一種親和性觸角狀酶固定化載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種親和性觸角狀酶固定化載體及其制備方法，屬于酶固定化領域。本發(fā)明的特征在于：親和性觸角狀酶固定化載體的觸角狀的不同鏈長可通過氯乙?；郾揭蚁┪⑶蚬δ芑?CH2Cl與單體的摩爾比的不同而獲得，再通過酸或和堿分別對觸角狀的環(huán)氧載體進行部分開環(huán)或先全開環(huán)再部分閉環(huán)，得到不同環(huán)氧基分布的、親和性觸角狀酶固定化載體。該載體應用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化，得到部分開環(huán)載體效果最好。由于載體部分開環(huán)，在鏈末端會產(chǎn)生一些親水性的基團，這些基團可能對固定化酶具有保護作用，使得酶活提高。
【專利說明】一種親和性觸角狀酶固定化載體
(—)【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種親和性觸角狀酶固定化載體，其特征在于該載體具有不同環(huán)氧基分布的結構。及可通過酸或和堿分別對觸角狀的環(huán)氧載體進行部分開環(huán)或先全開環(huán)再部分閉環(huán)制備，屬于酶固定化【技術領域】。
(二)【背景技術】
[0002]在固定化載體上，接上一些有足夠長度的且是親水的分子鏈，即所謂的“柔性鏈”，而后再將酶結合到柔性鏈上。該柔性鏈可使載體表面的剛性及疏水性得到改善，而變得柔順、親水，使減少并緩解固定化過程中酶分子所受到的碰撞力，維持酶蛋白的正常構象，從而減少酶活的損失；同時被固定的酶仍有較高的自由度，可以較好地保留其游離態(tài)的均相催化活性。這種方法可稱作“酶的柔性固定化”。該方法具有較好的研究價值和應用前景。
[0003]酶的柔性固定化技術的核心是載體的選擇與制備。要求載體既具有親水性，又要具有足夠長的分子鏈。如沈斌等(沈斌，魏榮卿，劉曉寧，朱建星，歐陽平凱，胺化聚苯乙烯載體柔性固定化木瓜蛋白酶[J]，化工學報，2005,56?):1070~1075)以Mannich反應制備出胺化聚苯乙烯樹脂，再以雙醛淀粉為柔性鏈對木瓜蛋白酶進行柔性固定化，所得到的固定化酶相比手臂固定化酶，具有較高的酶活回收率，且穩(wěn)定性得到了較好的提高；Bunyamin Karagoz 等(Karagoz B, Bayramoglu G, Altintas B, Bicak N, AricaM Y, Poly(styrene-divinylbenzene)beads surface functionalized with d1-blockpolymer grafting and mult1-modal ligand attachment:performance of reversiblyimmobilized lipase in ester synthesis[J].Bioprocess Biosyst Eng,2011,34(6):735~746)對交聯(lián)聚苯乙 烯微球經(jīng)乙酰氧基汞化反應、氯交換反應和2-溴乙酰溴反應三步進行表面修飾制備出溴乙?；郾揭蚁?PS-acyl-Br)大分子引發(fā)劑，再通過ATRP法先后將苯乙烯(St)和甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)嵌段接枝到該引發(fā)劑表面，合成出含環(huán)氧基鏈載體(PS-acyl-PS-b-PGMA)?；蛄碛眉憾?HMDA)和戊二醛(GA)先后再對該載體胺化和醛基化，獲得另一種載體(PS-acyl-PS-b-PGMA-HMDA-GA)。將上述兩種載體對脂肪酶共價固定化，結果表明，經(jīng)胺化和醛基化后的載體由于具有一定的親水作用，其固定化酶酶活高于未經(jīng)胺化和醛基化載體。
(三)
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明公開一種親和性觸角狀酶固定化載體，通過酸或和堿分別對觸角狀的環(huán)氧載體進行部分開環(huán)或先全開環(huán)再部分閉環(huán)，得到不同環(huán)氧基分布的、親和性觸角狀酶固定化載體，用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化。結果表明，由于載體部分開環(huán)，在鏈末端會產(chǎn)生一些親水性的基團，這些基團可能對固定化酶具有保護作用，使得酶活提高。
[0005]本發(fā)明所述的載體按以下步驟制備:由氯乙?；郾揭蚁┪⑶?，通過原子轉移自由基聚合法(ATRP)進行單體如甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)或和丙烯酰胺(AM)共聚或和丙烯酸酯(MA)共聚接枝，合成得到一觸角狀的環(huán)氧載體，而后再通過酸或和堿分別對其進行部分開環(huán)或先全開環(huán)再部分閉環(huán)，得到不同環(huán)氧基分布的、親和性觸角狀酶固定化載體，該載體可用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化。
[0006]本發(fā)明所述的親和性觸角狀酶固定化載體的觸角狀的不同鏈長可通過氯乙?；郾揭蚁┪⑶蚬δ芑?CH2Cl與單體的摩爾比的不同而獲得，其中氯乙酰化聚苯乙烯微球功能基-CH2Cl與丙烯酰胺或丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比的范圍為1: 5: 15至 1: 40: 120。
[0007]本發(fā)明所述的親和性觸角狀酶固定化載體，其特征在于所述的親和性觸角狀酶固定化載體可由不同鏈長的觸角狀的環(huán)氧載體經(jīng)部分開環(huán)得到表面含有部分極性羥基基團的、相同或相近環(huán)氧基擔載量的、不同鏈長的觸角狀酶固定化載體，由其固定化酶。
[0008]本發(fā)明所述的親和性觸角狀酶固定化載體，其特征在于所述的親和性觸角狀酶固定化載體可由不同鏈長的觸角狀的環(huán)氧載體經(jīng)先全開環(huán)再部分閉環(huán)得到不同或相同或相近環(huán)氧基擔載量的、不同鏈長的觸角狀酶固定化載體，由其固定化酶。
[0009]本發(fā)明的親和性觸角狀酶固定化載體，可用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化，其特征在于所述的不同環(huán)氧基分布的、親和性觸角狀酶固定化載體固定化酶按以下步驟制備:首先將酶溶解于緩沖液中，再加入親和性觸角狀酶固定化載體，在20~45°C振蕩反應20~50h，反應結束后用相同的緩沖液清洗所制備的固定化酶數(shù)次后獲得柔性固定化酶。
[0010]本發(fā)明所述的親和性觸角狀酶固定化載體，其特征在于所述的親和性觸角狀酶固定化載體由于部分開環(huán)，在鏈末端會產(chǎn)生一些親水性的極性基團，這些極性基團的親水性可起到與酶分子相容性改善的作用，進而在維持蛋白分子正常構象的環(huán)境下固定化酶，使得酶活提聞。
(三)【具體實施方式】
[0011]實施例1
[0012]取YCJOl脂肪酶0.4ml溶于15ml pH為7.8，濃度為0.1Omol / L的磷酸緩沖液中，然后在該溶液中加入0.1Og由氯乙?；郾揭蚁┪⑶驗橐l(fā)劑，通過調(diào)節(jié)引發(fā)劑的功能基-CH2Cl與丙烯酰胺和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1: 5: 15，經(jīng)丙烯酰胺和甲基丙烯酸縮水甘油酯的ATRP接枝后，再經(jīng)40ml濃度為0.07mol / L的HCl溶液部分開環(huán)
0.5h制得的親和性觸角狀酶固定化載體，30°C搖床中振蕩反應48h后，分離出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸鹽緩沖液清洗6~8次后測定其酶活。
[0013]實施例2
[0014]取木瓜蛋白酶10.0Omg溶于IOml pH為6.0，濃度為0.05mol / L的磷酸緩沖液中，然后在該溶液中加入0.1Og由氯乙?；郾揭蚁┪⑶驗橐l(fā)劑，通過調(diào)節(jié)引發(fā)劑的功能基-CH2Cl與丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1: 8: 24，經(jīng)丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的ATRP接枝后，再經(jīng)40ml濃度為0.20mol / L的HCl溶液先全開環(huán)lh，然后用20ml濃度為0.0150mol / L的NaOH溶液再部分閉環(huán)3h制得的親和性觸角狀酶固定化載體，25°C搖床中振蕩反應25h后，分離出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸鹽緩沖液清洗6~8次后測定其酶活。
[0015] 實施例3
[0016]取Candida mgosa 脂肪酶 50.0Omg 溶于 IOml pH 為 7.0,濃度為 0.1Omol / L 的憐酸緩沖液中，然后在該溶液中加入0.1Og由氯乙?；郾揭蚁┪⑶驗橐l(fā)劑，通過調(diào)節(jié)引發(fā)劑的功能基-CH2Cl與丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1: 10: 30，經(jīng)丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的ATRP接枝后，再經(jīng)40ml濃度為0.20mol / L的HCl溶液先全開環(huán)1.5h，然后用20ml濃度為0.0150mol / L的NaOH溶液再部分閉環(huán)5h制得的親和性觸角狀酶固定化載體，37°C搖床中振蕩反應30h后，分離出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸鹽緩沖液清洗6~8次后測定其酶活。
[0017]實施例4
[0018]取胰蛋白酶10.0Omg溶于5ml pH為7.5，濃度為0.1Omol / L的磷酸緩沖液中，然后在該溶液中加入0.1Og由氯乙?；郾揭蚁┪⑶驗橐l(fā)劑，通過調(diào)節(jié)引發(fā)劑的功能基-CH2Cl與丙烯酰胺和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1: 15: 45，經(jīng)丙烯酰胺和甲基丙烯酸縮水甘油酯的ATRP接枝后，再經(jīng)40ml濃度為0.07mol / L的HCl溶液部分開環(huán)Ih制得的親和性觸角狀酶固定化載體，20°C搖床中振蕩反應30h后，分離出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸鹽緩沖液清洗6~8次后測定其酶活。
[0019]實施例5
[0020]取豬胰脂肪酶10.0Oml溶于5ml pH為7.0，濃度為0.1Omol / L的磷酸緩沖液中，然后在該溶液中加入0.1Og由氯乙?；郾揭蚁┪⑶驗橐l(fā)劑，通過調(diào)節(jié)引發(fā)劑的功能基-CH2Cl與丙烯酰胺和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1: 20: 60，經(jīng)丙烯酰胺和甲基丙烯酸縮水甘油酯的ATRP接枝后，再經(jīng)40ml濃度為0.07mol / L的HCl溶液部分開環(huán)1.5h制得的親和性觸角狀酶固定化載體，40°C搖床中振蕩反應36h后，分離出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸鹽緩沖液清洗6~8次后測定其酶活。
[0021]實施例6
[0022]取蛋白酶10.0Omg溶于5ml pH為6.0，濃度為0.05mol / L的磷酸緩沖液中，然后在該溶液中加入0.1Og由氯乙酰化聚苯乙烯微球為引發(fā)劑，通過調(diào)節(jié)引發(fā)劑的功能基-CH2Cl與丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1: 25: 75，經(jīng)丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的ATRP接枝后，再經(jīng)40ml濃度為0.20mol / L的HCl溶液先全開環(huán)4h,然后用20ml濃度為0.0150mol / L的NaOH溶液再部分閉環(huán)IOh制得的親和性觸角狀酶固定化載體，30°C搖床中振蕩反應20h后，分離出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸鹽緩沖液清洗6~8次后測定其酶活。
[0023]實施例7
[0024]取脂肪酶0.5ml溶于IOml pH為7.5，濃度為0.1Omol / L的磷酸緩沖液中，然后在該溶液中加入0.1Og由氯乙?；郾揭蚁┪⑶驗橐l(fā)劑，通過調(diào)節(jié)引發(fā)劑的功能基-CH2Cl與丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1: 30: 90，經(jīng)丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的ATRP接枝后，再經(jīng)40ml濃度為0.20mol / L的HCl溶液先全開環(huán)6h，然后用20ml濃度為0.0150mol / L的NaOH溶液再部分閉環(huán)15h制得的親和性觸角狀酶固定化載體，40°C搖床中振蕩反應36h后，分離出制得的柔性固定化酶，用上述的磷酸鹽緩沖液清洗6~8次后測定其酶活。
[0025]實施例8
[0026]取胃蛋白酶50.0Omg溶于IOml pH為6.5，濃度為0.1Omol / L的磷酸緩沖液中，然后在該溶液中加入0.1Og由氯乙?；郾揭蚁┪⑶驗橐l(fā)劑，通過改變引發(fā)劑的功能基-CH2Cl與丙烯酰胺和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比為1: 40: 120，經(jīng)丙烯酰胺和甲基丙烯酸縮水甘油酯的ATRP接枝后，再經(jīng)40ml濃度為0.07mol / L的HCl溶液部分開環(huán)2h制得的親和性觸角狀酶固定化載體，37°C搖床中振蕩反應24h后，分離出制得的柔性固定化酶，用上述磷酸鹽緩沖 液清洗6~8次后測定其酶活。
【權利要求】
1.一種親和性觸角狀酶固定化載體，其特征在于該載體按以下步驟制備:由氯乙?；郾揭蚁┪⑶?，通過原子轉移自由基聚合法或ATRP法進行單體如甲基丙烯酸縮水甘油酯即GMA或和丙烯酰胺即AM共聚或和丙烯酸酯即MA共聚接枝，合成得到一觸角狀的環(huán)氧載體，而后再通過酸或和堿分別對其進行部分開環(huán)或先全開環(huán)再部分閉環(huán)，得到不同環(huán)氧基分布的、親和性觸角狀酶固定化載體，該載體可用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種親和性觸角狀酶固定化載體，其特征在于所述的親和性觸角狀酶固定化載體的觸角狀的不同鏈長可通過氯乙?；郾揭蚁┪⑶蚬δ芑?CH2Cl與單體的摩爾比的不同而獲得，其中氯乙?；郾揭蚁┪⑶蚬δ芑?CH2Cl與丙烯酰胺或丙烯酸酯和甲基丙烯酸縮水甘油酯的摩爾比的范圍為1: 5: 15至1: 40: 120。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種親和性觸角狀酶固定化載體，其特征在于所述的親和性觸角狀酶固定化載體可由不同鏈長的觸角狀的環(huán)氧載體經(jīng)部分開環(huán)得到表面含有部分極性羥基基團的、相同或相近環(huán)氧基擔載量的、不同鏈長的觸角狀酶固定化載體，由其固定化酶。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的一種親和性觸角狀酶固定化載體，其特征在于所述的親和性觸角狀酶固定化載體可由不同鏈長的觸角狀的環(huán)氧載體經(jīng)先全開環(huán)再部分閉環(huán)得到不同或相同或相近環(huán)氧基擔載量的、不同鏈長的觸角狀酶固定化載體，由其固定化酶。
5.根據(jù)權利要求1或2或3或4所述的一種親和性觸角狀酶固定化載體，將其用于脂肪酶或蛋白酶的柔性固定化，其特征在于所述的不同環(huán)氧基分布的、親和性觸角狀酶固定化載體固定化酶按以下步驟制備:首先將酶溶解于緩沖液中，再加入親和性觸角狀酶固定化載體，在20~45°C振蕩反應20~50h，反應結束后用相同的緩沖液清洗所制備的固定化酶數(shù)次后獲得柔性固定化酶。
6.根據(jù)權利要求1或2或3所述的一種親和性觸角狀酶固定化載體，其特征在于所述的親和性觸角狀酶固定化載體由于部分開環(huán)，在鏈末端會產(chǎn)生一些親水性的極性基團，這些極性基團的親水性可起到與酶分子相容性改善的作用，進而在維持蛋白分子正常構象的環(huán)境下固定化酶，使得酶活提高。`
【文檔編號】C12N11/08GK103710332SQ201410001850
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月3日 優(yōu)先權日:2014年1月3日
【發(fā)明者】劉曉寧, 楊長青, 魏榮卿 申請人:南京工業(yè)大學