一種制備脂肪酸膠體溶液應(yīng)用于隱甲藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備脂肪酸膠體溶液應(yīng)用于隱甲藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其利用人工方式制造脂肪酸膠體溶液，并應(yīng)用到隱甲藻異養(yǎng)培養(yǎng)，可以明顯提高多不飽和脂肪酸的產(chǎn)量。本發(fā)明采用特定的超聲波乳化方法將脂肪酸前體成分處理成微米-納米級別的顆粒分散于培養(yǎng)液中，脂肪酸穩(wěn)定存在于溶液中，不出現(xiàn)分層、聚集或沉降現(xiàn)象，并供給到培養(yǎng)體系中，隱甲藻連續(xù)發(fā)酵數(shù)天，培養(yǎng)的微藻油脂的積累速度和長鏈脂肪酸的比例明顯上升，技術(shù)方法易于實現(xiàn)，適用于異養(yǎng)微藻的人工培養(yǎng)。
【專利說明】一種制備脂肪酸膠體溶液應(yīng)用于隱甲藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種能合成二十二碳六烯酸的異養(yǎng)微藻隱甲藻，特別是利用人工乳化法制備脂肪酸膠體溶液的制備方法，利用本微藻并添加人工膠體溶液生產(chǎn)多不飽和脂肪酸的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]二十二碳六烯酸(DHA)屬于多不飽和脂肪酸(PUFAs)的一種，是動物細胞膜磷脂的重要組成成分，決定了細胞膜的流動性和變形性。對多種疾病和某些癌癥的預(yù)防和治療有重要作用，足量的PUFAs的攝入對胎兒和幼兒視覺和神經(jīng)的發(fā)育至關(guān)重要。歐美國家現(xiàn)在對于DHA的應(yīng)用較為廣泛，主要應(yīng)用于食品和保健藥品中。在食品中的應(yīng)用包括嬰兒奶粉、牛奶、奶酪、食用植物油脂、烘焙油脂等，消費者對于DHA的認知度和認可度也比較高。當前食品工業(yè)上使用的二十二碳六烯酸多屬于從海洋捕撈的魚類的魚油中獲得，此法成本高昂，且原料品質(zhì)受環(huán)境因素影響較大。有少量來自海洋微藻，多數(shù)為國外公司壟斷，我們選用采用的微藻隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)為異養(yǎng)型微藻,無需光照培養(yǎng),工程化培養(yǎng)實現(xiàn)簡單，培養(yǎng)方式接近常規(guī)工業(yè)發(fā)酵，便于利用原有設(shè)備和技術(shù)工藝。而其DHA積累含量高，一般能達到總脂的30-50%，而且其他多不飽和脂肪酸的含量在1%以下，特別是不含EPA，使用安全。目前國際上已有利用的先例，如美國MARTECK公司推出的孕產(chǎn)婦用DHA膠囊已獲美國FDA食品認證，業(yè)界有利用微藻的自養(yǎng)作用在光培養(yǎng)反應(yīng)器中合成多不飽和脂肪酸，但自養(yǎng)培養(yǎng)設(shè)備復(fù)雜，產(chǎn)出率低。且藻液內(nèi)含有效成分濃度低，不利于下游分離純化。
[0003]長鏈脂肪酸的積累過程積累緩慢，規(guī)?；a(chǎn)過程周期較長，生產(chǎn)成本較高。異養(yǎng)培養(yǎng)微藻生長緩慢，如何提高菌體密度，縮短發(fā)酵時間，是核心技術(shù)難題之一，一個解決辦法是發(fā)酵原料中投加長鏈脂肪酸代謝合成前體，縮短合成步驟和時間，但中長鏈脂肪酸都為脂溶性物質(zhì)，不能溶解于水溶液，作為發(fā)酵底物加入反應(yīng)器中，影響傳質(zhì)和溶氧，限制了其應(yīng)用范圍。本發(fā)明致力于實現(xiàn)脂肪酸在水溶液中穩(wěn)定分散的實用方法，使微藻在人工培養(yǎng)體系中可利用低價值長鏈脂肪酸底物。以提高多不飽和脂肪酸的產(chǎn)量和合成效率。通過解決這一關(guān)鍵問題來縮短發(fā)酵周期，提高生產(chǎn)效率。
[0004]在天然水體中的膠體物質(zhì)與水體中的生態(tài)系統(tǒng)聯(lián)系緊密，源于自然界浮游生物釋放的含碳有機物(如細胞溶解、浮游生物攝食、顆粒有機物的降解、陸地水流運輸?shù)?在自然水體中的膠體含量可達IO7-1O9個/ml，是海水中最豐富的顆粒物，膠體可作為更大顆粒聚集的核心，影響海洋中各種沉積過程。膠體表面不僅僅是光化學(xué)反應(yīng)位，顆粒表面特征可以控制和影響自由態(tài)和吸附態(tài)離子在海水中的分配及行為。巨大的比表面積使其作為營養(yǎng)鹽、有機碳、微量元素、痕量有機物的良好載體，是真溶液和顆粒之間的中介，其特殊的物理化學(xué)屬性日益引起生態(tài)研究者關(guān)注。但在人工生物反應(yīng)器中和人工培養(yǎng)條件下利用膠體的生物效應(yīng)的創(chuàng)新應(yīng)用未見實用化技術(shù)的公布或報道。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種制備脂肪酸膠體溶液應(yīng)用于隱甲藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，該方法基于膠體溶液生態(tài)學(xué)效應(yīng)制備微-納米量級的脂肪酸的膠體溶液體系，其制備原理為:水溶液的溫度控制在脂肪酸的熔點以上，液態(tài)脂肪酸在超聲波對空化作用下解體與水混合成納-微尺度的膠體溶液。分散相粒子尺度小到臨界點之后，不易重新聚集，自然形成穩(wěn)定狀態(tài)，使脂肪酸在培養(yǎng)液中以更容易吸收的狀態(tài)被微藻代謝利用，應(yīng)用于微藻異養(yǎng)培養(yǎng)，能提高隱甲藻油脂含量和長鏈多不飽和脂肪酸比例。
[0006]本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)方案為:
[0007]一種制備脂肪酸膠體溶液應(yīng)用于隱甲藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，包括以下步驟:
[0008](I)按質(zhì)量比1:8-25將液體或固體狀態(tài)的長鏈脂肪酸和水混和均勻，再添加1-3%的表面活性劑，緩慢加熱至80-90°C，然后使用通用型超聲發(fā)生器裝置，變幅桿直徑控制在5-6_，震蕩容器底部放入適量的玻璃珠輔助乳化，玻璃珠以單層鋪滿容器底部為宜，不得讓變幅桿與容器壁直接接觸，變幅桿距離容器底部20-30mm，超聲換能裝置功率設(shè)置為100-150W,多次短時間間隔乳化，每次工作3秒間隔2秒，超聲震蕩處理1-2分鐘，溶液的溫度控制在90-95°C，脂肪酸膠體溶液制備完成后封裝，在121°C溫度下滅菌20分鐘后備用；
[0009](2)將上述滅菌后的脂肪酸膠體溶液在隱甲藻發(fā)酵起始培養(yǎng)時加入到培養(yǎng)基中，也可在發(fā)酵培養(yǎng)過 程中流加使用，其余培養(yǎng)步驟和方法與常規(guī)微生物和異養(yǎng)微藻的培養(yǎng)過程相同，發(fā)酵結(jié)束后測量生物量，總油脂含量，長鏈脂肪酸在總油脂中的比例，DHA在油脂中含量的比例。
[0010]所述的長鏈脂肪酸選自鏈長介于十碳到二十碳之間的偶數(shù)脂肪酸。
[0011]所述的表面活性劑選自離子表面活性劑或非離子表面活性劑，主要用作0/W型輔助乳化劑。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
[0013]1、有效提高脂肪酸的利用率，減少脂溶成份對發(fā)酵體系氧傳遞的不良影響；
[0014]2、操作便利、可利用現(xiàn)有設(shè)備、此方法所制備的材料存在穩(wěn)定，重現(xiàn)性好；
[0015]3、制備成本低、添加方式靈活、與現(xiàn)有發(fā)酵工藝結(jié)合方便；
[0016]4、能顯著降低發(fā)酵周期和發(fā)酵成本，提高產(chǎn)量。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為通用型超聲發(fā)生器裝置，其中，1.換能器，2.變幅桿，3.容器，4.玻璃珠。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
[0019]以乳化后的棕櫚酸作為發(fā)酵添加物
[0020]棕櫚酸(分子式=C16H32O2)常溫下為白色帶有珠光的鱗片狀固體，不溶解于水，直接作為底物添加不易被微藻吸收，也是合成二十二碳六烯酸(DHA)的前體物質(zhì)。
[0021]取500毫升水,加入固態(tài)棕櫚酸25克,再添加Tween80試劑8毫升。添加物濃度低起不到乳化效果，濃度高也會造成膠體體系不穩(wěn)定。緩慢加熱至90°C，使用通用型超聲發(fā)生器裝置，變幅桿直徑在6_左右，震蕩容器底部放入適量玻璃珠(5克)輔助乳化，不得讓變幅桿與容器壁直接接觸，變幅桿距離容器底部20-30mm，超聲換能裝置功率設(shè)置為120W (過程參看附圖1)?？栈^程中熱效應(yīng)引發(fā)溫度過高而使體系沸騰，多次短時間間隔乳化(工作3秒間隔2秒)。超聲震蕩處理I分鐘，溶液的控制溫度范圍為90-95°C，處理過程中溫度不得低于90°C，過熱易造成沸騰及溶液混和不勻，出現(xiàn)沉淀或聚團。脂肪酸膠體溶液制備完成后封裝在三角瓶中高溫滅菌(121°C，20分鐘)處理后備用。
[0022]藻種:隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii ATCC30556)
[0023]種子培養(yǎng)基:葡萄糖:9g/L，酵母膏:3g/L，海鹽:25g/L，
[0024]發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖:50g/L，酵母膏:6g/L，海鹽:25g/L，
[0025]培養(yǎng)溫度:25 °C pH值均調(diào)到6左右。
[0026]種子液接種后培養(yǎng)72小時后，種子液按10%的接種量接入到盛有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，另外無菌操作每瓶加入棕櫚酸膠體溶液30毫升(對照組不添加)，搖床轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)，培養(yǎng)溫度為25°C，培養(yǎng)240個小時后發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后測量生物量，總油脂含量，長鏈脂肪酸在總油脂中的比例，DHA在油脂中含量的比例。
[0027]DHA在總油中含量測量方法:
[0028]取IOOmg油脂樣品，置于IOOmL的磨口燒瓶中，加入0.5mol/L的KOH甲醇溶液2mL，于60°C水浴30min進行皂化，冷卻后加入2mL三氟化硼-甲醇(體積比為1:1)溶液，60°C水浴30min，冷卻后加入5mL正己烷振蕩，然后加入5mL飽和食鹽水，靜置分層后取上層正己烷相，抽取上層可直接進樣。
[0029]油脂氣相色譜分析方法:
[0030]島津GC-14C氣相工作站；色譜柱:安捷倫DB_23(60M)，載氣:氮氣。檢測器:氫火焰離子化檢測器。分流比1:50。進樣口溫度200°C，檢測器溫度250°C，進樣量I μ L。采用程序升溫，140°C保持3分鐘，IO0C /分鐘升溫，升溫至250°C，保持15分鐘。使用內(nèi)標積分面積法計算油脂中脂肪酸含量比例。
[0031]藻種細胞干重的測定
[0032]100毫升藻細胞液過濾后裝入預(yù)先稱重平衡的離心管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，沉淀后用蒸餾水清洗3次，50°C下真空干燥，定期取出，在干燥器內(nèi)冷卻后稱重，直至恒重(DC)。
[0033]對照組培養(yǎng)方法除未添加脂肪酸膠體溶液，其他實驗步驟和方法同上。
[0034]統(tǒng)計總油脂積累量和長鏈脂肪酸的含量比例結(jié)果如下表:
[0035]
【權(quán)利要求】
1.一種制備脂肪酸膠體溶液應(yīng)用于隱甲藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其特征在于包括以下步驟: (O按質(zhì)量比1:8-25將液體或固體狀態(tài)的長鏈脂肪酸和水混和均勻，再添加1-3%的表面活性劑，緩慢加熱至80-90°C，然后使用通用型超聲發(fā)生器裝置，變幅桿直徑控制在5-6_，震蕩容器底部放入適量的玻璃珠輔助乳化，玻璃珠以單層鋪滿容器底部為宜，不得讓變幅桿與容器壁直接接觸，變幅桿距離容器底部20-30mm，超聲換能裝置功率設(shè)置為100-150W,多次短時間間隔乳化，每次工作3秒間隔2秒，超聲震蕩處理1-2分鐘，溶液的溫度控制在90-95°C，脂肪酸膠體溶液制備完成后封裝，在121°C溫度下滅菌20分鐘后備用； (2)將上述滅菌后的脂肪酸膠體溶液在隱甲藻發(fā)酵起始培養(yǎng)時加入到培養(yǎng)基中，也可在發(fā)酵培養(yǎng)過程中流加使用，其余培養(yǎng)步驟和方法與常規(guī)微生物和異養(yǎng)微藻的培養(yǎng)過程相同，發(fā)酵結(jié)束后測量生物量，總油脂含量，長鏈脂肪酸在總油脂中的比例，DHA在油脂中含量的比例。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備脂肪酸膠體溶液應(yīng)用于隱甲藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，所述的長鏈脂肪酸選自鏈長介于十碳到二十碳之間的偶數(shù)脂肪酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備脂肪酸膠體溶液應(yīng)用于隱甲藻生產(chǎn)二十二碳六烯酸的方法，其特征在于，所述的表面活性劑選自離子表面活性劑或非離子表面活性劑，主要用作0/W型輔助乳化劑。
【文檔編號】C12P7/64GK103898173SQ201410004085
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月2日
【發(fā)明者】姚黎明, 肖尚, 陳祥松, 吳金勇, 姚建銘 申請人:中國科學(xué)院等離子體物理研究所