一種干旱和鹽誘導特異性啟動子及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種干旱和鹽誘導特異性啟動子及其應用，涉及基因工程領域。本發(fā)明提供的干旱和鹽誘導特異性啟動子是具有如下所述任一序列的DNA分子：(1)序列表中序列1-1429位核苷酸所示的DNA分子；(2)在嚴格條件下與(1)所述的DNA分子雜交且具有干旱和鹽誘導啟動子功能的DNA分子；(3)與(1)或(2)所述DNA分子具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。該啟動子應用于啟動GUS基因的表達或者應用于培育抗干旱和抗鹽的轉基因植物。
【專利說明】一種干旱和鹽誘導特異性啟動子及其應用【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領域，尤其涉及的是一種干旱和鹽誘導特異性啟動子及其應用。
【背景技術】
[0002]誘導型啟動子是指在正常環(huán)境條件下活性很低但是在受到外界特殊信號的刺激下能夠很大程度的提高基因表達量的啟動子。誘導型啟動子一方面可以通過特殊的信號源刺激目的基因的表達，另一方面可以避免植株生長發(fā)育過程中由組成型啟動子的超量表達所引起的負面效應。因此，誘導型啟動子在植物基因工程中有著廣泛應用前景。
[0003]Δ 1-二氫吡咯-5-羧酸合成酶(Pyrroline-5-carboxylate synthetase,P5CS)是參與脯氨酸合成的關鍵酶，脯氨酸是小分子的滲透物，在植物的抗逆性中起到重要的作用。脯氨酸的積累是通過脯氨酸合成的生物活化和生物降解的抑制作用而共同產(chǎn)生的。研究表明，將外源P5CS基因轉化到植物受體中可以提高植物受體內(nèi)游離的脯氨酸含量，從而增強轉基因植株抵抗?jié)B透脅迫的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的 技術問題是針對現(xiàn)有技術。
[0005]本發(fā)明的技術方案如下:
[0006]一種干旱和鹽誘導特異性啟動子，其是具有如下所述任一序列的DNA分子:
[0007](I)序列表中SEQ ID NO:5所示序列1-1429位核苷酸所示的DNA分子；
[0008](2)在嚴格條件下與(I)所述的DNA分子雜交且具有干旱和鹽誘導啟動子功能的DNA分子；
[0009](3)與⑴或⑵所述DNA分子具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。
[0010]所述嚴格條件為在0.1 X SSPE或0.1XSSC、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗月吳。
[0011]所述的干旱和鹽誘導特異性啟動子應用于啟動GUS基因的表達或者應用于培育抗干旱和抗鹽的轉基因植物。
[0012]本發(fā)明所述的MspScs啟動子為抗鹽和干旱相關的啟動子,對該啟動子的研究可為誘導型啟動子的研究打下堅實的基礎，也為培育出抗逆植株提供了前提。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為在重組表達載體pCAMBIA1304-GUS中，插入Msp5cs啟動子部分的結構示意圖；A為pCAMBIA1304質(zhì)粒結構簡圖，B為pMsp5cs-1304_GUS質(zhì)粒簡圖。
[0014]圖2為轉基因煙草植株再生的示意圖；其中，A為葉盤侵染共培養(yǎng)；B為誘導愈傷組織形成；C為愈傷組織誘導出小芽；D為長出抗性幼苗；E為抗性幼苗生根；F & G為抗性苗的移栽。
[0015]圖3為轉pl304Msp5cs-GUS質(zhì)粒煙草PCR結果；注:M.DL2000DNA標準分子質(zhì)量；1，2，3，5，6，8，9，11，12，14，15 & 17 為轉 PMSP5CS-1304 質(zhì)粒煙草 PCR 陽性植株。
[0016]圖4為轉pCAMBIA1304質(zhì)粒煙草PCR結果；注:M.DL2000DNA標準分子質(zhì)量；1，2，3,5,6,8,10 & 11為轉pCAMBIA1304質(zhì)粒煙草PCR陽性植株。
[0017]圖5為轉pl304Msp5cs-GUS質(zhì)粒和轉pCAMBIA1304質(zhì)粒的煙草葉片在鹽脅迫后的⑶S檢測結果；其中A為轉pl304MSpScS-GUS質(zhì)粒煙草鹽脅迫⑶S染色圖，B為轉PCAMBIA1304質(zhì)粒煙草鹽脅迫⑶S染色圖。 [0018]圖6為轉pl304Msp5cs-GUS質(zhì)粒和轉pCAMBIA1304質(zhì)粒的煙草葉片在干旱脅迫后的⑶S檢測結果；其中A為轉pl304MSp5cS-GUS質(zhì)粒煙草干旱脅迫⑶S染色圖，B為轉PCAMBIA1304質(zhì)粒煙草干旱脅迫⑶S染色圖。
【具體實施方式】
[0019]以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。
[0020]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的定性實驗，均設置三次重復實驗，取實驗圖片一致的圖片展示實驗結果。
[0021]本賽姆氏煙草(Nicotiana benthamiana):來自新疆農(nóng)業(yè)大學生物化學與分子生物學重點實驗室，種子編號:K326。
[0022]GUS染色液及GUS活性檢測:50 μ LX-Gluc (20mg/ml)、500 μ L磷酸緩沖液(0.lmol/L PH7.0) ,50 μ LEDTA (0.5mol/L, PH8.0) UOy LlO % Trion X-100 和 390 μ L 去離子水配置成Iml Gus染色液中過夜,然后吸出染色液,加入70%乙醇脫色,室溫放置過夜脫色后進行拍照。
[0023]pCAMBIA1304 載體:此載體從 pcambia institute 獲得。
[0024]Msp5Cs啟動子的獲得方法:參考文獻:張樺，新牧I號雜花苜?？鼓嫦嚓P基因的克隆和功能分析，新疆農(nóng)業(yè)大學，2011。
[0025]實施例1轉基因煙草的獲得與鑒定
[0026]一、重組表達載體pMsp5cs-1304_GUS的構建
[0027]1、根據(jù)參考文獻得到Msp5Cs啟動子的序列，設計特異性引物:MSP5CS SF:5’ATCGAGCTCGATTGACCTAGAACAGGGA-3，，MSP5CS SR: TCACCATGGGCAAGAGACAGTTCACGTA-3，，PCR 擴增體系為:ddH2018.25μ 1，IOXTaq DNA Polymerase Buffer2.5 μ I, dNTPl μ 1，引物 11 μ 1，引物 21 μ 1，DNA 模板 I μ 1，Taq DNA Polymerase0.25 μ 1，總共 25 μ I ；PCR 反應循環(huán)參數(shù)為:94°C 5min ；94°C 30s, 63.9°C 30s, 72°C lmin，循環(huán) 35 次；72°C IOmin ;4°C保存。
[0028]2、將 PCR 的產(chǎn)物和 18-T simple 連接:將 pMD_18T vector I μ 1，PCR 產(chǎn)物 4 μ 1，Solution Ι5μ 1，共10μ 混勻，于16°C連接儀中過夜，最后獲得連接載體pMD18-TMsp5cs。
[0029]3、用Nco I和Sac I兩種酶雙酶切連接載體pMD18_T Msp5cs，回收酶切產(chǎn)物。
[0030]4、用Nco I和Sac I兩種酶雙酶切pCAMBIA1304載體，回收載體骨架。
[0031]5、將步驟3和步驟4的回收產(chǎn)物在T4DNA連接酶的作用下進行連接:將 10XT4Buffer2.5 μ 1，DNA 片段 6 μ 1，載體 DNA 片段 5 μ 1，T4DNA 連接酶 I μ 1，ddH2010.5yl，(S*25yl)混合均勻，然后在16°C條件下，連續(xù)反應25小時，得到重組表達載體pMsp5cs-1304-GUS，如圖1所示。
[0032]二、轉基因煙草的獲得
[0033](I)將(一)中構建的重組表達載體pMsp5cs-1304-GUS和植物表達載體PCAMBIA1304通過凍融法轉化到農(nóng)桿菌LBA4404中，獲得兩種轉基因農(nóng)桿菌LBA4404菌株。
[0034](2)將煙草種子消毒后放置于1/2MS中，25°C培養(yǎng)10天左右獲得無菌煙草幼苗。
[0035](3)將剪下的無菌幼苗葉盤放置預培養(yǎng)基中(MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L6-BA,pH5.8)，25°C暗培養(yǎng)2天。同時將含有轉基因農(nóng)桿菌菌株接種于YEB培養(yǎng)基，28 °C，200rpm,培養(yǎng)至0D600 = 0.5，浸染暗培養(yǎng)結束的葉盤15min。
[0036](4)將侵染結束的葉盤轉移到滅菌濾紙上，吸干葉盤表面菌液后轉移至共培養(yǎng)基上(MS+0.lmg/LNAA+1.0mg/L6_BA+，pH5.8)，25°C左右暗培養(yǎng) 2 天。
[0037](5)然后將葉盤轉移至分化培養(yǎng)基培養(yǎng)(MS+0.05mg/L NAA+1.0mg/L6-BA+300mg/LCef+60mg/L Kan, pH5.8)，16/8光/暗培養(yǎng)大約一個月，保持室溫28°C。長出小苗后，將小苗轉移至生根培養(yǎng)基上(1/2MS+0.lmg/L NAA+250mg/L Cef+50mg/L Kan，ρΗ5.8)，16/8 光 /暗培養(yǎng)。生根后將苗移栽到含土壤的花盆中，如圖2所示。
[0038](6)獲得兩種轉基因幼苗后，待長出4-5片真葉后，采取葉片，提取植物基因組DNA,分別對兩種轉基因煙草植株的基因組DNA進行PCR。
[0039]轉pMsp5cs-1304-GUS質(zhì)粒植株以Msp5cs啟動子為目的基因設計引物。
[0040]Msp5cs SF:5，`-ATCGAGCTCGATTGACCTAGAACAGGGA-3，，
[0041]Msp5cs SR:5，-TCACCATGGGCAAGAGACAGTTCACGTA-3，。
[0042]PCR體系為:ddH2018.25 μ I, IOXTaq DNA Polymerase Buffer2.5 μ I, dNTPl μ 1，引物 11 μ 1，引物 21 μ 1，DNA 模板 I μ 1，Taq DNA Polymerase0.25 μ I (總共 25 μ I)。
[0043]PCR 反應循環(huán)參數(shù)為:94°C 5min ；94°C 30s, 63.9 °C 30s, 72 °C lmin，循環(huán) 35 次；72 °C 10min，4°C 保存。
[0044]轉pCAMBIA1304質(zhì)粒植株以npt II基因為目的基因設計引物。
[0045]NPT II SF:5，-CAGGGGCGCCCGGTTCTTTT-3，，
[0046]NPT II SR:5，-CGCCTTGAGCCTGGCGAACA-3，。
[0047]PCR體系為:ddH2018.25 μ I，IOXTaq DNA Polymerase Buffer2.5 μ I, dNTPl μ 1，引物 11 μ 1，引物 21 μ 1，DNA 模板 I μ 1，Taq DNA Polymerase0.25 μ I,(總共 25 μ I)。
[0048]PCR 反應循環(huán)參數(shù)為:94 °C 5min94 °C 30s, 60 °C 30s, 72 °C lmin,循環(huán) 35 次；72 °C 10min，4°C 保存。
[0049]經(jīng)過PCR篩選后的結果表明，兩種轉基因煙草均有15株可作為實驗材料，如圖3和圖4所示。
[0050]三、⑶S化學性質(zhì)分析
[0051]將(二)獲得的兩種陽性轉基因煙草進行脅迫實驗，并進行GUS化學性質(zhì)分析。
[0052]具體如下:
[0053](I)對兩種轉基因煙草進行鹽脅迫處理:用200mmol/L NaCl處理轉PMsp5cs-1304質(zhì)粒和轉PCAMBIA1304質(zhì)粒的煙草葉，分別在脅迫第I天、第3天、第5天、復水后第I天和復水第3天對葉片進行GUS染色檢測，結果如圖5所示。[0054]經(jīng)200mmol/L NaCl鹽脅迫后，檢測不同階段的煙草葉片⑶S染色情況，并進行拍照。從圖5中可以很清楚的看出，轉p5cs::⑶S質(zhì)粒的煙草葉片在鹽脅迫后隨著天數(shù)增加，葉片染色后顏色明顯加深，其中鹽脅迫第5天顏色最深；而轉CaMV35S AUS質(zhì)粒的煙草葉片GUS染色后葉片顏色變化不太明顯，反而在鹽脅迫第5天葉片顏色變淺。研究表明，在鹽脅迫的情況下，隨著天數(shù)增加，p5cs::GUS質(zhì)粒上的⑶S基因表達量增加；CaMV35S::GUS質(zhì)粒上的GUS基因表達變化不太明顯，且第5天植株葉片顏色有變淺趨勢，可能由于植物細胞滲透壓過高而不能正常生長所致。
[0055]復水后，植株能夠正常吸收水分調(diào)節(jié)細胞滲透壓，Msp5cs啟動子受外界環(huán)境的誘導減弱，⑶S基因的表達減少，轉p5cs::⑶S質(zhì)粒的植株葉片顏色逐漸變淺；轉CaMV35S:GUS質(zhì)粒煙草植株葉片的顏色變化不是太大。由Msp5Cs基因啟動子和CaMV35S啟動子調(diào)控⑶S基因表達量的多少可以說明，在鹽脅迫下，Msp5Cs啟動子的表達能力明顯比組成型啟動子CaMV35S強。研究表明，Msp5Cs基因啟動子是一種鹽誘導型啟動子。
[0056](2)對兩種轉基因煙草進行干旱脅迫處理:對轉基因煙草進行預先控水5天處理，減少土壤水分的干擾，然后在干旱脅迫的第I天、第3天、第5天、復水后第I天和復水第3天對葉片進行GUS染色檢測，結果如圖6所示。
[0057]分別對轉基因煙草進行干旱脅迫后，檢測不同脅迫時間段的轉基因煙草葉片GUS染色情況，并進行拍照。對兩種轉基因煙草進行預控水5天處理是防止天土壤中水分的干擾，從圖6中可以看出，在干旱處理后，轉p5cS::GUS質(zhì)粒的轉基因煙草隨著脅迫天數(shù)增多，葉片顏色也不斷加深，其中干旱脅迫第5天時葉片顏色最深；轉CaMV35S::GUS質(zhì)粒的煙草隨著天數(shù)的增加，葉片顏色變化不大。 研究表明，在干旱脅迫下，隨著天數(shù)增多，轉P5cs::GUS質(zhì)粒的煙草葉片GUS基因表達不斷增多；轉CaMV35S::GUS質(zhì)粒的煙草葉片中GUS基因表達差異不明顯，而且在干旱脅迫第5天，葉片中GUS基因表達有下降趨勢，可能是干旱影響煙草植株正常生長導致⑶S基因表達減少。
[0058]在復水后，植株能夠正常吸收水分調(diào)節(jié)自身滲透壓，轉基因煙草受到的干旱脅迫逐漸減弱并消失，苜蓿Msp5Cs基因啟動子受外界逆境環(huán)境誘導減弱，GUS基因表達逐漸減少；而轉CaMV35S::GUS質(zhì)粒的煙草葉片中⑶S基因表達基本不變。由此說明，在干旱脅迫下，Msp5Cs基因啟動子的表達能力比組成型啟動子CaMV35S強，說明苜蓿Msp5Cs基因啟動子也是一種干旱誘導型啟動子。
[0059]應當理解的是，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
【權利要求】
1.一種干旱和鹽誘導特異性啟動子，其特征是，是具有如下所述任一序列的DNA分子: (1)序列表中SEQID NO:5所示序列1-1429位核苷酸所示的DNA分子； (2)在嚴格條件下與(I)所述的DNA分子雜交且具有干旱和鹽誘導啟動子功能的DNA分子; (3)與(I)或(2)所述DNA分子具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。
2.根據(jù)權利要求1所述的干旱和鹽誘導特異性啟動子，其特征是，所述嚴格條件為在0.1 X SSPE或0.1XSSC、0.1% SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
3.根據(jù)權利要求1所述的干旱和鹽誘導特異性啟動子的應用，其特征是，應用于啟動GUS基因的表達或者應用于`培育抗干旱和抗鹽的轉基因植物。
【文檔編號】C12N15/113GK103773765SQ201410000113
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權日:2014年1月2日
【發(fā)明者】張樺, 錢進, 任燕萍, 曲延英, 許磊 申請人:新疆農(nóng)業(yè)大學