作為基因表達誘導劑的糖酯的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了新穎糖酯，特別是二糖酯，及其制備方法。這些化合物可用作微生物培養(yǎng)基組分以用于在微生物發(fā)酵過程中誘導基因表達。
【專利說明】作為基因表達誘導劑的糖酯
[0001] 相關申請案的奪叉引用
[0002] 本申請案要求2012年7月20日申請的美國臨時申請案序列號61/673, 997和2012 年12月27日申請的61/746, 120的權益，所述臨時申請案的內容全文并入。
[0003] 關于聯邦政府咨助研究的聲明
[0004] 依據美國農業(yè)部的授權書第#2012-33610-19542號，美國政府擁有本申請案中的 某些權力。

【技術領域】
[0005] 本發(fā)明涉及在細胞培養(yǎng)中用作基因表達誘導劑的化合物及其制備方法。更確切地 說，本發(fā)明涉及對于酶制造商來說能顯著降低制造成本的低成本而且高效的蛋白質誘導劑 的開發(fā)。

【背景技術】
[0006] 便宜而且容易獲得的工業(yè)酶是工業(yè)生物技術革命背后的關鍵推動因素，其中越來 越多地使用可再生資源以生物學方式產生化學物質和能量燃料。與用于治療和診斷目的的 高利潤酶或其它蛋白質相反，工業(yè)酶典型地具有較低利潤，并且在發(fā)酵后利用有限的下游 加工大量制造。對于工業(yè)酶市場來說，生產成本對商業(yè)上的成功是至關重要的。為了滿足 可再生化學物質和能源工業(yè)對較便宜而且容易獲得的酶的日益增加的需求，急需更有效而 且成本有效的生產工藝。
[0007] 主要工業(yè)酶制造商都把大量產能投入到真菌發(fā)酵，特別是使用絲狀真菌，例如曲 霉屬（Aspergillus spp)、青霉屬（Penicillium spp)、木霉屬（Trichoderma spp.)、拉克悼 金抱菌（Chrysosporium lucknowense) (Cl)和嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila) (重新分類），以制造紡織品、洗滌劑、食品和飼料以及新興生物燃料工業(yè)中所使用的眾多 酶產品（沙瑪（Sharma)等人，世界微生物學與生物技術雜志（World J. of Microbiol, and Biotech. ),25(12) :2083-2094(2009);維瑟（Visser)等人，工業(yè)生物技術（Industrial Biotech. )，7(3):214-223(2011))。
[0008] 在曲霉屬和木霉屬中大批生產相關蛋白質通常需要能在強天然啟動子下活化轉 錄開關從而驅動相關基因表達靶酶或蛋白質的誘導劑化合物。例如淀粉和纖維素等不溶性 底物通常用于實驗室規(guī)模下以便分別誘導曲霉屬和木霉屬中的蛋白質表達。然而，其在工 業(yè)規(guī)模下的實施因不良底物連貫性和材料和在大規(guī)模下所遭遇的例如滅菌、饋料、混合和 粘度問題等處理問題而受阻。因此，在大批生產酶和其它蛋白質時，高效可溶性誘導劑是更 優(yōu)選的。
[0009] 麥芽糖、異麥芽糖和麥芽糊精通常用作可溶性誘導劑以用于在曲霉屬中 誘導α -淀粉酶和葡糖淀粉酶（巴頓（Barton)等人，細菌學雜志（J. Bacteriol. ，b (3) :771-777 (1972))，而槐糖、纖維二糖和乳糖是廣泛用于木霉屬中的酶生產工業(yè)的 三種有效的可溶性誘導劑（庫比切克（Kubicek)等人，生物燃料生物技術（Biotech. Biofuels), 2:19(2009))。槐糖，S卩一種 β 1，2-二糖，被視為里氏木霉（Trichoderma reesei)中的纖維素酶基因啟動子的最強誘導劑，活性是纖維二糖的2500倍（曼德爾斯 (Mandels)等人，細菌學雜志（J. Bacteriol. ),83(2) :400-408 (1962))。這些相應的可溶性 誘導劑都在誘導之前、期間或之后由曲霉屬或木霉屬代謝。因此，它們被視為無償誘導劑， 因而需要在發(fā)酵期間不斷供應它們以便實現最佳誘導。
[0010] 在通過深層發(fā)酵進行的工業(yè)酶生產中，可溶性誘導劑通常呈單獨或補充有例如葡 萄糖等替代性碳源的饋入批料形式以碳受限方式供應至發(fā)酵器。由于誘導劑是有償的，故 誘導過程如果未經充分優(yōu)化則通常將導致會顯著降低生產率的分解代謝物阻遏以及會顯 著降低產率的非必需生長。因而，所屬領域中需要更強的無償或接近無償的誘導劑，其能消 除誘導受非意料抑制、生長或其它生理功能影響，從而允許進行更嚴格的過程優(yōu)化，以便與 當前可能達到的相比顯著提高生產率和產率。更強的誘導劑還能容易地用于滿足對更便宜 而且非誘導性原料的誘導需要以及增強例如乳糖、纖維素、麥芽糊精等常規(guī)誘導劑或例如 淀粉和纖維素水解物等更便宜替代物以及例如固相發(fā)酵等替代生產過程中的誘導。
[0011] 因為基于糖的誘導劑對于蛋白質表達來說既是誘導劑又是阻遏劑，所以通過對 誘導劑進行改性以減緩其吸收或新陳代謝來增強誘導力的方法是已知的。盡管未加以表 征，但已知八乙酸纖維二糖酯水解產物的誘導力優(yōu)于纖維二糖（曼德爾斯和里斯（Reese)， 細菌學雜志（J. Bacteriol. )，79(6) :816-826(1960))。在產糖芽霉菌（Pullularia pullulans)中，單棕櫚酸蔗糖酯所誘導的蔗糖酶產率是蔗糖的80倍（里斯等人，細菌學 雜志，100(3) :1151-1154(1969))。類似地，乙?；w維二糖在產紫青霉菌（Penicillium purpurogenum)中誘導纖維素酶時比葡萄糖或纖維二糖更有效，其中單-0-乙?；w維二 糖是所測試的最具活性的誘導劑（蘇喬（Suto)等人，發(fā)酵與生物工程雜志（J. Ferment. Bioengin. ),72(5) :352-357(1991))。本發(fā)明人的最近申請（國際申請第 WO 2013/003291 號）公開了由對天然槐糖脂進行稀酸處理而得到的一類新穎槐糖酯，天然槐糖脂的誘導力 為槐糖本身的至少30倍。


【發(fā)明內容】

[0012] 在一個方面，本發(fā)明提供了一種用于產生相關蛋白質的方法，其包含提供發(fā)酵宿 主和將所述發(fā)酵宿主與碳源和一或多種選自由以下各項組成的群組的化合物一起培養(yǎng)：

【權利要求】
1. 一種用于產生相關蛋白質的方法，其包含： a) 提供發(fā)酵宿主；和 b) 將所述發(fā)酵宿主與碳源和一或多種選自由以下各項組成的群組的化合物一起培 養(yǎng)：

其中R^H或C(O)R; Rb是H或C(O)R; R。是H或C(O)R; Rd是H或C(O)CH3; RgH或C(O)CH3; 心是H或C(O)CH3; &是!1 或C(0)CH3 ;且 R是脂肪族部分，其限制條件是在式（II)中，當艮是H或C(0)CH3且Rb是H或C(0)CH3 時，R。是H， 其中所述發(fā)酵宿主是在足以產生相關蛋白質的條件下加以培養(yǎng)。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中向所述培養(yǎng)物中加入任選的常規(guī)誘導劑。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述任選的常規(guī)誘導劑包含乳糖、纖維二糖、槐 糖、纖維素、纖維素水解物、麥芽糖、異麥芽糖、麥芽糊精、淀粉或淀粉水解物。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中所述相關蛋白質是纖維素酶或淀粉酶。
5. 根據權利要求1所述的方法，其中所述相關蛋白質是同源或異源蛋白質。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中所述同源或異源蛋白質是酶、激素、生長因子、細 胞因子或抗體。
7. 根據權利要求1所述的方法，其中所述發(fā)酵宿主能夠產生纖維素酶或淀粉酶。
8. 根據權利要求1所述的方法，其中所述發(fā)酵宿主是絲狀真菌或細菌或選自由以下 各項組成的菌屬群組的其它宿主：木霉屬（Trichoderma)、腐殖菌屬（Humicola)、側耳菌 屬（Pleurotus)、鏡刀菌屬（Fusarium)、曲霉屬（AspergiIlus)、鏈霉屬（Streptomyces)、 嗜熱單抱霉屬（Thermomonospora)、牙胞桿菌屬（Bacillus)、纖維桿菌屬（Cellulomonas)、 青霉屬（Penicillium)、擔子菌屬（Basidiomycete)、金孢屬（Chrysoporium)、擬盤多毛 抱屬（Pestalotiopsis)、脈抱菌屬（Neurospora)、頭抱霉屬（Cephalosporium)、綿霉屬 (Achlya)、柄孢殼菌屬（Podospora)、內座殼屬（Endothia)、毛霉屬（Mucor)、旋孢腔菌 屬（Cochliobolus)、毀絲霉屬（Myceliophthora)、籃狀菌屬（Talaromyces)和梨抱菌屬 (Pyricularia)ο
9. 根據權利要求1所述的方法，其中所述發(fā)酵宿主是絲狀真菌里氏木霉（Trichoderma reesei)或黑曲霉（Aspergillusniger) 〇
10. 根據權利要求1所述的方法，其中使所述發(fā)酵宿主在液體培養(yǎng)基中或在無自由流 動液體的固體底物上生長。
11. 根據權利要求1所述的方法，其中所述發(fā)酵宿主具有與編碼相關蛋白質的基因可 操作地連接的啟動子。
12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述啟動子是纖維素酶基因啟動子或淀粉酶基 因啟動子。
13. 根據權利要求11所述的方法，其中所述啟動子是cbhl啟動子或glaA啟動子或 amyA啟動子。
14. 根據權利要求1所述的方法，其中所述碳源是生物質。
15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述生物質是葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、乳糖、 纖維素、纖維素水解物、淀粉、淀粉水解物、麥芽糖或麥芽糊精。
16. 根據權利要求1所述的方法，其中所述式（I)、（II)、（III)、（IV)和（V)化合物是 從得自于化學催化或酶催化的轉酯化反應的粗產物混合物分離。
17. 根據權利要求1所述的方法，其中所述式（VI)化合物是從天然內酯型槐糖脂的甲 酸處理過程分離。
18. 根據權利要求1所述的方法，其中所述式（VII)化合物是從酵母假絲酵母菌 (Candidabombicola)的培養(yǎng)物分離。
19. 根據權利要求1所述的方法，其中R是選自未經取代的C^C24烷基、經取代的C^C24 烷基、未經取代的C2-C24烯基和經取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
20. 根據權利要求1所述的方法，其中R是選自經羥基取代的C1-C24烷基和經羥基取代 的C2-C24烯基的脂肪族部分。
21. 根據權利要求1所述的方法，其中R是選自經羧基取代的C1-C24烷基和經羧基取代 的C2-C24烯基的脂肪族部分。
22. 根據權利要求1所述的方法，其中R是選自經芳香族基團取代的C1-C24烷基和經芳 香族基團取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
23. 根據權利要求1所述的方法，其中所述式（I)、（II)、（III)、（IV)、（V)、（VI)和 (VII)化合物包含： K
U
其中Rt^H或C(O)CH3;RgH或C(O)CH3; 心是H或C(O)CH3; 且心是!1或C(0)CH3。
24. -種用于產生一或多種式（I)、式（II)、式（III)、式（IV)或式（V)化合物的方法， 其包含： a) 提供 >糖；和 b) 使所述二糖與乙烯酯在脂肪酶存在下在溶劑系統中接觸。
25. 根據權利要求24所述的方法，其中所述二糖包含乳糖、槐糖、纖維二糖、麥芽糖或 異麥芽糖。
26. 根據權利要求24所述的方法，其中所述脂肪酶包含Novozyme435、LipozymeTL、 LipozymeRM或Amano脂肪酶PS。
27. 根據權利要求24所述的方法，其中所述乙烯酯包含乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸 乙烯酯、肉桂酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、油酸乙烯酯、亞油酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯或硬 脂酸乙烯酯。
28. 根據權利要求24所述的方法，其中所述溶劑系統包含與叔戊醇、叔丁醇、四氫呋 喃、丙酮、甲醇或乙腈混合的極性溶劑。
29. 根據權利要求24所述的方法，其中所述極性溶劑包含二甲亞砜（DMSO)、吡啶或二 甲基甲酰胺（DMF)。
30. 根據權利要求24所述的方法，其還包含加熱到40°C至100°C之間的溫度。
31. 根據權利要求24所述的方法，其還包含進行真空蒸餾以去除所述溶劑系統和分離 相關產物。
32. -種用于產生一或多種式（I)、式（II)、式（III)、式（IV)或式（V)化合物的方法， 其是通過適當的二糖與合適的乙烯酯在溶劑系統中進行酸或堿催化的轉酯化反應來進行。
33. 根據權利要求32所述的方法，其中所述堿是碳酸鉀（K2C03)、氫氧化鈉（NaOH)或氫 氧化鉀（KOH)。
34. 根據權利要求32所述的方法，其中所述酸是硫酸（H2SO4)或鹽酸（HCl)。
35. 根據權利要求32所述的方法，其中所述乙烯酯包含乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯、丁酸 乙烯酯、肉桂酸乙烯酯、甲基丙烯酸乙烯酯、油酸乙烯酯、亞油酸乙烯酯、棕櫚酸乙烯酯或硬 脂酸乙烯酯。
36. 根據權利要求32所述的方法，其中所述溶劑系統包含諸如二甲亞砜（DMSO)、吡啶 或二甲基甲酰胺（DMF)等極性溶劑。
37. -種用于產生一或多種式（VI)化合物的方法，其包含： a) 在實質上非水性條件下使天然內酯型槐糖脂與甲酸或乙酸反應；和 b) 部分或完全去除所形成的甲酸酯或乙酸酯。
38. 根據權利要求37所述的方法，其中所述使天然槐糖脂與甲酸或乙酸反應步驟是由 第二種酸催化。
39. 根據權利要求37所述的方法，其中所述第二種酸包含硫酸（H2SO4)或鹽酸（HCl)。
40. 根據權利要求37所述的方法，其中所述天然槐糖脂是由發(fā)酵宿主產生。
41. 根據權利要求40所述的方法，其中所述發(fā)酵宿主是假絲酵母菌。
42. 根據權利要求37所述的方法，其中所述實質上非水性條件包含水含量不超過約 10 %的反應混合物。
43. 根據權利要求37所述的方法，其還包含在所述部分或完全去除所形成的甲酸酯或 乙酸酯步驟之前在40°C至120°C之間的溫度下進行加熱的步驟。
44. 根據權利要求37所述的方法，其中所述去除所形成的甲酸酯包含在乙酸和甲醇中 回流。
45. 根據權利要求37所述的方法，其中所述去除所形成的乙酸酯包含用酸或堿進行處 理。
46. -種由發(fā)酵宿主產生一或多種式（VII)化合物的方法。
47. 根據權利要求46所述的方法，其中所述發(fā)酵宿主是假絲酵母菌。
48. 根據權利要求46所述的方法，其中所述式（VII)和（Vila)化合物是從得自于假絲 酵母菌培養(yǎng)物的粗混合物分離。
49. 一種用于產生槐糖的方法，其包含： a) 在實質上非水性條件下使天然槐糖苷與甲酸反應；和 b) 完全去除所形成的甲酸酯； 其中獲得了經過純化的槐糖。
50. 根據權利要求49所述的方法，其中所述天然槐糖苷是甜菊苷、槐糖脂和類黃酮槐 糖苷。
51. 根據權利要求49所述的方法，其中所述使天然槐糖苷與甲酸反應步驟是由第二種 酸催化。
52. 根據權利要求51所述的方法，其中所述第二種酸包含硫酸（H2SO4)或鹽酸（HCl)。
53. 根據權利要求49所述的方法，其中所述實質上非水性條件包含水含量不超過約 10 %的反應混合物。
54. 根據權利要求49所述的方法，其還包含在所述完全去除甲酸酯步驟之前在40°C至 120 °C之間的溫度下進行加熱的步驟。
55. 根據權利要求49所述的方法，其中完全去除甲酸酯包含在溶劑中用堿進行處理。
56. 根據權利要求55所述的方法，其中所述堿是甲醇鈉（CH3NaO)或氨（NH3),且所述溶 劑是甲醇或乙醇。
57. -種具有式（II)結構的化合物，
其中： RgH或C(O)R; Rb是H或C(O)R; Rc^H或C(O)R;且 R是脂肪族部分，其限制條件是當R#H或C(0)CH3且Rb是H或C(0)CH3時，R。是H。
58. 根據權利要求57所述的化合物，其中R是選自由以下各項組成的群組：未經取代 的C1-C24烷基；經羥基、羧基或芳香族基團取代的C^C24烷基；未經取代的C2-C24烯基；和經 羥基、羧基或芳香族基團取代的C2-C24烯基。
59. 根據權利要求57所述的化合物，其中R是選自未經取代的C^C24烷基、經取代的 C1-C24烷基、未經取代的C2-C24烯基和經取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
60. 根據權利要求57所述的化合物，其中R是選自經羥基取代的C^C24烷基和經羥基 取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
61. 根據權利要求57所述的化合物，其中R是選自經羧基取代的C^C24烷基和經羧基 取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
62. 根據權利要求57所述的化合物，其中R是選自經芳香族基團取代的C^C24烷基和 經芳香族基團取代的C2-C24烯基的脂肪族部分。
【文檔編號】C12P21/00GK104471071SQ201380037346
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年7月18日 優(yōu)先權日:2012年7月20日
【發(fā)明者】湯姆·濤·黃 申請人:索芙洛生物技術公司