粘果酸漿控制器官大小基因第一內(nèi)含子的調(diào)控元件及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種來源于粘果酸漿控制器官大小基因POS1第一內(nèi)含子的調(diào)控元件及應(yīng)用。本發(fā)明所提供的調(diào)控元件為如下（a）-（c）任一所述DNA片段：（a）序列表中序列1所示的DNA片段；（b）序列表中序列1缺失第7-9位核苷酸中至少一個核苷酸后所形成的DNA片段；（c）與（a）或（b）限定的DNA片段具有90%以上同源性且功能相同的DNA片段。實驗證明，本發(fā)明所提供的粘果酸漿第一內(nèi)含子37bp調(diào)控元件的不同數(shù)目的重復(fù)對目的基因表達(dá)有不同的調(diào)控效應(yīng)。單拷貝至三拷貝會促進(jìn)目的基因表達(dá)，其中單拷貝的促進(jìn)作用最強，隨著拷貝數(shù)的增加，促進(jìn)作用逐漸減少，當(dāng)為四拷貝以上時基本無促進(jìn)作用?？梢?，本發(fā)明對于培育優(yōu)良品質(zhì)更加突出的植物新品種具有重要的意義。
【專利說明】粘果酸漿控制器官大小基因第一內(nèi)含子的調(diào)控元件及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種來源于粘果酸漿控制器官大小基因第一內(nèi)含子的調(diào)控元件及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]真核生物的基因一般由外顯子(exon)和內(nèi)含子(intixm)組成。外顯子是真核生物基因的一部分，它在剪接(splicing)后仍會被保存下來，并可在蛋白質(zhì)生物合成過程中被表達(dá)為蛋白質(zhì)。外顯子是最后出現(xiàn)在成熟RNA中的基因序列，又稱表達(dá)序列。既存在于最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。內(nèi)含子是在轉(zhuǎn)錄后的加工中，從最初的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物除去的內(nèi)部的核苷酸序列。
[0003]自從發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子以來，內(nèi)含子功能的研究一直受到人們的關(guān)注。因為內(nèi)含子屬于非編碼序列，曾一度被認(rèn)為它的存在沒有任何意義，在功能方面是無用基因，是基因組的垃圾。但隨著功能基因的進(jìn)一步研究，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子并不是基因組的垃圾，而是在基因表達(dá)調(diào)控中有著重要的生物學(xué)功能。另外在原核生物基因中不存在內(nèi)含子或著含有少量的內(nèi)含子，而在真核生物基因中內(nèi)含子的存在是普遍現(xiàn)象。內(nèi)含子的長度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外顯子的長度，甚至在人類基因組中非編碼序列占到95%-97%。由此可見，隨著生物進(jìn)化程度越高，其內(nèi)含子所含比例也越高，這也進(jìn)一步說明內(nèi)含子是具有生物學(xué)功能的。從生物進(jìn)化角度來講，內(nèi)含子也必定在生命活動中執(zhí)行著某種功能。近年來人們對內(nèi)含子的功能提出許多新的見解，其中最重要的一個方面是內(nèi)含子在基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。目前發(fā)現(xiàn)許多基因的內(nèi)含子都對基因的表達(dá)具有正調(diào)控作用，并且可能通過幾種不同機制來提高基因的表達(dá)效率，同時還 發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子也可能抑制基因的表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種來源于粘果酸衆(zhòng)(Physalis philadelphica)控制器官大小基因POSl第一內(nèi)含子中的調(diào)控元件。
[0005]本發(fā)明所提供的調(diào)控元件長37bp，為如下(a)_ (c)中任一 DNA片段:
[0006](a)序列表中序列I所示的DNA片段；
[0007](b)序列表中序列I缺失第7-9位核苷酸中至少一個核苷酸后所形成的DNA片段；
[0008](c)與(a)或(b)限定的DNA片段具有90%以上同源性且功能相同的DNA片段。
[0009]進(jìn)一步，所述DNA片段具體為如下15個中的任一種:(I)序列2的第1_37位(以P58中的37bp調(diào)控元件為代表);(2)序列28的第1_37位(以P59中第一拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)；(3)序列28的第121-157位(以P59中第三拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)；
(4)序列5的第1-34位(以P55中的37bp調(diào)控元件為代表)；(5)序列6的第1_37位(以P56中的37bp調(diào)控元件為代表)；(6)序列25的第1_37位(以P142中第一拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)；(7)序列26的第1-37位(以P143中第一拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)；
(8)序列18的第47-83位(以P116中第二拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)；(9)序列19的第47-83位(以Pl 19中第二拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)；(10)序列27的第47-83位(以P148中第二拷貝的37bp調(diào)控元件為代表);(11)序列33的第1_37位(以P126中第一拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)；(12)序列30的第68-104位(以P114中第二拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)；(13)序列31的第68-104位(以P117中第二拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)；
(14)序列30的第119-155位(以P114中第三拷貝為代表)；(15)序列34的第87-123位(以P131中第二拷貝的37bp調(diào)控元件為代表)。 [0010]本發(fā)明的再一個目的是提供來源于POSl基因第一內(nèi)含子序列。
[0011]本發(fā)明所提供的來源于POSl基因第一內(nèi)含子序列為如下(I)或(2):
[0012](I)序列表中序列2-序列38所示的37個DNA片段中的任一個；
[0013](2)與(I)限定的DNA片段具有90%以上同源性且功能相同的DNA片段。
[0014]以上兩種所述DNA片段(37bp調(diào)控元件或內(nèi)含子)在調(diào)控目的基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0015]在所述應(yīng)用中，所述目的基因的表達(dá)為在植物(如酸漿屬植物)中的表達(dá)。
[0016]本發(fā)明的還一個目的是提供一種用于提高目的基因表達(dá)的表達(dá)盒。
[0017]本發(fā)明所提供的表達(dá)盒為如下(al) - (a4)中任一:
[0018](al)自上游到下游依次包括:啟動子、I個所述DNA片段(37bp調(diào)控元件)、所述目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列；
[0019](a2)自上游到下游依次包括:啟動子、2個所述DNA片段(37bp調(diào)控元件)、所述目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列；
[0020](a3)自上游到下游依次包括:啟動子、3個所述DNA片段(37bp調(diào)控元件)、所述目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列；
[0021](a4)自上游到下游依次包括:啟動子、所述DNA片段(內(nèi)含子)、所述目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列。
[0022]在本發(fā)明中，所述啟動子具體為如下(Cl) - (c4)中任一種:
[0023](Cl)序列表中序列39所示的啟動子(P58啟動子)；
[0024](c2)序列表中序列40所示的啟動子(P64啟動子)；
[0025](c3)序列表中序列41所示的啟動子(P59啟動子)；
[0026](c4)35S 啟動子。
[0027]含有所述表達(dá)盒的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0028]所述表達(dá)盒、所述重組載體、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或所述重組菌，在提高目的基因表達(dá)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029]在本發(fā)明中，所述重組載體具體為如下中的任一種:
[0030](I)在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入“序列39+CATATG+序列2”所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒；
[0031](2)在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入“序列40+CATATG+序列12”所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒；
[0032](3) YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入“序列41+CATATG+序列28”所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒。
[0033](4)在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入“序列39+CATATG+序列2的第1-37位”所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒；
[0034](5)在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入“序列39+CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位”所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒；
[0035](6)在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入“序列39+CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1_37位”所示DNA片段后得到的重組質(zhì)粒。
[0036]所述YY96 載體記載于 “Lin, R.C.，Ding, L.，Casola, C.，Ripoll, D.R.，F(xiàn)eschottejC.，&Wang, H.Y.Transposase-derived transcription factors regulatelight signaling in Arabidopsis.Science318，1302-1305 (2007) ” 一文。
[0037]在所述應(yīng)用中，所述目的基因的表達(dá)為在植物(如酸漿屬植物)中的表達(dá)。
[0038]本發(fā)明的再一個目的是提供一種培育目的基因表達(dá)量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。
[0039]本發(fā)明所提供的培育目的基因表達(dá)量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，具體可包括如下步驟:
[0040](bl)向目的植物中導(dǎo)入所述表達(dá)盒，得到表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物；
[0041](b2)從步驟(bl)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到所述目的基因的表達(dá)量高于對照的轉(zhuǎn)基因植物；
[0042]所述對照為向所述目的植物中導(dǎo)入如下表達(dá)盒后得到的表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物:與本發(fā)明以上所提供的 所述表達(dá)盒相比僅去除所述DNA片段(37bp調(diào)控元件或內(nèi)含子)后所形成的表達(dá)盒。
[0043]在所述方法中，所述表達(dá)盒是通過含有所述表達(dá)盒的重組載體或重組菌導(dǎo)入所述目的植物中的。
[0044]在所述方法中，所述植物為酸漿屬植物。在本發(fā)明中，所述植物具體為洋酸漿(Physalis floridana) P106。
[0045]在所述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物可為轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體。更加具體的，在本發(fā)明的一個實施例中，所述轉(zhuǎn)基因植物為轉(zhuǎn)基因的洋酸衆(zhòng)(Physalis floridana) P106原生質(zhì)體。
[0046]在本發(fā)明的一個實施例中，以上的所述目的基因具體為熒光素酶基因(LUC)。
[0047]所述熒光素酶基因(LUC)為來自于YY96載體(記載于“Lin，R.C., Ding, L., Casola, C., Ripoll, D.R., Feschotte, C., &ffang, Η.Y.Transposase-derivedtranscription factors regulate light signaling in Arabidopsis.Science318, 1302-1305 (2007) ” 一文)上的熒光素酶基因(LUC)。
[0048]實驗證明，本發(fā)明所提供的37bp的調(diào)控元件的不同數(shù)目的重復(fù)對目的基因表達(dá)有不同的調(diào)控效應(yīng)。單拷貝至三拷貝會促進(jìn)目的基因表達(dá)，其中單拷貝的促進(jìn)作用最強，隨著拷貝數(shù)的增加，促進(jìn)作用逐漸減少，當(dāng)為四拷貝以上時基本無促進(jìn)作用?？梢?，本發(fā)明對于培育優(yōu)良品質(zhì)更加突出的植物新品種具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1為POSl基因第一個內(nèi)含子對目的基因表達(dá)調(diào)控作用。其中，pro58、pro64和pro59分別表示P58啟動子、P64啟動子和P59啟動子；int58、int64和int59分別表示P58、P64和P59的POSl基因第一個內(nèi)含子。與P58啟動子啟動LUC的作用相比，各組數(shù)據(jù)的差異顯著性(P值)標(biāo)示在圖中，*代表0.01〈P〈0.05，**代表P〈0.01。
[0050]圖2為POSl基因第一個內(nèi)含子中37bp調(diào)控序列對目的基因表達(dá)調(diào)控作用。其中，pro58表示P58啟動子；R(58)表示P58的POSl基因第一個內(nèi)含子中的37bp調(diào)控序列。與P58啟動子啟動LUC的作用相比，各組數(shù)據(jù)的差異顯著性(P值)標(biāo)示在圖中，*代表
0.01〈Ρ〈0.05，** 代表 Ρ〈0.01。
【具體實施方式】
[0051 ] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0052]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0053]下述實施例中所涉及的粘果酸衆(zhòng)(Physalis philadelphica)種內(nèi)37個不同種源，按照果實大小可以分為大、中和小三個組。其中，大組有P58、P50、P54、P55、P56、P110、P113、P120、P128、P130 ;中組有 P64、P49、P53、P61、P63、P112、P116、P119、P121、P123、P125、P132、P134、P142、P143、P148 ;小組有 P59、P52、P114、P117、P118、P126、P131、P135、P139、P140、P146。這些材料均記載于“Wang, L., Li, Z.C., &He, C.Y.Transcriptome-wide miningof the differentially expressed transcripts for natural variation of floralorgan size in Physalis philadelphica.J Exp Bot63, 6457-6465 (2012) 文，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。
[0054]YY96 載體和 35S:⑶S 載體:均記載于“Lin, R.C.，Ding, L.，Casola, C.，Ripoll, D.R., Feschotte, C., &ffang, Η.Y.Transposase-derived transcription factors regulatelight signaling in Arabidopsis.Science318, 1302-1305 (2007) ”一文，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。在YY96載體中，在HindIII和BamH I的下游有熒光素酶基因(LUC)。在35S:⑶S載體中，有依靠35S啟動子啟動表達(dá)的⑶S基因。
[0055]洋酸衆(zhòng)(Physalisfloridana) P106:記載于 “He, C.Y.，&Saedler, H.Heterotopic expression of MPF2is the key to the evolution of the Chineselantern of Physalis, a morphological novelty in Solanaceae.Proc Natl Acad SciUSA102, 5779-5784(2005) ”一文，公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得。
[0056]實施例1、POSl基因第一內(nèi)含子中的37bp調(diào)控元件的獲得及序列分析
[0057]實驗材料:粘果酸衆(zhòng)(Physalis philadelphica)種內(nèi)37個不同種源,按照果實大小可以分為大、中和小三個組。其中，大組(10份材料)有？58、？50、？54、？55、？56、？110、P113、P120、P128、P130 ;中組(16 份材料)有 P64、P49、P53、P61、P63、P112、P116、P119、P121、P123、P125、P132、P134、P142、P143、P148 ;小組(11 份材料)有 P59、P52、P114、P117、P118、P126、P131、P135、P139、P140、P146。
[0058]分別提取各實驗材料的葉片DNA，用如下引物I和引物2進(jìn)行PCR擴增，獲得各自POSl基因的基因組序列。
[0059]引物1:5，-ATGGCTTCAAAGCATGAGCTTCT-3，；
[0060]引物2:5，-CTATGGATCCGCCTGGGGCT-3，。
[0061]對所得37份材料的POSl基因的基因組序列進(jìn)行序列測定，經(jīng)序列比對后發(fā)現(xiàn)POSl基因第一個內(nèi)含子序列中含有一段37bp重復(fù)序列。
[0062]其中，大組(以P58為代表)中，P58的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列2 ;P50的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列3 ;P54的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列4 ；P55的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列5 ；P56的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列6 ;P110的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列7 ；P113的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列8 ；P120的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列9 ；P128的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列10 ；P130的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列11。這10份材料，POSl基因第一個內(nèi)含子序列均含有I個37bp重復(fù)序列，除P55中為序列5的第1-34位(37bp重復(fù)序列的第7-9位缺失)外，其余材料均為各序列的第1-37位。
[0063]中組(以P64為代表)的16份材料中，P64的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列12 ；P49的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列13 ；P53的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列14 ；P61的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列15 ；P63的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列16 ；P112的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列17 ；P116的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列18 ；P119的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列19 ；P121的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列20 ;P123的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列21 ;P125的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列22 ；P132的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列23 ；P134的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列24 ；P142的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列25 ；P143的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列26 ；P148的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列27。這16份材料，POSl基因第一個內(nèi)含子序列均含有2個37bp重復(fù)序列，其中第一個37bp重復(fù)序列為各序列的第1-37位；第二個37bp重復(fù)序列在各材料中的位置信息如下:
[0064]P64:序列 12 的第 47-83 位；
[0065]P49:序列 13 的第 47-83 位；
[0066]P53:序列 14 的第 47-83 位；
[0067]P61:序列 15 的第 48-84 位；
[0068]P63:序列 16 的第 47-83 位；
[0069]Pl 12:序列 17 的第 47-83 位；
[0070]Pl 16:序列 18 的第 47-83 位；
[0071]Pl 19:序列 19 的第 47-83 位；
[0072]P121:序列 20 的第 48-84 位；
[0073]P123:序列 21 的第 47-83 位；
[0074]P125:序列 22 的第 47-83 位；
[0075]P132:序列 23 的第 47-83 位；
[0076]P134:序列 24 的第 47-83 位；
[0077]P142:序列 25 的第 47-83 位；
[0078]P143:序列 26 的第 47-83 位；
[0079]P148:序列 27 的第 47-83 位。
[0080]小組(以P59為代表)的11份材料中，P59的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列28 ；P52的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列29 ；P114的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列30 ；P117的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列31 ；P118的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列32 ；P126的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列33 ；P131的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列34 ；P135的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列35 ;P139的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列36 ；P140的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列37 ；P146的POSl基因第一個內(nèi)含子序列為序列表中序列38。這11份材料，POSl基因第一個內(nèi)含子序列均含有3個37bp重復(fù)序列，其中第一個37bp重復(fù)序列為各序列的第1-37位；第二個37bp重復(fù)序列和第三個37bp重復(fù)序列在各材料中的位置信息如下:
[0081]P59:序列28的第68-104位，以及第121-157位；
[0082]P52:序列29的第68-104位，以及第121-157位；
[0083]Pl 14:序列 30 的第 68-104 位，以及第 119-155 位；
[0084]Pl 17:序列 31 的第 68-104 位，以及第 121-157 位；
[0085]Pl 18:序列 32 的第 68-104 位，以及第 121-157 位；
[0086]P126:序列 33 的第 68-104 位，以及第 121-157 位；
[0087]P131:序列 34 的第 87-123 位，以及第 140-176 位；
[0088]P135:序列 35 的第 68-104 位，以及第 121-157 位；
[0089]P139:序列 36 的第 68-104 位，以及第 119-155 位；
[0090]P140:序列 37 的第 68-104 位，以及第 121-157 位；
[0091]P146:序列 38 的第 68-104 位，以及第 121-157 位。
[0092]對從以上37份材料中共獲得的75個來自于POSl基因第一個內(nèi)含子序列的37bp重復(fù)序列進(jìn)行序列比對，將可變異位點進(jìn)行標(biāo)注，得到通式，如序列表中序列I所示，其中序列I的第7-9位核苷酸可以缺失至少一位。
[0093]本發(fā)明的發(fā)明人通過進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)這段37bp重復(fù)序列的拷貝數(shù)可以很好地與大、中、小果實組和POSl基因的表達(dá)量相對應(yīng)，即在所有大果實的種源中都含有一段37bp重復(fù)序列，POSl基因的表達(dá)量相對較高；在中果實的種源中含有二段37bp重復(fù)序列，POSl基因的表達(dá)量居中；小果實的種源中含有三段37bp重復(fù)序列，POSl基因的表達(dá)量相對較低。
[0094]實施例2、P0S1基因第一個內(nèi)含子對目的基因表達(dá)調(diào)控作用的研究
[0095]本實施例中，首先將分別代表大、中和小3種粘果酸漿的P58、P64和P59的啟動子連接上熒光素酶基因(LUC)，它們在啟動LUC表達(dá)上作用無明顯差異。但是，當(dāng)它們分別連上各自的第一個內(nèi)含子后(P58含有I個37bp重復(fù)序列；P64含有2個37bp重復(fù)序列；P59含有3個37bp重復(fù)序列)，P58組中LUC的表達(dá)最高，P64組次之，P59組最低。具體如下:
[0096]一、重組載體的構(gòu)建
[0097]UYY96-Pro58, YY96-Pro64, YY96-Pro59 的構(gòu)建
[0098]以粘果酸漿(Physalis philadelphica) P58、P64和P64的基因組為模版，擴增它們各自的內(nèi)源啟動子序列。
[0099]用于擴增P58和P64啟動子的引物為:
[0100]Pro-F:5’ -AAGCTTGTTTACTCAGAAAGCGAAAG-3，(下劃線部分為酶切位點 Hind III的識別序列，其后的序列為序列39和序列40的第1-20位)；[0101]Pro-R:5’ -GGATCCAGCGCGAAAAGAAACACA-3’ (下劃線部分為酶切位點 BamH I 的識別序列，其后的序列為序列39和序列40的后18位的反向互補序列)。
[0102]用于擴增P59啟動子的引物為:
[0103]Pro-F2:5，~AAGCTTGTTTACTCAGAAACCGAAAG~3，(下劃線部分為酶切位點 Hind III的識別序列，其后的序列為序列41的第1-20位)；
[0104]Pro-R:5’ -GGATCCAGCGCGAAAAGAAACACA-3’ (下劃線部分為酶切位點 BamH I 的識別序列，其后的序列為序列41的后18位的反向互補序列)。
[0105]將以上擴增得到的3組PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步鑒定正確后膠回收，采用限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。
[0106]對所得重組質(zhì)粒進(jìn)行Hind III和BamH I雙酶切鑒定，將初步鑒定正確的重組質(zhì)粒送樣測序。將經(jīng)測序鑒定表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入序列39所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為YY96-Pro58，其中序列39即為P58啟動子的序列。將經(jīng)測序鑒定表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入序列40所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為YY96-Pro64，其中序列40即為P64啟動子的序列。將經(jīng)測序鑒定表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入序列41所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為YY96-Pro59，其中序列41即為P59啟動子的序列。
[0107]2、YY96-Pro58-1nt58、YY96-Pro64_int64、YY96-Pro59-1nt59 的構(gòu)建
[0108]以粘果酸漿(Phys alis philadelphica) P58、P64和P64的基因組為模版，擴增它們各自的內(nèi)源啟動子序列。
[0109]擴增P58啟動子的引物為:
[0110]P58-FI:5，-AAGCTTGTTTACTCAGAAAGCGAAAG-3，(下劃線部分為酶切位點 Hind III的識別序列，其后的序列為序列39的第1-20位)；
[0111]P58-RI:5，-GAGCTCCATATGAGCGCGAAAAGAAACACA-3，(下劃線部分為酶切位點 SacI和NdeI的識別序列，其后的序列為序列39的第2455-2472位的反向互補序列)。
[0112]擴增P64啟動子的引物為:
[0113]P64-F1:5’ -AAGCTTGTTTACTCAGAAAGCGAAAGC-3，(下劃線部分為酶切位點 Hind III的識別序列，其后的序列為序列40的第1-21位)；
[0114]P64-RI:5，-GAGCTCCATATGAGCGCGAAAAGAAACACA-3，(下劃線部分為酶切位點 SacI和NdeI的識別序列，其后的序列為序列40的第2402-2419位的反向互補序列)。
[0115]擴增P59啟動子的引物為:
[0116]P59-FI:5，-AAGCTTGTTTACTCAGAAACCGAAAG-3，(下劃線部分為酶切位點 Hind III的識別序列，其后的序列為序列41的第1-20位)；
[0117]P59-RI: 5，-GAGCTCCATATGAGCGCGAAAAGAAACACAAAAGCTCAC-3，(下劃線部分為酶切位點SacI和NdeI的識別序列，其后的序列為序列41的第2424-2450位的反向互補序列)。
[0118]將以上擴增得到的3組PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步鑒定正確后膠回收，分別于PGEM-T Easy載體(Promega)相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明連入“AAGCTT+序列39+CATATGGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM_Pro58。將經(jīng)測序表明連入“AAGCTT+序列40+CATATGGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM_Pro64。將經(jīng)測序表明連入“AAGCTT+序列41+CATATGGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM_Pro59。
[0119]再以粘果酸漿(Physalis philadelphica) P58、P64和P64的基因組為模版，擴增它們各自的POSl基因第一個內(nèi)含子序列。
[0120]擴增P58的POSl基因的第一個內(nèi)含子序列的引物為:
[0121]I58-F:5，-CATATGGTACTGAAACTTTCTTAG-3，(下劃線部分為酶切位點 Nde I 的識別序列，其后的序列為序列2的第1-18位)；
[0122]I58-R:5’ -GAGCTCGGATCCCTTCATGAATGAGAAG-3> (下劃線部分為酶切位點 SacI 和BamHI的識別序列，其后的序列為序列2的第140-155位的反向互補序列)。
[0123]擴增P64的POSl基因的第一個內(nèi)含子序列的引物為:
[0124]I64-F:5’ -CATATGGTACTGAAACTTTCTTAGA-3’ (下劃線部分為酶切位點 Nde I 的識別序列，其后的序列為序列12的第1-19位)；
[0125]I64-R:5，-GAGCTCGGATCCCTTCATGAATGAGAAGA-3，(下劃線部分為酶切位點 SacI 和BamHI的識別序列，其后的序列為序列12的第189-205位的反向互補序列)。
[0126]擴增P59的POSl基因的第一個內(nèi)含子序列的引物為:
[0127]I59-F:5，-CATATGGTACTGAAGCTGTCTTAG-3，(下劃線部分為酶切位點 Nde I 的識別序列，其后的序列為序列12的第1-18位)；
[0128]I59-R:5? -GAGCTCGGATCCCTGCATGAGCGAGAAGAA-3> (下劃線部分為酶切位點 SacI和BamHI的識別序列，其后的序`列為序列12的第407-424位的反向互補序列)。
[0129]將以上擴增得到的3組PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，初步鑒定正確后膠回收，分別于PGEM-T Easy載體(Promega)相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明連入“CATATG+序列39+GGATCCGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM_int58。將經(jīng)測序表明連入“CATATG+序列40+GGATCCGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM_int64。將經(jīng)測序表明連入“CATATG+序列41+GGATCCGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM_int59。
[0130]用限制性內(nèi)切酶Nde I和SacI酶切pGEM_int58，回收大小約為155bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的pGEM-Pro58載體骨架片段相連，得到中間質(zhì)粒I ;再用Hind III和BamH I酶切中間質(zhì)粒1，回收大小約為2633bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切初步鑒定正確(大小約為7800bp和2633bp的兩個條帶)的重組質(zhì)粒送樣測序，將測序表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入了 “序列39+CATATG+序列2”所示DNA片段后的重組質(zhì)粒命名為 YY96-Pro58-1nt58。
[0131]用限制性內(nèi)切酶Nde I和SacI酶切pGEM_int64，回收大小約為205bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的pGEM-Pro64載體骨架片段相連，得到中間質(zhì)粒2 ;再用Hind III和BamH I酶切中間質(zhì)粒2，回收大小約為2630bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切初步鑒定正確(大小約為7800bp和2630bp的兩個條帶)的重組質(zhì)粒送樣測序，將測序表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入了“序列40+CATATG+序列12”所示DNA片段后的重組質(zhì)粒命名為 YY96-Pro64-1nt64。
[0132]用限制性內(nèi)切酶Nde I和SacI酶切pGEM_int59，回收大小約為205bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的pGEM-Pro59載體骨架片段相連，得到中間質(zhì)粒3 ;再用Hind III和BamH I酶切中間質(zhì)粒3，回收大小約為2880bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切初步鑒定正確(大小約為7800bp和2880bp的兩個條帶)的重組質(zhì)粒送樣測序，將測序表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入了“序列41+CATATG+序列28”所示DNA片段后的重組質(zhì)粒命名為 YY96-Pro59-1nt59。 [0133]二、POSl基因第一個內(nèi)含子對目的基因表達(dá)調(diào)控作用的研究
[0134]1、洋酸漿原生質(zhì)體的制備
[0135](I)以洋酸衆(zhòng)(Physalis floridana) P106為實驗材料,選取新葉5片,將其切成Imm左右寬的長條形,置于IOml酶液中消化3h。
[0136]酶液的配制(IOml):取Iml濃度為0.2M的MES水溶液，5ml濃度為0.8M的mannitol水溶液，Iml濃度為0.2M的KCl水溶液，2.9ml H2O,混合后于70°C 5min ;加入
0.15g 纖維素酶(MANUFACTURER, 110315-01),0.04g 離析酶(MANUFACTURER, 110105-01)，混合后于55°C IOmin,冰上至室溫；加入100 μ L濃度為IM的CaCl2水溶液，以及0.01g的BSA，
得到酶液。
[0137](2)反應(yīng)液在200目尼龍篩中過濾,濾液置于50ml離心管中，100g離心2min。
[0138](3)去上清，用20ml預(yù)冷的W5溶液(配方:溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:NaCl0.154M，CaCl2125mM, KC15mM, MES2mM ;各濃度均為相應(yīng)物質(zhì)在溶液中的終濃度)重懸，100g 離心 2min。
[0139](4)去上清,用20ml預(yù)冷的W5溶液(配方同上)重懸,冰上30min, 100g離心2min。沉淀即為原生質(zhì)體。
[0140](5)用Iml MMG溶液(配方:溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度如下:0.4M mannitol，15mMMgCl2,4mM MES ;各濃度均為相應(yīng)物質(zhì)在溶液中的終濃度)重懸原生質(zhì)體。
[0141]2、洋酸漿原生質(zhì)的轉(zhuǎn)化
[0142](I)在330yL原生質(zhì)體中加入5yg LUC載體和5 μ g35S:⑶S載體，輕柔混勻，防破碎。其中，要轉(zhuǎn)化的LUC載體為如下任一:步驟一構(gòu)建的YY96-Pro58、YY96_Pro64、YY96-Pro59、YY96-Pro58_int58、YY96-Pro64_int64、YY96-Pro59_int59。
[0143](2)加入 350yL PEG 溶液(配方:4g PEG4000+3ml H20+2.5ml 濃度為(λ 8M 的mannitol水溶液+Iml濃度為IM的CaCl2水溶液)，混勻，23°C孵育lOmin。
[0144](3)加入Iml W5溶液(配方同上)，100g離心lmin。
[0145](4)去上清,加入Iml W5溶液(配方同上)重懸，100g, lmin。
[0146](5)去上清，加入0.5ml W5溶液(配方同上)重懸，23°C，避光孵育20h。完成原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化。
[0147]3、報告基因的瞬時表達(dá)分析
[0148](I)將步驟2轉(zhuǎn)化好的原生質(zhì)體溶液離心，200g離心3min。
[0149](2)加100 μ LI XCCLR (Promega公司直接購買，目錄號Ε152Α)重懸，1000g離心2min,取上清冰浴。
[0150](3) LUC測定:取5μ L步驟(2)所得上清液加入到45μ L LUC Assay Buffer(Promega,產(chǎn)品目錄號為 E152A)中，利用 GloMax20/20_luminometer (Promega)測量 LUC活性。[0151](4) GUS測定:取5 μ L步驟(2)所得所得上清液加入到45 μ L MUG Mix (INALCO,1758-1630)，37 V孵育60min,再加入到950 μ L濃度為0.2Μ的Na2CO3水溶液中，利用GloMax20/20-fluorometer (Promega)測量 GUS 突光。
[0152](5)報告基因LUC的相對表達(dá)水平=LUC/⑶S。
[0153]實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0154]結(jié)果如圖1所示，僅將P58啟動子、P64啟動子和P59啟動子連接上熒光素酶基因(LUC)，它們在啟動LUC表達(dá)上作用無明顯差異。但是，當(dāng)它們分別連上各自的第一個內(nèi)含子后(P58含有I個37bp重復(fù)序列；P64含有2個37bp重復(fù)序列；P59含有3個37bp重復(fù)序列)，P58組中LUC的表達(dá)最高，P64組次之，P59組最低。
[0155]實施例3、P0S1基因第一個內(nèi)含子中37bp調(diào)控序列對目的基因表達(dá)調(diào)控作用的研
究
[0156]本實施例中，發(fā)明人又設(shè)計實驗，只用P58啟動子(序列39)，在其后不斷地添加37bp重復(fù)序列的數(shù)目(1-6個)。結(jié)果顯示，添加I個37bp重復(fù)序列對LUC的啟動效果最強；加2個37bp重復(fù)序列次之；加3個37bp重復(fù)序列啟動效果更低；當(dāng)加上4_6個37bp重復(fù)序列后，作用消失。具體如下:
[0157]—、重組表達(dá)載體的構(gòu)建
[0158]1、含有一個37bp重復(fù)序列的載體構(gòu)建
[0159]以P58的基因組為模板，擴增POSl基因第一個內(nèi)含子中的37bp重復(fù)序列。引物為:
[0160]R-Fl:5’-CATATGG TACTGAAAC-3’ (下劃線部分為酶切位點Nde I的識別序列，其后的序列為序列2的第1-10位)；
[0161]R-Rl:5，-GAGCTCGGATCCAAAGACGGAA-3，(下劃線部分為酶切位點 SacI 和 BamHI 的識別序列，其后的序列為序列2的第28-37位的反向互補序列)。
[0162]將以上擴增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，初步鑒定后切膠回收，與pGEM-TEasy載體(Promega)相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明連入“CATATG+序列2的第1-37位+GGATCCGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM_R(58)。
[0163]用限制性內(nèi)切酶Nde I和SacI酶切pGEM_R(58)，回收大小約為55bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的pGEM-Pix)58載體(見實施例2步驟一 2)骨架片段相連，得到中間質(zhì)粒4 ;再用HindIII和BamH I酶切中間質(zhì)粒4，回收大小約為2515bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切初步鑒定正確(大小約為7800bp和2515bp的兩個條帶)的重組質(zhì)粒送樣測序，將測序表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入了 “序列39+CATATG+序列2的第1_37位”所示DNA片段后的重組質(zhì)粒命名為YY96-Pro58-R(58)。
[0164]2、含有2個37bp重復(fù)序列的載體構(gòu)建
[0165]以重組質(zhì)粒YY96-Pro58_R(58)為模板，采用如下引物進(jìn)行PCR擴增:
[0166]R-Fl:5’-CATATGGTACTGAAAC_3’ (下劃線部分為酶切位點Nde I的識別序列，其后的序列為序列2的第1-10位)；
[0167]R-R2:5’ -GAGCTCGGATCCAAAGACGGAACTGCTGACTCTAAGAAAGTTTCAGTACAAAGACGGAA-3’(下劃線部分為酶切位點SacI和BamHI )。[0168]將以上擴增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，初步鑒定后切膠回收，與pGEM-TEasy載體(Promega)相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明連入“ CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+GGATCCGAGCTC”所示DNA片段的重鉬質(zhì)粒命名為pGEM-R(58)-R(58)。
[0169]用限制性內(nèi)切酶Nde I和SacI酶切pGEM_R(58)-R(58)，回收大小約為92bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的pGEM-Pro58載體(見實施例2步驟一 2)骨架片段相連，得到中間質(zhì)粒5 ;再用HindIII和BamH I酶切中間質(zhì)粒5，回收大小約為2552bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切初步鑒定正確(大小約為7800bp和2552bp的兩個條帶)的重組質(zhì)粒送樣測序，將測序表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入了“序列39+CATATG+序列2的第1_37位+序列2的第1-37位”所示DNA片段后的重組質(zhì)粒命名為YY96-Pro58-R(58) -R (58)。
[0170]3、含有3個37bp重復(fù)序列的載體構(gòu)建
[0171]以重組質(zhì)粒YY96-Pro58_R(58)為模板，采用如下引物進(jìn)行PCR擴增:
[0172]R-F2: 5，~CATATGGTACTGAAACTTTCTTAGAGTCAGCAGTTCCGTCTTTGTACTGAAAC~3，(下劃線部分為酶切位點Nde I);
[0173]R-R2: 5，-GAGCTCGGATCCAAAGACGGAACTGCTGACTCTAAGAAAGTTTCAGTACAAAGACGGAA-3’(下劃線部分為酶切位點SacI和BamHI )。
[0174]將以上擴增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，初步鑒定后切膠回收，與pGEM-TEasy載體(Promega)相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明連入“CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1_37位+GGATCCGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為 pGEM-R (58) -R (58) -R (58)。
[0175]用限制性內(nèi)切酶Nde I和Sac I酶切pGEM-R (58) -R (58) -R (58)，回收大小約為129bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的pGEM-Pro58載體(見實施例2步驟一 2)骨架片段相連，得到中間質(zhì)粒6 ;再用Hind III和BamH I酶切中間質(zhì)粒6，回收大小約為2589bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切初步鑒定正確(大小約為7800bp和2589bp的兩個條帶)的重組質(zhì)粒送樣測序，將測序表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入了“序列39+CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1_37位”所不DNA片段后的重組質(zhì)粒命名為 YY96-Pro58-R (58) -R (58) -R (58)。
[0176]4、含有4個37bp重復(fù)序列的載體構(gòu)建
[0177]以重組質(zhì)粒YY96-Pro58-R(58)_R(58)為模板，采用如下引物進(jìn)行PCR擴增:
[0178]R-F2: 5，~CATATGGTACTGAAACTTTCTTAGAGTCAGCAGTTCCGTCTTTGTACTGAAAC~3，(下劃線部分為酶切位點Nde I);
[0179]R-R2: 5，-GAGCTCGGATCCAAAGACGGAACTGCTGACTCTAAGAAAGTTTCAGTACAAAGACGGAA-3’(下劃線部分為酶切位點SacI和BamHI )。
[0180]將以上擴增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，初步鑒定后切膠回收，與pGEM-TEasy載體(Promega)相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明連入“CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1_37位+序列2的第1_37位+GGATCCGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM-R(58) -R(58) -R(58) -R(58)。[0181]用限制性內(nèi)切酶Nde I和SacI酶切pGEM-R (58)-R (58)-R (58)-R (58)，回收大小約為166bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的pGEM-Pro58載體(見實施例2步驟一 2)骨架片段相連，得到中間質(zhì)粒7 ;再用Hind III和BamH I酶切中間質(zhì)粒7，回收大小約為2626bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切初步鑒定正確(大小約為7800bp和2626bp的兩個條帶)的重組質(zhì)粒送樣測序，將測序表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入了“序列39+CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1_37位+序列2的第1_37位”所示 DNA 片段后的重組質(zhì)粒命名為 YY96-Pro58-R (58) -R (58) -R (58) -R (58)。
[0182]5、含有5個37bp重復(fù)序列的載體構(gòu)建
[0183]以重組質(zhì)粒YY96-Pro58-R (58) -R (58) -R (58)為模板，采用如下引物進(jìn)行PCR擴增:
[0184]R-F2: 5，~CATATGGTACTGAAACTTTCTTAGAGTCAGCAGTTCCGTCTTTGTACTGAAAC~3，(下劃線部分為酶切位點Nde I);
[0185]R-R2:5’ -GAGCTCGGATCCAAAGACGGAACTGCTGACTCTAAGAAAGTTTCAGTACAAAGACGGAA-3’(下劃線部分為酶切位點SacI和BamHI )。
[0186]將以上擴增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，初步鑒定后切膠回收，與pGEM-TEasy載體(Promega)相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明連入“CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1_37位+序列2的第1_37位+序列2的第1-37 位 +GGATCCGAGCTC”所示 DNA 片段的重組質(zhì)粒命名為 pGEM-R(58)-R(58)-R(58)-R(58)-R(58)。
[0187]用限制性內(nèi)切酶Nde I 和 Sac I 酶切 pGEM-R (58)-R (58)-R (58)-R (58)-R (58)，回收大小約為203bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的pGEM-Pro58載體(見實施例2步驟一
2)骨架片段相連，得到中間質(zhì)粒8 ;再用Hind III和BamH I酶切中間質(zhì)粒8，回收大小約為2663bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切初步鑒定正確(大小約為7800bp和2663bp的兩個條帶)的重組質(zhì)粒送樣測序，將測序表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入了 “序列39+CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位”所示DNA片段后的重組質(zhì)粒命名為YY96_Pro58-R(58)-R(58)-R (58)-R (58)-R (58)。
[0188]6、含有6個37bp重復(fù)序列的載體構(gòu)建
[0189]以重組質(zhì)粒YY96-Pro58-R(58) -R(58) -R(58) -R(58)為模板，采用如下引物進(jìn)行PCR擴增:
[0190]R-F2: 5，-CATATGGTACTGAAACTTTCTTAGAGTCAGCAGTTCCGTCTTTGTACTGAAAC-3，(下劃線部分為酶切位點Nde I);
[0191]R-R2:5’ -GAGCTCGGATCCAAAGACGGAACTGCTGACTCTAAGAAAGTTTCAGTACAAAGACGGAA-3’(下劃線部分為酶切位點SacI和BamHI )。
[0192]將以上擴增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，初步鑒定后切膠回收，與pGEM-TEasy載體(Promega)相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)測序表明連入“CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1_37位+序列2的第1_37位+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+GGATCCGAGCTC”所示DNA片段的重組質(zhì)粒命名為pGEM-R(58)-R (58) -R (58) -R (58) -R (58) -R (58)。
[0193]用限制性內(nèi)切酶Nde I 和 SacI 酶切 pGEM-R (58) -R (58) -R (58) -R (58) -R (58)-R(58)，回收大小約為240bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的pGEM-Pro58載體骨架片段相連，得到中間質(zhì)粒9 ;再用Hind III和BamH I酶切中間質(zhì)粒9，回收大小約為2700bp的目的條帶，與經(jīng)過同樣雙酶切的YY96載體的骨架大片段相連，得到重組質(zhì)粒。將經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切初步鑒定正確(大小約為7800bp和2700bp的兩個條帶)的重組質(zhì)粒送樣測序，將測序表明在YY96載體的酶切位點Hind III和BamH I之間插入了“序列39+CATATG+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位+序列2的第1_37位+序列2的第1_37位+序列2的第1-37位+序列2的第1-37位”所示DNA片段后的重組質(zhì)粒命名為YY96_Pro58-R(58) -R (58) -R (58) -R (58) -R (58) -R (58)。
[0194]二、POSl基因第一個內(nèi)含子中37bp調(diào)控序列對目的基因表達(dá)調(diào)控作用的研究
[0195]1、洋酸漿原生質(zhì)體的制備
[0196]同實施例2。
[0197]2、洋酸漿原生質(zhì)的轉(zhuǎn)化
[0198]參照實施例2相關(guān)步驟進(jìn)行，僅將其中要轉(zhuǎn)化的LUC載體替換為如下任一:實施例2步驟一構(gòu)建的YY96-Pro58，本實施例步驟一構(gòu)建的6個重組表達(dá)載體。
[0199]3、報告基因的瞬時 表達(dá)分析
[0200]參照實施例2相關(guān)步驟進(jìn)行，實驗重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。
[0201]結(jié)果如圖2所示,與不添加37bp重復(fù)序列僅用P58啟動子啟動LUC表達(dá)的對照組相比，添加I個37bp重復(fù)序列時對LUC表達(dá)的促進(jìn)效果最強；加2個37bp重復(fù)序列次之；加3個37bp重復(fù)序列時對LUC表達(dá)的促進(jìn)效果更低；當(dāng)加上4-6個37bp重復(fù)序列后，對LUC表達(dá)的促進(jìn)作用消失。
[0202]綜合實施例2和實施例3的結(jié)果，可見序列I所示的POSl基因第一內(nèi)含子序列中的37bp重復(fù)序列的不同數(shù)目對目的基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。
【權(quán)利要求】
1.DNA片段，為如下(a) - (C)中任一: (a)序列表中序列I所示的DNA片段； (b)序列表中序列I缺失第7-9位核苷酸中至少一個核苷酸后所形成的DNA片段； (c)與(a)或(b)限定的DNA片段具有90%以上同源性且功能相同的DNA片段。
2.DNA片段，為如下(I)或(2): (1)序列表中序列2-序列38所示的37個DNA片段中的任一個； (2)與(I)限定的DNA片段具有90%以上同源性且功能相同的DNA片段。
3.權(quán)利要求1或2所述DNA片段在調(diào)控目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
4.用于提高目的基因表達(dá)的表達(dá)盒，其特征在于:所述表達(dá)盒為如下(al)_(a4)中任 (al)自上游到下游依次包括:啟動子、I個權(quán)利要求1所述DNA片段、所述目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列； (a2)自上游到下游依次包括: 啟動子、2個權(quán)利要求1所述DNA片段、所述目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列； (a3)自上游到下游依次包括:啟動子、3個權(quán)利要求1所述DNA片段、所述目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列； (a4)自上游到下游依次包括:啟動子、權(quán)利要求2所述DNA片段、所述目的基因，以及轉(zhuǎn)錄終止序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)盒，其特征在于:所述啟動子為如下(cl)-(c4)中任一種: (cl)序列表中序列39所示的啟動子； (c2)序列表中序列40所示的啟動子； (c3)序列表中序列41所示的啟動子； (c4) 35S啟動子。
6.含有權(quán)利要求4或5所述表達(dá)盒的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
7.權(quán)利要求4或5所述表達(dá)盒或權(quán)利要求6所述的重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌，在提聞目的基因表達(dá)中的應(yīng)用。
8.一種培育目的基因表達(dá)量提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟: (bl)向目的植物中導(dǎo)入權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)盒，得到表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物； (b2)從步驟(bl)所得轉(zhuǎn)基因植物中得到所述目的基因的表達(dá)量高于對照的轉(zhuǎn)基因植物； 所述對照為向所述目的植物中導(dǎo)入如下表達(dá)盒后得到的表達(dá)所述目的基因的轉(zhuǎn)基因植物:與權(quán)利要求4或5所述的表達(dá)盒相比僅去除權(quán)利要求1或2所述DNA片段后所形成的表達(dá)盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于:在所述方法中，所述表達(dá)盒是通過含有所述表達(dá)盒的重組載體或重組菌導(dǎo)入所述目的植物中的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于:所述植物為酸漿屬植物。
【文檔編號】C12N1/15GK103725684SQ201410004958
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】賀超英, 王麗 申請人:中國科學(xué)院植物研究所