一種提高谷氨酸脫羧酶重組工程菌表觀催化活力的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種提高谷氨酸脫羧酶重組工程菌表觀催化活力的方法，包括：將谷氨酸脫羧酶重組工程菌接種至培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，獲得種子液；將種子液接種至培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑的同時(shí)向培養(yǎng)基中加入細(xì)胞壁合成抑制劑或者表面活性劑來(lái)干擾重組菌細(xì)胞壁或（和）細(xì)胞膜的合成，達(dá)到增強(qiáng)菌體通透性、提高菌體表觀催化活力的目的；誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體，即得到表觀催化活力提高的谷氨酸脫羧酶重組工程菌。本發(fā)明避免了常規(guī)菌體培養(yǎng)后再進(jìn)行透性化處理所需的多步工藝步驟，為改善高谷氨酸脫羧酶重組工程菌表觀催化活力提供一種簡(jiǎn)便、高效和低成本的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種提高谷氨酸脫羧酶重組工程菌表觀催化活力的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種提高谷氨酸脫羧酶重組工程菌表觀催化活力的方法。
技術(shù)背景
[0002]Y-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、利尿、抗驚厥、預(yù)防癲癇、改善睡眠、抗抑郁、促進(jìn)激素分泌和保肝利腎等多種生理功能。此外，GABA可作為前體物質(zhì)用于合成生物可降解材料聚酰胺-4和環(huán)境有好的塑料溶劑N-吡咯烷酮等化工產(chǎn)品。因此，GABA在食品、醫(yī)藥和化工領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]制備GABA的方法主要是化學(xué)合成法和生物合成法兩大類(lèi)，其中生物合成法又包括植物富集法和微生物發(fā)酵法兩種。生物法合成GABA是利用生物體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD)作為催化劑,將L-谷氨酸或鈉鹽α-脫羧生成GABA?；瘜W(xué)合成法普遍受到反應(yīng)條件苛刻、原料成本高和產(chǎn)品安全性問(wèn)題的制約。生物法制備GABA具有原料來(lái)源豐富、過(guò)程簡(jiǎn)單、轉(zhuǎn)化效率高，條件溫和以及環(huán)境友好優(yōu)點(diǎn)，因而更具有商業(yè)化開(kāi)發(fā)前景。
[0004]微生物GAD是胞內(nèi)酶，需要經(jīng)過(guò)細(xì)胞破碎、提取與純化才能獲得高活力的GAD制劑。而在破胞、提取與純化過(guò)程中，都不避免的導(dǎo)致酶蛋白的損失，這無(wú)疑會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本的增加，同時(shí)提取與純化步驟復(fù)雜、耗費(fèi)巨大。利用微生物細(xì)胞制備GABA，可以省去提取和純化酶的冗長(zhǎng)工序和時(shí)間的耗費(fèi)，大大降低成本。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)篩選出許多具有GAD活性的菌株用于GABA的制備。但是如何有效提高細(xì)胞催化活力、降低生產(chǎn)成本仍然是工業(yè)化制備GABA所研究的熱點(diǎn)。通過(guò)基因工程技術(shù)，將GAD基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，可以有效提高菌體的催化活性。但是由于菌體細(xì)胞壁及細(xì)胞膜的屏障作用限制了底物及產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外的交換，使菌體胞內(nèi)的GAD活力難以充分發(fā)揮，嚴(yán)重了影響了工程菌的表觀催化活力，使底物轉(zhuǎn)化速率降低。因此，有效改善細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對(duì)底物的傳質(zhì)阻力來(lái)提高GAD工程菌的表觀催化活力對(duì)于制備GABA具有重要意義。
[0005]細(xì)胞透性化技術(shù)(cell permeabilization)可以在不造成細(xì)胞裂解以及不破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的情況下改善細(xì)胞的通透性，使得小分子物質(zhì)和一些較大分子物質(zhì)能夠自由地進(jìn)出細(xì)胞，從而提高菌體的表觀催化活力。將培養(yǎng)好的細(xì)胞用有機(jī)溶劑或者表面活性劑等透性化試劑或者超聲、凍融等物理方法進(jìn)行處理，雖然可以有效提高菌體表觀催化活力，但是對(duì)培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行處理，無(wú)疑會(huì)增加多步工藝步驟，增加生產(chǎn)成本，對(duì)于規(guī)?；a(chǎn)尤為不利。例如利有機(jī)溶劑對(duì)培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行透性化處理的典型步驟包括，菌體收集，菌體清洗，透性化試劑處理，透性化試劑的去除和菌體回收等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供了一種提高谷氨酸脫羧酶重組工程菌表觀催化活力的方法，實(shí)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶工程菌培養(yǎng)與透性化處理過(guò)程的耦合，避免了常規(guī)菌體培養(yǎng)后在進(jìn)行透性化處理的多步工藝步驟，為改善高谷氨酸脫羧酶重組工程菌表觀催化活力提供一種簡(jiǎn)便和低投入方法。
[0007]—種提高谷氨酸脫羧酶重組工程菌表觀催化活力的方法，包括:
[0008](I)將谷氨酸脫羧酶重組工程菌接種至培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，獲得種子液；
[0009](2)將種子液接種至培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD為0.6~0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑的同時(shí)向培養(yǎng)基中加入細(xì)胞壁合成抑制劑或者表面活性劑；
[0010]其中，所述的谷氨酸脫羧酶工程菌包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的谷氨酸脫羧酶基因，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌；
[0011](3)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體，即得到表觀催化活力提高的谷氨酸脫羧酶重組工程菌。
[0012]本發(fā)明將谷氨酸脫羧酶工程菌培養(yǎng)與透性化處理過(guò)程相耦合，在谷氨酸脫羧酶重組工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中加入細(xì)胞壁合成抑制劑或者表面活性劑，干擾細(xì)胞壁的合成，改善菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對(duì)催化反應(yīng)中底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)限制，另外，細(xì)胞壁合成抑制劑或者表面活性劑與誘導(dǎo)劑的加入時(shí)間相同:菌液的OD為0.6~0.8，此時(shí)，細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)菌最活躍，生長(zhǎng)旺盛且繁殖速度快，可達(dá)到較好的處理效果，且此時(shí)細(xì)菌對(duì)外界環(huán)境的敏感程度低，可降低表達(dá)產(chǎn)物、細(xì)胞壁合成抑制劑或者表面活性劑對(duì)細(xì)胞的傷害作用，避免細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)停滯。
[0013]所述的谷氨酸脫羧酶工程菌通過(guò)常規(guī)的基因工程技術(shù)得到，一般先將谷氨酸脫羧酶基因連入表達(dá)載體，構(gòu)建得到重組表達(dá)載體，再將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中。其中，表達(dá)載體可以為pET-28a、pET-29、pET-30、pET-34等非氨芐青霉素抗性的表達(dá)載體。
[0014]本申請(qǐng)中，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌，具體可以為(E.coli) BL21、大腸桿菌(E.coli) BLR、大腸桿菌(E.col`i) Origam1、大腸桿菌(E.coli) NovaBlue 或大腸桿菌(E.coli) Rosetta 等。
[0015]所述的谷氨酸脫羧酶基因具體可源自短乳桿菌(Lactobacillus brevis),乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis),唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)和大腸桿菌等。
[0016]在谷氨酸脫羧酶重組工程菌誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中的某些培養(yǎng)條件可參照常規(guī)的選擇，如所述種子液的接種量為I~2% ;步驟(1)和(2)中，所述振蕩培養(yǎng)的溫度為35~38°C，轉(zhuǎn)速為200-220rpm ;步驟(1)中，振蕩培養(yǎng)的時(shí)間為12~16小時(shí)。
[0017]所述的誘導(dǎo)劑根據(jù)重組載體上的啟動(dòng)子相應(yīng)的選擇。
[0018]所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為20~30°C，轉(zhuǎn)速為100~150rpm，時(shí)間為6~12h，優(yōu)選的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為150rpm，時(shí)間為6h。
[0019]所述的細(xì)胞壁合成抑制劑具體可以為氨芐青霉素。
[0020]所述的表面活性劑具體可以為十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)。
[0021]所述細(xì)胞壁合成抑制劑或者細(xì)胞壁干擾劑的終濃度為I~10μ g/ml，優(yōu)選為2~10 μ g/ml。適宜劑量的細(xì)胞壁合成抑制劑或者表面活性劑可達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)效果，終濃度過(guò)低，達(dá)不到透性化改造的目的，終濃度過(guò)高則可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或生長(zhǎng)停滯。其中，氨芐青霉素的終濃度為2~7 μ g/ml, CTAB的終濃度為3~10 μ g/ml ;優(yōu)選的，氨芐青霉素的終濃度為3~5 μ g/ml, CTAB的終濃度為5~10 μ g/ml,。[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0023]( 1)本發(fā)明通過(guò)在GAD重組工程菌培養(yǎng)過(guò)程中加入細(xì)胞壁合成抑制劑或者干擾劑來(lái)提高重組谷氨酸脫羧酶工程菌細(xì)胞被膜的通透性，實(shí)現(xiàn)谷氨酸脫羧酶工程菌培養(yǎng)與透性化處理的耦合，可以在不需要對(duì)培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)透性化處理的情況下減小菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜對(duì)底物和產(chǎn)物的傳質(zhì)限制，充分發(fā)揮菌體細(xì)胞內(nèi)GAD的催化活力，提高工程菌的表觀GAD催化活力。本發(fā)明可避免后續(xù)透性化處理細(xì)胞的步驟及相關(guān)設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)的投入，為制備高GAD活性的菌體催化劑提供了一個(gè)簡(jiǎn)便方法。
[0024](2) GAD重組工程菌在提高透性的同時(shí)，由于細(xì)胞整體結(jié)構(gòu)完整，對(duì)胞內(nèi)酶具有較好的保護(hù)作用，不僅可以充分發(fā)揮酶的催化活力，還延長(zhǎng)了酶的使用壽命。此外，透性化GAD細(xì)胞可以看作是一種不溶性GAD酶源，可以用已知的各種固定化對(duì)透性化GAD工程菌細(xì)胞進(jìn)行固定化，以適應(yīng)特定生產(chǎn)過(guò)程的需要。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。
[0026]菌種:E.coliBL21(DE3)/pET28a_gadB表達(dá)重組大腸桿菌(可參見(jiàn)“Cloning, sequencing and expression of a glutamate decarboxylase gene from theGABA-producing strain Lactobacillus brevis CGMCC1306[J].ANNALS0F MICROBIOLOGY.2012，62(2): 689-698”)，該表達(dá)重組大腸桿菌包含有來(lái)自保藏編號(hào)為CGMCC N0.1306的短乳桿菌(Lactobacillus brevis)的谷氨酸脫羧酶基因(gadB)。
[0027]LB培養(yǎng)基:酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaC110g/L。
[0028]一個(gè)酶活力單位定義為在37°C條件下，Imin生成I μ mol GABA所需要的酶量(IU=Iymol GABA inlmin at37°C)。GAD的比活力定義為每毫克干重細(xì)胞所具備的酶活力單位(U.mg-lcells, dry weight)。
[0029]實(shí)施例1
[0030]從活化的LB固體培養(yǎng)基上挑取單克隆菌體接入5mL含卡那霉素(50μ g.mL—1)的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，獲得種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到含有卡那霉素(50 μ g.mL-1)的LB培養(yǎng)基，置于37°C，200r/min培養(yǎng)至0D_0.6-0.8時(shí)加入IPTG，使IPTG終濃度為0.5 μ M，同時(shí)加入終濃度為3 μ g.mL—1的氨芐青霉素，30°C，150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。同時(shí)以不加氨芐青霉素的培養(yǎng)的菌體作為空白對(duì)照。
[0031]培養(yǎng)結(jié)束后，取一定量菌液于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用200mM醋酸緩沖液(pH4.8)清洗菌體I次，測(cè)定菌體表觀催化活力為1.34U/mg。與相同培養(yǎng)條件下不加氨芐青霉素的培養(yǎng)的菌體相比，菌體表觀催化活力提高2.35倍。
[0032]實(shí)施例2
[0033]從活化的LB固體培養(yǎng)基上挑取單克隆菌體接入5mL含卡那霉素(50μ g.mL—1)的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，獲得種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到含有卡那霉素(50 μ g.mL-1)的LB培養(yǎng)基，置于37°C，200r/min培養(yǎng)至0D_0.6-0.8時(shí)加入IPTG，使IPTG終濃度為0.5 μ M，同時(shí)加入終濃度為5 μ g.mL—1的氨芐青霉素，30°C，150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。同時(shí)以不加氨芐青霉素的培養(yǎng)的菌體作為空白對(duì)照。
[0034]培養(yǎng)結(jié)束后，取一定量菌液于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用200mM醋酸緩沖液(pH4.8)清洗菌體I次，測(cè)定菌體表觀催化活力為3.55U/mg。與相同培養(yǎng)條件下不加氨芐青霉素的培養(yǎng)的菌體相比，菌體表觀催化活力提高6.23倍。
[0035]實(shí)施例3
[0036]從活化的LB固體培養(yǎng)基上挑取單克隆菌體接入5mL含卡那霉素(50μ g.mL—1)的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到含有卡那霉素(50 μ g.πι 1)的LB培養(yǎng)基，置于37°C，200r/min培養(yǎng)至0D_0.6-0.8時(shí)加入IPTG，使IPTG終濃度為0.5 μ M，同時(shí)加入終濃度為10 μ g.mL—1的CTAB，30°C,150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。同時(shí)以不加CTAB的培養(yǎng)的菌體作為空白對(duì)照。
[0037]培養(yǎng)結(jié)束后，取一定量菌液于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用200mM醋酸緩沖液(pH4.8)清洗菌體I次，測(cè)定菌體表觀催化活力1.40U/mg。與相同培養(yǎng)條件下，不加CTAB的菌體相比，菌體表觀催化活力提高2.46倍。
[0038]實(shí)施例4
[0039]從活化的LB固體培養(yǎng)基上挑取單克隆菌體接入5mL含卡那霉素(50μ g.mL—1)的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到含有卡那霉素(50 μ g.πι 1)的LB培養(yǎng)基，置于37°C，200r/min培養(yǎng)至0D_
0.6-0.8時(shí)加入IPTG，使IPTG終濃度為0.5 μ M，同時(shí)加入終濃度為5 μ g.mL—1的CTAB，30°C,150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。同時(shí)以不加CTAB的培養(yǎng)的菌體作為空白對(duì)照。
[0040]培養(yǎng)結(jié)束后，取一定量菌液于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用200mM醋酸緩沖液(pH4.8)清洗菌體I次，測(cè)定菌體表觀催化活力0.74U/mg。與相同培養(yǎng)條件下，不加CTAB的菌體相比，菌體表觀催化活力提高1.3倍。
[0041]對(duì)比例I
[0042]從活化的LB固體培養(yǎng)基上挑取單克隆菌體接入5mL含卡那霉素(50μ g.mL—1)的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到含有卡那霉素(50 μ g.πι 1)的LB培養(yǎng)基，置于37°C，200r/min培養(yǎng)至0D_
0.6-0.8時(shí)加入IPTG，使IPTG終濃度為0.5 μ M，同時(shí)加入終濃度為5-10 μ g.mL—1的十二烷基磺酸鈉，30°C，150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。同時(shí)以不加十二烷基磺酸鈉的培養(yǎng)的菌體作為空白對(duì)照。
[0043]培養(yǎng)結(jié)束后，取一定量菌液于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用200mM醋酸緩沖液(pH4.8)清洗菌體I次，測(cè)定菌體表觀催化活力0.42-0.48U/mg。與相同培養(yǎng)條件下，不加十二烷基磺酸鈉的菌體相比(0.57U/mg),菌體表觀催化活力略有下降。
[0044]對(duì)比例2
[0045]從活化的LB固 體培養(yǎng)基上挑取單克隆菌體接入5mL含卡那霉素(50μ g.mL—1)的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到含有卡那霉素(50 μ g.πι 1)的LB培養(yǎng)基，置于37°C，200r/min培養(yǎng)至0D_
0.6-0.8時(shí)加入IPTG，使IPTG終濃度為0.5 μ M，同時(shí)加入終濃度為0.1%_1%的吐溫80，30°C,150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。同時(shí)以不加吐溫80的培養(yǎng)的菌體作為空白對(duì)照。
[0046]培養(yǎng)結(jié)束后，取一定量菌液于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用200mM醋酸緩沖液(pH4.8)清洗菌體I次，測(cè)定菌體表觀催化活力0.46-0.57U/mg。與相同培養(yǎng)條件下，不加吐溫80的菌體相比(0.57U/mg)，菌體表觀催化活力沒(méi)有明顯變化。[0047]對(duì)比例3
[0048]從活化的LB固體培養(yǎng)基上挑取單克隆菌體接入5mL含卡那霉素(50μ g.mL—1)的LB液體培養(yǎng)基中，370C，200r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液。將種子液按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種到含有卡那霉素(50 μ g.πιm1)的LB培養(yǎng)基，置于37°C，200r/min培養(yǎng)至0D_
0.6-0.8時(shí)加入IPTG，使IPTG終濃度為0.5 μ M，同時(shí)加入終濃度為0.1%_1%的司班80，30°C,150r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。同時(shí)以不添加司班80的培養(yǎng)的菌體作為空白對(duì)照。
[0049]培養(yǎng)結(jié)束后，取一定量菌液于4°C，1000Og離心5min收集菌體，用200mM醋酸緩沖液(pH4.8)清洗菌體I次，測(cè)定菌體表觀催化活力0.48-0.60U/mg。與相同培養(yǎng)條件下，不加司班80的菌 體相比(0.57U/mg)，菌體表觀催化活力沒(méi)有明顯變化。
【權(quán)利要求】
1.一種提高谷氨酸脫羧酶重組工程菌表觀催化活力的方法，其特征在于，包括: (1)將谷氨酸脫羧酶重組工程菌接種至培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)，獲得種子液； (2)將種子液接種至培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至OD為0.6~0.8時(shí)，加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，加入誘導(dǎo)劑的同時(shí)向培養(yǎng)基中加入細(xì)胞壁合成抑制劑或者表面活性劑； 其中，所述的谷氨酸脫羧酶工程菌包括宿主細(xì)胞和轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的谷氨酸脫羧酶基因，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌； (3)誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后收集菌體，即得到表觀催化活力提高的谷氨酸脫羧酶重組工程菌。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌(E.coli)BL21、大腸桿菌(E.coli) BLR、大腸桿菌(E.coli) Origam1、大腸桿菌(E.coli) NovaBlue或大腸桿菌(E.coli) Rosetta。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體不帶有氨芐青霉素抗性基因。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的表達(dá)載體為pET-28a、pET-29、pET-30或pET-34。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞壁合成抑制劑或者表面活性劑的終濃度為I~lOyg/mL.
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞壁合成抑制劑為氨芐青霉素。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述氨芐青霉素的終濃度為2~7μ g/ml。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的表面活性劑為十六烷基三甲基溴化銨。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述十六烷基三甲基溴化銨的終濃度為3~10μ g/ml。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的溫度為20~30°C，時(shí)間為6~12h。
【文檔編號(hào)】C12N1/38GK103773731SQ201410005648
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月3日
【發(fā)明者】梅樂(lè)和, 趙偉睿, 黃 俊, 胡升, 雷引林, 金志華, 姚善涇 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院