一種人巨細胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提出了一種人巨細胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途。所述引物為SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2的序列；所述探針為SEQ?ID?NO:4的序列，其5’端單鏈堿基序列，其為與靶序列互補的5-10個堿基；中間13-20個堿基；3’端序列，為5-10個堿基序列；所述5’端單鏈堿基序列與3’端序列部分匹配成頸結構；所述探針為頸環(huán)結構，TM值=（頸環(huán)TM值+7）±1，5’端有18-25個堿基能夠和靶基因完全匹配，共約23-32bp；其5’端和3’端分別標記熒光和非熒光淬滅基團。本發(fā)明的引物和探針具有穩(wěn)定的線性結構，用于檢測人巨細胞病毒核酸定量具有較低的熒光本底值、信噪比高和檢測靈敏度高的優(yōu)點。
【專利說明】—種人巨細胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及體外診斷試劑。尤其涉及一種人巨細胞病毒核酸定量檢測引物和探針、試劑盒及其用途。
【背景技術】
[0002]人巨細胞病毒(Human Cytomegalo virus,HCMV)屬皰疫病毒科乙組皰疫亞科?，F有的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法有一系列的問題，比如電鏡技術雖直接、客觀，但對病毒滴度要求高，設備昂貴，并且需要熟練的技術人員，因此檢測價值較低。病毒分離由于技術要求高，分離時間長，易污染的缺點也不易于大量開展。用常規(guī)PCR檢測CMV-DNA，具有簡便、快捷等特點。但是由于擴增后的產物需電泳檢測，易造成交叉污染出現假陽性的結果。
[0003]突光定量PCR是(realtimefluores-cence quantitative PCR, RTFQ PCR)是 1996年由美國Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗技術,它是通過突光染料或突光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監(jiān)控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種具有穩(wěn)定的線性結構的引物和探針，還在于提供一種具有較低的熒光本底值、信噪比高和檢測靈敏度高的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法。
[0005]為實現上述 目的，本發(fā)明提供一種人巨細胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述引物為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列；所述探針的序列為--從5’端起，與靶序列互補的5-10個堿基的單鏈堿基序列；中間13-20個堿基的環(huán)狀結構序列；3’端的5-10個堿基序列；所述5’端的與靶序列互補的5-10個堿基與3’端的5-10個堿基序列部分匹配成頸結構；所述探針成頸環(huán)結構，同時探針TM值=(頸環(huán)TM值+7)±1，探針5’端有18-25個堿基能夠和靶基因完全匹配，探針序列約23-32bp ;所述探針5’端標記熒光基團，3’端標記非熒光淬滅基團。
[0006]所述探針序列為SEQ ID NO:4的序列。
[0007]所述探針序列5’端標記FAM基團，3’端標記Dabcyl非熒光淬滅基團。
[0008]本發(fā)明還保護一種人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，包括上述的任一引物和探針。
[0009]還包括如下成分，樣本提純試劑，PCR擴增試劑、參考品試劑和HCMV定量標準品。
[0010]所述樣本提純試劑為裂解液、洗滌液和重復洗滌液；所述裂解液成分為Trizirn*HC1、二氧化娃、Triton X_100、EDTA.2Na、異硫氰酸胍；所述洗漆液為Trizma?.HCl、TritonX-100、EDTA *2Na、異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為TH HCl、Triton X_100、EDTA.2Na ；所述PCR擴增試劑為HCMV PCR反應管和HCMV反應緩沖液；所述參考品試劑為HCMV陰性對照、HCMV臨界陽性對照，HCMV強陽性對照；優(yōu)選的，所述裂解液為10mMPH7.0 Trizma^;HCl,I重量％。二氧化硅、I體積％。Triton X-1OOUOmM EDTA *2Na、2M異硫氰酸胍；所述洗滌液為10mMPH7.0 TrizieaS HClU體積％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na、2M異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為 10mMPH7.0 Trizma* HCl、I 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na ;所述 HCMV PCR反應管含有2U Taq酶、0.01U UNG酶、0.1mM EDTA.2Na、25微升石蠟油；HCMV反應緩沖液為 IOpM HCMV 引物，5pM HCMV 探針、20mMPH9.0 Trizma?丨 HCl、50mM KCl、1.5mM MgC12、0.1mMEDTA.2Na、0.2mM dNtps。
[0011]本發(fā)明還提供一種應用所述引物和探針或所述試劑盒進行人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟，
[0012]樣品制備；制備得到純化的核酸；
[0013]PCR擴增和熒光值讀取，采用權利要求1-3任一引物和探針或權利要求4的試劑盒;
[0014]結果判定。
[0015]所述樣品制備為取0.5mL離心管加入裂解液100 μ L然后加入待測樣本50 μ L，混懸，室溫靜置10分鐘進行裂解；10000g離心25秒，去上清；加入150 μ L洗滌液對所得到的沉淀進行洗滌，混懸，1000Og離心25秒，去上清；加入150 μ L重復洗滌液，混懸，1000Og離心25秒，去上清備用，純化得到的沉淀即為核酸；所述裂解液為10mMPH7.0TriziieflHClU重量％。二氧化硅、I體積％。Triton X-1OOUOmM EDTA.2Na、2M異硫氰酸胍；所述洗滌液為10mMPH7.0 Trizma?:HCl、l 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na、2M 異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為 10mMPH7.0 Trizma?: HClU 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na。
[0016]所述PCR擴增程序為，38 °C 5分鐘，95 °C 10分鐘；進入以下循環(huán):95 °C 15秒，580C 50秒，共40循環(huán)；所述熒光值讀取為在PCR擴增每個循環(huán)的58°C，30秒時。
`[0017]所述結果判定為:
[0018]如果檢測樣本中病毒載量為5.0X 102Copies/mL ( HCMV DNA ( 5.0 X IO8Copies/HiL判斷為陽性，直接報告定量結果；
[0019]如果檢測樣本中病毒載量為> 5.0X 108Copies/mL,判斷為陽性，報告為>5.0X 108Copies/mL ；
[0020]如果檢測樣本中病毒載量為OCopies/ml,判斷為陰性,報告為0.0Copies/ml ；
[0021]如果檢測樣本中病毒載量為< 5.0X102Copies/mL，Copies數僅供參考，建議重新檢測。
[0022]樣本提純試劑用于提取人巨細胞病毒樣本中的核酸，所提取的核酸可以直接用于熒光定量PCR。
[0023]制備的核酸分別用反應緩沖液30 μ L融解，取25 μ L依次加入反應管中，混勻，稍微離心，置入熒光PCR擴增儀內。擴增曲線通過連接于PCR擴增儀的終端電腦獲取，用于分析是否感染人巨細胞病毒。
[0024]參考品用于檢測核酸提取過程和PCR擴增過程是否正常進行。
[0025]本發(fā)明的試劑盒具體可以包括:
[0026]樣本提純試劑
[0027]裂解液1.1mL/支，2支；[0028]洗滌液1.6mL/支，2支；
[0029]重復洗滌液，1.6mL/支，2支；
[0030]PCR擴增試劑:
[0031 ] HCMV PCR 反應管，2 μ L/ 支，20 支；
[0032]HCMV反應緩沖液，350 μ L/支，2支；
[0033]參考品試劑:
[0034]HCMV 陰性對照，165 μ L/ 支，I 支；
[0035]HCMV臨界陽性對照，165 μ L/支，I支；
[0036]HCMV強陽性對照，165 μ L/支，I支。
[0037]HCMV定量標準品，165 μ L/支，共5支。
[0038]具體的:
[0039]HCMV陰性對照:生理鹽水；
[0040]HCMV臨界陽性對照:生理鹽水、5.0 X 103copies/mL的HCMV質粒；
[0041]HCMV強陽性對照:生理鹽水、5.0X 107copies/mL的HCMV質粒。
[0042]HCMV定量標準品見表2
[0043]
【權利要求】
1.一種人巨細胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述引物為SEQ IDNO:1和SEQ ID NO: 2的序列；所述探針的序列從5’端起，與靶序列互補的5_10個堿基的單鏈堿基序列；中間13-20個堿基的環(huán)狀結構序列；3’端的5-10個堿基序列；所述5’端的與靶序列互補的5-10個堿基的單鏈堿基序列與3’端的5-10個堿基序列部分匹配成頸結構；所述探針成頸環(huán)結構，同時探針TM值=(頸環(huán)TM值+7)±1，探針5’端有18-25個堿基能夠和靶基因完全匹配，探針序列約23-32bp ;所述探針5’端標記熒光基團，3’端標記非熒光淬滅基團。
2.權利要求1的人巨細胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述探針序列為SEQ ID NO:4的序列。
3.權利要求1或2的人巨細胞病毒核酸定量檢測的引物和探針，其特征在于，所述探針序列5’端標記FAM基團，3’端標記Dabcyl非熒光淬滅基團。
4.一種人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，包括權利要求1-3的任一引物和探針。
5.權利要求4的人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，還包括如下成分，樣本提純試劑，PCR擴增試劑、參考品試劑。
6.權利要求5的人巨細胞病毒核酸定量檢測試劑盒，其特征在于，所述樣本提純試劑為裂解液、洗滌液和重復洗滌液；所述裂解液成分為TrizmafflHCl、二氧化硅、TritonX-100、EDTA *2Na、異硫氰酸胍；所述洗滌液為 TrimaP HCl、Triton X-100、EDTA.2Na、異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為Triz!ua?: HC1、Triton X-100、EDTA.2Na ;所述PCR擴增試劑為HCMV PCR反應管和HCMV反應緩沖液；所述參考品試劑為HCMV陰性對照、HCMV臨界陽性對照，HCMV強陽性對照和HCMV定量標準品；優(yōu)選的，所述裂解液為10mMPH7.0 Trizim^iHCl,I重量％。二氧化硅、I體積％。Triton X-1OOUOmM EDTA *2Na、2M異硫氰酸胍；所述洗滌液為10mMPH7.0 Trizma?iHCl 、l 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA *2Na、2M 異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為 10mMPH7.0 T rizma*: HCl、I 體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na ;所述 HCMV PCR反應管含有2U Taq酶、0.01U UNG酶、0.1mM EDTA.2Na、25微升石蠟油；HCMV反應緩沖液為 IOpM HCMV 引物，5pM HCMV 探針、20mMPH9.0 Trizma*]HC1,5OmM KC1、1.5mM MgC12、0.1mMEDTA.2Na、0.2mM dNtps。
7.一種應用權利要求1-3任一引物和探針或權利要求4的試劑盒進行人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，包括如下步驟， 樣品制備；制備得到純化的核酸； PCR擴增和熒光值讀取，采用權利要求1-3任一引物和探針或權利要求4的試劑盒； 結果判定。
8.權利要求7的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，所述樣品制備為取，0.5mL離心管加入裂解液100 μ L，然后加入待測樣本50 μ L，混懸，室溫靜置10分鐘進行裂解；10000g離心25秒，去上清；加入150 μ L洗滌液對所得到的沉淀進行洗滌，混懸，1000Og離心25秒，去上清；加入150 μ L重復洗滌液，混懸，1000Og離心25秒，去上清備用，純化得到的沉淀即為核酸；所述裂解液為10mMPH7.0 Tii zma* HCl、I重量％。二氧化硅、I體積％。Triton X-1OOUOmM EDTA.2Na、2M 異硫氰酸胍;所述洗滌液為 10mMPH7.0 Triznia*HClU體積％。Triton X-1OOUmM EDTA.2Na、2M異硫氰酸胍；所述重復洗滌液為.10mMPH7.0 Trizma*] HCl、I 體積％? Triton X-1OOUmM EDTA.2Na。
9.權利要求8的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，所述PCR擴增程序為，380C 5分鐘，95°C 10分鐘；進入以下循環(huán):95°C 15秒，58°C 50秒，共40循環(huán)；所述熒光值讀取為在PCR擴增每個循環(huán)的58°C，30秒時。
10.權利要求8的人巨細胞病毒核酸定量檢測方法，其特征在于，所述結果判定為: 如果檢測樣本中病毒載量為 5.0X 102Copies/mL ≤ HCMV DNA ≤ 5.0 X 108Copies/mL 判斷為陽性，直接報告定量結果； 如果檢測樣本中病毒載量為> 5.0X 108CopieS/mL，判斷為陽性，報告為>.5.0X 108Copies/mL ； 如果檢測樣本中病毒載量為OCopies/ml,判斷為陰性,報告為0.0Copies/ml ；如果檢測樣本中病毒載量為< 5.0X102Copies/mL，Copies數僅供參考，建議重新檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805713SQ201410007284
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權日:2014年1月8日
【發(fā)明者】魏超, 林家旺, 魏劭 申請人:廈門安普利生物工程有限公司