一種汞離子的快速檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種汞離子的快速檢測方法及檢測試劑盒。本發(fā)明將DNA支點介導的鏈置換反應技術與試紙條檢測技術相結合，建立一種用于快速可視化的汞離子檢測方法和檢測試劑盒。本發(fā)明的檢測方法可在室溫下完成整個反應過程，達到快速檢測的目的，對汞離子的檢測限為1nM，且具有很好的特異性，檢測結果直觀，肉眼可見，檢測過程方便，可用于汞離子的實地現(xiàn)場檢測。
【專利說明】一種汞離子的快速檢測方法及檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學【技術領域】，涉及一種DNA支點介導的鏈置換反應用于汞離子的快速檢測。
【背景技術】 [0002]汞離子(Hg2+)是一種具有嚴重生理毒性的重金屬離子，對人體危害嚴重，是環(huán)境監(jiān)測的重要指標。由于其具有持久性、易遷移性和高度的生物富集性，使其成為目前全球最引人關注的環(huán)境污染物之一。其主要毒性效應是導致貧血、神經(jīng)機能失調(diào)和腎損傷、生殖系統(tǒng)損傷等。美國環(huán)境保護署規(guī)定飲用水中汞離子的最大允許量不得超過ΙΟηΜ。目前己報道的檢測汞離子的方法主要有原子發(fā)射光譜、原子吸收光譜、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法等。然而這些方法通常需要昂貴的儀器以及復雜的操作，嚴重制約了這些方法的廣泛應用。因此，開發(fā)操作簡便、選擇性好、靈敏度高且成本低廉的汞離子檢測方法具有非常重要的意義。汞離子能夠與DNA中的胸腺嘧啶(thymine，T)特異性地結合，在DNA的T-T錯配中可形成 T-Hg2+-T 復合物(Tanaka, Y.；0da, S.;Yamaguchi, H.；Kondo, Y.；Kojima, C and Ono,A.J.Am.Chem.Soc.,2007,129，244-245)?；谶@一特點，有報道了熒光法、比色法、電化學方法以及電化學發(fā)光法用于汞離子的檢測。但是這些方法都需要使用檢測儀器來讀取檢測數(shù)據(jù)，難以用于實地現(xiàn)場快速檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了解決現(xiàn)有技術中所存在的不足，本發(fā)明旨在將DNA支點介導的鏈置換反應技術與試紙條檢測技術相結合，建立一種用于快速可視化的汞離子檢測方法和檢測試劑盒。
[0004]本發(fā)明所采取的技術方案是:
[0005]一種汞離子的快速檢測方法，包括如下步驟:
[0006]I)構建莖環(huán)結構DNA:所述莖環(huán)結構DNA的一端適當延伸，用作DNA支點，DNA支點中含有T堿基；
[0007]2)構建輔助DNA:所述輔助DNA的一端含有T堿基，在有汞離子存在時能與莖環(huán)結構DNA的DNA支點端通過形成T-Hg2+-T復合物互補，從而打開莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構；
[0008]3)將待檢樣品和圣環(huán)結構DNA、輔助DNA混合后，靜直反應，在有萊尚子存在時能與莖環(huán)結構DNA的DNA支點端通過形成T-Hg2+-T復合物互補，從而打開莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構；
[0009]4)通過檢測莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構是否被打開來判斷待檢樣品中是否含有汞離子。
[0010]作為優(yōu)選的，所述莖環(huán)結構DNA中，DNA支點的堿基數(shù)為5~10個堿基。
[0011]作為優(yōu)選的，所述DNA支點中含有I~5個T堿基。
[0012]作為優(yōu)選的，所述莖環(huán)結構DNA中，環(huán)狀區(qū)的堿基數(shù)為9~12，莖狀區(qū)的堿基數(shù)為18~21個,?狀區(qū)的堿基數(shù)比環(huán)狀區(qū)的堿基數(shù)多。[0013]在汞離子存在的情況下，所述輔助DNA與莖環(huán)結構DNA的DNA支點以及DNA支點一側的莖狀區(qū)互補。
[0014]所述方法的步驟4)可采用熒光法、電化學方法、比色法、電化學發(fā)光法或試紙條法來檢測莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構是否被打開。
[0015]作為優(yōu)選的，步驟4)采用試紙條法檢測莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構是否被打開，所述試紙條包括樣品墊、金標墊、含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜以及吸水紙；
[0016]所述金標墊上噴射有金標DNA探針I(yè)，所述金標DNA探針I(yè)與莖環(huán)結構DNA的環(huán)狀區(qū)互補；
[0017]所述檢測區(qū)上固定有DNA探針2，所述DNA探針2與莖環(huán)結構DNA的莖狀區(qū)互補；
[0018]所述質(zhì)控區(qū)上固定有DNA探針3,所述DNA探針3與DNA探針I(yè)互補。
[0019]一種汞離子快速檢測試劑盒，其包括:
[0020]1)莖環(huán)結構DNA:所述莖環(huán)結構DNA的一端適當延伸，用作DNA支點，DNA支點中含有T喊基；
[0021]2)輔助DNA:所述輔助DNA的一端含有T堿基，在有汞離子存在時能與莖環(huán)結構DNA的DNA支點端通過形成T-Hg2+-T復合物互補，從而打開莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構，形成部分互補的雙鏈DNA ；
[0022]3)檢測試紙條。
[0023]所述檢測試紙條包括樣品墊、金標墊、含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜以及吸水紙；
[0024]所述金標墊上噴射有金標DNA探針I(yè)，所述金標DNA探針I(yè)與莖環(huán)結構DNA的環(huán)狀區(qū)互補；
[0025]所述檢測區(qū)上固定有DNA探針2，所述DNA探針2與莖環(huán)結構DNA的莖狀區(qū)互補；
[0026]所述質(zhì)控區(qū)上固定有DNA探針3,所述DNA探針3與DNA探針I(yè)互補。
[0027]所述DNA探針2用鏈霉親和素與生物素修飾；所述DNA探針3用鏈霉親和素和生物素修飾。
[0028]下面舉例介紹一下本發(fā)明方法的技術原理:
[0029]如圖1所示，莖環(huán)結構DNA包含有4個功能區(qū)域，分別是1、2、3和2*區(qū)域，其中2和2*是互補的,構成莖環(huán)結構的莖狀區(qū)；3為莖環(huán)結構的環(huán)狀區(qū)；1區(qū)域可以作為DNA支點，用于啟動DNA鏈置換反應。在I區(qū)域中含有I~5個T堿基。
[0030]輔助DNA包含有2個區(qū)域(I*和2*)，其中在區(qū)域I*中也含有I~5個T堿基。在有Hg2+存在時，莖環(huán)結構DNA的DNA支點的I區(qū)域通過形成T-Hg2+-T復合物與輔助DNA的I*區(qū)域結合,從而開始介導DNA鏈置換反應，打開莖環(huán)結構,使輔助DNA的2*區(qū)域和莖環(huán)結構DNA的2區(qū)域結合，形成更長的部分互補的雙鏈DNA (I*和I互補，2*和2互補)。此時,莖環(huán)結構DNA被打開，形成部分雙鏈DNA結構,而且莖環(huán)結構DNA的3區(qū)域和2*區(qū)域被暴露在外?？刹捎脽晒夥?、電化學方法、比色法、電化學發(fā)光法或試紙條法來檢測莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構是否被打開，下面介紹其中的試紙條法。
[0031]如圖2所示，檢測試紙條包含4個部分:樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，這四個部分從左到右依次固定于膠板上。DNA探針I(yè)(DNAprobel)用巰基(-SH)修飾，固定在金納米顆粒(AuNPs)上，形成的AuNPs-DNA probel復合物噴射在金標墊上。硝酸纖維素膜上劃有兩個檢測區(qū)域:檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，其中檢測區(qū)固定的是鏈霉親和素(SA)-生物素(biotin)-DNA探針2 (SA-biotin-DNAprobe2)，質(zhì)控區(qū)固定的是鏈霉親和素(SA)-生物素(biotin) -DNA 探針 3 (SA-biotin-DNA probe3)。其中 DNA 探針 I 的 3* IX域與上述部分雙鏈DNA的3區(qū)域是互補的:DNA探針2的2區(qū)域與h沭部分雙鏈DNA的2*區(qū)域是互補的；DNA探針3與DNA探針I(yè)互補。
[0032]將部分雙鏈DNA滴于試紙條的樣品墊上，通過毛細管遷移作用向前移動，經(jīng)過金標墊時，部分雙鏈DNA的3區(qū)域與DNA probel的3*區(qū)域雜交，形成復合物。該復合物繼續(xù)往前移動，通過檢測區(qū)時，部分雙鏈DNA的2*區(qū)域會與固定在檢測區(qū)的SA-biotin-DNApr0be2相互作用，從而抓住該復合物，使其在檢測區(qū)聚集。聚集的金納米顆粒形成肉眼可見的紅色區(qū)域。過量的AuNPs-DNAprobel復合物會與質(zhì)控區(qū)上的DNA探針3雜交，在質(zhì)控區(qū)聚集，從而質(zhì)控區(qū)也呈紅色。也就是說有汞離子存在時候，檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)都顯示紅色。當沒有汞離子存在時，莖環(huán)結構DNA和輔助DNA不會相互作用，無法啟動DNA支點介導的鏈置換反應，因而沒有部分互補的雙鏈DNA形成，莖環(huán)結構DNA的2*區(qū)域沒有暴露出來，無法被檢測區(qū)的DNA探針2捕獲，從而檢測區(qū)沒有紅色出現(xiàn)，而質(zhì)控區(qū)始終顯示紅色，表明組裝的試紙條可用。
[0033]本發(fā)明的有益效果是:
[0034](I)本發(fā)明的檢測方法具有較高的靈敏度，對汞離子的檢測限為InM，檢測結果直觀，肉眼可見，檢測過程方便，可用于汞離子的實地現(xiàn)場檢測；
[0035](2)本發(fā)明所述的汞離子檢測方法具有很好的特異性，常見的其他金屬離子對檢測不產(chǎn)生影響；
[0036](3)本發(fā)明的檢測方法，可在室溫下完成整個反應過程，達到快速檢測的目的；試紙條使用起來省時、省力，檢測速度快`且操作簡單方便，不需要使用任何儀器，不需要專業(yè)的技術人員，無須培訓即可推廣使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為DNA支點介導的鏈置換反應示意圖；
[0038]圖2為試紙條檢測示意圖；
[0039]圖3為對不同濃度的汞離子檢測的結果圖；
[0040]圖4為特異性實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0041]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0042]實施例1
[0043]一種基于DNA支點介導的鏈置換反的汞離子快速檢測試劑盒的構建
[0044]一、莖環(huán)結構DNA與輔助DNA的設計
[0045]莖環(huán)結構DNA的序列如SEQ ID NO:1所示,其結構如下:
[0046]AGTCTAGGATTCGGCGTG GGTTAAGACACA CACGCCGAATCCTAGACT
[0047]2*3 2[0048]ACTTTTCG
[0049]I
[0050]其中，其中2和2*是互補的，構成莖環(huán)結構的莖狀區(qū)；3為莖環(huán)結構的環(huán)狀區(qū)；1區(qū)域可以作為DNA支點，用于啟動DNA鏈置換反應。
[0051]輔助DNA的序列如SEQ ID NO:2所示，結構如下:
[0052]CGTTAAGT AGTCTAGGATTCGGCGTG
[0053]I*2*
[0054]輔助DNA的I*區(qū)域通過形成T-Hg2+-T復合物與莖環(huán)結構DNA的DNA支點I區(qū)域結合，從而開始介導DNA鏈置換反應，打開莖環(huán)結構，使輔助DNA的2*區(qū)域和莖環(huán)結構DNA的2區(qū)域結合，形成更長的部分互補的雙鏈DNA。
[0055]二、試紙條的設計及組裝
[0056]下面試紙條所用到的DNA探針的序列如表1所示。
[0057]表1
[0058]
【權利要求】
1.一種汞離子的快速檢測方法，包括如下步驟: 1)構建莖環(huán)結構DNA:所述莖環(huán)結構DNA的一端適當延伸，用作DNA支點，DNA支點中含有T喊基； 2)構建輔助DNA:所述輔助DNA的一端含有T堿基，在有汞離子存在時能與莖環(huán)結構DNA的DNA支點端通過形成T-Hg2+-T復合物互補，從而打開莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構； 3)將待檢樣品和莖環(huán)結構DNA、輔助DNA混合后，靜置反應，在有汞離子存在時能與莖環(huán)結構DNA的DNA支點端通過形成T-Hg2+-T復合物互補，從而打開莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構； 4)通過檢測莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構是否被打開來判斷待檢樣品中是否含有汞離子。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述莖環(huán)結構DNA中，DNA支點的堿基數(shù)為5~10個堿基。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，所述DNA支點中含有I~5個T喊基。
4.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述莖環(huán)結構DNA中，環(huán)狀區(qū)的堿基數(shù)為9~12,?狀區(qū) 的堿基數(shù)為18~21個,?狀區(qū)的堿基數(shù)比環(huán)狀區(qū)的堿基數(shù)多。
5.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，在汞離子存在的情況下，所述輔助DNA與莖環(huán)結構DNA的DNA支點以及DNA支點一側的莖狀區(qū)互補。
6.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，步驟4)可采用熒光法、電化學方法、比色法、電化學發(fā)光法或試紙條法來檢測莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構是否被打開。
7.根據(jù)權利要求1或6所述的檢測方法，其特征在于，步驟4)采用試紙條法檢測莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構是否被打開，所述試紙條包括樣品墊、金標墊、含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜以及吸水紙； 所述金標墊上噴射有金標DNA探針I(yè)，所述金標DNA探針I(yè)與莖環(huán)結構DNA的環(huán)狀區(qū)互補； 所述檢測區(qū)上固定有DNA探針2，所述DNA探針2與莖環(huán)結構DNA的莖狀區(qū)互補； 所述質(zhì)控區(qū)上固定有DNA探針3,所述DNA探針3與DNA探針I(yè)互補。
8.一種汞離子快速檢測試劑盒，其包括: 1)莖環(huán)結構DNA:所述莖環(huán)結構DNA的一端適當延伸，用作DNA支點，DNA支點中含有T堿基； 2)輔助DNA:所述輔助DNA的一端含有T堿基，在有汞離子存在時能與莖環(huán)結構DNA的DNA支點端通過形成T-Hg2+-T復合物互補，從而打開莖環(huán)結構DNA的莖環(huán)結構，形成部分互補的雙鏈DNA ； 3)檢測試紙條。
9.根據(jù)權利要求8所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述檢測試紙條包括樣品墊、金標墊、含有檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的硝酸纖維素膜以及吸水紙； 所述金標墊上噴射有金標DNA探針I(yè)，所述金標DNA探針I(yè)與莖環(huán)結構DNA的環(huán)狀區(qū)互補； 所述檢測區(qū)上固定有DNA探針2，所述DNA探針2與莖環(huán)結構DNA的莖狀區(qū)互補；所述質(zhì)控區(qū)上固定有DNA探針3,所述DNA探針3與DNA探針I(yè)互補。
10.根據(jù)權利要求8所述的快速檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA探針2用鏈霉親和素與生物素 修飾；所述DNA探針3用鏈霉親和素和生物素修飾。
【文檔編號】C12Q1/68GK103773855SQ201410005084
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月2日 優(yōu)先權日:2014年1月2日
【發(fā)明者】陳俊華, 周順桂, 溫俊林 申請人:廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所