化已經被探索和 用來改變植物原料物理化學性質，從而降低其耐降解性。 之前有大量報道討論關于臭氧對木質纖維原料進行預處理。之后的專利和參考文獻描 述了這個過程：U. S. Pat. No. 20100159521A1 (Cirakovic&Diner，2010b) ;U. S. Pat. No. 2010 0159522A1 (Cirakovic&Diner, 2010a) ；E.P.Pat No.0,045,500 (Ishibashi et al.,1985)； (Garcia-Cubero et al.，2009;Garcia_Cubero et al.，2012)。所有的這些專利和出版物 都在這一發(fā)明中整體引用。 利用無水的液氨或者是氫氧化銨溶液來對木質纖維原料預處理已經很好的實踐了。之 后的專利和參考文獻描述了這個過程：：U. S. Pat. No. 20120325202 (Dale，2012) ;U. S. Pat. No. 7915017Β2 (Dale, 2011) ；U. S. Pat. No. 20090221042A1 (Dale et al. ,2009) ；U. S. Pat. No.00610688A (Dale&ffeaver, 2000) ；(Kim&Lee,2005, 2007 ；Kim et al. ,2008 ；Yoo et al., 2013)。所有的這些專利和出版物也整體整合在本發(fā)明中。 以上所提到的預處理方法有些缺陷，包括分離五碳糖和六碳糖流（例如濃酸和稀酸 法），糖的降解（例如，酸或醛會導致較差的碳水化合物回收和對接下來下游過程，如糖化 和發(fā)酵，有抑制作用），長的預處理時間（例如，生物預處理），不完全破壞木質素-碳水化 合物網（例如，蒸汽預處理）和在中和酸或堿過程中廢棄產品的處置。組合預處理策略通 ?？梢愿咝У卮龠M植物原料的降解，并且經常應用于設計先進的預處理技術。一種用結 合在較高的溫度下（75-150°C )，低濃度無水氨堿性處理之后，用臭氧氧化或者反過這兩者 順序的方法已經被證明了可以提高酶解糖化得率（Cirakovic&Diner，2010b)。然而，在之 前的文章中每個步驟的具體作用沒有明確的闡釋。一種用氫氧化銨在室溫下處理棉秸桿 60天，之后用臭氧處理的預處理方法可以獲得其中50%木質素的降解（Ben-Ghedalia et al.，1980)。這種用羥基自由基（臭氧/雙氧水，超氧水）先進的氧化過程的反應速率比單 純的臭氧處理反應速率要高，因為它們與有機和無機化合物反應速度快，并且克服了擴散 效應的影響（Nothe et al.，2009)。 植物原料預處理后，一般分步或同步用纖維素酶進行酶解產糖。對于工業(yè)生產生物 能源過程來說，經過糖化步驟后，高糖濃度更利于實現(xiàn)連續(xù)的或間歇的發(fā)酵過程。之后，在 乙醇發(fā)酵過程中，同步糖化發(fā)酵技術被廣泛應用來取代分步糖化發(fā)酵技術（Elliston et al·，2013 ;Lim et al·，2013 ;Lin et al·，2013 ;Suriyachai et al·，2013)，但是還未廣泛 用于利用產油微生物生產微生物油脂。產油微生物，例如酵母和真菌可以利用從木質纖維 原料中生產的五碳糖和六碳糖（Gao et al.，2013;Huang et al.，2009;Tsigie et al·， 2011 ;Yu et al.，2011 ;Zeng et al.，2013)，使整個過程更有效率，同時也需要開發(fā)一套預 處理糖化過程可以生產單一的糖流（包含五碳糖和六碳糖），并且測試這些從木質纖維原 料得到的糖來生產生物能源或生物產品的應用能力。產油微生物有積累油脂的達到細胞 干重的70%的能力（Chen et al.，2009)。然而，其需要異樣培養(yǎng)是需要有機碳源的。大 量的報告指出，利用產油酵母作用于不同的底物來積累油脂，比如甘油（Duarte et al.， 2013 ;Kitcha&Cheirsilp，2013 ;Meesters et al. ，1996 ;Papanikolaou&Aggelis，2002)， 下水道污泥（Angerbauer et al·，2008 ;Huang et al·，2013a ;Peng et al·，2013)，whey permeate(Akhtar et al·，1998 ;Ykema et al·，1988)，甘鹿糖衆(zhòng)（Alvarez et al·，1992; Gonzalez-Garcia et al·，2013 ;Schneider et al·，2013)，稻桿水解物（Huang et al·， 2009)。用木質纖維原料避免了"用于能源還是作為糧食的矛盾"的問題。微生物油脂中的 脂肪酸與傳統(tǒng)植物油脂中的相類似，產油酵母已經被證實是可以滿足生物柴油工廠生產的 可行的微生物（Zhao et al.，2010)。


【發(fā)明內容】
因此，本發(fā)明的目標是提供一個可以對木質纖維原料進行預處理，糖化，并且用這些可 溶性糖/植物原料進行發(fā)酵獲得生物燃料或生物產品的過程。這個過程有兩個步驟，第一 步驟，主要是破壞纖維素表面木質素阻礙，從而使疏水作用降低。第二步驟是允許植物次生 壁細胞中的木質素脫除，并且使纖維結構溶脹，從而利于纖維素酶水解纖維素產糖。此外， 這項發(fā)明的目標是預處理過程中木質素改性或是分解，通過在第一步中用強反應試劑來提 高第二步反應的效率。另外，這項發(fā)明的目的是開發(fā)一種可以用高的預處理木質纖維原料 底物濃度來生產可溶性糖的酶解過程。還有，這項發(fā)明的目的是用預處理的植物原料直接 地應用于同步糖化發(fā)酵過程，去生產微生物油脂或是用從分步酶水解先得到的可溶性糖， 再通過產油微生物（任何種類的真菌、細菌、酵母和水藻）來生產微生物油脂。這些或其他 的目的將會通過參考后面描述和圖畫的逐漸闡述。 本發(fā)明提供了促進木質纖維原料水解來生產可溶性糖和應用其中木質素的預處理方 法。糖和木質素產品可以用來生產生物燃料或生物化學品。這些方法可以用于經過機械磨 碎含有不同水分的木質纖維原料。這些原料可以被氧化劑選擇性地進行表面木質素改性， 然后用液態(tài)氨進行纖維素溶脹和結晶度降低。經過處理后，預處理后的原料主要是碳水化 合物，并且更容易進行酶解產糖。預處理之后，高碳水化合物含量的原料被纖維素酶水解來 產生單一可溶可發(fā)酵糖流包括五碳糖（木糖和阿拉伯糖）和六碳糖（葡萄糖和半乳糖）。 這個糖流中包含極少量的預處理產生的抑制物，如有機酸、呋喃、羧甲基糠醛等。得到的可 發(fā)酵糖可以用于生物化學品或生物產品的生產。 在方案中，預處理木質纖維原料的過程包含： (a) 提供含有纖維素，半纖維素和木質素的木質纖維原料； (b) 研磨木質纖維原料，比如到達20-60目； (c) 用水調整植物原料的濕度從0到90% ; (d) 用含有臭氧的氣流在半連續(xù)模式不銹鋼容器中處理原料，其中臭氧濃度在1-20% (質量比）之間，溫度在〇到25°C，反應時間1到20分鐘。原料中的木質素被改性到一定 的程度。 (e) 之后，原料用液氨浸泡，氨水的濃度不要超過30% (質量體積比），并且原料固含量 在1-20% (質量體積比）之間，在15-50°C溫度范圍，反應1-24小時。反應之后，包含木質 素和液氨的液相用過濾或離心法分離，并且剩余的固體被清洗或中和，例如加入酸，如硫酸 或者鹽酸。預處理過程擴大了纖維素微束的結構，并且降低了纖維素的結晶度，使原料容易 水解成單糖。 在另一個方案中，預處理木質纖維原料的過程包含： (a) 提供含有纖維素，半纖維素和木質素的木質纖維原料； (b) 研磨木質纖維原料，比如到達20-60目； (c) 形成或提供3-30% (質量體積比）的雙氧水水溶液； (d) 用雙氧水調整植物原料的濕度從0到90% ; (e) 用含臭氧的氣流在半連續(xù)模式不銹鋼容器中處理原料，其中臭氧濃度在1-20% (質量比）之間，溫度〇到25°C，反應時間1到20分鐘。原料中的木質素被改性到一定的 程度。 (f) 之后，原料用液氨浸泡，氨水的濃度不要超過30% (質量體積比），并且原料固含量 在1-20% (質量體積比）之間，在15-50°C下，反應1-24小時。反應之后，包含木質素和液 氨的液相用過濾或離心法分離，并且剩余的固體被清洗或中和，例如加入酸，如硫酸或者鹽 酸。預處理過程擴大了纖維素微束的結構，并且降低了纖維素的結晶度，使原料容易水解成 單糖。 在一些方案中，預處理木質纖維原料的過程包含： 經過上述（a)和（b)過程之后，用水或用3-30% (w/v)的雙氧水水溶液調整原料的濕 度0% -90% (質量體積比）。 濕度調節(jié)之后，原料用液氨浸泡，氨水的濃度不要超過30% (質量體積比），并且原料 固含量在1-20% (質量體積比）之間，溫度在15-50°C，反應1-24小時。反應之后，包含木 質素和液氨的液相用過濾或離心法分離，并且剩余的固體被清洗或中和，例如加入酸，如硫 酸或者鹽酸。預處理過程擴大了纖維素微束的結構，并且降低了纖維素的結晶度，使原料容 易水解成單糖。 (f)之后的步驟用液氨按照上述敘述浸泡，來生產可以糖化的原料。 在另一個方案中，預處理木質纖維原料的過程包含： 經過上述（a)和（b)過程之后，用水或用3-30% (w/v)的雙氧水水溶液調整原料的濕 度0% -90% (質量體積比）。 用含臭氧的氣流在一系列或單個不銹鋼容器反應釜中以半連續(xù)模式處理經過濕度調 節(jié)的原料，其中臭氧濃度在1-20% (質量比）之間，溫度在0到25°C之間，反應時間2到20 分鐘。原料中的木質素被改性到一定的程度。未反應的臭氧或產生的其他氣體被回收用來 生產純的空氣和氧氣。 之后的步驟是用液氨按照上述敘述浸泡，來生產可以糖化的原料。 在另一個方案中，用來回收（e)步驟中氨廢液中的木質素和氨的過程包含： 收集木質素-液氨（溫度30-50°C )溶液到儲存罐中； 在50-80°C下，將木質素-液氨溶液中的氨蒸發(fā)； 用氫氧化銨的形式將氨回收，并且繼續(xù)用于液氨浸泡處理； 從剩余溶液中回收的不含氨的木質素，通過蒸發(fā)，酸沉淀或者膜過濾來獲得； 純化分離出的木質素的過程包含：1.醋酸溶解，2.過量水沉淀，3.離心，4.用二氯甲烷 溶解，5.用乙醚沉淀，6.干燥得到最終純的木質素。 在另一個方案中，這項發(fā)明的方法進一步地與用酶水解預處理原料來生產可酵解糖結 合。水解過程包含用緩沖液將原料配成5-20%的固含量的溶液，然后用酶水解原料（例如， 用混合微生物）來生產濃縮的糖流。 在這一部分中，包含用可溶性糖進行發(fā)酵的過程?？扇苄蕴峭ㄟ^這里的描述方法可以 得到。通過酶解反應后得到的水解液可以被用來生產微生物油脂，乙醇，丁醇，異丁醇或者 其它的生物化學品和生物產品。 在這個部分，包含直接用預處理后的原料進行同步酵解發(fā)酵的過程。預處理后的原料 可以被用來在25-40?下，進行同步酵解發(fā)酵來生產生物燃料和生物產品。 這項發(fā)明的其他的特點和優(yōu)點將會在之后的發(fā)明的描述中闡述，并且部分可以從描述 中明顯獲得或者從現(xiàn)實實踐中獲得。這項發(fā)明從此文敘述和聲名中特別指出組成和方法。

【專利附圖】

【附圖說明】 為了詳細的了解和闡述這項發(fā)明，用之后的容易理解的描述和配圖來做參照： 圖1.是兩步法"臭氧-液氨浸泡"預處理過程100的流程圖。 圖2.是兩步法"臭氧-液氨浸泡"預處理過程中在一系列反應器中臭氧氧化過程102 的流程圖。 圖3.是兩步法"臭氧-液氨浸泡"預處理過程中，通過廢氣處理器來報廢不需要的氣 體和殘留的臭氧來凈化氣體流，降低空氣/氣體成本過程103。 圖4.是氨和木質素回收過程104的流程圖。 圖5.是用分步水解過程200和產油微生物發(fā)酵產生物油脂過程300的流程圖。 圖6.是用產油微生物進行同步糖化發(fā)酵產生物油脂過程400的流程圖。 圖7.代表不同種類的產油酵母產微生物油脂。 圖8.展示了稻草桿粒徑和臭氧-氨浸泡預處理的同步糖化發(fā)酵物料衡算數(shù)據。 細節(jié)描述 木質纖維原料的主要成分碳水化合物或者多糖（纖維素和半纖維素）有提供為生產 成本低廉、可再生，經過發(fā)酵或非生物學轉化產生生物燃料（包括生物乙醇，生物丁醇，微 生物油脂和生物甲烷等）或生物化學品的糖源的可能性。然而，木質纖維原料難于降解，需 要用有效的預處理過程使多糖更容易被水解。本發(fā)明的系統(tǒng)提供了兩步原料預處理方法。 開始，疏水的木質素分子被高效氧化劑（如臭氧、超氧水）進攻，然后部分處理過的原料進 一步地在相對低溫，低壓強的條件下，用液氨浸泡處理。這里公開包括減少預處理試劑（臭 氧，雙氧水和氨）用量或將其回收的方法。這些方法的優(yōu)點部分體現(xiàn)在預處理時，較低的溫 度和壓力需求。
[0050] 這項發(fā)明的基本的預處理過程100已經在流程圖（圖1)中展示。木質纖維原料 用錘式粉碎機E-Ol研磨，然后通過P-02傳到濕度調整反應器E-04。用蒸汽發(fā)生器E-03進 行濕度調整。經過濕度調整的原料被送到預處理段101。在一些方案中，雙氧水和水加入 到E-02罐。（從E-05儲藏罐）中提供的純的氧氣、氧氣-空氣混合氣體或者純的空氣的 氣體流通過氣體輸送裝置P-07被輸送到壓縮系統(tǒng)E-06。壓縮氣體流（P-08)被輸送到臭 氧發(fā)生器E-07。富含臭氧的氣體由管道P-09輸送到已經裝填好調整好濕度原料的預處理 反應器E-08。預處理反應后，多余的氣體混合物通過連接器P-IO經E-09排出。預處理后 的原料輸通過管道P-Il送到氨浸泡預處理反應器E-10。預處理中需要的液氨溶液可以由 儲藏池 E-Il經過管道和泵系統(tǒng)（P-12, P-13and E-12)提供新鮮的液氨，或是從回收過程 1〇4(圖4)經過相同的系統(tǒng)提供回收氨。處理過后的原料稀漿由管道P-14被注入到分離 罐E-13中，分離后的原料可以用E-15罐中的新鮮的水洗滌，或者用E-15儲存槽中的酸中 和殘余氨。分理出的溶液經過分離釜E-13輸送到E-14(圖4)。從反應器E-13中輸出的更 多反應的原料之后被送往過程200去生產可以酵解的糖在過程300生產生物燃料或生物產 品，或者原料直接送到過程400進行產品生產。 圖2.闡釋了 101段為了更高效的在一系列的反應器（E-08A或E-08B a或E-08C)中 應用臭氧，降低它的成本的改變。在102段改變包括富含臭氧的氣體輸送穿過E-08A罐，并 且它的廢氣通過管閥系統(tǒng)（P-18, P-19和V-1)連接/不連接到E-08B罐，相似的通過管閥 系統(tǒng)（P-20, P-21和V-2)連接/不連接到E-08C罐。 圖3.解釋了對101和102段改變通過引用氣體清潔系統(tǒng)E-16來減少通入氣體成本。 氣體凈化系統(tǒng)可能包含一個洗滌器和/或熱降解和/或催化降解器，這些在之前的參考文 獻中闡述：：U. S. Pat. No. 6315861B1 (Jos印h et al.，2001) ;Ε· P. Pat. No. 0526383 (Jos印h et al.，1993)，之后連接包含冷卻單元和/或干燥氣體狀態(tài)單元E-17。氣體清潔系統(tǒng)已經 商業(yè)化，并且通過閱讀指南很容易理解使用。 圖4顯示了下一個用來處理從過程100中得到的溶液方法的過程104。最初，利用泵 E-18和管道P-25和P-26,溶液被泵供給到可在市場中買到的滴流床容器E-19。然后，蒸汽 從底部通過容器E-19來從溶液中用逆流法汽提大部分的氨。在說明書中，知道如何操作的 氨汽提系統(tǒng)需要一定的技能。含氨蒸氣再經氫氧化鈉接觸（從容器E-22提供）在接觸容 器E-21中再次被轉化為氫氧化銨?；厥瞻比缓蟊淮鎯υ谌萜鱁-Il用來做下一步液氨浸泡 預處理。下游出來的管流中含有水，木質素，硅，抽出物等，經過熱交換器E-23來進行熱回 收，冷卻流被供給到分離容器E-24。在篩選或膜分離之后，大分子量的木質素被回收并存儲 到容器E-25。從分離容器E-24產生的流供給到吸附柱吸附低分子量的木質素，并把它存儲 在容器E-28。來自塔的廢物流進一步接收到儲罐E-27。 圖5和6顯示下一步處理過的木質纖維素生物質的酶解過程200,油脂發(fā)酵過程300和 同步糖化發(fā)酵過程400。下一步的處理，包括經過101和/或102和/或103過程得到的預 處理后的木質纖維素材料與一種或多種水解酶反應的過程200。潛在的，處理是在含有木質 纖維原料，糖化酶，檸檬酸或醋酸緩沖液中的一種和水的液態(tài)介質中進行。在糖化過程中的 固含量，例如約〇. 1% (w/v)到20% (W/V)合適的葡聚糖可以加入到液態(tài)溶解介質。在說 明書中，一項技能是了解關于木質纖維原料的葡聚糖含量?？扇苄蕴堑牧鳎ɡ?，葡萄糖， 木糖，阿拉伯糖，甘露糖等）可以在過程200的后期獲得。這個流然后被進一步用于發(fā)酵過 程300,在本發(fā)明中用產油酵母作為示范，并不僅限于它們，而一系列的利用糖的微生物可 用于各種過程，如生產生物乙醇，丁醇，有機酸，抗生素等。在另一個過程400中，預處理的 生物質是被直接用在同步糖化發(fā)酵過程。 定義 "木質纖維原料"是指主要包括木質素，纖維素和半纖維素的材料。"木質纖維素生物 質"是指植物材料含有木質素，纖維素和半纖維素，包括但不限于，小麥秸桿，麥秸，稻草，玉 米秸桿，甘蔗，甘蔗渣，草（例如柳枝稷），麻，玉米，高粱，甘蔗，竹，樹木和木材（如棕櫚油， 桉樹，楊樹，柳，奇崗，等），廢報紙，報紙，果殼，牛糞，都市固體廢棄物，等。木質纖維素生物 質大致可分為原始植物原料，廢棄植物原料和能源作物。原始生物質包括所有自然生長的 陸生植物，如樹木，灌木和草。廢棄生物質是各產業(yè)部門生產的低價值的副產品如農業(yè)（如 玉米秸桿，甘蔗渣，秸桿等），林業(yè)（鋸木廠和造紙廠的廢物）。能源作物是以產量高的木質 纖維素生物質作物作為第二代生物燃料的生產原料；例如柳枝稷和大象草。 "碳水化合物"指的是長鏈的糖分子或在木質纖維素生物質中發(fā)現(xiàn)的多糖，包括纖維 素、半纖維素。 "糖"是指從木質纖維素生物質水解得到的糖。這些糖包括，葡萄糖，木糖，甘露糖，阿拉 伯糖，半乳糖。 "預處理"指的是一種在酶解前用于處理木質纖維素生物質的過程。本文所包含的方法 包括為了使植物原料更易于水解，如酶水解，的預處理方法。用來預處理的試劑包括一個或 多個：一個或一個以上的高活性氧化劑和一種或多種堿化劑。預處理方法的步驟一般是在 降低（低）溫度和/或降低（低）壓條件下運行。在某些方面，只采用降低溫度。在其他 方面，只采用減少壓力。在另一實施例中，低的溫度和低的壓力都被采用。我們指的"低溫" 是溫度在30°C左右，最低可達4°C。因此，溫度使用范圍從大約4到30度。用"低壓力"，我 們的意思是，預處理反應進行的壓力可達1. 5個大氣壓。在下降低溫度和/或壓力的條件 下進行這些反應的優(yōu)點包括，例如：低維護成本，運營和資本成本。 適當?shù)睦w維原料的粒徑按照一些實施例中的描述，植物原料被引入一個反應釜或容器 進行反應。容器必須能夠耐受描述所需的溫度和壓力，可以進一步包括混合或攪拌，監(jiān)測溫 度和壓力的各種儀表，為了引進和去除（如吸走）反應物的各種進口和出口閥，等。罐的制 作材料還應當暴露在這里使用的試劑時，不易被腐蝕，如不銹鋼。 生物質，然后接觸（暴露）于至少一種氧化劑。示例性的氧化劑，可用于本發(fā)明的包 括但不限于：臭氧，超氧水（臭氧加過氧化氫）；單獨的過氧化氫酶，酶，如漆酶，過氧化物酶 等，以及它們的組合。結合"是指生物原料可能在相同的時間里會接觸到兩種或兩種以上的 氧化劑（例如，在一個單一的混合物，含有生物原料和兩種或兩種以上的試劑）或按順序， 比如生物原料可能接觸到第一個氧化劑，然后接觸到另一個不同的氧化劑。在某些方面，如 果是按步驟地接觸，洗滌或漂洗原料的步驟在接觸一個（例如第一）氧化劑后和在接觸到 另一個（第二個）之前可以進行，或不包括在接觸間干燥原料的步驟。示范性的氧化和堿 化劑的特點，以及它們的組合，描述如下。 "臭氧化"是用臭氧處理的木質纖維素生物質的行為。木質纖維素類生物質可在水懸浮 液中或在固體干燥相。在本發(fā)明的某些方面，木質纖維素生物質最初與含有臭氧的氣體接 觸。臭氧氧化木質纖維素聚合物，導致聚合物的脫木素和碎裂，從而減少木質纖維素材料的 疏水性，縮短氨水浸泡所需的時間和提高用于產糖的糖化酶對原料中纖維素的接觸性。 "包括臭氧的氣體"指的是一種氣體，包含至少是約80%至約99%的其它氣體，通常是 約1至約20%的臭氧。氣體的其他成分可能是任何可以作為一個臭氧的載體，包括但不限 于"空氣"，例如壓縮空氣；氮；氧；二氧化碳，一氧化碳，氫，氦及其混合物等。這種氣體混合 物可以被稱為"富含臭氧的氣體"。 富含臭氧的氣體通常作為氣體流傳遞到生物質中的速率從約〇. 1升/分鐘到約10升 /分鐘或更高的傳遞率，一般是在范圍從約〇. 5到約5升/分鐘，如0. 5,1，1. 5, 2, 2. 5, 3， 3. 5,4,4. 5,或5升/分鐘。氣體可能被吹到或越過生物物質的表面，最好伴有原料的攪拌 或以某種方式將氣體混合其中；或氣體可通入或通過原料；或氣體可以引入存有原料的容 器（如密閉容器），用旋轉，振動，或一些其他形式的攪拌的方法將氣體和容器中的原料混 合；或原料和氣體通過一個共同的通道或管道同時對流，等。考慮到互相的影響，充分的氣 體和原料的運動可以提供臭氧和木質纖維素材料之間的接觸，通過用原料接觸和/或擴散 (注，滲透，浸漬）中的方式，允許氣體以某種方式氧化原料。 臭氧可能來自任何合適的來源。例如，制備臭氧的方法如：科羅娜放電的法，經紫外線 (UV)的臭氧發(fā)生器，通過真空紫外線（VUV)臭氧發(fā)生器，通過冷等離子體的方法，通過電解 產生臭氧（EOG)，等。在一些實施例中，臭氧是用一個或兩個例如L11-L24臭氧發(fā)生器（由 美國加利福尼亞太平洋臭氧制作）用空氣和氧氣生產臭氧。 臭氧處理的時間長度是從2分鐘到2小時，通常是從2分鐘到60分鐘左右，例如2, 5， 10,15, 20, 25, 30, 35,40,45, 50, 55 或 60 分鐘或更長的時間，例如 65, 70, 75,80,85,90,95， 100,105,110,115,或120分鐘。臭氧處理通常是在壓力為約1至約1.5的大氣壓下或1，2， 3,4, 5 或 6psig。 在一個方面中，本發(fā)明采用結合過氧化氫和臭氧（超氧水）產生的羥基自由基方法處 理木質纖維素原料。在這方面采用通過H2O2產生高活性的羥基自由基基于芬頓原理用于使 木質素碎片化。羥基自由基與芳香木質素化合物反應并使之降解，造成脫甲氧基化，β-0-4 醚鍵的裂解，羥基化和Ca鍵的氧化。 根據這一方面，大小合適的原料與過氧化氫溶液（通常為水溶液）接觸或混合，并隨后 接觸如上敘述的臭氧。加入反應的過氧化氫濃度（用過氧化氫和臭氧的摩爾比表示）范圍 一般從約為0. 25 : 1摩爾比到約為3 : 1的摩爾比，例如約為0. 25 : 1，0. 5 : 1，0. 75 : 1， 1 : 1，1.25 : 1，1.5 : 1，1.75 : 1，2 : 1，2.25 : 1，2.5 : 1，2.75 : 1，或 3 : 1。這一 濃度的加入量一般在 100 (KT6 到約 1000 (KT6 (例如 100,150,200,250,300,350,400,450， 500, 550,600,650, 700, 750,800,850,900,950 或 1000 (ΚΓ6)升 / 每克原料。提供最終的過 氧化氫/原料的質量/質量比為約〇. 03到0. 3 (例如0. 03,0. 05,0. 1，0. 15,0. 2,0. 25或 0· 3) 〇 原料與過氧化氫（水溶液）的混合物被放置在一個容器里，并暴露于臭氧如上所述，在 低溫、低壓條件中的一個或兩個條件下進行。暴露于臭氧的時間長度通常是從2分鐘到20 分鐘左右（例如 2, 3,4, 5,6, 7,8,9,10,11，12,13,14,15,16,17,18,19,或 20 分鐘）和從 2 分鐘到2小時（例如10, 20, 30,40, 50,60, 70,80,90,100,110或120分鐘）。臭氧處理通常 是在壓力為約1至約1. 5的大氣壓下或1，2, 3,4, 5或6psig。 "結合預處理"，根據本發(fā)明的另一方面，臭氧或超氧水過程中用一種快速的氧化劑，進 行初始或初步的木質素脫除，以提高效率和減少氨與原料預處理所需要的時間。氨可以是 液體或氣體。臭氧或超氧水最初改變木質素的結構（Buie et al.，2013)，并且隨后暴露于 氨造成進一步的變化（Gao et al.，2012)，同時，降低纖維素原料中的結晶度使它容易糖化 成碳水化合物。如果用液體（如含水）氨，原料中的纖維也會有利地發(fā)生溶脹。 初始的臭氧或超氧水處理通常是在（如上述的臭氧或超氧水預處理）一個周期，時間 范圍從2分鐘到60分鐘，通常從2分鐘到2小時中進行。這一步反應的條件是低溫度和/ 或壓力，如上。此后，經過處理的材料暴露于氣態(tài)氨，或浸泡在液態(tài)氨，例如氫氧化銨溶液。 如果使用氣態(tài)氨，處理方法如下：經臭氧氧化或超氧水處理后的生物質裝在一個圓柱 形反應器中，然后氣態(tài)氨在要求的時間內通過填充柱。 如果用氨溶液，一般是水和溶液，氨的濃度一般是從約5%至約30% (例如5,10,15， 20, 25,或30% )。原料與含水氨的比，例如，從約5%至約25%質量/質量（如5,10,15， 20,或 25% )。 在含水氨中浸泡（暴露，接觸，等）的步驟通常在一段時間范圍從30分鐘到24小時內 進行，通常從30分鐘到幾天。這一步也是在較低的溫度和/或壓力條件下進行，如在溫度 范圍從約 20°C至約 70°C (例如 20, 25, 30, 35,40,45, 50, 55,60,65,或 70°C )，最好是從約 30°C到約60°C。一般，最高溫度約60°C被應用于本發(fā)明。 "水解"或"纖維素分解"酶指的是一系列的酶通常會包含一種或多種纖維素酶，木聚糖 酶，或用來消化木質纖維素生物質的酶。適當?shù)拿缚赡馨?，例如，?) 一種或一種以上的 纖維素酶，（2) -種或更多的半纖維素酶，（3) -種或更多的木質素酶。纖維素酶包括纖維 素內切酶（內切葡聚糖酶），纖維素外切酶（外切葡聚糖酶），和/或（_葡萄糖苷酶（纖維 二糖酶）等。半纖維素酶包括（_木糖苷酶，α-阿拉伯呋喃糖苷酶，木葡聚糖酶，乙酰木聚 糖酯酶，α-葡萄糖醛酸苷酶，木聚糖酶，等。"木質素酶"包括木質素過氧化物酶，漆酶和錳 過氧化物酶，等。 "水解液"指的是一個含有水解酶，預處理的木質纖維素生物質和酶作用在生物質而得 到的糖的溶液。 "酶用量"是用來消化木質纖維素生物質的酶量，并考慮使用濾紙單元（FPU)或纖維二 糖單元（CBU)或酶溶液的克重。 "毒物"或"抑制劑"是抑制微生物生長的有機酸和呋喃化合物，如乙酸和5-羥甲基糠 醛，糠醛，等。 "糖化"指的是用酶水解多糖生產糖。 "產油微生物"或"產油的"，指的是任何微生物（細菌，酵母，真菌和藻類），可利用糖發(fā) 酵生產油脂。證明可以產油的酵母菌株包括：彎曲隱球菌，膠紅類酵母菌，紅冬孢酵母菌，斯 達油脂酵母，解脂耶氏酵母，發(fā)酵絲孢酵母，等?？梢耘e出的一些潛在的脂質生產真菌菌株， 如稻根霉菌，費希新薩托菌，球毛殼，黑曲霉，深黃被孢霉，雅致小克銀漢霉，卷枝毛霉菌，土 曲霉，密叢毛霉和疏綿狀嗜熱絲孢菌，等?？捎糜趯嵺`本發(fā)明的細菌的例子包括但不限于物 種，如分枝桿菌，棒狀桿菌，諾卡氏菌，分節(jié)孢子桿菌等。藻類可用于實踐本發(fā)明包括但不限 于：小球藻，鹽藻等。 "發(fā)酵"是指用酶水解產生的糖利用產油微生物生產目標產品的過程。 "廢物"是在預處理工藝中無用的化學物質。廢棄化學品包括酸如硫酸或鹽酸，以及堿， 如氫氧化鈉。 "堿性處理"是是用堿性的或高PH的化學品的混合物對木質纖維素生物質進行預處理。 "室溫"或"環(huán)境溫度"，是指在約15°C至約30°C之間的任何溫度。 "同步糖化發(fā)酵（SSF) "是指在這一過程中，糖化發(fā)酵步驟發(fā)生在同一個單元的操作。 在這一過程中，預處理后的木質纖維素生物質混合糖化酶和產油微生物進行同步糖化發(fā)酵 (SSF)。酶破壞復雜的二糖或寡糖或多糖（如纖維二糖，木聚糖，葡三聚糖，纖維素，半纖維 素，等）釋放供微生物生長和生產生物燃料或生物制品時可使用的單糖（如葡萄糖，木糖， 甘露糖，阿拉伯糖，半乳糖）。固含量和纖維素酶的用量可隨特定條件的變化而適當變化，例 如微生物類型，原料類型，等。 SSF經常應用到乙醇的生產中。由于減少酶解過程中形成的纖維二糖和葡萄糖對酶 解的抑制作用，SSF可以產生更高的產品產率和需要較少量的酶（Elliston et al.，2013 ; Emert&Katzen，1980 ;Emert et al.，1980 ;Gauss et al. ?1976 ；Gutierrez et al. ? 2013 ； Hoyer et al. ，2013 ;Huang et al. ，2013b ;Spindler et al. ，1989 ;Spindler et al.， 1987 ;Takagi et al.，1977 ;Wi*ight et al.，1987)。SSF 和半纖維素糖發(fā)酵相結合，因為較 低的成本，已引起人們的重視（Dien et al.，2000;Golias et al.，2002)，并且，這樣的組 合可以在本發(fā)明中應用。 "物理化學因素"指的是預處理時物理和化學參數(shù)，包括但不限于溫度，木質纖維素生 物質顆粒大小，化學試劑的使用和濃度，和停留時間。 "停留時間"是指，木質纖維生物質在預處理反應器中的時間。 "固含量"是指在預處理反應器中固體和液體的比例。 "氨水"或"含有氨的水溶液"指的是氨氣（NH3)使用或銨離子（NH4+)在水中形成氫氧 化銨。 用于木質纖維素或木質素時"碎片化"，是指在木質素和木質素，以及木質素和碳水化 合物分子間的結構鍵的斷裂。 "粒徑"指的是木質纖維素生物質用于預處理時的顆粒大小。 "網格"指的是泰勒篩規(guī)模，它通過穿過鐵絲網的能力定義了粒徑的大小。 對于原料用"處理"或"預處理"指的是對原料進行預處理。 "含水量"指的是包含在木質纖維素生物質中或添加到木質纖維素生物質中的水的比 例。 "固體殘留物"是指經過預處理后，不是溶液形式的固體生物質。 "失活"當指酶通過加熱或化學方法變性，不再具有其催化功能。 "微生物油脂"或"脂類"或"單細胞油"是指使用本發(fā)明的方法，用生物法合成并儲存在 產油微生物，如細菌，真菌，藻類和酵母菌，中的脂質。這樣的脂類包括但不限于以下的一種 或多種脂肪酸：肉豆蔻酸，棕櫚油酸，硬脂酸，油酸，亞油酸，亞麻酸，花生四烯酸，等。特定的 脂質包括但不限于：十七碳烯酸，二十二烷酸，二十四烷酸，十五烷酸，十六碳烯酸，γ -亞 麻酸和二十碳烯酸，等。 使用此處描述的方法得到的微生物油脂可以用于任何合適的目的，如精細化工原料。 一方面，它們被用來生產生物燃料，特別是"添加的"生物燃料。"生物燃料"指的是一種由 生物材料制作的燃料。典型的生物燃料可以按照此處的描述使用脂質生成，包括但不限于 可再生汽油和柴油，噴氣燃料和生物柴油。在這個專利中，需要一定的熟悉提取和處理脂 類方法的技能。提取后，油按照描述可用于生產生物燃料（例如沼氣，生物柴油，乙醇等醇 類，等），說明如下的例子：US patents(Day et al.，2013;Franklin et al.，2011;0yler， 2011)，其內容完整特此納入參考。 "添加"的燃料是燃料的一種，使用前生物燃料通常不需要適應常規(guī)的基于石油的發(fā)動 機燃油系統(tǒng)或燃料配送網絡。添加燃料可以"用來"和/或以任何量與其他的添加燃料，添 加的共混物，和/或常規(guī)燃料混合。 除非另有規(guī)定，在本發(fā)明中所有的技術和科學術語與普遍的用語一致。雖然任何方法 和材料相似或等價的描述也可用于實施本發(fā)明或在本發(fā)明中測試，現(xiàn)在介紹代表性的典型 方法和材料。 在本規(guī)范中引用的所有的出版物和專利已經具體化引用做參考，如果每個出版物或專 利是具體和個別地引用和被納入參照和描述的方法和/或材料與引用的有關的出版物一 致。任何出版的引文在其批準的申請日之前，不應視為承認本發(fā)明不得早于之前早發(fā)表出 來的發(fā)明等出版物。此外，如果出版日期設置可能不同于實際出版日期，可能需要被獨立的 證實。 值得注意的是，這里所使用和附加要求闡述的，單數(shù)形式"a"，"an"和"the"，包括多個 參照物，除非上下文中另有明確規(guī)定。它進一步指出，要求可能被起草排除任何可選的元 素。因此，這一說法為專有名詞前置基礎服務，如"完全"""只有"，等和與要求內容復述相 聯(lián)系，或使用"否定"限制。 將閱讀這個文件在本領域的技術人員，每個描述的實施案例和示出的具有離散的組件 和功能，可以很容易地分離或結合其他的幾個實施例的特征不背離本發(fā)明實施例的范圍或 精神。任何的列舉方法可以在邏輯允許的情況下，以任何的順序將列舉的事件應用。 在本發(fā)明的示例性實施例中有更詳細的描述，本發(fā)明并不限于特定的實施例中，如可 能，當然，變化，是可以理解的。這也可以理解，所使用的術語在這里是描述具體的實施例， 唯一的目的，并不是要限制，由于本發(fā)明的范圍將僅由附加要求限制。 實施例 實驗工作的目標按照下面描述是酶糖化之前，為了最大限度地提高單體糖的生產和減 少這種糖的損失，開發(fā)高效的，具有最小毒性的（或最少抑制物），加工木質纖維素生物質 (如小麥秸桿，草坪草）的經濟的預處理技術。本發(fā)明進一步闡述了關于利用產生的單糖生 產生物制品和生物燃料的詳情，在下面的例子中進行描述。應該認識到，在本發(fā)明的示例性 實施例中的這些例子，只用圖解的方式表明。 代表作名錄列出的例子中使用的化學品和材料，都是分析純試劑和化學品。 葡萄糖，木糖，甘露糖，半乳糖，纖維二糖，檸檬酸，氫氧化鈉，氫氧化銨，過氧化氫來自 于西格瑪奧德里奇公司（St. Louis，Mo.)。 稻草來自美國普爾曼的葛蘭奇供應公司，并在華盛頓州立大學的木材材料與工程實驗 室用錘式粉碎機粉碎。通過用一個特定的泰勒網格標準篩對秸桿進行篩分，然后將所得的 顆粒，用于下一步的預處理。 原料中糖的分析 生物質在105°C的熱風爐中干燥24小時，然后用于組份分析。NREL的標準的實驗室分 析方法（LAP)用于碳水化合物和木質素含量的測定（Sluiter et al.，2004)。在兩個階段 的酸水解過程約〇. 3克樣品被稱重和處理。初始3毫升72% (w/w)硫酸在37°C水解后，樣 品用蒸餾水稀釋到總體積為84毫升，并高溫滅菌1小時。用離子色譜法測定在水相中的糖 (戴安ICS-3000與PAC PA20柱和CarboPac PA20戴安保護柱）。每個樣品持續(xù)60分鐘， 在換樣品之間沖洗柱子先用100% 200mM NaOH，然后用去離子水沖洗。通過對標準樣品糖 比較計算出糖的濃度，所有的測量都是三平行。 糖化或酶解 用對照和處理后的樣品進行酶水解，估計預處理前后的糖回收率。在環(huán)形震蕩搖床 (Gyromax 747)中，水解在50°C下，用1到20%的固含量，以及含有100微升2%疊氮化鈉 的50毫摩醋酸鈉緩沖液（pH 4.8)，30FPU (每克原料）的纖維素酶（Novozymes NS 50013) 和30CBU(每克原料）的β-葡甘聚糖酶（Novozymes NS 50010)的溶液中，在規(guī)定時間內 進行。在某些實施例中，來自Novozymes Cellic? CTec2和HTec2也被應用于酶解，除非有 其他說明。酶水解后，在規(guī)定時間釋放的總糖，被用來計算糖回收率。酶解產物的糖組分使 用dionex-ic按照前部分詳細介紹進行分析（原料中糖的分析）。 實施例1 控制臭氧處理和氨水浸泡（SAA)處理以及兩者相結合（臭氧處理后，在進行氨水浸泡 處理）處理麥草的糖的分析 對對照和經2小時臭氧處理（狀態(tài)：（臭氧化：90%濕度調整到42-60目的粒徑，5. 4% 臭氧在2升/分鐘的氣流量下反應2小時），只有氨浸泡處理（條件60°C和24小時），結合 處理（臭氧化：90%濕度調整到42-60目的粒徑，5. 4%臭氧在2升/分鐘的氣流量下反應 10分鐘；氨浸泡：20%固含量（w/v)，20%氫氧化銨水溶液（w/v)，50°C反應溫度和6小時的 反應時間）的稻草秸桿樣品的糖分析結果在表1中顯示。臭氧處理后的樣品中單糖的濃度 隨時間減少，這可能是臭氧與糖反應有關。用測得的百分比來看，經過SAA和OSAA處理后 的樣品糖濃度顯著增加，這是去除抽提物，灰分和木質素到一定程度的協(xié)同效應。 表1

【權利要求】
1. 一個在酶水解糖化之前，木質纖維素生物質的預處理方法，包括與H 202的水溶液混 合制備0%至90% (W/W)水分含量的原料，接觸指的是原料/過氧化氫混合物與臭氧氣體， 在所述溫度15°C -30°C進行接觸。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述方法包括步驟：在混合之前，篩選原料粒徑。
3. 如權利要求1所述的方法，其中所述步驟將時間范圍從約1到20分鐘。
4. 如權利要求3所述的方法，所述接觸步驟是至少15分鐘。
5. 如權利要求1所述的方法，所述接觸步驟之后，酶水解糖化之前是由漂洗和干燥的 步驟的其中之一或兩者都有。
6. 如權利要求1所述的方法，其中酶水解糖化得到的糖用于產油微生物生產油脂。
7. -個在酶水解糖化之前，預處理木質纖維素生物質方法，包括在溫度15°C -30°C下， 原料與臭氧進行接觸，已經被臭氧處理過的原料，在壓強低于一個大氣壓的條件下，用液氨 在50 °C下處理。
8. 如權利要求7所述的方法，該方法包括在接觸之前，對原料經行粒徑篩選。
9. 如權利要求7所述的方法，其中所述接觸的步驟時間從約3至約36小時。
10. 如權利要9所述的方法，其中所述接觸的步驟進行了從約6至約9小時。
11. 如權利要求7所述的方法，其中第二步驟接觸壓強要低于一個大氣壓。
12. 如權利要求7所述的方法，其中，所產生的較低的木質素含量原料特別適用于任何 生物燃料或生物制品的同步糖化和發(fā)酵過程。
13. 如權利要求7所述的方法，所述接觸步驟之后，酶水解糖化之前是由漂洗和干燥的 步驟的其中之一或兩者都要。
14. 如權利要求7所述的方法，氨水的量相對于經臭氧處理的原料干重是4 : 1到 10 : 1〇
15. 如權利要求7所述的方法，還包括過濾和酸沉淀原料浸泡后的氨溶液的步驟，并從 中回收可溶性或不溶木質素。
16. 如權利要求20所述的方法，其中酶水解糖化得到的糖用于產油微生物油脂生產。
17. -個在酶水解糖化之前，預處理木質纖維素生物質方法，包括與H 202的水溶液混合 制備0%至90% (W/W)水分含量的原料。接觸指的是原料/過氧化氫混合物與臭氧氣體， 在所述溫度15°C -30°C進行接觸，然后已經被臭氧處理過的原料，用液氨在50°C下處理。
18. 如權利要求15所述的方法，該方法包括在混合之前，對原料經行粒徑篩選
19. 如權利要求15所述的方法，所述接觸步驟時間大約5到20分鐘。
20. 如權利要求15所述的方法，所述接觸的步驟時間從約3至約9小時。
21. 如權利要求15所述的方法，所述接觸步驟之后，接觸之前是由漂洗和干燥的步驟 的其中之一或兩者都要。
22. 如權利要求15所述的方法，所述接觸步驟之后，酶水解糖化之前是由漂洗和干燥 的步驟的其中之一或兩者都要。
23. 如權利要求15所述的方法，氨水的量相對于經臭氧處理的原料干重是4 : 1到 10 : 1〇
24. 如權利要求15所述的方法，還包括過濾和酸沉淀原料浸泡后的氨溶液的步驟，并 從中回收可溶性或不溶木質素。
25.如權利要求15所述的方法，其中酶水解糖化得到的糖用于產油微生物油脂生產。
【文檔編號】C12P7/64GK104487585SQ201380033984
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年6月25日 優(yōu)先權日:2012年6月29日
【發(fā)明者】布魯·馬赫什, 高·艾倫, 陳樹林 申請人:華盛頓州立大學