一種與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的snp標(biāo)記及其鑒定方法和潛在應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記及其鑒定方法和潛在應(yīng)用，所述與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記位于海灣扇貝轉(zhuǎn)錄本Ai-53308序列的第760個(gè)堿基處，此堿基存在U和C兩個(gè)形式;相應(yīng)的，該SNP在基因組DNA中存在Ｔ和Ｃ兩個(gè)等位基因形式（以下基因型均指該SNP在基因組DNA中的基因型）;所述海灣扇貝Ai-53308轉(zhuǎn)錄本，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明的有益效果在于可以在苗種繁育前對(duì)親貝進(jìn)行基因型鑒定，通過(guò)棄選CC基因型的親貝，提高后代群體的熱耐受性。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記及其鑒定方法和潛在應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程與遺傳育種領(lǐng)域，涉及一個(gè)與海灣扇貝熱耐受性性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其鑒定方法和潛在應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]海灣扇貝原產(chǎn)美國(guó)大西洋沿岸及墨西哥灣，有四個(gè)地理亞種，其中北方亞種和南方亞種先后引進(jìn)中國(guó)。海灣扇貝北方亞種主要養(yǎng)殖在河北、遼寧和山東沿海(渤海海域)，南方亞種主要養(yǎng)殖在廣東廣西沿海(北部灣海域)，是我國(guó)重要的養(yǎng)殖貝類(lèi)。高溫年份，海灣扇貝北方亞種主養(yǎng)區(qū)經(jīng)常發(fā)生規(guī)模死亡，給養(yǎng)殖戶(hù)造成巨大損失。高溫被認(rèn)為是引起扇貝夏季規(guī)模死亡的主要環(huán)境誘因，因此提高海灣扇貝熱耐受性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]生物通常有三種途徑應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫:1)分子伴侶蛋白表達(dá)上調(diào)，幫助細(xì)胞內(nèi)蛋白維持正確的空間結(jié)構(gòu)或錯(cuò)誤折疊蛋白的重新折疊；2)細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)有效平衡脅迫條件下產(chǎn)生的自由基，防止胞內(nèi)結(jié)構(gòu)被破壞；3 )啟動(dòng)泛素蛋白酶體系以降解結(jié)構(gòu)被破壞了的蛋白，防止其聚集產(chǎn)生毒性。宋林生等對(duì)海灣扇貝熱休克蛋白HSP70啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行重測(cè)序鑒定出8個(gè)與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記，這些標(biāo)記可能通過(guò)影響HSP70表達(dá)水平影響海灣扇貝熱耐受性，然而這種可能性尚未被證明。
[0004]本發(fā)明在利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序預(yù)測(cè)海量SNP標(biāo)記的基礎(chǔ)上，利用候選基因關(guān)聯(lián)分析的方法，篩選出I個(gè)與海灣扇貝熱耐受性極顯著相關(guān)的SNP標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)該SNP的T等位基因比C等位基因更有利于海灣扇貝在高溫脅迫條件下存活。熒光定量PCR結(jié)果顯示，熱激情況下海灣扇貝轉(zhuǎn)錄本53308轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，據(jù)此推測(cè)與上述SNP緊密連鎖的一種變異通過(guò)影響基因的表達(dá)影響海灣扇貝的熱耐受性。從而，上述SNP可以作為海灣扇貝熱耐受性的功能標(biāo)記，用于海灣扇貝高熱耐受性品系的選育。本發(fā)明不但提供與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記，還提供簡(jiǎn)便且具有可移植性的鑒定方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種與海灣扇貝熱耐受性性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記及其鑒定方法和潛在應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn):
[0007]一種與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記:所述與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記位于海灣扇貝轉(zhuǎn)錄本A1-53308序列的第760個(gè)堿基處，此堿基存在T和C兩個(gè)形式；
[0008]所述海灣扇貝A1-53308轉(zhuǎn)錄本，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0009]與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記的鑒定方法，包括步驟如下:
[0010]I)提取海灣扇貝的基因組DNA，使用滅菌水或TE緩沖液稀釋到10_20ng/uL ；
[0011]2)取步驟I)中所述海灣扇貝的基因組DNA為模板，利用引物F和R配制反應(yīng)體系:基因組DNAluL，通用PCR mix5uL，引物F和R各0.2uL，滅菌雙蒸水3.6uL (若基因組DNA濃度≤5ng/uL，可加4.6uL基因組DNA而不加滅菌雙蒸水。另反應(yīng)體系可同比放大)；
[0012]3) PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?
[0013]
【權(quán)利要求】
1.一種與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記，其特征在于:所述與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記位于海灣扇貝轉(zhuǎn)錄本A1-53308序列的第760個(gè)堿基處，此堿基存在T和C兩個(gè)形式； 所述海灣扇貝A1-53308轉(zhuǎn)錄本，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種如權(quán)利要求1所述的與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記的鑒定方法，其特征在于: 包括步驟如下: . 1)提取海灣扇貝的基因組DNA，使用滅菌水或TE緩沖液稀釋到10-20ng/uL； .2)取步驟I)中所述海灣扇貝的基因組DNA為模板，利用引物F和R配制反應(yīng)體系:基因組DNAluL，通用PCR mix5uL，引物F和R各0.2uL，滅菌雙蒸水3.6uL ;所述反應(yīng)體系可同比放大； .3)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記的鑒定方法，其特征在于: 所述步驟2)中，用于鑒定所述與海灣扇貝熱耐受性性狀相關(guān)的SNP標(biāo)記的正向引物為F:5’ -GATCTCAGAAGTGAACGTCTG-3’ ； 反向引物為 R:5’ -TGATTCTAGCCTGTACCATTAC-3’。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記的鑒定方法，其特征在于: 當(dāng)所述基因組DNA濃度≤5ng/uL時(shí)，需加入4.6uL基因組DNA而不加滅菌雙蒸水。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記的鑒定方法，其特征在于: 所述步驟3)中，內(nèi)標(biāo)為等量混合的高溫內(nèi)標(biāo)和低溫內(nèi)標(biāo)，即兩條具有不同GC含量的雙鏈寡核苷酸，高、低溫內(nèi)標(biāo)終濃度分別為2.5uM。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記的鑒定方法，其特征在于: 所述步驟3)中，SNP基因型鑒定時(shí)所需的高、低內(nèi)標(biāo)序列，其中，高溫內(nèi)標(biāo)序列為: . 5，-GCGGTCAGTCGGCCTAGCGGTAGCCAGCTGCGGCACTGCGTGACGCTCAG-3，
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記的鑒定方法，其特征在于: 獲得內(nèi)標(biāo)的具體方法為: 1)委托公司合成四條寡核苷酸單鏈:
8.—種如上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的與海灣扇貝熱耐受性相關(guān)的SNP標(biāo)記的潛在應(yīng)用，其特征在于:在苗種繁育前，通過(guò)非致死性取樣提取親貝基因組DNA，利用如上述任一項(xiàng)權(quán)利要求中所述的SNP標(biāo)記及其鑒定方法判斷親貝基因型，通過(guò)棄選CC基因型親貝有效提高后代群體的熱耐受性。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103740702SQ201410007416
【公開(kāi)日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月7日
【發(fā)明者】杜雪地, 李莉, 張守都, 張國(guó)范 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所