通過合成的自我復制的RNA形成人iPS細胞的制作方法
【專利摘要】本公開文本提供了用于獲得誘導性干細胞的方法和組合物，及其制備和使用方法。
【專利說明】通過合成的自我復制的RNA形成人iPS細胞
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2012年5月21日提交的美國臨時申請序列號61/649, 876和2013年 3月15日提交的61/798, 229號的優(yōu)先權(quán)，在此通過引用將它們每一個全文并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 提供了用于從成纖維細胞產(chǎn)生和繁殖干細胞的方法和組合物。本公開文本涉及誘 導性多能干細胞（iPS)的產(chǎn)生及其使用方法。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 干細胞為再生器官、修復組織、制備或遞送生物因子和治療疾病或病癥的潛在來 源。
[0006] 發(fā)明概述
[0007] 患者來源的誘導性多能干細胞的產(chǎn)生對于在治療上使用干細胞是重要的。iPS細 胞的產(chǎn)生要求幾個多能性轉(zhuǎn)錄因子或重組因子（RF)的表達，包括Oct4、Sox2、Klf4、cMyc、 Glisl(和潛在地Nanog與Lin28)。然而，由于擔心在iPS細胞產(chǎn)生期間載體DNA(病毒和 裸DNA)整合到基因組中，排除了這些方法隨后應(yīng)用在患者中。
[0008] 本公開文本描述了通過使用來自修飾的甲病毒（例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎（VEE)病 毒）的合成的自我復制的RNA來異位表達RF以產(chǎn)生誘導性多能干細胞（iPS)的方法。在 一實施方案中，設(shè)計甲病毒表達四種RF，使其具有超過mRNA轉(zhuǎn)染方法的下列優(yōu)勢：1)利用 能夠用于有限數(shù)量的細胞分裂的自我復制的單一RNA種類，因此減少了轉(zhuǎn)染量；2)能夠在 一個、兩個、三個、四個或更多個RF開放閱讀框（0RF)處編碼；以及3)在多次細胞分裂過程 中以高閾值水平穩(wěn)定表達所有RF基因。通過使用甲病毒的自我復制骨架（已移除結(jié)構(gòu)基 因）表達RF只需要3-4次轉(zhuǎn)染（甚至只要1或2次）到原代成纖維細胞就可以產(chǎn)生iPS 細胞。甲病毒RF-RNA轉(zhuǎn)錄本的產(chǎn)生利用SP6 (或T7)體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，不要求特別的條件， 因此進一步地簡化了方法用于廣泛用途。通過隨時間在相同的細胞中以穩(wěn)定高水平表達四 種RF，連同用于有效數(shù)量的多次細胞傳代的甲病毒-RFRNA的復制，甲病毒-RFRNA方法 解決了與通過持續(xù)大于14天每天重復用四個單獨的RFmRNA每天轉(zhuǎn)染來嘗試產(chǎn)生iPS細 胞有關(guān)的主要的無效率問題。甲病毒-RFRNA為不利用DNA中間物的異位方法，因此沒有 機會發(fā)生基于DNA載體的iPS細胞方法可能發(fā)生的整合突變。而且，可以通過從培養(yǎng)基撤 回B18R來調(diào)節(jié)通過降解來丟失RNA復制子的時機。使用這一方法，0CT4/KLF4/S0X2/c-MYC 與0CT4/KLF4/S0X2/GLIS1甲病毒-RFRNA方案從兩個獨立的親代人成纖維細胞群中產(chǎn)生 了大于100個獨立的iPS細胞克隆。另外，可以改造方法以表達可選的RF組合和/或向 RF-RNA骨架插入額外的RF0RF，用于從特定的細胞類型提純iPS細胞產(chǎn)生或在驅(qū)動分化轉(zhuǎn) 化中使用。
[0009] 本公開文本提供了甲病毒復制子RNA，其包含至少一個來自甲病毒的非結(jié)構(gòu)性復 制酶域和至少一個編碼因子的非甲病毒的異源性序列，所述因子用于當在體細胞中表達時 誘導多能干細胞的產(chǎn)生。在一實施方案中，復制子包含獲自甲病毒的序列，所述甲病毒選自 東方馬腦炎病毒（EEE)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEE)、埃弗格賴德病毒、穆坎博病毒、皮春納 病毒和西方馬腦炎病毒（WEE)。在另一實施方案中，復制子包含獲自甲病毒的序列，所述甲 病毒選自辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、米德爾堡病毒、基孔肯雅病毒、阿尼昂尼昂病 毒、羅斯河病毒、巴馬森林病毒、蓋他病毒、鷺山病毒、貝巴魯病毒、馬雅羅病毒、烏納病毒、 奧拉病毒、瓦塔羅阿病毒、巴班肯病毒、Kyz病毒（Kyzylagachvirus)、高地J病毒、摩根堡 病毒、恩杜姆病毒、博吉河病毒。還在另一實施方案中，至少一個非甲病毒的異源性序列包 含至少2、3、4或5個非甲病毒的異源性序列。還在另一實施方案中，在上文任何的非甲病 毒的異源性序列選自編碼KLF多肽、S0X-2多肽、0CT-3/4多肽、c-MYC或n-MYC或L-MYC多 肽、GLIS1多肽、NANOG多肽和其任何組合的多核苷酸。在另一實施方案中，編碼KLF多肽的 多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:8序列至少95%同一性的KLF多肽。在另一實施方案中， 編碼KLF多肽的多核苷酸編碼具有SEQIDN0:8序列的KLF多肽。還在另一實施方案中， 編碼KLF多肽的多核苷酸包含SEQIDNO: 7所示序列，其中"T"為"U"。在另一實施方案 中，編碼S0X-2多肽的多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:6序列至少95%同一性的S0X-2多 肽。在另一實施方案中，編碼S0X-2多肽的多核苷酸編碼具有SEQIDN0:6序列的S0X-2 多肽。還在另一實施方案中，編碼S0X-2多肽的多核苷酸包含SEQIDN0:5所示序列，其中 "T"為"U"。在另一實施方案中，編碼0CT-4多肽的多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:4序列 至少95%同一性的0CT-4多肽。在另一實施方案中，編碼0CT-4多肽的多核苷酸編碼具有 SEQIDN0:4序列的0CT-4多肽。還在另一實施方案中，編碼0CT-4多肽的多核苷酸包含 SEQIDN0:3所示序列，其中"T"為"U"。在另一實施方案中，編碼c-MYC多肽的多核苷酸 編碼具有與SEQIDNO: 10序列至少95%同一性的c-MYC多肽。在另一實施方案中，編碼 c-MYC多肽的多核苷酸編碼具有SEQIDNO: 10序列的c-MYC多肽。還在另一實施方案中， 編碼c-MYC多肽的多核苷酸包含SEQIDN0:9所示序列，其中"T"為"U"。在另一實施方案 中，編碼GLIS1多肽的多核苷酸編碼具有與SEQIDN0:34序列至少95%同一性的GLIS1多 肽。在另一實施方案中，編碼GLIS1多肽的多核苷酸編碼具有SEQIDN0:34序列的GLIS1 多肽。還在另一實施方案中，編碼GLIS1多肽的多核苷酸包含SEQIDN0:33所示序列，其 中"T"為"U"。在另一實施方案中，編碼NAN0G多肽的多核苷酸編碼具有與SEQIDNO:2序 列至少95%同一性的NANOG多肽。在另一實施方案中，編碼NANOG多肽的多核苷酸編碼具 有SEQIDN0:2序列的NAN0G多肽。還在另一實施方案中，編碼NAN0G多肽的多核苷酸包含 SEQIDNO: 1所示序列，其中"T"為"U"。在一實施方案中，在上文任何的復制子從5'到3' 包含：(VEERNA復制酶）-(啟動子）-(RFJ-(自切割肽）-(RF2)-(自切割肽）-(RF3) -(IRES 或核心啟動子）-(RF4) - (IRES或任選的啟動子）-(任選的選擇性標記物）-(VEE3 'UTR和聚 腺苷酸尾）_(任選的選擇性標記物）_啟動子；其中RFh為誘導體細胞去分化為多能細胞 的因子，其中RF2_3為任選的、RF3_4為任選的、或RF4為任選的；其中RFh選自0ct-4、Klf4、 Sox-2、c-Myc、Nanog和Glisl。在另一實施方案中，復制子包含與SEQIDN0:29、30、31或 32從大約位置1到大約位置756190%、95%、98 %、99 %或100 %同一的序列，其中序列的 "T"被"U"取代，接著是一個或多個RF，再接著是3'UTR和聚腺苷酸尾，其中一個或多個RF 選自O(shè)ct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glisl;其中當存在多個RF時，編碼序列可被 內(nèi)部核糖體進入位點（IRES)或小啟動子所分隔。在另一實施方案中，復制子括與選自SEQ 10吣:29、30、31或32的序列至少95%、98%、99%或100%同一的序列，其中"!'"為1"。
[0010] 本公開文本也提供了組合物，其包含被如以上任何實施方案和本文進一步所述的 實施方案中所述的復制子轉(zhuǎn)化的人細胞。在一實施方案中，組合物還包含B18R條件培養(yǎng) 基。在另一實施方案中，人細胞為體細胞。在另一實施方案中，人細胞為成纖維細胞。
[0011] 本公開文本也提供了制備干細胞的方法，其包括在表達復制子的編碼序列的條件 下培養(yǎng)以上和本文他處所述的組合物至少30天，和分離干細胞。
[0012] 本公開文本也提供了制備干細胞的方法，其包括用本公開文本的復制子轉(zhuǎn)化體細 胞，在促進復制子表達的條件下培養(yǎng)體細胞，和分離干細胞。在一實施方案中，培養(yǎng)包括在 B18R條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞。在另一實施方案中，通過將B18RmRNA轉(zhuǎn)染到原代人成纖維 細胞來產(chǎn)生B18R條件培養(yǎng)基。
[0013] 本公開文本也提供了通過本文所述的方法所獲得的分離的干細胞，其中干細胞沒 有逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA或RNA。
[0014] 本公開文本也提供了方法，其包括：使人體細胞與異位的自我復制的RNA復制子 接觸，所述復制子包含編碼至少四個選自以下的去分化因子的多核苷酸：（i)KLF4、（ii) 0CT4、（iii)SOX2、（iv)c-MYC或n-MYC或L-MYC、（v)GLISl和（vi)NANOG;培養(yǎng)體細胞以表 達去分化因子；選擇呈現(xiàn)干細胞形態(tài)和/或干細胞標志物的細胞；和繼代培養(yǎng)細胞以獲得 誘導性干細胞群。在一實施方案中，通過檢測腫瘤排斥抗原1-60和/或1-81的表達選擇 細胞。
[0015] 本公開文本也提供了用于產(chǎn)生人干細胞的載體系統(tǒng)，其包含至少一個自我復制 的RNA復制子，所述復制子包含一個或多個編碼選自以下的去分化因子的多核苷酸：KLF4、 0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1和NAN0G或其任何組合。在一實施方案中，復 制子包含（a) 0ct4、Sox2、Klf4 與c_Myc，或（b) 0ct4、Sox2、Klf4 和Glisl。在另一實施方 案中，至少一個自我復制的RNA載體源自甲病毒。在另一實施方案中，甲病毒為VEE。
[0016] 本公開文本也提供了包含異位的RNA復制子的分離的人體細胞，所述復制子包含 一個或多個去分化多核苷酸序列。在另一實施方案中，其中在表達異位的RNA復制子中去 分化多核苷酸的培養(yǎng)條件下，體細胞去分化。
[0017] 本公開文本也提供了包含人體細胞的細胞群，所述人體細胞含有異位的RNA復制 子，所述復制子包含一個或多個去分化多核苷酸序列。
[0018] 本公開文本也提供了通過以下方法獲得的細胞群：通過使人體細胞與異位的自 我復制的RNA復制子接觸，所述復制子包含編碼至少四個選自以下的去分化因子的多核苷 酸：（i)KLF4,（ii)0CT4,（iii)S0X2,（iv)c-MYC或n-MYC或L-MYC，（v)GLISl和（vi)NANOG; 培養(yǎng)體細胞以表達去分化因子；選擇呈現(xiàn)干細胞形態(tài)學和/或干細胞標志物的細胞；和繼 代培養(yǎng)細胞以獲得誘導性干細胞群。在一實施方案中，通過檢測腫瘤排斥抗原1-60和/或 1-81的表達選擇細胞。
[0019] 本公開文本也提供了含有編碼B18R的異位的RNA分子的重組的人成纖維細胞。在 一實施方案中，編碼B18R的RNA包含SEQIDN0:39,其中"T"被"U"代替。在另一實施方 案中，RNA編碼包含SEQIDNO:40所示序列的多肽。
[0020] 本公開文本也提供了制備B18R條件培養(yǎng)基的方法，其包括在允許B18R表達的條 件下培養(yǎng)用編碼B18R的RNA轉(zhuǎn)化的人成纖維細胞，和從培養(yǎng)分離培養(yǎng)基。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖1A-E顯示了親代人成纖維細胞中合成的VEE-RFRNA復制子的結(jié)構(gòu)和持久性。 (A)VEE-RFRNA復制子的示意圖。5'末端nsPl-4:非結(jié)構(gòu)蛋白1-4;3'末端C，E2，E1:結(jié)構(gòu) 蛋白。26S內(nèi)部啟動子，核糖體轉(zhuǎn)移2A肽，IRES序列，嘌呤霉素（Puro)耐藥基因和用于PCR 檢測復制子的區(qū)域的位置如所示。（B)B18RmRNA與VEERNA復制子的共轉(zhuǎn)染能夠在第1天 表達VEE-GFP。（C)B18R條件培養(yǎng)基（B18R-CM)和嘌呤霉素選擇是VEE-GFPRNA持久超過 7天必需的。（D)B18R-CM和嘌呤霉素是VEE-GFPRNA保留必需的。如所示的在第7天GFP 表達的圖片。條，200ym。（E)VEERNA的免疫印跡分析表示的在第1天HFF細胞中表達的 重編程因子，與逆轉(zhuǎn)錄病毒（RV-4FS)表達比較。
[0023] 圖2A-E顯示了通過VEE-RFRNA產(chǎn)生iPS細胞。（A)表觀遺傳的VEE-RFRNAiPS 細胞產(chǎn)生方案的示意圖。在第〇天（d0)平板接種人成纖維細胞并且在第1天用VEE-RFRNA 復制子加上B18RmRNA(3:l比率）共轉(zhuǎn)染（Tfx)(匯合，約4X105個細胞）并且如所示的 用嘌呤霉素處理直到第7天（或第10天）。細胞在B18R-CM中培養(yǎng)直到在第25-30天分離 iPS細胞集落。（B)VEE-OKS-iMRNA產(chǎn)生用堿性磷酸酶染色的iPS細胞集落，但VEE-0MKS 1?嫩不產(chǎn)生。（〇如所示的從第1、4、7、10天轉(zhuǎn)染方案，從耵或冊？所產(chǎn)生的1?3細胞集落 的堿性磷酸酶染色。（D)如所示的來自BJ或HFF成纖維細胞的VEE-OKS-iMRNA第26天和 VEE-OKS-iGRNA第22天的iPS細胞集落的典型圖像。條，100ym。（E)如所示的產(chǎn)生分離 的iPS細胞克隆中多能ES標志物基因的免疫組化染色。從26個其他iPS細胞克隆（總共 30個克?。┇@得的相似的結(jié)果。條，100ym;插圖，10倍放大率。
[0024] 圖3A-E顯示了VEE-RFRNAiPS細胞克隆的特征。⑷如所示的通過qRT-RCR分 析BJ和HFF的VEE-OKS-iMiPS克隆的ES標志物基因的表達。（B)NANOG和0CT4啟動子 區(qū)域的DNA甲基化分析。實心圓，甲基化的；空心圓，去甲基化的。頂部數(shù)字指示相對于轉(zhuǎn) 錄起始位點的CpG數(shù)字。（C)與帶有所示多能性NANOG、0CT4、S0X2的親代人BJ成纖維細 胞和人HUES9胚胎干細胞比較BJ-0KS-iM#2和BJ-0KS-iG#5的全基因組mRNA序列資料散 點圖分析。（D)全基因組RNA序列分析的非監(jiān)督式分層系統(tǒng)樹圖顯示了與BJ成纖維細胞 比較，四個獨立的帶有HUES9的iPS細胞克隆的聚集。（E)裸鼠中BJ-0KS-iM#21克隆的畸 胎瘤形成。AE1/AE3(細胞角蛋白）、NF-1(神經(jīng)元細胞）和GFAP(神經(jīng)元細胞）用作外胚 層的標志物；肌間線蛋白（肌肉細胞）用作中胚層的標志物；以及AFP(原始的和定形內(nèi)胚 層）用作內(nèi)胚層的標志物。條，100um。
[0025] 圖4顯示了用于檢查RNA復制子的存在的RT-PCR分析。OKS-iM-RNA復制子的質(zhì)粒 ?〇?敏感性的測量。用100、10和1€8質(zhì)粒（上圖）進行1^?2、118?4和0(^4-了24-1(1^4(01() 區(qū)域的PCR。HFF-OKS-iMiPSC克隆的RT-PCR。+;陽性對照，在OKS-iM-RNA復制子的轉(zhuǎn)染 后一天制備總RNA。陰性對照，從模擬的轉(zhuǎn)染HFF制備總RNA。從第8代制備來自iPS細 胞克隆的總RNA(下圖）。
[0026] 圖5顯示了iPS細胞克隆的核型分析。在每一克隆20個G顯帶分裂中期細胞進 行HFF-0KS-iM-l、BJ-0KS-iM-2、BJ-0KS-iM-21 和BJ-OKS-iG-5 克隆的G顯帶核型分析并且 在所有克隆中判斷為正常的男性核型（細胞系GENETICS)。
[0027] 圖6A-B顯示了用ST0飼養(yǎng)細胞培養(yǎng)iPS細胞克隆。收集細胞，然后肌內(nèi)地或皮 下地注射到裸鼠的后肢肌肉或背側(cè)。在注射5-8周后，切開腫瘤并且用4%多聚甲醛固定。 (A)裸鼠中HFF-〇KS-iM#l克隆的畸胎瘤分析。AE1/AE3(細胞角蛋白）和NF-1 (神經(jīng)元細 胞）用作外胚層的標志物；肌間線蛋白（肌肉細胞）用作中胚層的標志物；以及AFP(原始 的和定形內(nèi)胚層）用作內(nèi)胚層的標志物。條，lOOum。（B)來自BJ-OKS-iG克隆3和5的畸 胎瘤的H&E染色。條，lOOym。
[0028] 圖7A-D顯示（A)B18R條件培養(yǎng)基對VEERNA復制子的持久存在有用。頂部：GFP 陽性細胞的％，底部：GFP陽性群中GFP熒光的平均值。（B)細胞的圖片。條，200ym。（C) 如所示的在第10天RF的蛋白表達。（D)B18R-CM是飼養(yǎng)培養(yǎng)中iPS細胞產(chǎn)生所必需的。如 所示的用〇KS-iMRNA和B18RmRNA共轉(zhuǎn)染HFF，然后在B18R-CM和嘌呤霉素存在的情況下 培養(yǎng)細胞。在第10天（第1、3、8天轉(zhuǎn)染）或第11天（第1、4、7、10天轉(zhuǎn)染）將細胞傳代 至ST0飼養(yǎng)細胞，在B18R-CM加上/減去嘌呤霉素存在或不存在的情況下培養(yǎng)細胞。
[0029] 發(fā)明詳述
[0030] 如本文和所附的權(quán)利要求中所用的，單數(shù)形式"一（a)"、"一個（an)"和"所述 (the) "包括復數(shù)指示物，除非上下文另有明確地規(guī)定。因此，例如提及"一細胞"包括許多 此類細胞和提及"一試劑"包括提及本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員已知的一個或多個試劑等。
[0031] 而且，"或"意指"和/或"除非另有說明。相似地，"包含（comprise)"，包含 (comprises) "、"包含（comprising) "、"包括（include) "、"包括（includes)" 和"包括 (including)"為可互換的并且不以此為限。
[0032] 還應(yīng)理解的是其中各自實施方案的描述使用術(shù)語"包含"，本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員 應(yīng)理解在一些具體實例中，可選地使用語言"基本上由……組成"或"由……組成"描述實施 方案。
[0033] 盡管與本文所述的那些相似的方法和材料或等同物可以用于實施所公開的方法 和組合物，本文描述了示例性方法、裝置和材料。
[0034] 除非另有定義，本文所用的所有科技和科學術(shù)語都具有與本公開內(nèi)容所屬的領(lǐng)域 中普通技術(shù)人員通常理解的相同的意義。因此，如貫穿本申請中所用的，下列術(shù)語將具有下 列的意義。
[0035] 雖然誘導性多能干細胞（iPS細胞）實際上在分子水平和功能水平上與ES細胞相 同，存在將它們的治療潛能轉(zhuǎn)化成醫(yī)學應(yīng)用的關(guān)鍵障礙。問題之一為因為目前iPS細胞的 重編程和繁殖的標準方案包括不適用于潛在的臨床目的的動物衍生的材料，需要研發(fā)產(chǎn)生 和擴增hiPS細胞的完全確定的方法。
[0036] 日本京都大學ShinyaYamanaka小組描述了誘導性多能干細胞（iPS)。Yamanaka 鑒定了在胚胎干細胞中特別活躍的基因并且將逆轉(zhuǎn)錄病毒用于用精選的那些基因轉(zhuǎn)染 小鼠成纖維細胞。最后，分離了四個對多能干細胞產(chǎn)生至關(guān)重要的關(guān)鍵的多能性基因： 0ct-3/4、S0X2、c-Myc和Klf4。通過Fbxl5+細胞的抗生素選擇分離細胞。相同的小組與其 他兩個來自哈佛，MIT和洛杉磯加利福尼亞大學的獨立的研宄小組一起發(fā)表了研宄，表明將 小鼠成纖維細胞成功的重編程到iPS并且甚至產(chǎn)生了可存活的嵌合體。
[0037] 通過四個重編程的因子（RF;也稱為去分化因子）的逆轉(zhuǎn)錄病毒的表達產(chǎn)生人iPS 細胞開啟了基于患者特異的個人化干細胞的再生醫(yī)學治療的潛能。然而，逆轉(zhuǎn)錄病毒的插 入致突變潛能連同休眠的RF基因特別是c-MYC活化的潛能，幾乎消除了基于整合的DNA的 方法用于再生醫(yī)學治療。已研發(fā)了其他基于DNA的iPS方法，使用附加型載體，腺病毒，整合 的和離體的piggyBac轉(zhuǎn)位子或敲除的慢病毒；然而，這些方法或受iPS細胞產(chǎn)生的低效率 之苦或需要留下插入的DNA元件標簽的基因組刪除策略。使用仙臺病毒或mRNA轉(zhuǎn)染的基于RNA的iPS細胞方法避免了與基于DNA的方法有關(guān)的潛在的整合問題并且為內(nèi)在地更安全 的用于臨床應(yīng)用的方法。盡管仙臺病毒提供了相當有效的iPS方法，與在iPS細胞克隆中 持久的仙臺病毒復制有關(guān)的問題需要陰性選擇步驟，接著是幾個來自單細胞水平的再克隆 步驟以分離無病毒的iPS細胞，此類過程導致了過度的iPS細胞分裂和傳代。更有希望的 非基于DNA的方法之一涉及四個單獨的RFmRNA(加上GFPmRNA)在16天里每天轉(zhuǎn)染。不 幸地，這種方法仍然是有問題的。例如，進行用相應(yīng)的轉(zhuǎn)染的mRNA取代KLF4和c-MYC逆轉(zhuǎn) 錄病毒的試驗并且驗證結(jié)果；然而不能用轉(zhuǎn)染的mRNA取代0CT4和S0X2逆轉(zhuǎn)錄病毒。這問 題看來起源于RFmRNA的快速降解以及隨著時間不一致的細胞-細胞閾值表達水平變異， 其源自在重編程期間嘗試每天轉(zhuǎn)染四個獨立的mRNA到相同的細胞，持續(xù)大于14天。因此， 仍然存在著對產(chǎn)生人iPS細胞簡單的、高度可再生的、非基于DNA的方法的重要的需求。
[0038] 本公開文本提供了用于產(chǎn)生來自體細胞（例如成纖維細胞）的iPS細胞的方法和 組合物。組合物和方法包括衍生自甲病毒的復制子的使用。復制子包含復制所必需的編碼 非結(jié)構(gòu)性甲病毒蛋白的RNA序列和1、2、3、4個或更多的與甲病毒異源的編碼序列，其誘導 體細胞到干細胞表型的去分化。
[0039] 如本文所用的，術(shù)語"甲病毒"具有它在本領(lǐng)域中常規(guī)的意義，并且包括各種物種， 諸如委內(nèi)瑞拉馬腦炎（VEE)病毒、東方馬腦炎（EEE)病毒、埃弗格賴德病毒（EVE)、穆坎博 病毒（MUC)、皮春納病毒（PIX)和西方馬腦炎病毒，所有這些都是甲病毒的VEE/EEE組的成 員。其他甲病毒包括，例如塞姆利基森林病毒（SFV)、辛德畢斯病毒、羅斯河病毒、基孔肯雅 病毒、S.A.AR86、巴馬森林病毒、米德爾堡病毒、阿尼昂尼昂病毒、蓋他病毒、覽山病毒、貝巴 魯病毒、馬雅羅病毒、烏納病毒、奧拉病毒、瓦塔羅阿病毒、巴班肯病毒、Kyz病毒、高地J病 毒、摩根堡病毒、恩杜姆病毒和博吉河病毒。在本文所述的構(gòu)建體和方法中特別有用的甲病 毒為VEE/EEE組甲病毒。
[0040] 術(shù)語"甲病毒RNA復制子"、"甲病毒復制子RNA"、"甲病毒RNA載體復制子"和"載 體復制子RNA"可互換地使用，指的是表達非結(jié)構(gòu)性蛋白基因的RNA分子從而使得它可以引 導它自己的復制（擴增）并且在最低限度上包含5'和3'甲病毒復制識別序列，甲病毒非結(jié) 構(gòu)性蛋白的編碼序列，和多聚腺苷酸尾。它可額外地包含一個或多個指導異源性RNA序列 的表達，即轉(zhuǎn)錄和翻譯，的元件（例如IRES序列、核心或迷你啟動子等）。在一實施方案中， 本公開文本的甲病毒復制子可以包含5'和3'甲病毒復制識別序列、甲病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白 的編碼序列、多聚腺苷酸尾和一個或多個選自SOX-2、c-Myc、OCT-3/4、Klf、Glisl和Nanog 的編碼序列。
[0041] 術(shù)語"多核苷酸"、"核酸"或"重組的核酸"指的是諸如脫氧核糖核酸ONA)，并且 在適當?shù)那闆r下（特別是關(guān)于復制子），核糖核酸（RNA)的多核苷酸。
[0042] 關(guān)于基因或多核苷酸的術(shù)語"表達"指的是基因或多核苷酸的轉(zhuǎn)錄，并且視情況而 定，mRNA轉(zhuǎn)錄本到蛋白或多肽的翻譯。因此，如從上下文中清楚的是，蛋白或多肽的表達由 開放閱讀框的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯引起。
[0043] 本領(lǐng)域中那些技術(shù)人員應(yīng)認識到的是，由于基因密碼的簡并性質(zhì)，各種各樣在它 們的核苷酸序列中不同的密碼子可以用于編碼給定的氨基酸。只不過引用本文所述的特別 的多核苷酸或編碼多肽的基因序列來例證本公開文本的實施方案，并且本公開文本包括編 碼包含與本公開文本的方法中利用的酶的蛋白和多肽相同的多肽氨基酸序列的任何序列 的多核苷酸。同樣，多肽通?？梢匀淌芤粋€或多個在它的氨基酸序列中的氨基酸取代，刪除 和插入而沒有缺失或顯著的缺失期望的活性。本公開文本包括此類具有可選的氨基酸序列 的多肽，本文所示的通過RNA或DNA序列所編碼的氨基酸序列只不過例證本公開文本的實 施方案。
[0044] 本公開文本提供了重組的DNA表達載體、RNA復制子或質(zhì)粒形式的多核苷酸，如在 本文他處更詳述的編碼一個或多個多肽。
[0045] 使用cDNA、mRNA或可選地基因組DNA作為模板和適當?shù)墓押塑账嵋铮鶕?jù)標準 的PCR擴增技術(shù)和以下實施例部分中所述的那些程序可以擴增本公開文本的多核苷酸。由 此擴增的核酸可以克隆到適當?shù)妮d體并且通過序列分析表征。而且，通過標準的合成技術(shù)， 例如使用自動化DNA合成儀可以制備對應(yīng)于核苷酸序列的寡核苷酸。
[0046] 在一實施方案中，本公開文本的復制子包含從大約位置1至大約位置7561與SEQ IDN0:29、30、31或32有90%、95%、98%、99%或100%同一的序列（包括其中序列的， "T" 被"U" 取代），接著是一個或多個選自O(shè)ct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glisl的 RF。當存在多個RF時，編碼序列可被內(nèi)部核糖體進入位點（IRES)或諸如SP1小的（例如 核心）啟動子所分隔。對本公開文本而言RF的順序并不是關(guān)鍵的；因此順序可為Klf4、 Oct-3/4、Sox_2、c_Myc或可為Sox_2、Klf4、Oct-3/4、c_Myc或 0ct4、Klf4、Sox2、c_Myc或 RF順序的任何變化。復制子還包含選擇性標記物（例如抗生素抗性標記物）。在其他實施 方案中，RF的編碼序列可被諸如T2A和/或E2A自切割的肽分隔。在其他實施方案中，復 制子從5'到3'包含：(VEERNA復制酶）-(26S啟動子）-0^)-(自切割肽）-(RF2)-(自切 割肽）_ (RF3) - (IRES或核心啟動子）-(RF4) - (IRES或任選的啟動子）-(任選的選擇性標記 物）-(VEE3'UTR和聚腺苷酸尾）；其中RFg為誘導體細胞去分化為多能細胞的因子，其中 RF2_3為任選的，RF3_4為任選的，或RF4為任選的；其中RF^選自0ct-4、Klf4、Sox-2、c-Myc、 Nanog和Glisl。在一實施方案中，上文的復制子為RNA分子。在另一實施方案中，復制子 衍生于VEE并且包括減少致病性的突變。在一實施方案中，VEE為TC-83株（疫苗株）-帶 有一個點突變（nsP2P773-S突變）的基于RNA的復制子，其減少了復制子的細胞病變效應(yīng)。
[0047] 在上文的任何實施方案中，RF包括變體和簡并的多核苷酸序列。例如，RF可以包 含0CT-4多肽、KLF4多肽、S0X-2多肽、c-MYC多肽、NANOG多肽或GLIS1的同源物和變體。 例如，在本文所述的任何復制子實施方案中有用的NANOGRF編碼序列可以包含（i)編碼 SEQIDN0:2多肽的多核苷酸；（ii)包含與SEQIDN0:1至少95%同一性并且編碼具有 NANOG活性的多肽的多核苷酸；（iii)具有如前所述的SEQIDNO: 1的多核苷酸或（iv)編 碼含有1-10個保守的氨基酸取代并且其中多肽具有Nanog活性的SEQIDNO: 2多肽的多 核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被"U"取代的"T"。例如，在本文所述的任 何復制子實施方案中有用的〇ct-4RF編碼序列可以包含（i)編碼SEQIDN0:4多肽的多核 苷酸；（ii)包含與SEQIDNO: 3至少95%同一性并且其編碼具有Oct-4活性的多肽的多核 苷酸；（iii)具有如前所述的SEQIDNO:3的多核苷酸或（iv)編碼含有1-10個保守的氨 基酸取代并且其中多肽具有〇ct-4活性的SEQIDNO:4多肽的多核苷酸；其中任何上文所 述的核酸序列可以具有被"U"取代的"T"。例如，在本文所述的任何復制子實施方案中有用 的Sox-2RF編碼序列可以包含（i)編碼SEQIDN0:6多肽的多核苷酸；（ii)包含與SEQID NO: 5至少95%同一性并且其編碼具有S0X-2活性的多肽的多核苷酸；（iii)具有如前所述 的SEQIDNO: 5的多核苷酸或（iv)編碼含有1-10個保守的氨基酸取代并且其中多肽具有 S0X-2活性的SEQIDN0:6多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被"U" 取代的"T"。例如，在本文所述的任何復制子實施方案中有用的KLF4RF編碼序列可以包含 (i)編碼SEQIDN0:8多肽的多核苷酸；（ii)包含與SEQIDN0:7至少95%同一性并且其 編碼具有KLF4活性的多肽的多核苷酸；（iii)具有如前所述的SEQIDNO: 7的多核苷酸或 (iv)編碼含有1-10個保守的氨基酸取代并且其中多肽具有KLF4活性的SEQIDN0:8多肽 的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序列可以具有被"U"取代的"T"。例如，在本文所述 的任何復制子實施方案中有用的〇-1^0 1^編碼序列可以包含（1)編碼5￡0 10勵:10多肽 的多核苷酸；（ii)包含與SEQIDN0:9至少95%同一性并且其編碼具有c-MYC活性的多肽 的多核苷酸；（iii)具有如前所述的SEQIDNO: 7的多核苷酸或（iv)編碼含有1-10個保 守的氨基酸取代并且其中多肽具有c-MYC活性的SEQIDN0:10多肽的多核苷酸；其中任何 上文所述的核酸序列可以具有被"U"取代的"T"。例如，在本文所述的任何復制子實施方 案中有用的GLIS1RF編碼序列可以包含（i)編碼SEQIDN0:34多肽的多核苷酸；（ii)包 含與SEQIDN0:33至少95%同一性并且其編碼具有GLIS1活性的多肽的多核苷酸；（iii) 具有如前所述的SEQIDNO:33的多核苷酸或（iv)編碼含有1-10個保守的氨基酸取代并 且其中多肽具有GLIS1活性的SEQIDN0:34多肽的多核苷酸；其中任何上文所述的核酸序 列可以具有被"U"取代的"T"。
[0048] Nanog為在胚胎干細胞（ESC)中表達的基因并且在維持多能性方面發(fā)揮重要作 用。Nanog被認為是與S0X2 -起行使功能。編碼Nanog的多核苷酸和多肽分別示于SEQID N0:1和2中。而且，SEQIDN0:1包含被"T"可以被"U"取代的DNA序列。人NANOG蛋白 (例如見通過引用并入本文的檢索號NP_079141)為帶有位于細胞的核部分的同源域基序 的305個氨基酸蛋白。與小鼠的NANOG相似，人NANOG的N末端區(qū)域富含Ser、Thr和Pro 殘基并且C末端包含Trp重復序列。人NANOG中的同源域范圍在大約95個殘基-大約155 個殘基。已知人Nanog的同源物。
[0049] "Oct多肽"指的是轉(zhuǎn)錄因子的八聚物家族的任何天然存在的成員，或與最相關(guān)的 天然存在的家族成員相比維持相似的轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50%、80%或90%活性內(nèi)）的 變體，或包含至少天然存在的家族成員的DNA結(jié)合域的多肽，還可以包含轉(zhuǎn)錄激活域。示 例性O(shè)ct多狀包括Oct_l、0ct_2、0ct_3/4、0ct_6、0ct_7、0ct_8、0ct_9 和Oct_l1。例如 0ct3/4(本文稱作"0ct4"）包含POU域，在Pit-1、Oct-1、Oct-2和uric-86之間保守的 150 個氨基酸序列。見Ryan,A.K. &Rosenfeld,M.G.GenesDev. 11，1207-1225 (1997)。在一 些實施方案中，變體在它們的全序列與天然存在的Oct多肽家族成員，諸如以上所列的或 諸如基因庫登錄號NP002692. 2 (人0ct4)或NP038661. 1 (小鼠0ct4)中所列的那些序列比 較具有至少85%，90%或95%氨基酸序列同一性。Oct多肽（例如0ct3/4)可以來源于 人、小鼠、大鼠、牛、豬或其他動物。通常，相同的蛋白種類可與基因改造的細胞種類一起使 用。0ct-4(八聚物-4)為P0U家族的同源域轉(zhuǎn)錄因子并且調(diào)節(jié)許多基因的表達（例如見 J.Biol.Chem.，Vol. 282,Issue29, 21551-21560, 2007 年 7 月 20 日，通過引用并入本文）。 編碼0ct4的多核苷酸和多肽分別示于SEQIDN0:3和4中。而且，SEQIDN0:3包含被"T" 可以被"U"取代的DNA序列。人Oct-4的同源物為已知的，示于下列的檢索號NP_038661. 1 和NM_013633. 1 (小家鼠）、NP_001009178 和NM_001009178(褐家鼠）、以及NP_571187 和NM_131112 (斑馬魚），通過引用將這些并入本文。
[0050] SPY(性別決定區(qū)Y)-盒2,又名SOX2,為在未分化的胚胎干細胞的自我更新、Fgf4 的反式激活以及調(diào)控DNA彎曲度中發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子（例如見Scaffidietal.J.Biol. Chem.，Vol. 276,Issue50, 47296-47302, 2001 年 12 月 14 日，通過引用并入本文）。"Sox 多肽"指的是SRY有關(guān)的HMG-盒（Sox)轉(zhuǎn)錄因子的任何天然存在的成員，通過高迀移率 族（HMG)域的存在所表征，或其維持與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比相似的轉(zhuǎn)錄因子 活性（在至少50%、80%或90%活性內(nèi)）的變體，或包含至少天然存在的家族成員的DNA 結(jié)合域的多肽，還可以包含轉(zhuǎn)錄激活域。例如見Dang,D.T.，etal.，Int.J.Biochem.Cell Biol. 32:1103-1121 (2000)。示例性Sox多肽包括，例如Soxl、Sox-2、Sox3、Sox4、Sox5、 Sox6、Sox7、Sox8、Sox9、Soxl0、Soxll、Soxl2、Soxl3、Soxl4、Soxl5、Soxl7、Soxl8、Sox-21和 Sox30。Soxl已顯示以如Sox2相似的效率產(chǎn)生iPS細胞，并且基因Sox3、Soxl5和Soxl8也顯 不了產(chǎn)生iPS細胞，盡管比Sox2 的效率稍低。見Nakagawa，etal.，NatureBiotechnology 26:101-106(2007)。在一些實施方案中，變體在它們的全序列與天然存在的Sox多肽家族 成員，諸如以上所列的或諸如基因庫登錄號CAA83435(人Sox2)中所列的那些比較具有至 少85%，90 %或95 %氨基酸序列同一性。Sox多肽（例如Soxl、Sox2、Sox3、Soxl5或Soxl8) 可以來源于人、小鼠、大鼠、牛、豬或其他動物。通常，相同的蛋白種類可與基因改造的細胞 種類一起使用。編碼Sox2的多核苷酸和多肽分別示于SEQIDN0:5和6中。而且，SEQID N0:5包含被"T"可以被"U"取代的DNA序列。人Sox2的同源物為已知的。
[0051] Kruppel樣因子4,又名KLF4,在干細胞維持和生長中發(fā)揮作用。"Klf多肽"指的 是Kruppel樣因子（Klf)家族，含有與果幡胚胎模式調(diào)節(jié)子Kruppel那些相似的氨基酸序 列的鋅指蛋白，的任何天然存在的成員，或維持與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比相似 的轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50%、80%或90%活性內(nèi)）的變體，或包含至少天然存在的家族 成員的DNA結(jié)合域的多肽，還可以包含轉(zhuǎn)錄激活域。見Dang,D.T.，Pevsner,J. &Yang,V. W. ,CellBiol. 32, 1103-1121 (2000)。示例性Klf家族成員包括Klfl、Klf2、Klf3、Klf-4、 Klf5、Klf6、Klf7、Klf8、Klf9、Kin〇、Kim、Kin2、Kin3、Kin4、Kin5、Kin6 和Klfl7。 發(fā)現(xiàn)Klf12和Klf14為能夠在小鼠中產(chǎn)生iPS細胞的因子，并且有關(guān)的基因Klf1和Klf5 也可以，盡管效率減低。見Nakagawa等，NatureBiotechnology26:101-106(2007)。在 一些實施方案中，變體在它們的全序列與天然存在的Klf多肽家族成員，諸如以上所列的 或諸如基因庫登錄號CAX16088(小鼠Klf4)或CAX14962(人Klf4)中所列的那些比較具有 至少85%、90%或95%氨基酸序列同一性。Klf多肽（例如Klfl、Klf4和Klf5)可以來源 于人、小鼠、大鼠、牛、豬或其他動物。通常，相同的蛋白種類可與基因改造的細胞種類一起 使用。到了本文所述的Klf多肽的程度，可以用雌激素有關(guān)的受體(Essrb)多肽取代它。 因此，對本文所述的每一Klf多肽實施方案而言意圖是，同樣地描述了使用Essrb取代Klf4 多肽的對應(yīng)的實施方案。編碼KLF4的多核苷酸和多肽分別示于SEQIDN0:7和8中。而 且，SEQIDN0:7包含被"T"可以被"U"取代的DNA序列。人KLF4的同源物為已知的并且 包括NP_034767、NM_010637 (小家鼠），通過引用將其并入本文。
[0052] 細胞基因的MYC家族由c-myc、N_myc和L-myc組成，三個在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化和 凋亡中發(fā)揮功能的基因（HenrikssonandLuscher1996;FacchiniandPenn1998)ZMyc 多肽"指的是Myc家族的任何天然存在的成員（例如見Adhikary,S. &Eilers,M.Nat.Rev.Mol.CellBiol. 6:635-645 (2005))，或其維持與最相關(guān)的天然存在的家族成員相比相似的 轉(zhuǎn)錄因子活性（在至少50%、80%或90%活性內(nèi)）的變體，或包含至少天然存在的家族成 員的DNA結(jié)合域的多肽，還可以包含轉(zhuǎn)錄激活域。示例性Myc多肽包括，例如c-Myc、N_Myc 和L-Myc。在一些實施方案中，變體在它們的全序列與天然存在的Sox多肽家族成員，諸如 以上所列的或諸如基因庫登錄號CAA25015 (人Myc)中所列的那些比較具有至少85%、90% 或95%氨基酸序列同一性。Myc多肽（例如c-Myc)可以來源于人、小鼠、大鼠、牛、豬或其 他動物。通常，相同的蛋白種類可與基因改造的細胞種類一起使用。盡管myc家族基因具 有共同的結(jié)構(gòu)和生物學活性。N-Myc為MYC家族的成員并且編碼具有堿性螺旋（bHLH)域蛋 白。c-myc和N-myc的基因組結(jié)構(gòu)為相似地組織的并且包括三個外顯子。第一外顯子的大 部分和第三外顯子的3'部分包含運載轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列的非翻譯區(qū)。在細胞核中發(fā) 現(xiàn)N-myc蛋白并且與另一bHLH蛋白形成二聚物以便結(jié)合DNA。編碼c-Myc的多核苷酸和多 肽分別示于SEQIDN0:9和10中。而且，SEQIDN0:9包含被"T"可以被"U"取代的DNA 序列。蛋白的Myc家族的同源物和變體為本領(lǐng)域中已知的。
[0053] Glisl(Glis家族鋅指1)為編碼相同名稱的KrUppel樣蛋白的基因，在染色體 lp32. 3上發(fā)現(xiàn)了它的基因座。在未受精卵和某一細胞階段的胚胎中富含該基因，并且其可 以用于促進直接重編程體細胞為誘導性多能干細胞。Glisl可以用作重編程體細胞為誘 導性干細胞中所用的四個因子的其中之一。所用的其他三個轉(zhuǎn)錄因子為0ct3/4、Sox2和 1(1料。人61丨81(匪_147193)和多肽示于5￡0 10勵:33和34中（分別為〇0嫩和多肽）。
[0054] 使用本領(lǐng)域中已知的技術(shù)可以克隆和表達編碼人oct4(pour5fl)、sox2、klf4、 c-myc(n-myc或L-myc)、Glisl和nanog的cDNA，其變體和同源物。使用本文所示的編碼一 個或多個去分化因子的多核苷酸序列可以克隆到合適的載體用于在目標細胞類型中表達。
[0055] RF"活性"（例如RF變體活性）指的是當與本領(lǐng)域中已知的其他RF組合表達時 去分化體細胞的能力。例如，通過在體細胞中與klf4、Sox-2和c-myc共表達Oct-4變體并 且檢測體細胞是否去分化來測量Oct-4變體的Oct-4活性。如果細胞去分化，然后就可以 說Oct-4變體具有Oct-4活性。
[0056] 在另一實施方案中，復制子包含如SEQIDN0:29、30、31或32中所示的序列。還 在另一實施方案中，復制子包含與SEQIDN0:29、30、31或32大約90%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%、99.5%同一的序列，其中當復制子被轉(zhuǎn)染到體細胞中時，體細 胞被"誘導"變?yōu)楦杉毎Ａ硗?，任何SEQID^):29、30、31或32，其中"!'"被""'取代。
[0057] 在一實施方案中，SEQIDN0:29提供了本公開文本的復制子。在另一實施方案 中，SEQIDN0:29的序列具有被"U"取代的"T"。復制子包含核苷酸1至大約核苷酸7561 的VEERNA復制酶，核苷酸7562-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割 肽的編碼序列，8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的編碼 序列，10223-11176的人Sox-2序列，11195-11805的內(nèi)部核糖體進入位點，11818-13140 的人c-Myc序列，13165-13776的內(nèi)部核糖體進入位點，13777-14376的嘌呤霉素抗性基 因，14383-14510的VEE3'UTR和多聚腺苷酸尾，14679-15539的氨芐青霉素抗性基因和 16320-16337 的SP6 啟動子。
[0058] 在一實施方案中，SEQIDNO: 30提供了本公開文本的復制子。在另一實施方案中， 5￡〇10勵:30具有被1"取代的"!'"。復制子包含核苷酸1至大約核苷酸7561的￥￡￡1?隱 復制酶，核苷酸7592-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的編碼序列， 8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的編碼序列，10223-11176 的人Sox-2序列，11195-11805的內(nèi)部核糖體進入位點，11818-13140的人c-Myc序列， 13165-13776的內(nèi)部核糖體進入位點，13777-14376的嘌呤霉素抗性基因，14383-14510的 VEE3'UTR和多聚腺苷酸尾，14679-15539的氨芐青霉素抗性基因和16319-16336的17啟 動子。
[0059] 在一實施方案中，SEQIDNO: 31提供了本公開文本的復制子。在另一實施方案中， SEQIDN0:31具有被"U"取代的"T"。復制子包含核苷酸1至大約核苷酸7561的VEERNA 復制酶，核苷酸7592-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的編碼序列， 8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的編碼序列，10223-11176 的人Sox-2序列，11195-11805的內(nèi)部核糖體進入位點，11818-13680的人Glisl序列， 13689-14300的內(nèi)部核糖體進入位點，14301-14900的嘌呤霉素抗性基因，14907-15034的 VEE3'UTR和多聚腺苷酸尾，15203-16063的氨芐青霉素抗性基因和16844-16861的SP6啟 動子。
[0060] 在一實施方案中，SEQIDNO: 32提供了本公開文本的復制子。在另一實施方案中， SEQIDN0:32具有被"U"取代的"T"。復制子包含核苷酸1至大約核苷酸7561的VEERNA 復制酶，核苷酸7592-8671的人Oct-4序列，核苷酸8678-8731的T2A自切割肽的編碼序列， 8738-10147的人Klf4序列，核苷酸10154-10213的自切割E2A肽的編碼序列，10223-11176 的人Sox-2序列，11195-11805的內(nèi)部核糖體進入位點，11818-13680的人Glisl序列， 13689-14300的內(nèi)部核糖體進入位點，14301-14900的嘌呤霉素抗性基因，14907-15034的 VEE3'UTR和多聚腺苷酸尾，15203-16063的氨芐青霉素抗性基因和16843-16860的17啟 動子。
[0061] 在另一實施方案中，可使用多個甲病毒復制子，每一復制子包含一個或多個誘導 體細胞變?yōu)楦杉毎囊蜃拥木幋a序列，其中多個甲病毒復制子的組合包括所有用于誘導去 分化到干細胞所必需的所有RF的編碼序列。
[0062] 在更為具體的實施方案中，甲病毒復制子包含用于OCT-3/4、SOX-2、KLF、c-MYC、 GLIS1和/或NAN0G表達的編碼序列。在具體的實施方案中，甲病毒復制子包含用于0CT-4、 KLF4、S0X-2、GLIS1 和c-MYC的編碼序列。
[0063] 復制子也可被基因改造為表達甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白。美國專利7, 045, 335、7, 078, 218、 7, 425, 337和7, 442, 381號描述了許多此類甲病毒RNA復制子的構(gòu)建體，其由5'和3'甲病 毒復制識別序列、甲病毒非結(jié)構(gòu)性蛋白的編碼序列和多聚腺苷酸尾組成，并且通過引用將 此類構(gòu)建體并入本文。甲病毒RNA復制子的具體實施方案可包含一個或多個減毒突變，減 毒突變?yōu)楹塑账釀h除、添加、或一個或多個核苷酸的取代、或包含重排或嵌合構(gòu)建的突變， 該突變導致了含有突變的活病毒中毒力相對于適當?shù)囊吧图撞《居袚p失。
[0064] 術(shù)語"一個或多個甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白"指的是一個甲病毒所編碼的結(jié)構(gòu)蛋白或甲病 毒所編碼的結(jié)構(gòu)蛋白的組合。通過病毒產(chǎn)生的這些蛋白如多聚蛋白并且在文獻中通常表示 為C-E3-E2-6k-El。E3和6k用作兩個糖蛋白E2和E1的膜易位/轉(zhuǎn)運信號。因此，本文術(shù) 語E1的使用可以指的是E1、E3-El、6k-El或E3-6k-El，本文術(shù)語E2的使用可以指的是E2、 E3-E2、6k-E2或E3-6k-E2。減毒突變可以引入到任何一個或多個甲病毒結(jié)構(gòu)蛋白。
[0065] 另外，如以上所提及的，用于產(chǎn)生代謝物有用的酶的同源物包含在本文所提供的 微生物和方法中。第一家族或物種的初始酶或基因所用的術(shù)語"同源物"指的是第二家族或 物種的不同的酶和基因，通過功能的、結(jié)構(gòu)的或基因組的分析確定對應(yīng)于第一家族或物種 的初始酶或基因的第二家族或物種的酶或基因。通常來說，同源物具有功能的、結(jié)構(gòu)的或基 因組的相似性。通過已知的技術(shù)使用基因探針和PCR可以容易地克隆酶或基因的同源物。 使用功能測定和/或通過基因的基因組作圖可以確定如同源物的克隆序列的同一性。
[0066] 如果編碼蛋白的核酸序列具有與編碼第二蛋白的核酸序列相似的序列，則蛋白與 第二蛋白具有"同源性"或為"同源的"?？蛇x地，如果兩個蛋白具有"相似的"氨基酸序列， 則蛋白具有與第二蛋白的同源性。（因此，術(shù)語"同源蛋白"定義為兩個蛋白具有相似的氨 基酸序列）。
[0067] 如本文所用的，當氨基酸序列具有至少大約30%、40%、50%、60%、65%、70%、 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性時，兩 個蛋白（或蛋白的區(qū)域）是基本上同源的。為檢測兩個氨基酸序列或兩個核酸序列的百分 比同一性，出于最佳比對的目的比對序列（例如可以將缺口引入到第一和第二氨基酸或核 酸序列的一個或兩個用于最佳比對并且出于比較的目的可以忽視非同源性序列）。在一實 施方案中，比對用于比較目的的參考序列的長度為至少30%、通常至少40%、更通常至少 50 %、甚至更通常至少60 %、并且甚至更通常至少70 %、80 %、90 %、100 %的參考序列的長 度。然后比較在對應(yīng)的氨基酸位置或核苷酸位置處氨基酸殘基或核苷酸。當?shù)谝恍蛄兄形?置如第二序列中對應(yīng)的位置被相同的氨基酸殘基或核苷酸所占據(jù)，然后分子在那個位置是 相同的（如本文所用的氨基酸或核酸"同一性"等同于氨基酸或核酸"同源性"）。兩個序 列之間百分比同一性為序列所共用的相同的位置數(shù)目的函數(shù)，考慮到缺口的數(shù)目，每一缺 口的長度，其需要引入用于兩個序列的最佳比對。
[0068] 當所用的蛋白或肽"同源的"時，應(yīng)認識到的是不同的殘基位置通常相差保守的氨 基酸取代。"保守的氨基酸取代"為其中氨基酸殘基被另一具有側(cè)鏈（R基）和相似的化學 特性（例如電荷或疏水性）氨基酸殘基所取代的那個。通常，保守的氨基酸取代基本上不 會改變蛋白的功能特性。在兩個或多個氨基酸序列彼此不同于保守的取代的情況下，可向 上調(diào)整百分比序列同一性或同源性的程度以校正取代的保守性。進行這種調(diào)整的方法為本 領(lǐng)域中那些技術(shù)人員熟知的（例如見Pearsonetal.，1994,在此通過引用將其并入）。
[0069] "保守的氨基酸取代"為其中用一具有相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基取代氨基酸殘基。 本領(lǐng)域中已定義了具有相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族。這些家族包括帶有堿性側(cè)鏈（例 如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側(cè)鏈（例如天冬氨酸、谷氨酸）、無電荷極性側(cè)鏈（例如甘 氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸）、非極性側(cè)鏈（例如丙氨酸、纈氨酸、亮 氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸）、分支側(cè)鏈（例如蘇氨酸、纈氨 酸、異亮氨酸）和芳族側(cè)鏈（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸）的氨基酸。下列六組 每一組包含彼此保守取代的氨基酸：1)絲氨酸（S)、蘇氨酸（T) ;2)天冬氨酸（D)、谷氨酸 (E) ;3)天冬酰胺（N)、谷氨酰胺（Q) ;4)精氨酸（R)、賴氨酸（K) ;5)異亮氨酸（I)、亮氨酸 (L)、甲硫氨酸（M)、丙氨酸（A)、纈氨酸（V);和6)苯丙氨酸（F)、酪氨酸（Y)、色氨酸（W)。
[0070] 通常使用序列分析軟件測量多肽的序列同源性，其也可稱為百分比序列同一性。 例如見遺傳學計算機組（GCG)的序列分析軟件包，威斯康星大學生物技術(shù)中心，910大學 路，麥迪遜，Wis。53705。使用分配給各種取代、刪除和其他修飾，包括保守的氨基酸取代的 同源性測量蛋白分析軟件匹配相似的序列。例如，GCG包含諸如"Gap"和"Bestfit"的程 序，其可以使用缺省參數(shù)以檢測密切相關(guān)的多肽之間序列同源性或序列同一性，諸如來自 不同有機體物種的同源多肽或野生型蛋白與其突變蛋白之間同源多肽。例如見GCG6. 1版 本。
[0071] 所用的比較分子序列與包含來自不同有機體的大量序列的數(shù)據(jù)庫典型的算 法為計算機程序BLAST(Altschul, 1990 ;Gish, 1993 ;Madden, 1996 ;Altschul, 1997 ; Zhang, 1997)，特別是blastp或tblastn(Altschul, 1997)。BLASTp典型的參數(shù)為：期望 值：l〇(缺?。粸V波器：段（缺省）；空位打開罰分：11(缺?。?；空位延伸罰分：1(缺?。?； 最大的比對：1〇〇(缺省）；字長：11(缺?。?；描述數(shù)：1〇〇(缺?。?；罰分矩陣：BLOWSUM62。
[0072] 當搜素包含來自大量不同有機體的序列的數(shù)據(jù)庫時，通常比較氨基酸序列。通 過本領(lǐng)域中已知的算法而不是blastp可以測量使用氨基酸序列數(shù)據(jù)庫搜索。例如，使用 FASTA，GCG6. 1版本中的程序可以比較多肽序列。FASTA提供了查詢和搜索序列之間最佳 重疊的區(qū)域的比對和百分比序列同一性（Pearson，1990,在此通過引用將其并入）。例如， 使用FASTA，其缺省參數(shù)（字長2,得分矩陣PAM250)，如GCG6. 1版本中所提供的可以檢測 氨基酸序列之間百分比序列同一性，在此通過引用將其并入。
[0073] 如本文所用的，本公開文本的組合物和方法提供了去分化體細胞形成干細胞的能 力（例如誘導干細胞的形成）。干細胞為能夠分化為其他細胞類型的細胞，其包括具有特別 的、特異的功能的那些（例如組織特異性細胞、實質(zhì)細胞和其祖細胞）。有各種種類的干細 胞，其可以以他們分化為期望的細胞/組織類型的能力表征。例如，"祖細胞"為專能干細胞 或多能干細胞。祖細胞為可以產(chǎn)生不同終末分化的細胞類型的細胞，能夠產(chǎn)生各種祖細胞 的細胞。術(shù)語"多能的"或"多能性"指的是具有產(chǎn)生后代細胞能力的細胞，在適當?shù)臈l件下 可以經(jīng)歷分化為細胞類型，其共同地展示了與來自所有三個胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚 層）細胞系有關(guān)的特征。多能干細胞可以有助于產(chǎn)前的、出生后的或成年動物的所有胚胎 源性組織。標準的本領(lǐng)域公認的測試，諸如在8-12周齡SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力，可 以用于建立細胞群的多能性；然而各種多能干細胞特征的鑒定也可用于檢測多能細胞。"多 能干細胞特征"指的是從其他細胞中區(qū)別多能干細胞的細胞的特征。在適當條件下可以經(jīng) 歷分化為共同地展示了與來自所有三個胚層（內(nèi)胚層、中胚層和外胚層）細胞系有關(guān)的特 征的細胞類型的產(chǎn)生后代的能力為多能干細胞特征。分子標志物的某些組合的表達或非表 達也為多能干細胞特征。例如，人多能干細胞表達至少一些，并且在一些實施方案中，所有 來自下列非限制列表的標志物：SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、TRA-2-49/6E、ALP、 Sox2、E-鈣黏蛋白、UTF-l、0ct4、ReXl和Nanog。與多能干細胞有關(guān)的細胞形態(tài)也是多能干 細胞的特征。相比之下，與多能干細胞比較，多能干細胞能夠分化為細胞子集。例如，多能 干細胞能夠經(jīng)歷分化為三個胚層的一個或兩個。如本文所用的，"非多能細胞"指的是不是 多能細胞的哺乳動物細胞。此類細胞的實例包括分化細胞及專能細胞。分化細胞的實例包 括但不限于來自骨髓、皮膚、骨骼肌、脂肪組織和外周血組織的細胞。示例性細胞類型包括 但不限于成纖維細胞、肝細胞、成肌細胞、神經(jīng)元、成骨細胞、破骨細胞和T細胞。
[0074] 甚至比多能干細胞更原始的（即定向的特別分化命運）另一細胞種類為所謂的 "全能的"干細胞（例如已受精的卵母細胞，處于發(fā)育的兩個和四個細胞階段胚胎細胞），其 具有分化為任何特定物種的細胞類型的能力。例如，單一的全能干細胞可產(chǎn)生完整的動物 及特定物種（例如人）中發(fā)現(xiàn)的無數(shù)細胞類型的任何。
[0075] 多能干細胞為經(jīng)歷自我更新同時維持產(chǎn)生所有三個胚層源性組織和生殖細胞系 的能力的細胞類型。盡管源自人囊胚的多能人胚胎干細胞（hES)細胞為有希望的基于細胞 治療來治療諸如帕金森疾病、心肌梗塞、脊髓損傷、糖尿病的疾病和病癥的來源，它們的臨 床潛能受限于它們的免疫原性和倫理關(guān)懷。
[0076] 術(shù)語"前體細胞"、"祖細胞"和"干細胞"在本領(lǐng)域中可互換地使用，并且在本文中 指的是多能的或譜系定向祖細胞，其潛在地能夠無限量的有絲分裂以更新它的細胞系或產(chǎn) 生后代細胞，其將分化為成纖維細胞或能夠自我更新并且能夠分化為實質(zhì)細胞類型的譜系 定向祖細胞和它的后代。不同于多能干細胞，通常認為譜系定向祖細胞能夠產(chǎn)生許多彼此 表型不同的細胞類型。反而，它們產(chǎn)生一種或可能兩種譜系定向的細胞類型。
[0077] 本公開文本顯示了使用異位的mRNA表達系統(tǒng)（例如復制子系統(tǒng)）可以誘導終 末分化的人細胞（例如人皮膚成纖維細胞）去分化。本公開文本考慮了各種去分化（也 稱為重編程的因子（RF))編碼序列的使用，例如包含編碼KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或 n-MYC(L-Myc)、GLIS1、NAN0G或其任何組合（例如KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC(L-Myc) 和任選地NANOG)的多核苷酸。通過體內(nèi)或體外將細胞與一個或多個自我復制的RNA載體 接觸完成去分化，所述載體保持對宿主細胞基因組異位的并且編碼誘導去分化的因子。在 各種實施方案中，通過在B18R存在的情況下培養(yǎng)自我復制的RNA轉(zhuǎn)化的宿主細胞可以控制 本公開文本異位的自我復制的RNA載體。用于促進去分化的方法提供了促進被損傷或疾病 所損害的哺乳動物細胞和組織的再生的方法。本公開文本也提供了用于富集誘導性干細胞 和包含此類豐富干細胞的細胞群的方法。
[0078] 患者特異性多能干細胞的產(chǎn)生具有急劇加速干細胞實現(xiàn)臨床用途從而治療退行 性疾病的潛能。本公開文本提供了應(yīng)用來自患者的易于捐獻的基質(zhì)細胞諸如皮膚成纖維細 胞并且通過一套包含編碼（i)KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC(L-Myc)、NAN0G或其任何組 合；（ii)KLF4、0CT4、S0X2 和GLIS1 ;以及（iii)KLF4、0CT4、S0X2 和NANOG的RNA去分化因 子的異位表達產(chǎn)生人誘導性多能干細胞（hiPS或iPS)的方法。產(chǎn)生的細胞系在生理學和 形態(tài)學上與人胚胎的內(nèi)細胞團所產(chǎn)生的人胚胎干細胞（HESC)沒有區(qū)別。hiPS細胞與兩個 已建立的HESC細胞系分享了幾乎同一的基因表達譜。
[0079] 術(shù)語"去分化"為本相關(guān)領(lǐng)域中技術(shù)人員所熟悉。通常去分化表示譜系定向細胞 退化為干細胞的狀態(tài)，例如通過"誘導"去分化的表型。例如如本文進一步地所述的，KLF4、 0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1和/或Nanog可以誘導譜系定向有絲分裂抑制 的細胞中有絲分裂的去分化和誘導。
[0080] 在一實施方案中，本公開文本提供了包含已用本公開文本的復制子轉(zhuǎn)化的人體細 胞的細胞培養(yǎng)。在一實施方案中，體細胞為成纖維細胞。在另一實施方案中，體細胞為角質(zhì) 細胞。在另一實施方案中，復制子包含與SEQIDN0:29、30、31或32從大約位置1-大約 位置7561有90%、95%、98%、99%或100%同一的序列（包括其中序列的"1'"被1"取 代），接著是一個或多個選自0ct-3/4、Sox-2、Klf4、c-Myc、Nanog和Glisl的RF，再接著是 VEE3'UTR和聚腺苷酸尾。其中當存在多個RF時，編碼序列可被內(nèi)部核糖體進入位點（IRES) 或?。ɡ绾诵模﹩幼又T如SP1所分隔。對本公開文本而言RF的順序并不是關(guān)鍵的； 因此順序可為Klf4、Oct-3/4、Sox_2、c_Myc或可為Sox_2、Klf4、Oct-3/4、c_Myc或 0ct4、 Klf4、Sox2、c-Myc或RF順序的任何變化。在一實施方案中，復制子包含與SEQIDN0:29、 30、31或32所示的序列至少大約95%、98%、99%或100%同一的序列。還在另一實施方案 中，細胞培養(yǎng)在包含B18R的條件培養(yǎng)基中和/或與編碼B18R的多核苷酸共轉(zhuǎn)化。
[0081] 本公開文本也提供了制備來自于包含已用本公開文本的復制子轉(zhuǎn)化的人體細胞 的干細胞、在促進復制子中編碼序列表達的條件下培養(yǎng)體細胞和培養(yǎng)細胞足夠的時間段以 便去分化細胞為干細胞的方法。在一實施方案中，細胞傳代至少5、10、15、20或更多次。在 另一實施方案中，培養(yǎng)細胞至少10、20、30或更多天。還在另一實施方案中，細胞培養(yǎng)在包 含B18R的條件培養(yǎng)基中和/或與編碼B18R的多核苷酸共轉(zhuǎn)化。
[0082] 本公開文本也提供了通過本文所述的方法誘導性干細胞培養(yǎng)。在一實施方案中， 干細胞不包含細胞的基因組DNA中任何異源性RF因子。在另一實施方案中，干細胞不包含 任何逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA或RNA(例如無逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA或RNA的干細胞）。
[0083] 在一實施方案中，本公開文本提供了單獨地或群體地分離的誘導性干細胞。當提 及本公開文本的干細胞時術(shù)語"分離的"或"純化的"意指基本上沒有攜帶與譜系專有有關(guān) 標志物的細胞的細胞。在特別的實施方案中，人誘導性多能干細胞為至少30%、35 %、40 %、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%沒有此類污染的細 胞類型。在另一實施方案中，分離的干細胞也基本上無可溶的天然存在的分子。如下文更 完全談?wù)摰模缈梢酝ㄟ^從培養(yǎng)源提?。ɡ缃?jīng)由密度梯度離心和/或流式細胞術(shù)）獲 得本公開文本基本上純化的干細胞。可以通過任何適當?shù)姆椒y量純度。例如可以通過流 式細胞術(shù)（例如FACS分析）純化本公開文本的干細胞，如本文所述的。此類純化的iPS細 胞沒有任何逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA或RNA。
[0084] 在一實施方案中，本公開文本提供了誘導性干細胞的富集群。"誘導性干細胞的富 集群"為其中本公開文本的誘導性干細胞與其他細胞類型部分地分離從而使得由此得到的 細胞群具有比初始的細胞群更高的誘導性干細胞的濃度。誘導性干細胞的富集群可以具 有比分離之前初始細胞群高大約10倍、100倍、500倍、1，000倍、2, 000倍、3, 000倍、4, 000 倍、5, 000倍、6, 000倍、7, 000倍、8, 000倍、9, 000倍、10, 000倍或更高的濃度的誘導性干 細胞。例如本公開文本誘導性干細胞由至少5%、10%、15%、20%、35%、30%、35%、40%、 45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或更多的干細胞富集 群組成。例如通過選擇抗與分化細胞有關(guān)的細胞顯示標志物、或其他不期望的細胞類型、和 /或選擇與本公開文本的人誘導性多能干細胞有關(guān)的細胞顯示標志物（例如TRA-1-81和/ 或TRA-1-60)，和/或通過在特定的培養(yǎng)系統(tǒng)中再生分離的干細胞可獲得誘導性干細胞的 富集群。可選地，或除標志物表達富集之外，標志物表達的缺失也可用作富集。此類富集的 iPS細胞將沒有任何逆轉(zhuǎn)錄病毒的RNA或DNA通常用于轉(zhuǎn)化帶有RF的細胞。
[0085] 在另一實施方案中，本公開文本提供了誘導性干細胞的細胞系。如本文所用的， "細胞系"意指本公開文本的干細胞培養(yǎng)或在延長的時間段優(yōu)選無限期地可以再生的其后 代細胞，并且術(shù)語包括例如，培養(yǎng)、低溫貯藏和再培養(yǎng)接下來低溫貯藏的細胞。如本文所用 的"培養(yǎng)"意指生長在培養(yǎng)基中并且任選地相應(yīng)地傳代的誘導性干細胞群。干細胞培養(yǎng)可 為原代培養(yǎng)（例如沒有傳代的培養(yǎng)）或為繼代或隨后的培養(yǎng)（例如再培養(yǎng)或傳代一次或多 次的細胞群）。
[0086] 在一實施方案中，本公開文本提供了去分化為干細胞（例如誘導性干細胞）的細 胞，所述干細胞包含包括自我更新的能力和分化為中胚層、內(nèi)胚層和外胚層特征，其中通過 使用復制RNA載體一個或多個RF異位表達到宿主細胞基因組可以產(chǎn)生去分化的細胞。在 一實施方案中，復制子載體衍生于甲病毒（例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒）。
[0087] 本公開文本的人誘導性多能干細胞的治療用途包括移植人誘導性多能干細胞、干 細胞群或其后代細胞到個體以治療包括癌癥、腫瘤、損傷、病毒感染、糖尿病等造成的疾病 和病癥的各種病理狀態(tài)。干細胞或干細胞群（包括基因改造的干細胞）被引入到需要此類 干細胞或后代細胞或需要KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NAN0G、GLIS1或任何 其編碼的或基因改造的細胞所產(chǎn)生的蛋白或分子組合的個體中。例如，在一實施方案中，人 誘導性多能干細胞可以給藥于經(jīng)受已殺死、減少或損害了個體的干細胞或其他細胞的化療 的癌癥患者，其中誘導性干細胞取代損害的或死亡的細胞。在另一實施方案中，可以用至少 一種額外的治療因子（除了去分化因子之外）轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化人誘導性多能干細胞。例如，一 旦通過本公開文本的方法分離或獲得本公開文本人誘導性多能干細胞，就可用編碼治療多 肽的多核苷酸轉(zhuǎn)化干細胞。此類方法和組合物可以提供用于期望的多肽產(chǎn)生的干細胞生物 反應(yīng)器或可用作基因遞送或基因治療。在這一實施方案中，可用編碼治療多肽的多核苷酸 分離、轉(zhuǎn)化iPS細胞然后植入或給藥于個體，或可分化為期望的細胞類型并且植入和遞送 到個體。在此類條件下多核苷酸表達在用于遞送多肽產(chǎn)物的個體中。
[0088] 如果人細胞與受體相比是異源的（非自體同源的/同種異體的），通常進行伴隨 免疫抑制治療，例如免疫抑制劑環(huán)孢霉素或FK506的給藥。然而，由于本公開文本的人誘 導性多能干細胞的不成熟的狀態(tài)，可不需要此類免疫抑制治療。因此，在一實施方案中，不 存在免疫調(diào)節(jié)（例如免疫抑制）治療時本公開文本的人誘導性多能干細胞可以給藥于受 體。可選地，細胞可被膜密封，其允許流體交換但是阻止細胞/細胞接觸。微膠囊化細胞 的移植為本領(lǐng)域中已知的，例如Balladur等，1995,Surgery117:189-94, 1995 ;和Dixit 等，1992,CellTransplantation1:275-79。
[0089] 可直接地將細胞引入到外周血或存放在遍及全身的其他位置中，例如期望的組織 或腹膜中的微載體珠。例如，單程序中可以移植1〇 2個至10 9個細胞，并且可以如所需的進 行額外的移植。
[0090] 可以體外誘導人誘導性多能干細胞的分化或譜系定向（有絲分裂抑制的）細胞的 去分化，或可選地通過體內(nèi)組織接觸誘導（例如通過與成纖維細胞或細胞基質(zhì)成分接觸）。 任選地，分化劑或去分化劑（例如KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NAN0G、GLIS1 或其任何組合或其激動劑）可共給藥于或隨后給藥于個體。
[0091] 以如已顯不了 0膜島細胞的移植為糖尿病患者提供了治療（Shapiro等，2000)。 本公開文本的人誘導性多能干細胞提供了可選的胰島細胞來源用以預(yù)防或治療糖尿病。例 如，本公開文本的誘導性多能干細胞可以產(chǎn)生、分離和分化為胰腺細胞類型并且遞送到個 體?？蛇x地，誘導性多能干細胞可以被遞送到個體的胰腺并且在體內(nèi)分化為胰島細胞。因 此，細胞對移植以便預(yù)防或治療糖尿病的發(fā)生有用。
[0092] 本公開文本考慮本文所述的體外方法可以對去分化的或再分化的細胞（例如從 相同的個體收獲細胞并且返回到相同的個體）。本公開文本還考慮本文所述的體外方法可 對非自體移植有用。在一實施方案中，移植發(fā)生在基因相關(guān)的供體和受體之間。在另一實 施方案中，移植發(fā)生在基因不相關(guān)的供體和受體之間。在任何以上的實施方案中，本公開文 本考慮可以在培養(yǎng)中擴展去分化的細胞并且儲存用于以后的檢索和使用。相似地，本公開 文本考慮可以在培養(yǎng)中擴展再分化的細胞并且儲存用于以后的檢索和使用。
[0093] 本公開文本的組合物和方法可應(yīng)用于其中分化的（譜系定向的）細胞從個體移 除，培養(yǎng)中去分化，然后再引入到個體或雖然仍在培養(yǎng)中，基因改造用以沿著特異的分化途 徑再分化（例如胰細胞、神經(jīng)元、干細胞、皮膚細胞、心血管細胞、胃腸細胞等）的程序。然 后可以將此類再分化的細胞引入到個體。例如，可以移除分化的成纖維細胞，去分化（例如 用本公開文本包含KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、GLIS1、NAN0G或其任何組合 的復制子的異位表達）并且有絲分裂地擴展然后再分化（例如用KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC 或n-MYC或L-MYC、NAN0G、GLIS1的拮抗劑或其任何組合）或已知的因子（包括物理刺激） 用以沿著譜系定向的途徑引起hESCs的分化。在一實施方案中，方法包括從受傷的或生病 的個體移除分化的細胞。來自從受傷個體收獲的細胞的去分化的細胞稍后可以返回到受傷 的或生病的個體用以治療傷口或退行性疾病。去分化的細胞可以再引入到受傷處，或細胞 可以再引入到遠離受傷處的位點。相似地，可以從受傷的個體收獲細胞，體外去分化，體外 再分化，并且移植回到個體用以治療傷口或退行性疾病。
[0094] 本公開文本的人誘導性多能干細胞可以從獲自哺乳動物個體的樣品分離。個體可 以為任何哺乳動物（例如牛、綿羊、豬、犬科、貓科動物、馬、靈長類），包括人。細胞樣品可獲 自任何數(shù)目的不同來源，包括，例如骨髓、胎兒組織（例如胎兒肝組織）、外周血、臍帶血、胰 腺等。
[0095] 在另一實施方案中，本公開文本提供了建立和/或維持干細胞群或其后代細胞及 包含干細胞和后代細胞混合的細胞群，和所產(chǎn)生的細胞群的方法。就本公開文本的人誘導 性多能干細胞而言，一旦建立了細胞培養(yǎng)或干細胞的混合培養(yǎng)，就通過在誘導細胞增殖的 條件下傳代到新鮮的培養(yǎng)基體外有絲分裂地擴增細胞群，如細胞密度指示，伴有或不伴有 組織形成。此類培養(yǎng)方法可以包括在缺乏特別的誘導分化的生長因子（例如IGF、EGF、FGF、 VEGF和/或其他生長因子）的培養(yǎng)基中使細胞傳代，在KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC 或L-MYC、NANOG、GLIS1或其任何組合的起刺激作用的制劑（例如激動劑）存在的情況下， 在KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合，或以上的任何 組合存在的情況下。包含成纖維細胞或成纖維細胞樣細胞的培養(yǎng)和包含干細胞和成纖維細 胞的混合的培養(yǎng)都可以轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)基當達到足夠的細胞密度時。一些干細胞類型不 顯示典型的接觸抑制-凋亡或它們變成靜止的當密度為最大限度時。因此，適當?shù)膫鞔?術(shù)可以用于減少接觸抑制和靜止。因此，在一實施方案中，例如將細胞的一部分轉(zhuǎn)移到具有 新鮮培養(yǎng)基的新的培養(yǎng)皿。此類移除或轉(zhuǎn)移可以在任何培養(yǎng)皿中完成。
[0096] -旦在培養(yǎng)中建立了本公開文本的人誘導性多能干細胞，如以上所述的，它們就 可以維持或儲存在細胞"庫"中，其包含需要定期的轉(zhuǎn)移的體外連續(xù)的細胞培養(yǎng)或已被低溫 貯藏的細胞。
[0097] 根據(jù)已知的方法進行本公開文本的干細胞或其他細胞的低溫貯藏，諸 如Doyle等，（eds.)，1995,Cell&TissueCulture:LaboratoryProcedures,John Wiley&Sons,Chichester中描述的那些。例如，但不限制于，細胞可懸浮在"凍結(jié)培養(yǎng)基" 中，諸如，例如培養(yǎng)基還包含15-20%胎牛血清（FBS)和10%二甲亞砜（DNSO)，有或沒有 5-10%甘油，例如大約4-10X106個細胞/ml的密度。細胞可分配在玻璃瓶或塑料瓶中，然 后將其密封并且轉(zhuǎn)移到可編程的或被動式冰箱的冷凍室?？山?jīng)驗主義地檢測最佳的冷凍速 率。例如，可使用通過溶解熱產(chǎn)生_1°C/min溫度改變的冷凍程序。一旦包含細胞的小瓶到 達-80°C，就將它們轉(zhuǎn)移到液氮存儲區(qū)。低溫貯藏的細胞可以存儲年多的時間，盡管應(yīng)至少 每5年檢查它們以保持活力。
[0098] 本公開文本的低溫貯藏的細胞組成細胞庫，根據(jù)需要其部分可以通過融化取出然 后用于產(chǎn)生包含干細胞的干細胞培養(yǎng)。例如通常通過將小瓶從液氮轉(zhuǎn)移到37°C水浴快速進 行融化。在無菌的條件下應(yīng)即刻轉(zhuǎn)移小瓶的融化內(nèi)容物到包含適當?shù)呐囵B(yǎng)基的培養(yǎng)皿。明 智的是培養(yǎng)基中的細胞可以調(diào)整為大約1-3X105個細胞/ml的初始密度。一旦開始培養(yǎng)， 就每天檢查細胞，例如，用倒置顯微鏡檢測細胞增殖，并且只要他們達到/適當?shù)拿芏染驮?培養(yǎng)。
[0099] 根據(jù)需要本公開文本的人誘導性多能干細胞可從細胞庫中取出，并且用作體外新 的干細胞的產(chǎn)生，例如作為三維組織培養(yǎng)，如下文所述的，例如體內(nèi)通過直接地將細胞給予 到需要新的成纖維細胞或組織之處的位點。如本文所述的，本公開文本的人誘導性多能干 細胞可用于產(chǎn)生個體中使用的新的組織，其中最初從個體自己的血液或其他組織（即自體 細胞）分離細胞?？蛇x地，本公開文本的細胞可用作普遍存在的的供體細胞用以產(chǎn)生新的 組織供任何個體中使用（即異源性細胞）。
[0100] 一旦建立，干細胞的培養(yǎng)就可以用于產(chǎn)生能夠產(chǎn)生新的組織后代細胞和/或成 纖維細胞。可以通過特異的外源性生長因子或通過改變干細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)條件（例如密 度）觸發(fā)干細胞分化為成纖維細胞或其他細胞類型，隨后由此組織的產(chǎn)生。因為細胞為多 能的，它們可以用于重組已輻照的個體和/或化療治療的個體；或作為特定譜系的細胞來 源，通過為它們的成熟、增殖和分化提供一個或多個選擇的譜系?？梢杂糜谡T導分化的因子 的實例包括紅細胞生成素，集落刺激因子，例如GM-CSF、G-CSF或M-CSF、白細胞介素，例如 幾-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8等，白血病抑制因子仏正），青灰因子（5七1)等，與組織定向 的細胞或其他譜系定向的細胞類型共培養(yǎng)，從而誘導干細胞變成定向的特定譜系。
[0101] 在另一實施方案中，人誘導性多能干細胞為基因改造的用以表達針對特異的生長 因子類型的基因用于成功的和/或改進分化為成纖維細胞、其他基質(zhì)細胞或?qū)嵸|(zhì)細胞和/ 或可翻轉(zhuǎn)的移植前或移植后。
[0102] 本公開文本的細胞可用于治療需要由疾病或創(chuàng)傷造成的組織的修復或置換的個 體。治療需要使用本公開文本的細胞用于產(chǎn)生新的組織，使用因此產(chǎn)生的組織，根據(jù)本領(lǐng)域 中目前已知的或在未來研發(fā)的任何方法。例如，本公開文本的誘導性細胞（例如包含表達 KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合的異位表達載體的 細胞）可為植入的，注射的或相反直接地給藥到組織損害部位從而使得它們可在體內(nèi)產(chǎn)生 新組織。在一實施方案中，給藥包括基因改造的干細胞的給藥。
[0103] 在一實施方案中，制備用于直接注射到期望新組織產(chǎn)生之處的位點的包含本公開 文本的細胞的制劑。例如，非限制性的，本公開文本的細胞可懸浮在用于注射的水凝膠溶液 中。可選地，例如可允許包含細胞的水凝膠溶液在模具中變硬從而形成具有移植之前細胞 分散在其中的基質(zhì)。一旦基質(zhì)變硬，可培養(yǎng)細胞形成從而使得在移植前有絲分裂地擴增細 胞。水凝膠為經(jīng)由共價鍵、離子鍵或氫鍵交聯(lián)的有機聚合物（天然的或合成的）從而創(chuàng)建 其中使水分子陷入以便形成凝膠的三維的晶格結(jié)構(gòu)?？梢杂糜谛纬伤z的材料實例包括 多糖諸如褐藻酸鹽及其鹽，聚膦嗪，和離子鍵地、聚氧化乙烯-聚丙二醇嵌段共聚物分別通 過溫度和pH交聯(lián)的聚丙烯酸酯。水凝膠材料的合成方法及制備此類水凝膠的方法為本領(lǐng) 域中已知的。
[0104] 此類細胞制劑還可包含一個或多個其他組分，包括選擇的細胞外基質(zhì)組分，諸如 一種或多種本領(lǐng)域中已知的膠原類型，和/或生長因子和藥物。可有效地摻入到細胞制劑 中的生長因子包括一個或多個本領(lǐng)域中已知的組織生長因子，諸如但不限于TGF-0家族 的任何成員、IGF-I和-II、生長激素，諸如BMP-13的BMPs等?？蛇x地，可基因改造本公開 文本的細胞用以表達和產(chǎn)生諸如BMP-13或TGF-0的生長因子。也可包括在制劑中的其他 組分包括，例如緩沖液用以提供適當?shù)膒H和等滲性，潤滑劑，用來保持細胞在給藥處或靠 近給藥處（例如褐藻酸鹽、瓊脂和植物膠）的粘性材料和可產(chǎn)生給藥處期望的效應(yīng)的其他 細胞類型（例如增強或修飾組織的形成或它的物理化學特性，支持細胞存活力或炎癥抑制 或排斥）?？梢酝ㄟ^適當?shù)膫谡谏w物用以防止細胞離開位點覆蓋細胞。此類傷口遮蓋物 為本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的。
[0105] 可選地，本公開文本的人誘導性多能干細胞可接種于三維的框架或支架并且培養(yǎng) 以允許細胞分化，生長和填充基質(zhì)或即刻體內(nèi)移植，其中接種的細胞將在框架的表面上增 殖并且與個體的細胞合作形成體內(nèi)置換組織?？梢灾踩肱c任何一個或多個生長因子，藥物， 額外的細胞類型或刺激形成或相反增強或改善本公開文本的實踐的其他組分組合的此類 框架。
[0106] 還在另一實施方案中，本公開文本的人誘導性多能干細胞與三維的培養(yǎng)系統(tǒng)可以 共同在"生物反應(yīng)器"中使用用來產(chǎn)生組織構(gòu)建體，其擁有原始的人組織關(guān)鍵的生化的、物 理的和結(jié)構(gòu)特性，通過培養(yǎng)細胞并且在環(huán)境條件下產(chǎn)生通常原生組織富有經(jīng)驗的組織。生 物反應(yīng)器可包括許多設(shè)計。通常培養(yǎng)條件包括將生理應(yīng)激置于與包含體內(nèi)遇到的那些相似 的細胞的構(gòu)建體上。
[0107] 可以在各種應(yīng)用中使用本公開文本的人誘導性多能干細胞，它們的后代細胞和組 織。這些包括但不限于分化型、未分化型、去分化型細胞的移植或植入。此類細胞和組織用 于修復、置換或增大由于疾病或創(chuàng)傷損害或不能正常發(fā)育的組織。
[0108] 根據(jù)本公開文本所產(chǎn)生的人誘導性多能干細胞和組織可以用于修復或置換被損 害的或被破壞的組織或增大現(xiàn)存的組織。
[0109] 另外，例如本公開文本的細胞或組織可以用于體外篩選化合物、過敏原、生長因子 /調(diào)節(jié)因子、藥物組合物等對干細胞的功效和/或細胞毒性從而通過檢測干細胞的生物活 性中的變化（例如KLF4、OCT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合 表達或活性，增殖力，附著力的變化）闡明某些疾病的機制，研宄藥物和/或生長因子通過 機制起作用從而調(diào)節(jié)干細胞生物活性（例如KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、 NANOG、Glisl或其任何組合表達或活性），診斷和監(jiān)控患者的癌癥用于基因治療、基因遞送 或蛋白遞送；以及產(chǎn)生生物活性的產(chǎn)物。
[0110] 人誘導性多能干細胞也可用在分離和評估與干細胞分化和成熟有關(guān)的因子。因 此，人誘導性多能干細胞可用在檢測諸如條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)基的活性的測定，評估用于細 胞生長活性，涉及特定譜系等奉獻的流體。各種系統(tǒng)為可應(yīng)用的并且可以設(shè)計用于基于各 種生理應(yīng)激人誘導性多能干細胞的誘導性分化。
[0111] 本公開文本的人誘導性多能干細胞、其后代細胞和其衍生的組織可體外用于篩選 廣泛多樣的用于藥物制劑、生長因子/調(diào)節(jié)因子、抗炎癥因子等的有效性和細胞毒性制劑。 為此，本公開文本的細胞或組織培養(yǎng)可以體外維持和暴露于待被測試的制劑?？梢酝ㄟ^它 的損害或殺死干細胞或培養(yǎng)中它們的后代細胞的能力測量細胞毒性劑的活性。通過染色技 術(shù)可以易于評估。通過分析體外活細胞的數(shù)目，例如總細胞計數(shù)和分化細胞計數(shù)可以評估 生長因子/調(diào)節(jié)因子的效應(yīng)。使用標準的細胞學的和/或組織學的技術(shù)可以實現(xiàn)，包括應(yīng) 用定義類型特異的細胞抗原的抗體的免疫細胞化學技術(shù)的使用。在懸浮培養(yǎng)或三維系統(tǒng)中 可以評估各種藥物對本公開文本的細胞的影響。在一方面，可以分析測試劑對本公開文本 的人誘導性多能干細胞的影響。
[0112] 表達目標基因產(chǎn)物或體外由此產(chǎn)生的組織的干細胞可以植入到否則缺乏那個基 因產(chǎn)物的個體中。例如，表達能夠預(yù)防或改善各種類型的血管疾病或病癥的癥狀的產(chǎn)物或 預(yù)防或促進炎性疾病的基因為特別目標。在一實施方案中，基因改造從而表達抗炎性基因 產(chǎn)物的本公開文本的細胞用于降低植入失敗的風險或減少由于炎癥反應(yīng)組織中進一步的 退行性改變。例如，可以基因改造從而表達一個或多個例如包括對應(yīng)于抗體的個體基因 型的肽或多肽的抗炎性基因產(chǎn)物的本公開文本的干細胞中和粒細胞-巨噬細胞集落刺激 因子（GM-CSF)、TNF、IL-1、IL-2或其他炎性細胞因子。IL-1已顯示減少蛋白聚糖和II、 IX、和XI型膠原的合成（Tyler等，1985,Biochem.J. 227:69-878;Tyler等，1988，(：〇11. Relat.Res. 82:393-405;Goldring等，1988,J.Clin.Invest. 82:2026-2037 ;和Lefebvre 等，1990,Biophys.Acta. 1052:366-72)。TNF也抑制蛋白聚糖和II型膠原的合成，盡管它比 IL-1 有效性低很多（Yaron,I等，1989,ArthritisRheum. 32:173-80 ;Ikebe,T等，1988,J. Immunol. 140:827-31 ;和Saklatvala,J.，1986,Nature322:547-49)。例如還可基因改造 從而表達編碼人補體調(diào)節(jié)蛋白的基因本公開文本的細胞防止移植物被宿主排斥。例如見 McCurry等，1995,NatureMedicine1:423-27。在另一實施方案中，可基因改造從而包括 基因或多核苷酸序列的人誘導性多能干細胞表達或引起血管生成因子的表達。
[0113] 本公開文本的誘導性干細胞表達一個或多個與人多能干細胞表型有關(guān)的標志物 和/或缺少一個或多個與分化細胞（例如具有自我更新、再生或分化能力減少的細胞）和/ 或神經(jīng)元起源的細胞有關(guān)的標志物。分子為期望的細胞類型的"標志物"如果在期望的細胞 類型的足夠高百分比的細胞上發(fā)現(xiàn)它或在不期望的細胞類型的足夠低百分比的細胞上發(fā) 現(xiàn)它。通過從細胞群中選擇具有標志物的細胞從包含期望的和不期望的細胞類型的細胞群 中可以使人實現(xiàn)期望的細胞類型的期望的純化水平。標志物可以顯示在，例如30%、35%、 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99% 或更多的期望 的細胞類型上并且可以顯示在少于50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、 5%、1%或更少的不期望的細胞類型上。
[0114] 如以上所討論的，本公開文本的誘導性干細胞或已分化的誘導性干細胞通過被分 子特異地識別某些標志物的存在和/或缺乏所表征。因此，在一方面，本公開文本提供了標 記本公開文本的誘導性干細胞的方法。在一實施方案中，用特異性識別與本公開文本的誘 導性干細胞有關(guān)的標志物的分子標記人誘導性多能干細胞。在另一實施方案中，細胞群與 特異地結(jié)合標志物（例如TRA-1-81)的分子在允許分子結(jié)合標志物的條件下接觸，其中細 胞群包含至少一個具有所述標志物的干細胞。在另一實施方案中，細胞群與特異地結(jié)合標 志物（例如TRA-1-81)的分子在允許分子結(jié)合標志物的條件下接觸，其中細胞群包含沒有 標志物的干細胞和具有標志物的非干細胞。例如所用的分子可以為抗體，抗體衍生物或配 體。分子任選地可以包含額外的部分，例如可檢測的（例如熒光的或比色的標記）部分或 幫助標記細胞分離的部分（例如其他分子或磁粒所結(jié)合的部分）。
[0115] 在一實施方案中，轉(zhuǎn)化的體細胞群經(jīng)歷了腫瘤排斥抗原1-61和1-81 (TRA-1-60、 TRA-1-81)的活體染色。TRA-1-60和TRA-1-81可商購獲得，例如購自Chemicon國際有限 公司（Temecula，Calif.，USA)。使用單克隆抗體這些抗原的免疫學檢測已用于與其他標 志物組合表征多能干細胞（ShamblottM.J等?（1998)PNAS95:13726-13731;Schuldiner M?等?（2000).PNAS97:11307-11312ThomsonJ.A等?（1998).Science282:1145-1147; ReubinoffB.E等? （2000).NatureBiotechlnology18:399-404;HendersonJ.K 等?（2002).StemCells20:329-337;PeraM?等?（2000).J.CellScience113:5-10)。在 一實施方案中，已用至少一個包含KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC并且任選地或 可選地NAN0G或Glisl的異位的RNA載體轉(zhuǎn)化的體細胞群富集包含TRA-1-81或TRA-1-60 表達的細胞。在另一實施方案中，細胞也可富集與逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體有關(guān)的可檢測的標志 物的缺失。
[0116] 在另一方面，本公開文本提供了分離本公開文本的誘導性干細胞的方法。例如通 過利用結(jié)合人誘導性多能干細胞上的標志物（例如TRA-l-81、TRA-l-60或標志物的組合） 的分子（例如抗體、抗體衍生物、配體或Fc肽融合分子）因此陽性地選擇結(jié)合分子的細胞 (即陽性選擇）可以分離本公開文本的人誘導性多能干細胞。陽性選擇方法的其他實例包 括在期望的和不期望的細胞類型的混合群中優(yōu)選地促進期望的細胞類型生長的方法?？蛇x 地，通過使用結(jié)合不存在于期望的細胞類型但是存在于不期望的細胞類型上的標志物的分 子，可以從期望的細胞中移除包含此類標志物的不期望的細胞（即陰性選擇）。其他陰性選 擇方法包括在期望的和不期望的細胞類型的混合群中優(yōu)選地殺死或抑制不期望的細胞類 型的生長。因此，通過使用陰性選擇，陽性選擇，或其組合，可以制備富集的干細胞群。
[0117] 分離程序可包括使用抗體包被的磁珠的磁力分離，親和色譜法，連接到單克隆抗 體的細胞毒素劑，或與單克隆抗體聯(lián)合使用的此類制劑，例如補體和細胞毒素，并且"淘選" 結(jié)合固體基質(zhì)（例如平板）的抗體，或其他便利的技術(shù)。提供精確的分離的技術(shù)包括熒光 激活細胞分選，其可以具有不同的成熟程度，例如許多色彩通道，低角度和鈍光散射檢測通 道以及阻抗通道?？贵w可便利地與標記結(jié)合，諸如磁珠其允許直接的分離，生物素其可與結(jié) 合到載體上的抗生素蛋白或鏈霉親和素一起除去，熒光染料其可以與熒光激活細胞分選一 起使用，諸如此類，從而允許以便于特定的細胞類型的分離。可應(yīng)用任何對人誘導性多能干 細胞的活力沒有過度地毒害的技術(shù)。在一實施方案中，用抗標志物的抗體（例如TRA-1-81 抗體）孵育細胞，并且人工地選擇標志物染色陽性的細胞及再培養(yǎng)。
[0118] 富集方法的組合可用于改進純化或富集的時間或效率。例如，在除去具有不指示 目標細胞類型的標志物的細胞的富集步驟后，通過熒光激活細胞分選（FACS)或其他具有 高特異性的方法可進一步地分離或富集細胞。多色分析可與FACS-起應(yīng)用。在針對特定抗 原或缺乏其染色水平的基礎(chǔ)上分離細胞。熒光染料可用于標記針對特定抗原特異的抗體。 此類熒光染料包括藻膽蛋白，例如藻紅蛋白和別藻藍蛋白，熒光素，德克薩斯紅等。
[0119] 任何細胞類型特異的標志物都可以用于對特定的細胞類型或抗特定的細胞類型 的選擇。對富集有用的誘導性干細胞標志物包含表達的標志物諸如TRA-1-81和與逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體或其他外源性載體有關(guān)的標志物的缺失（例如GFP)。
[0120] 一旦分離了干細胞，就可以將它們?nèi)芜x地繁殖在適當?shù)呐囵B(yǎng)基中在飼養(yǎng)層存在或 不存在的情況下。另外，本發(fā)明的人誘導性多能干細胞可培養(yǎng)在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中。
[0121] -旦在培養(yǎng)中建立了本公開文本的人誘導性多能干細胞，如上文所述的，它們就 可以維持或儲存在細胞"庫"中，其包含需要定期的轉(zhuǎn)移的體外連續(xù)的細胞培養(yǎng)或已被低溫 貯藏的細胞。在一些實施方案中，庫存細胞對個體的自體治療有用。
[0122] 通過分解用作成纖維細胞來源的適當?shù)钠鞴倩蚪M織可易于分離成纖維細胞。使用 本領(lǐng)域中技術(shù)人員已知的技術(shù)可容易地實現(xiàn)。例如，可以機械地分解和/或用消化酶和/ 或螯合劑處理組織或器官，所述螯合劑減弱相鄰細胞間連接使得組織可能分散到個體細胞 的懸浮液中而沒有很大的細胞破壞。通過切碎組織并且用任何數(shù)量的消化酶單獨地或組合 地處理切碎的組織可以實現(xiàn)酶分解。這些包括但不限于胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、膠原酶、 彈性蛋白酶和/或透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶、鏈酶蛋白酶、分散酶等。也可通過許多方 法包括但不限于略舉數(shù)例螺紋磨床、攪拌器、篩、均質(zhì)器、壓敏元件或絕緣體的使用實現(xiàn)機 械破碎。組織分解技術(shù)的綜述見Freshney,CultureofAnimalCells.AManualofBasic Technique，2dEd.，A.R.Liss，Inc.，NewYork，1987,Ch. 9,pp. 107_126〇
[0123] 一旦組織變成單個細胞的懸浮液，就可以分餾懸浮液到亞群，從其中可以獲得成 纖維細胞和/或其他基質(zhì)細胞和/或成分。也可使用標準的細胞分離技術(shù)實現(xiàn)，所述技術(shù) 包括但不限于特異細胞類型的克隆和選擇，不想要的細胞的選擇性破壞（陰性選擇），混合 群中基于差別細胞可凝集性的分離，凍融過程，混合群中細胞的差別粘附特性，過濾，常規(guī) 的和區(qū)帶離心，離心淘選（逆流離心），單元重力分離，逆流分配，電泳和熒光激活細胞分 選。克隆選擇和細胞分離技術(shù)的綜述見Freshney,CultureofAnimalCells.AManualof BasicTechniques, 2dEd. ,A.R.Liss,Inc. ,NewYork, 1987,Ch. 11and12,pp. 137-168。
[0124] 例如可如下所述地進行成纖維細胞的分離：徹底洗滌新鮮的組織樣品并且在漢克 斯平衡鹽溶液（HBSS)中切碎以便除去血清。切碎的組織在新鮮制備的分裂酶諸如胰蛋白 酶的溶液中孵育1-12小時。此類孵育后，分裂的細胞為懸浮的，通過離心壓成丸，并且接種 到培養(yǎng)皿。所有成纖維細胞將在其他細胞之前粘附，因此，可以選擇性分離適當?shù)幕|(zhì)細胞 并且使其生長。
[0125] 去分化細胞將用于體內(nèi)移植或植入之處對獲得來自于患者自身組織的基質(zhì)細胞 有用。
[0126] 寡核苷酸探針和引物可以用于鑒定本文所述的及克隆和擴增過程中各種因子的 表達。寡核苷酸探針和引物指的是長度8-2000個核苷酸的核酸分子。更具體地，這些寡 核苷酸的長度范圍大約8、10、15、20或30-100個核苷酸，但是通常為大約10-50個（例如 15-30個核苷酸）。本領(lǐng)域中技術(shù)人員可以經(jīng)驗為主地確定在特定條件下本公開文本的測 定中適當長度的寡核苷酸。
[0127] 通過任何合適的方法，包括但不限于適當?shù)男蛄械目寺『拖拗坪突谝阎?KLF4、0CT4、S0X2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NAN0G或其任何組合多核苷酸和多肽序列直接 的化學合成可以制備寡核苷酸引物和探針。各種來自其他物種的直系同源物為本領(lǐng)域中已 知的。
[0128] 寡核苷酸引物和探針可以包含核酸類似物，諸如例如肽核酸，鎖核酸（LNA)類似 物和嗎啉基類似物。可以用捕獲或可檢測的標記使探針的3'末端功能化從而幫助KLF4、 0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合核酸的檢測。
[0129] 可以通過合并可檢測的標記來標記任何本公開文本的寡核苷酸或核酸，其通過光 譜學的，光化學的，生物化學的，免疫化學的或化學的方法為可測的。例如，此類標記可以包 含放射性物質(zhì)（ 32P、35S、3H、125I)，熒光染料（5-溴脫氧尿苷，熒光素，乙酰氨基芴，地高辛）， 生物素，納米顆粒等。此類寡核苷酸通常標記在它們的3'和5'末端。
[0130] 寡核苷酸引物和探針可以固定化在固相載體上。固相載體為本領(lǐng)域中那些技術(shù) 人員已知的并且包括反應(yīng)盤、測試管、聚苯乙烯珠、磁珠、硝化纖維素條、膜、諸如膠乳粒子 的微粒，玻璃等的孔壁。固相載體不是關(guān)鍵的并且可以通過本領(lǐng)域中技術(shù)人員所選擇。因 此，膠乳粒子、微粒、磁珠或非磁珠、膜、塑料管、微量測試孔壁、玻璃或硅片等為所有合適的 實例。使寡核苷酸固定化在固相的合適的方法包括離子的，疏水的，共價的相互作用等。可 以根據(jù)它的吸引和固定捕獲試劑的固有能力選擇固相載體。寡核苷酸探針或引物可以單 獨地或以本公開文本的大約2-10000個獨特的寡核苷酸的組粘附到單一的固相載體或固 定化到固相載體上。包含多個本公開文本的寡核苷酸引物或探針的底物可用于檢測或擴 增KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合。例如，寡核苷 酸探針可用在寡核苷酸芯片諸如Affymetrix所售的或美國專利5, 143, 854號；PCT出版物 TO90/15070和92/10092號中所述的那些，在此通過引用將這些發(fā)明并入本文。使用機械 的合成方法或光直接合成方法可以產(chǎn)生這些測定，所述光直接合成方法包含光刻法方法和 固相寡核苷酸合成的組合。本公開文本還考慮能夠特異地結(jié)合KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或 n-MYC或L-MYC、NANOG或Glisl多肽的抗體。
[0131] 參照或?qū)φ杖褐傅氖且唤M預(yù)測代表總?cè)后w個體或個人。測量測試樣品的樣品中 KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合的量，其中數(shù)量與 對照樣品比較。
[0132] 在另一方面，本公開文本提供了沿著定向譜系分化干細胞的方法，所述方法包括 抑制KLF4、0CT4、SOX2、c-MYC或n-MYC或L-MYC、NANOG、Glisl或其任何組合的表達或活 性。就這一點而言有用的分化劑包括，例如抗體，反義寡核苷酸，RNAi構(gòu)建體或核糖酶。
[0133] 本公開文本的方法中有用的培養(yǎng)技術(shù)公開在國際專利出版WO2010/120785號 中，其通過引用并入本文。
[0134] 提供下列的實施例用以例證本公開文本的某些方面并且?guī)椭绢I(lǐng)域中那些技術(shù) 人員實踐本公開文本。絕不認為這些實施例以任何方式限制了本公開文本的范圍。 實施例
[0135] 實施例1
[0136] 細胞。BJ包皮成纖維細胞和STO細胞系獲自ATCC。原代人包皮成纖維細胞（HFF) 和HUES-9人ES細胞系獲自現(xiàn)有的資源。BJ、HFF和STO培養(yǎng)在包含10%FBS，MEM非必需 氨基酸（NEAA)，丙酮酸，盤尼西林和鏈霉素的DMEM中。HUES-9和iPS細胞與ES培養(yǎng)基一起 培養(yǎng)在包含20%基因敲除的SR、GlutaMAX、NEAA、2-巰基乙醇（所有都來自Invitrogen)， 盤尼西林，鏈霉素和bFGF(10ng/ml)的基因敲除的D-MEM。通過絲裂霉素C(10yg/ ml,Sigma)處理制備ST0飼養(yǎng)細胞。對iPS細胞克隆和HUES-9的無飼養(yǎng)的培養(yǎng)而言，細胞 在Matrigel?(BDBioscience)包被的孔傳代并且與ES培養(yǎng)基在制備于ST0飼養(yǎng)細胞的條 件培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0137]質(zhì)粒構(gòu)建。0CT4(登錄號NM_002701)、c-MYC(登錄號NM_002467)和GLIS1 (登錄 號BC104911)的編碼cDNA獲自O(shè)pen生物系統(tǒng)。S0X2(登錄號NM_003106)、KLF4(登錄號 NM_004235)、NAN0G(登錄號BC099704)獲自ATCC。B18R(登錄號D01019)獲自Addgene。通 過引用將與每一以上的登錄號有關(guān)的多核苷酸和多肽序列并入本文。cDNA用作PCR擴增的 模板以增加限制性酶位點和/或Kozak序列，并且被克隆到pBluescriptSK+載體用于核對 cDNA序列。然后cDNA被克隆到用于mRNA合成的pTNT載體（Promega)和用于逆轉(zhuǎn)錄病毒 產(chǎn)生的pCX4bsrl。對使用病毒的2A肽序列的多順反子表達而言，使F2A寡核苷酸、T2A寡核 苷酸和E2A寡核苷酸（表1)退火的并且分別克隆到pBluescriptSK+載體的EcoRI/Spel、 Spel/Xbal和Xbal/Notl位點。重編程因子的cDNA與框架中的2A肽序列連接，然后克隆到 pVEE-S-IRES-Puro。從p5'VEE/S/GFP/Pac3 構(gòu)建pVEE-S-IRES-Puro用以克隆重編程的因 子。簡略地，用Xbal/Mfel消化刪除p5'VEE/S/GFP/Pac中的GFP/Pac基因和部分的3'UTR， 然后引入多克隆位點（MCS;NdeI、AscI、BbvCI、ClaI、MfeI、FseI和Notl)(表 1)，IRES和來 自pCX4puro的嘌呤霉素抗性基因。為了方便起見，這一載體被改名為pVEE-IRES-Puro。為 了產(chǎn)生帶有I7RNA核糖核酸聚合酶的RNA，通過使用VEE載體的SacI/BstZ17I片段作為模 板的PCR(表 1)，SP6 啟動子（AITTAGGTGACACTATAG(例如見SEQIDN0:31，16844-16861)) 被 17 啟動子（TAATACGACTCACTATAG(例如見SEQIDN0:32,16843-16860))取代（SP6 啟動 子位于SacI位點旁邊）。
[0138] 表1:PCR克隆引物
[0139]
【權(quán)利要求】
1. 甲病毒復制子RNA，其包含： 至少一個來自甲病毒的非結(jié)構(gòu)性復制酶域和至少一個編碼因子的非甲病毒的異源性 序列，所述因子用于當在體細胞中表達時誘導多能干細胞的產(chǎn)生。
2. 如權(quán)利要求1所述的甲病毒復制子RNA，其中所述復制子包含獲自甲病毒的序列，所 述甲病毒選自東方馬腦炎病毒（EEE)、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEE)、埃弗格賴德病毒、穆坎 博病毒、皮春納病毒和西方馬腦炎病毒（WEE)。
3. 如權(quán)利要求1所述的甲病毒復制子RNA，其中所述復制子包含獲自甲病毒的序列，所 述甲病毒選自辛德畢斯病毒、塞姆利基森林病毒、米德爾堡病毒、基孔肯雅病毒、阿尼昂尼 昂病毒、羅斯河病毒、巴馬森林病毒、蓋他病毒、覽山病毒、貝巴魯病毒、馬雅羅病毒、烏納病 毒、奧拉病毒、瓦塔羅阿病毒、巴班肯病毒、Kyz病毒、高地J病毒、摩根堡病毒、恩杜姆病毒 和博吉河病毒。
4. 如權(quán)利要求1所述的甲病毒復制子RNA，其中所述至少一個非甲病毒的異源性序列 包含至少2、3、4或5個非甲病毒的異源性序列。
5. 如權(quán)利要求1-4中任一項所述的甲病毒復制子RNA，其中所述非甲病毒的異源性序 列選自編碼KLF多肽、S0X-2多肽、0CT-3/4多肽、c-MYC或n-MYC或L-MYC多肽、GLIS1多 肽、NANOG多肽及其任何組合的多核苷酸。
6. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼KLF多肽的多核苷酸編碼與 SEQ ID N0:8序列具有至少95%同一性的KLF多肽。
7. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼KLF多肽的多核苷酸編碼具 有SEQ ID N0:8序列的KLF多肽。
8. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼KLF多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO: 7所示的序列，其中"T"為"U"。
9. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼S0X-2多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID N0:6序列具有至少95%同一性的S0X-2多肽。
10. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼S0X-2多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID N0:6序列的S0X-2多肽。
11. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼S0X-2多肽的多核苷酸包含 SEQ ID N0:5所示的序列，其中"T"為"U"。
12. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼0CT-4多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID N0:4序列具有至少95%同一性的0CT-4多肽。
13. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼0CT-4多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID N0:4序列的0CT-4多肽。
14. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼0CT-4多肽的多核苷酸包含 SEQ ID N0:3所示的序列，其中"T"為"U"。
15. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼c-MYC多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID NO: 10序列具有至少95%同一性的c-MYC多肽。
16. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼c-MYC多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID NO: 10序列的c-MYC多肽。
17. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼c-MYC多肽的多核苷酸包含 SEQ ID N0:9所示的序列，其中"T"為"U"。
18. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼GLIS1多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID N0:34序列具有至少95%同一性的GLIS1多肽。
19. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼GLIS1多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID N0:34序列的GLIS1多肽。
20. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼GLIS1多肽的多核苷酸包含 SEQ ID NO:33所示的序列，其中"T"為"U"。
21. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼NANOG多肽的多核苷酸編碼 與SEQ ID NO:2序列具有至少95%同一性的NANOG多肽。
22. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼NANOG多肽的多核苷酸編碼 具有SEQ ID NO:2序列的NANOG多肽。
23. 如權(quán)利要求5所述的甲病毒復制子RNA，其中所述編碼NANOG多肽的多核苷酸包含 SEQ ID N0:1所示的序列，其中"T"為"U"。
24. 如權(quán)利要求1所述的甲病毒復制子RNA，其中所述復制子從5'到3'包含：(VEE RNA復制酶）-(啟動子）-(RFD -(自切割肽）-(RF2)-(自切割肽）-(RF3) - (IRES或核心啟 動子）_ (RF4) - (IRES或任選的啟動子）-(任選的選擇性標記物）-(VEE 3 ' UTR和聚腺苷酸 尾）_(任選的選擇性標記物）_啟動子；其中RFg為誘導體細胞去分化為多能細胞的因子， 其中RF2_3為任選的，RF3_4為任選的，或RF 4為任選的；其中RFh選自O(shè)ct-4、Klf4、Sox-2、 c_Myc、Nanog 和 G1 i s 1。
25. 如權(quán)利要求1或24所述的甲病毒復制子RNA，其中所述復制子包含與SEQ ID N0:29、30、31或32從大約位置1到大約位置756190%、95%、98%、99%或100%同一的序 列，其中所述序列的"T"被"U"取代，接著是一個或多個RF，再接著是3'UTR和聚腺苷酸尾， 其中所述一個或多個RF選自0(^-3/4、5(?-2、1(1€4、(3-]\^(3、似11(^和61181;其中當存在多 個RF時，編碼序列可被內(nèi)部核糖體進入位點（IRES)或小啟動子所分隔。
26. 如權(quán)利要求25所述的甲病毒復制子RNA，其中所述復制子包含與選自SEQ ID 吣:29、30、31或32的序列至少95%、98%、99%或100%同一的序列，其中"!'"為1"。
27. 組合物，其包含用權(quán)利要求1-26中任一項所述的復制子轉(zhuǎn)化的人細胞。
28. 如權(quán)利要求27所述的組合物，其還包含B18R條件培養(yǎng)基。
29. 如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述人細胞為體細胞。
30. 如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述人細胞為成纖維細胞。
31. 制備干細胞的方法，其包括在表達復制子的編碼序列的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求27所 述的組合物至少30天，和分離干細胞。
32. 制備干細胞的方法，其包括用權(quán)利要求1-26中任一項所述的復制子轉(zhuǎn)化體細胞， 在促進所述復制子表達的條件下培養(yǎng)所述體細胞，和分離干細胞。
33. 如權(quán)利要求31或32所述的方法，其中所述培養(yǎng)包括在B18R條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)所 述細胞。
34. 如權(quán)利要求33所述的方法，其中通過將B18R mRNA轉(zhuǎn)染到原代人成纖維細胞來產(chǎn) 生所述B18R條件培養(yǎng)基。
35. 從權(quán)利要求31或33所述的方法所獲得的分離的干細胞，其中所述干細胞沒有逆轉(zhuǎn) 錄病毒的DNA或RNA。
36. 方法，其包括： 使人體細胞與異位的自我復制的RNA復制子接觸，所述復制子包含編碼至少四種選 自以下的去分化因子的多核苷酸：（i)KLF4,（ii)0CT4,（iii)S0X2,（iv)c-MYC或n-MYC或 L-MYC，（v)GLISl 和（vi)NANOG ; 培養(yǎng)所述體細胞以表達所述去分化因子； 選擇呈現(xiàn)干細胞形態(tài)和/或干細胞標志物的細胞；以及 繼代培養(yǎng)所述細胞以獲得誘導性干細胞群。
37. 如權(quán)利要求36所述的方法，其中通過檢測腫瘤排斥抗原1-60和/或1-81的表達 來選擇所述細胞。
38. 用于產(chǎn)生人干細胞的載體系統(tǒng)，其包含 至少一個自我復制的RNA復制子，所述復制子包含一個或多個編碼選自以下的去分化 因子的多核苷酸：1〇^4、0(^4、5(?2、(3-]^(：或11-]^(：或1-]^(：、61151、隱勵6或其任何組合。
39. 如權(quán)利要求38所述的載體系統(tǒng)，其中所述復制子包含： (a) 0ct4、Sox2、Klf4 和 c_Myc，或 (b) 0ct4、Sox2、Klf4 和 Glisl。
40. 如權(quán)利要求38所述的載體系統(tǒng)，其中一個自我復制的RNA載體源自甲病毒。
41. 如權(quán)利要求40所述的載體系統(tǒng)，其中所述甲病毒為VEE。
42. 包含異位的RNA復制子的分離的人體細胞，所述復制子包含一個或多個去分化多 核苷酸序列。
43. 如權(quán)利要求42所述的人體細胞，其中在表達所述異位的RNA復制子中的去分化多 核苷酸的培養(yǎng)條件下，所述體細胞去分化。
44. 細胞群，包含權(quán)利要求43所述的細胞。
45. 通過權(quán)利要求35所述的方法獲得的細胞群。
46. 如權(quán)利要求44或45所述的細胞群或權(quán)利要求35或36所述的方法，其中所述細胞 或方法包括在抑制所述異位的RNA復制子降解的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細胞。
【文檔編號】C12N5/074GK104508131SQ201380038648
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月21日
【發(fā)明者】史蒂文·F·道迪, 吉岡直壽 申請人:加利福尼亞大學董事會