生物合成途徑、重組細胞和方法
【專利摘要】本公開通常描述了經(jīng)修飾以展示增加的戊酸的生物合成的重組細胞，制成此類重組細胞的方法，和誘導細胞產(chǎn)生戊酸的方法。本公開還通常描述了經(jīng)修飾以展示增加的2-甲基丁酸的生物合成的重組細胞，制成此類重組細胞的方法，和誘導細胞產(chǎn)生2-甲基丁酸的方法。
【專利說明】生物合成途徑、重組細胞和方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求享有于2012年5月11日提交的美國臨時專利申請系列號61/645, 900的 優(yōu)先權(quán)，其通過引用并入文本。
[0002] 概述 在一個方面中，本公開描述重組細胞，其經(jīng)修飾以展示相比于野生型對照增加的戊酸 的生物合成。在另一個方面中，本公開描述重組細胞，其經(jīng)修飾以展示相比于野生型對照增 加的2-甲基丁酸的生物合成。
[0003] 在各方面中，重組細胞可以是真菌細胞或細菌細胞。在各方面中，重組細胞可以是 光合的。在各方面中，重組細胞可以是分解纖維素的。
[0004] 在其中重組細胞展示增加的戊酸的生物合成的方面中，增加的戊酸的生物合成可 以包括相比于野生型對照L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L-蘇氨酸中的增加，相比于野生型對照L-蘇 氨酸轉(zhuǎn)化為2-酮丁酸中的增加，相比于野生型對照2-酮丁酸延長活性中的增加，相比于野 生型對照2-酮戊酸延長活性中的增加，相比于野生型對照酮酸脫羧酶活性中的增加，相比 于野生型對照對預定底物的酮酸脫羧酶選擇性中的增加，或相比于野生型對照醛脫氫酶活 性中的增加。
[0005] 在其中重組細胞展示增加的2-甲基丁酸的生物合成的方面中，增加的2-甲基丁 酸的生物合成可以包括相比于野生型對照L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L-蘇氨酸中的增加，相比于 野生型對照L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為2-酮丁酸中的增加，2-酮丁酸轉(zhuǎn)化為2-酮-3-甲基戊酸中的 增加，相比于野生型對照酮酸脫羧酶活性中的增加，相比于野生型對照對預定底物的酮酸 脫羧酶選擇性中的增加，或相比于野生型對照醛脫氫酶活性中的增加。
[0006] 在另一個方面中，本公開描述方法，其通常包括在包含碳源的培養(yǎng)基中在對于重 組細胞產(chǎn)生戊酸有效的條件下孵育展示增加的戊酸的生物合成的重組細胞。在一些實施方 案中，碳源可以包含以下的一種或多種：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、L-蘇氨酸、2-酮丁 酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、戊醛、C02、纖維素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖或甘油。
[0007] 在另一個方面中，本公開描述方法，其通常包括在包含碳源的培養(yǎng)基中在對于重 組細胞產(chǎn)生2-甲基丁酸有效的條件下孵育展示增加的2-甲基丁酸的生物合成的重組細 胞。在一些實施方案中，碳源可以包含以下的一種或多種：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬氨酸、 L-蘇氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-甲基丁醛、C02、纖維素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖 或甘油。
[0008] 在另一個方面中，本公開描述方法，其通常包括將編碼至少一種催化碳源轉(zhuǎn)化為 戊酸的多肽的異源多核苷酸引入宿主細胞，其中至少一種多核苷酸可操作地連接于啟動 子，從而使得經(jīng)修飾的宿主細胞催化碳源轉(zhuǎn)化為戊酸。
[0009] 在另一個方面中，本公開描述方法，其通常包括將編碼至少一種催化碳源轉(zhuǎn)化為 2-甲基丁酸的多肽的異源多核苷酸引入宿主細胞，其中至少一種多核苷酸可操作地連接于 啟動子，從而使得經(jīng)修飾的宿主細胞催化碳源轉(zhuǎn)化為2-甲基丁酸。
[0010] 本發(fā)明的上述概述不旨在描述本發(fā)明的各公開的實施方案或每種實施。隨后更具 體的描述示例說明性實施方案。在貫穿本申請的幾處，通過實施例的列表提供教導，所述實 施例可以以多種組合使用。在每種情況下，描述的列表只能作為代表性的組，并且不應(yīng)當解 釋為排他性的列表。
[0011] 附圖簡述 圖1.生產(chǎn)2-甲基丁酸（2MB)和戊酸（PA)的途徑。（A)從1-丁烯和2-丁烯至2-甲 基丁酸和戊酸的化學方法。（B)從葡萄糖合成2-甲基丁酸的代謝途徑。（C)從葡萄糖合成 戊酸的代謝途徑。
[0012] 圖2?用于（A)2-甲基丁酸（2MB)生產(chǎn)、（B)戊酸（PA)生產(chǎn)的合成操縱子。DC， 2_酮酸脫羧酶；DH，醛脫氫酶。
[0013] 圖3.使用不同醛脫氫酶的發(fā)酵實驗的結(jié)果。（A)用于2-甲基丁酸生產(chǎn)的醛脫氫 酶的比較。（B)用于戊酸生產(chǎn)的醛脫氫酶的比較。
[0014] 圖4.使用不同酮酸脫羧酶的發(fā)酵實驗的結(jié)果。（A)用于2-甲基丁酸生產(chǎn)的酮酸 脫羧酶的比較。（B)用于戊酸生產(chǎn)的酮酸脫羧酶的比較。
[0015] 圖5.酮酸脫羧酶和醛脫氫酶的組合的發(fā)酵實驗的結(jié)果。（A)用于2-甲基丁酸生 產(chǎn)的各種組合的比較。（B)用于戊酸生產(chǎn)的各種組合的比較。
[0016] 說明性實施方案的詳述 在以下的示例性實施方案的描述中，指定了某些代謝酶和那些酶的天然來源。這些僅 僅是合適的酶和指定酶的合適來源的實例。具有相似催化活性的可選的酶是可以的，如可 從不同的微生物物種或菌株中獲得的同源物。因此，本文描述的示例性實施方案不應(yīng)當解 釋為限制權(quán)利要求中反映的微生物或方法的范圍。
[0017] 戊酸和2-甲基丁酸用作多種應(yīng)用例如增塑劑、潤滑劑和藥物的化學中間體。本 公開描述了在大腸桿菌co7i)中生物合成這兩種酸的合成代謝途徑的構(gòu)建： 修飾天然的亮氨酸生物合成途徑以生產(chǎn)戊酸；修飾天然的異亮氨酸生物合成途徑以生產(chǎn) 2_甲基丁酸。研究多種醛脫氫酶和2-酮酸脫羧酶在構(gòu)建的途徑中的活性。通過在搖瓶發(fā) 酵中酶的優(yōu)化組合，實現(xiàn)對2-甲基丁酸2. 59g/L和對戊酸2. 58g/L的最高滴度（titer)。 該工作證明了高體積脂肪酸可再生生產(chǎn)的可行性。
[0018] 原油是能源和工業(yè)有機化學品的主要來源。然而，原油儲備正在快速衰竭，使得燃 料和化學品的可持續(xù)途徑的開發(fā)更具吸引力。為應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，可以使用生物合成的方法， 其涉及將微生物工程化以生產(chǎn)非天然的化學中間體。非天然代謝物的生產(chǎn)可以涉及合成代 謝途徑的工程化和開發(fā)。在該工作中，開發(fā)了從葡萄糖或其它合適的碳源可再生生產(chǎn)戊酸 (PA)和2-甲基丁酸（2MB)的生物合成策略。
[0019] 2005年美國總消耗的戊酸和2-甲基丁酸約為14, 000公噸（Dow. Product Safety Assessment: Isopentanoic Acid. The Dow chemical company 2008)。這些化學品可 以作為中間體用于多種應(yīng)用，例如增塑劑、潤滑劑和藥物。它們同樣用于從烴類提取硫 醇。戊酸的酯類作為戊酸類生物燃料（pentanoic biofuels)正在獲得增加的關(guān)注，因為 它們可以以非常高的摻合比在汽油和柴油（diesel)中使用（Lange等，Angew Chem Int Edit 2010;49:4479-4483)。商業(yè)上，這些化學品通常通過氧化戊醛和/或2-甲基丁醛生 產(chǎn)，其每一種可以通過基于石油的化合物與合成氣反應(yīng)的方法制成（Dow. Product Safety Assessment: Isopentanoic Acid. The Dow chemical company 2008)。因為該方法使用 有毒性的中間體如合成氣和不可再生的基于石油的原料，因此需要這些化學品的可持續(xù)途 徑。本文展示生物合成作為這些化學品的潛在可替代途徑。
[0020] 工程化的生物合成途徑的一個優(yōu)點是在微生物間天然生物合成途徑的保守。因 此，一旦新的工程化的生物合成途徑在一種微生物中建立，其通?？梢栽谄渌⑸镏袘?yīng) 用。在該工作中，大腸桿菌中的天然的亮氨酸和異亮氨酸生物合成途徑，通過引入大腸桿菌 宿主細胞異源(非天然)酶醛脫氫酶和/或2-酮酸脫羧酶來進行修飾。2-甲基丁酸和戊酸 的示例性合成代謝途徑分別在圖1B和圖1C中顯示。兩種途徑的共同中間體是2-酮丁酸 (2KB)，其通過生物合成的脫氨酶IIvA從蘇氨酸衍生。從rA dr講P dr謙]過表達可以驅(qū)動 碳流朝向蘇氨酸生物合成（Zhang 等，Proc Natl Acad Sci USA 2010;107:6234-6239)， 并且因此，進入合成代謝途徑以生產(chǎn)戊酸和/或2-甲基丁酸。
[0021] 對2-甲基丁酸的合成，在圖1B中顯示，2-酮丁酸被驅(qū)動進入2-酮-3-甲基戊酸 (KMV)的合成，其是2-甲基丁酸的倒數(shù)第二個前體。通過IlvG和IlvM催化2-酮丁酸和丙 酮酸縮合成2-乙酰-2-羥基丁酸（AHB)。另兩種酶IlvC和IlvD可以催化AHB轉(zhuǎn)化為KMV。 KMV隨后通過酮酸脫羧酶（DC)脫羧成2-甲基丁醛，其可以通過醛脫氫酶（DH)氧化為2-甲 基丁酸。
[0022] 對于戊酸的合成，2-酮丁酸可以經(jīng)歷2個循環(huán)的"+1"碳鏈延長以產(chǎn)生2-酮己酸 (2KC)。在天然的亮氨酸生物合成途徑中，2-酮異戊酸通過由2-異丙基蘋果酸合酶（LeuA)、 異丙基蘋果酸異構(gòu)酶復合體（LeuC、LeuD)和3-異丙基蘋果酸脫氫酶（LeuB)催化的3步鏈 延長循環(huán)轉(zhuǎn)化為2-酮異己酸。然而，在我們的合成途徑中，LeuA、LeuB、LeuC、和LeuD足夠 靈活以類似地延長2-酮丁酸至2-酮戊酸，并且隨后延長2-酮戊酸至2-酮己酸（4)。2-酮 己酸可以隨后通過2-酮酸脫羧酶（DC)脫羧至戊醛，其可以通過脫氫酶（DH)氧化至戊酸。
[0023] 生物合成2-甲基丁酸和戊酸的代謝途徑的構(gòu)建 生產(chǎn)2-甲基丁酸（2MB)和戊酸（PA)的生物合成方案分別在圖1B和圖1C中顯示。天 冬氨酸生物合成下游的所有酶從3個合成操縱子過表達。一個操縱子包括ThrA、ThrB和 ThrC的編碼區(qū)，其每一個均涉及蘇氨酸合成，在攜帶壯觀霉素抗性標記物的低拷貝質(zhì)粒 pIPAl上I\lac01啟動子的控制下。對于2-甲基丁酸的合成（圖1B)，以、 和被克隆至具有卡那霉素抗性標記物的低拷貝質(zhì)粒上以獲得PIPA2。相似地，對于戊 酸的合成，沒P 啵克隆至攜帶卡那霉素抗性標記物的低拷貝質(zhì) 粒PIPA3上。多種醛脫氫酶和酮酸脫羧酶存在于攜帶氨芐青霉素抗性標記物的高拷貝質(zhì)粒(PIPA4至pIPA15,表2)上以轉(zhuǎn)錄順序DC-DH(2-酮酸脫羧酶-脫氫酶）在I\laC〇l啟動子 之下。
[0024] 由于蘇氨酸是兩個途徑的共同中間體，因此在本研究中使用了蘇氨酸過生產(chǎn)菌株 大腸桿菌菌株ATCC98082。該菌株移除了蘇氨酸輸出基因rAM以確保蘇氨酸的細胞內(nèi)高水 平（Zhang 等，Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107:6234-6239)，還刪除醇脫氫酶基 因以消除導向相應(yīng)醇的副反應(yīng)。產(chǎn)生的菌株此后被稱為PA1菌株。
[0025] 在圖1B和圖1C顯示的合成途徑被設(shè)計為包括將酮酸2-酮-3-甲基戊酸（圖 1B)和2-酮己酸（2KC，圖1C)脫羧為它們相應(yīng)的醛，隨后氧化醛至羧酸?；谖覀兿?前對于生產(chǎn)異丁酸的工作（Zhang等，ChemSusChem 2011;4:1068-1070)，我們從乳 酸乳球菌/acKs)克隆野生型2_酮異戊酸脫羧酶KIVD (de la Plaza 等，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 2004;238:367-374)，從大腸桿菌克隆苯乙醛脫氫酶PadA (Rodriguez-Zavala 等，Protein Sci 2006;15:1387-1396)以檢查我們的目標化學品的 生產(chǎn)。PA1菌株用質(zhì)粒pIPAl、pIPA2和pIPA4轉(zhuǎn)化以生產(chǎn)2-甲基丁酸。PA1菌株用質(zhì)粒 pIPAl、pIPA3和pIPA4轉(zhuǎn)化以生產(chǎn)戊酸。使用各重組菌株實施搖瓶發(fā)酵。使用這種方法， 我們生產(chǎn)出2. 26g/L的2-甲基丁酸和2. 12g/L的戊酸，證明了我們的生物合成方法的可行 性。
[0026] 醛脫氫酶的篩選 為改進生產(chǎn)滴度，檢測選擇不同醛脫氫酶的效果（圖3A和圖3B)。選擇6種 醒脫氫酶作為該研究的候選酶：來自大腸桿菌的乙醒脫氫酶AldB(Ho和Weiner, JBacteriol2005;187:1067-1073)、3-羥基丙醛脫氫酶AldH(Jo等，Appl MicrobiolBiotechnol2008;81:51-60)、苯乙醒脫氧酶PadA(Rodriguez-Zavala 等，ProteinSci2006; 15:1387-1396)、玻拍酸半醒脫氫酶GabD(Bartsch等，J Bacteriol1990;172:7035-7042)、y-氨基丁醛脫氫酶YdcW(Gruez等，JMolBiol 2004; 343:29-41)和來自iferAAo/oferia的a-麗戊二酸半醒脫氧酶KDHba(Jo 等，ApplMicrobiolBiotechnol2008;81:51-60)。細菌菌株使用如圖2中顯不的3種 合成操縱子構(gòu)建。引入菌株的全部異源酶在菌株間是相同的，除了醛脫氫酶。選擇野生型 KIVD作為2-酮酸脫羧酶用于各菌株。在30°C實施搖瓶發(fā)酵并且樣品通過HPLC分析。分 析發(fā)酵物以鑒定生產(chǎn)最高量的期望產(chǎn)物的菌株--并因而鑒定醛脫氫酶。
[0027] 為比較用于生產(chǎn)2-甲基丁酸的各種醛脫氫酶的活性，PA1菌株用質(zhì)粒pIPAl、 PIPA2,以及pIPA4至pIPA9中任一個轉(zhuǎn)化。在發(fā)酵后，用AldH達到2. 51g/L的最高滴度，而 AldB、PadA、KDHba、GabD 和 YdcW 分別產(chǎn)生 2. 31 g/L、2. 26 g/L、0. 67 g/L、0. 14 g/L 和 0? 23 g/L (圖 3A)。
[0028] 對于戊酸的生產(chǎn)，PA1菌株使用質(zhì)粒pIPAl、pIPA2,以及pIPA4至pIPA9中任一個 轉(zhuǎn)化。發(fā)現(xiàn)KDH ba為生產(chǎn)戊酸的最有活性的醛脫氫酶（2. 25g/L)，而AldH、AldB、PadA、GabD 和 YdcW 分別生產(chǎn) 1. 76 g/L、0. 42 g/L、2. 12 g/L、0. 54 g/L 和 0? 22 g/L (圖 3B)。
[0029] 2-酮酸脫羧酶的篩選 在發(fā)酵過程中觀察到幾種代謝副產(chǎn)物例如乙酸、丙酸、丁酸和3-甲基丁酸。來 自乳酸乳球菌的野生型酮酸脫羧酶KIVD (de la Plaza等，F(xiàn)EMS Microbiol Lett 2004;238:367-374)和它的突變體的幾種被研究用于增加目標C5酸的產(chǎn)量并且降低副產(chǎn) 物形成。單一氨基酸取代突變沒份J被報道對于更大的底物增加了 KIVD的特異性。其它三 個突變和/^的效果，各自與K你突變組合，進行了研究。這些突變通過 較小的疏水殘基替換了關(guān)鍵位置的龐大殘基。還研究了來自鼠傷寒沙門氏菌（ 加Ai皿ri，）的n引哚丙酮酸脫羧酶（iroc)的效果。用不同的2-酮酸脫羧酶構(gòu)建質(zhì)粒，但 是均具有相同的醛脫氫酶（PadA)和其它酶。
[0030] 為比較用于2-甲基丁酸合成的選擇的2-酮酸脫羧酶的活性，使用用于2-甲基丁 酸的pIPAl、pIPA2,以及質(zhì)粒pIPAlO至pIPA13中任一個轉(zhuǎn)化PA1菌株。為比較用于戊酸 合成的選擇的2-酮酸脫羧酶的活性，使用用于戊酸合成的pIPAl、pIPA3,以及質(zhì)粒pIPAlO 至PIPA13中任一個轉(zhuǎn)化PA1菌株。搖瓶發(fā)酵顯示IPDC比KIVD或任何其突變體更好地工 作以生產(chǎn)2-甲基丁酸（2. 5g/L)或戊酸（2. 14g/L)(圖4A和圖4B)。
[0031] 已確定在用于生產(chǎn)2-甲基丁酸的全部候選的醛脫氫酶和2-酮酸脫羧酶中AldH 和IPDC具有最高活性后，將它們組合在一起（pIPA14)以研究效果是否是累加的。在組合 中，2-甲基丁酸滴度達到2. 59 g/L，只少量地高于AldH與WT KIVD的2. 51 g/L或PadA與 IPDC的2. 5 g/L (圖5A)。類似地，將-同克隆（pIPA15)用于戊酸的生產(chǎn)。 這增加戊酸滴度至2. 58 g/L。與之相比，仰1^與WT KIVD的生產(chǎn)滴度為2. 25 g/L或PadA 與IPDC的生產(chǎn)滴度為2. 14 g/L (圖5B)。
[0032] 酶的純化和表征 對最具活性的酮酸脫羧酶IPDC，和最具活性的醛脫氫酶AldH和KDHba，表征它們對在構(gòu) 建的途徑中涉及的底物的活性。AldH從His-標簽質(zhì)粒表達并純化。IPDC和KDHba可從 先前的研究獲得。動力學參數(shù)通過監(jiān)測在340nm的NADH吸光度測量。K M的值在表 1中給出。
[0033] 表1酶的動力學參數(shù)
【權(quán)利要求】
1. 重組細胞，其經(jīng)修飾以展示相比于野生型對照增加的戊酸的生物合成。
2. 重組微生物細胞，其經(jīng)修飾以展示相比于野生型對照增加的2-甲基丁酸的生物合 成。
3. 任何前述權(quán)利要求的重組微生物細胞，其中所述微生物細胞是真菌細胞。
4. 權(quán)利要求3的重組細胞，其中所述真菌細胞是酵母科（Saccharomycetaceae family)的成員。
5. 權(quán)利要求3的重組細胞，其中所述真菌細胞是釀酒酵母（ cereFisiae)、皺落假絲酵母rwgiosa)或白色念珠菌
6. 權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的重組細胞，其中所述微生物細胞是細菌細胞。
7. 權(quán)利要求6的重組細胞，其中所述細菌細胞是變形菌門（phylum Protobacteria)的 成員。
8. 權(quán)利要求7的重組細胞，其中所述細菌細胞是腸桿菌科（Enterobacteriaceae family)的成員。
9. 權(quán)利要求8的重組細胞，其中所述細菌細胞是大腸桿菌（co/i)。
10. 權(quán)利要求7的重組細胞，其中所述細菌細胞是假單胞菌科（Pseudomonaceae family)的成員。
11. 權(quán)利要求10的重組細胞，其中所述細菌細胞是惡臭假單胞菌（ putida)。
12. 權(quán)利要求6的重組細胞，其中所述細菌細胞是厚壁菌門（phylum Firmicutes)的成 員。
13. 權(quán)利要求12的重組細胞，其中所述細菌細胞是芽孢桿菌科(Bacillaceae family) 的成員。
14. 權(quán)利要求13的重組細胞，其中所述細菌細胞是枯草芽孢桿菌（ subtilis、。
15. 權(quán)利要求12的重組細胞，其中所述細菌細胞是鏈球菌科（Streptococcaceae family)的成員。
16. 權(quán)利要求15的重組細胞，其中所述細菌細胞是乳酸乳球菌（ZaciococcM lactis、。
17. 權(quán)利要求12的重組細胞，其中所述細菌細胞是梭菌科（Clostridiaceae family) 的成員。
18. 權(quán)利要求17的重組細胞，其中所述細菌細胞是解纖維梭菌（ cellulolyticum)。
19. 權(quán)利要求6的重組細胞，其中所述細菌細胞是藍細菌門（phylum Cyanobacteria) 的成員。
20. 任何前述權(quán)利要求的重組細胞，其中所述微生物細胞是光合的。
21. 任何前述權(quán)利要求的重組細胞，其中所述微生物細胞是分解纖維素的。
22. 權(quán)利要求1和3-21中任一項的重組細胞，其中相比于野生型對照增加的戊酸的生 物合成包括相比于野生型對照L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L-蘇氨酸中的增加，相比于野生型對照 L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為2-酮丁酸中的增加，相比于野生型對照2-酮丁酸延長活性中的增加，相比 于野生型對照2-酮戊酸延長活性中的增加，相比于野生型對照酮酸脫羧酶活性中的增加， 相比于野生型對照對預定底物的酮酸脫羧酶選擇性中的增加，或相比于野生型對照醛脫氫 酶活性中的增加。
23. 權(quán)利要求2-21中任一項的重組細胞，其中相比于野生型對照增加的2-甲基丁酸的 生物合成包括相比于野生型對照L-天冬氨酸轉(zhuǎn)化為L-蘇氨酸中的增加，相比于野生型對 照L-蘇氨酸轉(zhuǎn)化為2-酮丁酸中的增加，2-酮丁酸轉(zhuǎn)化為2-酮-3-甲基戊酸中的增加，相 比于野生型對照酮酸脫羧酶活性中的增加，相比于野生型對照對預定底物的酮酸脫羧酶選 擇性中的增加，或相比于野生型對照醛脫氫酶活性中的增加。
24. 方法，其包括： 在包含碳源的培養(yǎng)基中在對于重組細胞產(chǎn)生戊酸有效的條件下孵育權(quán)利要求1和 3-23中任一項的重組細胞，其中所述碳源包含以下的一種或多種：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬 氨酸、L-蘇氨酸、2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、戊醛、⑶ 2、纖維素、木糖、蔗糖、阿拉伯糖 或甘油。
25. 方法，其包括： 在包含碳源的培養(yǎng)基中在對于重組細胞產(chǎn)生2-甲基丁酸有效的條件下孵育權(quán)利要求 2-23中任一項的重組細胞，其中所述碳源包含以下的一種或多種：葡萄糖、丙酮酸、L-天冬 氨酸、L-蘇氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-甲基丁醛、CO 2、纖維素、木糖、蔗糖、阿拉 伯糖或甘油。
26. 方法，其包括： 將編碼至少一種催化碳源轉(zhuǎn)化為戊酸的多肽的異源多核苷酸引入宿主細胞，其中將至 少一種多核苷酸可操作地連接于啟動子，從而使得經(jīng)修飾的宿主細胞催化所述碳源轉(zhuǎn)化為 戊酸。
27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述碳源包含以下的一種或多種：葡萄糖、丙酮酸、L-天 冬氨酸、L-蘇氨酸、2-酮丁酸、2-酮戊酸、2-酮己酸、戊醛、CO 2、纖維素、木糖、蔗糖、阿拉伯 糖或甘油。
28. 方法，其包括： 將編碼至少一種催化碳源轉(zhuǎn)化為2-甲基丁酸的多肽的異源多核苷酸引入宿主細胞， 其中將至少一種多核苷酸可操作地連接于啟動子，從而使得經(jīng)修飾的宿主細胞催化所述碳 源轉(zhuǎn)化為2-甲基丁酸。
29. 權(quán)利要求28的方法，其中所述碳源包含以下的一種或多種：葡萄糖、丙酮酸、L-天 冬氨酸、L-蘇氨酸、2-酮丁酸、2-酮-3-甲基戊酸、2-甲基丁醛、CO 2、纖維素、木糖、蔗糖、阿 拉伯糖或甘油。
30. 權(quán)利要求24-29中任一項的方法，其中所述宿主細胞是真菌細胞。
31. 權(quán)利要求30的方法，其中所述真菌細胞是酵母科的成員。
32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述真菌細胞是釀酒酵母、皺落假絲酵母或白色念珠菌。
33. 權(quán)利要求24-29中任一項的方法，其中所述宿主細胞是細菌細胞。
34. 權(quán)利要求33的方法，其中所述細菌細胞是變形菌門的成員。
35. 權(quán)利要求34的方法，其中所述細菌細胞是腸桿菌科的成員。
36. 權(quán)利要求35的方法，其中所述細菌細胞是大腸桿菌。
37. 權(quán)利要求34的方法，其中所述細菌細胞是假單胞菌科的成員。
38. 權(quán)利要求37的方法，其中所述細菌細胞是惡臭假單胞菌。
39. 權(quán)利要求33的方法，其中所述細菌細胞是厚壁菌門的成員。
40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述細菌細胞是芽孢桿菌科的成員。
41. 權(quán)利要求40的方法，其中所述細菌細胞是枯草芽孢桿菌。
42. 權(quán)利要求39的方法，其中所述細菌細胞是鏈球菌科的成員。
43. 權(quán)利要求42的方法，其中所述細菌細胞是乳酸乳球菌。
44. 權(quán)利要求39的方法，其中所述細菌細胞是梭菌科的成員。
45. 權(quán)利要求44的方法，其中所述細菌細胞是解纖維梭菌。
46. 權(quán)利要求33的方法，其中所述細菌細胞是藍細菌門的成員。
47. 權(quán)利要求24-46中任一項的方法，其中所述宿主細胞是光合的。
48. 權(quán)利要求24-46中任一項的方法，其中所述宿主細胞是分解纖維素的。
【文檔編號】C12N15/52GK104520426SQ201380035331
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月11日
【發(fā)明者】張 K., K. 漢德 Y. 申請人:明尼蘇達大學評議會