一種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽及其制備方法和應用。本發(fā)明所述的腫瘤抑素30肽的氨基酸序列為SEQ?No.1，編碼所述腫瘤抑素30肽的核苷酸序列為SEQ?No.2。本發(fā)明在保持腫瘤抑素41肽抗腫瘤活性的前提下刪除19肽中的非活性片段，減少融合肽的氨基酸數(shù)目，以降低融合肽的生產成本，尤其是化學合成的生產成本，增加用藥的安全性。
【專利說明】一種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽及其制備方法和應用，屬于生物制藥領域。
【背景技術】
[0002]人腫瘤抑素(tumstatin)來源于人膠原IV α 3鏈，由244個氨基酸殘基組成。腫瘤抑素第75至95位氨基酸殘基組成的21肽具有抑制血管內皮細胞增殖，阻止腫瘤組織新生血管生成的活性。第185至203位氨基酸殘基組成的19肽能直接抑制腫瘤細胞的增殖與遷移。我們曾經研究顯示，對腫瘤抑素21肽進行改造:刪除第20、21位的酪氨酸(Y)和絲氨酸(S);將第14位的苯丙氨酸(F)改為色氨酸(W)，以方便用紫外檢測多肽的濃度；將第18位天冬酰胺(N)改為甘氨酸(G)，與其前面的精氨酸(R)和后面的天冬氨酸(D)形成一個RGD序列，再在其后增加一組RGD序列，形成串聯(lián)的RGDRGD序列。改造后的21肽羧基端與完整的19肽氨基端融合，成為腫瘤抑素融合肽(41肽)。
[0003]將兩種蛋白或多肽融合在一起并保持兩種蛋白或多肽各自的活性，必須保證在融合蛋白中兩種蛋白或多肽各自的立體結構不變。為此需在兩種蛋白或多肽之間引入柔性連接片段。所謂柔性連接片段是指連續(xù)的小分子氨基酸序列，如甘氨酸、脯氨酸等。在融合蛋白中柔性連接片段自身易于形成β_轉角二級結構，因而不參與兩邊蛋白或多肽二級結構的形成，使兩邊的多肽或蛋白能保持原來的立體結構和生物學活性。
[0004]RGD序列廣泛分布在細胞外基質蛋白中。細胞外基質蛋白通過RGD序列與細胞膜上的整合素受體識別、結合，介導細胞與細胞外基質之間，細胞與細胞之間的相互作用，參與血管新生，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉移等病理過程。在可溶性多肽或蛋白中引入RGD序列，可使可溶性多肽或蛋白與整合素結合，競爭性阻止細胞外基質蛋白與整合素的結合，抑制或逆轉上述病理過程，產生所謂的“去整合素效應”。G為小分子甘氨酸，多肽鏈在G處易于出現(xiàn)彎折。R為精氨酸，側鏈帶正電荷；D為天冬氨酸，側鏈帶負電荷；R和D的側鏈間形成離子鍵。RGD序列在多肽和蛋白質中總是以β-轉角的二級結構形式存在。RGDRGD序列在41肽中即起到去整合素效應，提高了抗腫瘤活性，又取代柔性連接片段負責連接19肽和21肽。
[0005]用小鼠Η22肝癌細胞腹水制作小鼠肝癌動物模型，檢測21肽、19肽和41肽的抗腫瘤活性，結果21肽的抑瘤率為40.08%, 19肽的抑瘤率為42.41%，41肽抑瘤率為69.14%。41肽的抗腫瘤作用明顯好于19肽和21肽。關于腫瘤抑素41肽已經申請國家發(fā)明專利，申請?zhí)枮?201310472765.0。

【發(fā)明內容】
:
[0006]本發(fā)明所要解決的技術問題是在保持腫瘤抑素41肽抗腫瘤活性的前提下刪除其19肽中的非活性片段，減少融合肽的氨基酸數(shù)目，以降低融合肽的生產成本，尤其是化學合成的生產成本，增加用藥的安全性。
[0007]有研究結果確定腫瘤抑素19肽的抗腫瘤活性區(qū)位于其羧基端的酪氨酸-酪氨酸-絲氨酸-天冬酰胺-絲氨酸(YYSNS) 5肽上，其中的SNS形成β -轉角是保持19肽抗腫瘤活性所必有的。我們曾將YYSNS5肽與前期改造的21肽羧基端融合，結果融合肽的抗腫瘤活性遠低于41肽。隨后根據19肽的氨基酸序列在YYSNS5肽的氨基端每次增加I個氨基酸，分別與21肽融合，結果由NYYSNS6肽和CNYYSNS7肽與21肽融合成的多肽抗腫瘤作用都不如41肽，而由TCNYYSNS8肽與21肽融合成的多肽其抗腫瘤活性與41肽相當甚至超過了 41肽。上述研究結果揭示在融合肽中保持完整19肽的抗腫瘤活性至少需要其羧基端的8個氨基酸。用此8肽取代19肽與改造后的21肽融合，刪除了 19肽氨基端的11個氨基酸，使融合肽由41肽縮短為30肽。多肽和蛋白質藥物分子量越小其免疫原性越低，其用藥的安全性越高。在多肽合成中序列越短合成的純度越高，成本越低。因此30肽的實用性要比41肽好，市場競爭性要比41肽強。
[0008]本發(fā)明具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽的氨基酸序列見SEQ N0.1，編碼所述腫瘤抑素30肽的優(yōu)選核苷酸序列見SEQ N0.2。
[0009]制備上述具有抗腫瘤活性的腫瘤抑素30肽可用化學合成法和基因重組法。本發(fā)明提供的腫瘤抑素30肽的基因重組方法在腫瘤抑素41肽基因重組方法的基礎上進行了改進。在41肽基因重組的設計中選擇pTYBl質粒作為表達載體，將41肽置于內含肽的氨基端，使內含肽的斷裂點位于41肽羧基端的絲氨酸和內含肽氨基端的半胱氨酸之間。這樣得到的41肽雖然結構與化學合成的完全相同，但產量偏低。究其原因是靶多肽羧基端的絲氨酸影響了內含肽的自我斷裂，23°C 16小時斷裂率只有5-15%。為此腫瘤抑素30肽重組換用PTYB21為表達載體，將30肽置于內含肽的羧基端。得到的重組30肽氨基酸數(shù)目和兩端氨基酸種類都沒有改變。靶多肽氨基端為蛋氨酸，23°C 16小時內含肽的自動斷裂率可大于95%,從而提聞了腫瘤抑素30妝的得率。
[0010]用基因重組法制備上述具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽，包括以下步驟:
[0011](I)選用PTYB21質粒作為`30肽基因重組載體，用Sapl和Pstl雙酶切pTYB21質粒;
[0012](2)合成核苷酸序列為SEQ N0.3和SEQ N0.4兩條單鏈DNA，退火成雙鏈后將5'端磷酸化，作為與載體重組的腫瘤抑素30肽編碼基因；
[0013](3)將步驟(2)中目的基因與步驟(1)中雙酶切的PYTB21質粒重組，轉化大腸桿菌JM109，用PCR方法篩選重組菌；
[0014](4)對PCR篩選陽性的重組菌進行測序；
[0015](5)對測序正確的重組菌提取重組質粒，轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，經IPTG誘導表達，然后經幾丁質親和層析，內含肽斷裂，獲得腫瘤抑素30肽。
[0016]自然，含有所述的核苷酸序列的表達載體以及含有所述的載體的宿主菌也應在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0017]對本發(fā)明所得到的腫瘤抑素30肽進行動物實驗，抑瘤率達到71.77%，而41肽的抑瘤率為69.14%。因此本發(fā)明還進一步提出了所述30肽及其編碼的核苷酸序列作為抗腫瘤藥物的應用?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0018]圖1為用PCR篩選重組質粒結果，I為pTYB21質粒，2-6為重組質粒，7為DNA分子
量標準；
[0019]圖2為重組質粒測序結果，圖A為模板鏈(編碼鏈的互補鏈)測序結果圖；圖B為測得的編碼鏈序列，280-373位鹼基為30肽的編碼序列，與設計的編碼序列完全一致；
[0020]圖3為幾丁質親和層析中各蛋白峰的SDS-聚丙烯凝膠電泳結果，其中I為細菌裂解液上清，2為穿透液(雜蛋白)，3為30肽(在SDS-Page上見不到條帶)，4為幾丁質結合蛋白-內含肽；
[0021 ] 圖4為30肽三羥甲基甘氨酸SDS-Page電泳圖；
[0022]圖5為腫瘤抑素30肽與41肽對小鼠H22肝癌抑瘤效果的對比結果圖；其中，A為PBS對照組、B為腫瘤抑素41肽組、C為腫瘤抑素30肽組、D為順鉬組；
[0023]圖6為腫瘤抑素30肽抑制小鼠H22肝癌細胞增殖實驗結果圖；
[0024]圖7為用藥7天5-氟尿嘧啶組與腫瘤抑素10mg/kg/d組小鼠狀態(tài)比較圖；其中A和C為5-氟尿嘧啶組、B和D為10mg/kg/d腫瘤抑素30肽組、E為陰性對照組；
[0025]圖8為腫瘤抑素30肽組與對照組腫瘤大小的比較結果圖，其中A為對照組，B為腫瘤抑素30肽組。
【具體實施方式】
`[0026]下面結合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內。
[0027]實施例1腫瘤抑素30肽的基因重組
[0028](I)選用pTYB21質粒為基因重組載體，用Sapl和Pstl雙酶切pTYB21質粒(質粒和酶均購自美國NEB公司)；
[0029](2)合成核苷酸序列為SEQ N0.3和SEQ N0.4兩條單鏈DNA，退火成雙鏈后將5'端憐Ife化；
[0030](3)將目的基因與雙酶切的PYTB21質粒重組，轉化大腸桿菌JM109 (本組保存)，用PCR方法篩選重組菌。PCR的引物的核苷酸序列為SEQ N0.5和SEQN0.6，PCR結果如圖1所示；
[0031](4)選擇一株重組菌送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果與設計序列完全相同，如圖2所示；
[0032](5)提取重組質粒，轉化大腸桿菌BL21 (DE3) (NEB公司隨質粒贈送)，經IPTG誘導表達；
[0033](6)菌體裂解液過幾丁質親和層析柱，幾丁質結合蛋白-內含肽-30肽結合在柱上。經DTT誘導，內含肽斷裂，釋放出30肽。經此一步層析即可純化獲得30肽。結果見圖
3、圖 4 ；
[0034](7)用NaOH去除幾丁質結合蛋白-內含肽，使層析柱再生，結果見圖4。(廠商規(guī)定用0.3%Na0H，層析柱重復使用不超過5次)我們將NaOH的質量濃度提高到0.5%，層析柱重復使用率可提高到10-15次。
[0035]實施例2動物實驗對腫瘤抑素30肽和41肽抗腫瘤活性的比較
[0036]將凍存的H22小鼠肝癌細胞(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院，黑龍江省腫瘤研究所保存)置于37°C水浴l_2min，待細胞融化，每只昆明種小鼠腹腔注射0.2ml, 10天左右接種小鼠腹腔長滿腹水。無菌條件下抽取腹水作為瘤源，用生理鹽水調整細胞濃度為3X107/ml。取體重18-22g的雄性昆明種小鼠，每只于肩胛腋窩處皮下接種腫瘤細胞0.2ml。待能觸及接種部位的腫瘤結節(jié)后，試驗組腫瘤組織內注射本發(fā)明腫瘤抑素30肽5mg/kg/d (用
0.2mol PBS pH7.4緩沖液溶解)，連續(xù)用藥10天，處死小鼠，剝離腫瘤結節(jié)，稱重，計算抑瘤率。41肽組注射41肽5mg/kg/d，對照組注射等體積的PBS緩沖液。結果見表1、圖5，41肽的抑瘤率為69.14%, 30肽的抑瘤率為71.77%。
[0037]表1腫瘤抑素41肽、30肽對小鼠H22腹水型轉移肝癌實體瘤的抑瘤率(X土 s，n=8)
[0038]
【權利要求】
1.一種具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽，其特征在于，所述的腫瘤抑素30肽的氨基酸序列為SEQ N0.1。
2.根據權利要求1所述的具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽，其特征在于，編碼所述腫瘤抑素30肽的核苷酸序列為SEQ N0.2。
3.制備權利要求1所述的具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)選用PTYB21質粒作為30肽基因重組載體，用Sapl和Pstl雙酶切pTYB21質粒； (2)合成核苷酸序列為SEQN0.3和SEQ N0.4兩條單鏈DNA，退火成雙鏈后將5'端磷酸化，作為與載體重組的腫瘤抑素30肽編碼基因； (3)將步驟(2)中目的基因與步驟(1)中雙酶切的PYTB21質粒重組，轉化大腸桿菌JM109，用PCR方法篩選重組菌； (4)對PCR篩選陽性的重組菌進行測序； (5)對測序正確的重組菌提取重組質粒，轉化大腸桿菌BL21(DE3)，經IPTG誘導表達，然后經幾丁質親和層析，內含肽斷裂，獲得腫瘤抑素30肽。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的PCR的特異性引物的核苷酸序列為SEQ N0.5和SEQ N0.6。
5.一種載體，其特征在于，所述載體包括權利要求2所述的核苷酸序列。
6.一種宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞包括權利要求4所述的載體。
7.權利要求1或2所述的具有抗腫瘤作用的腫瘤抑素30肽在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【文檔編號】C12N15/12GK103755799SQ201410008322
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月8日 優(yōu)先權日:2014年1月8日
【發(fā)明者】楊寶峰, 劉興漢, 初文峰, 呂延杰, 張麗秋, 董興麗, 劉遠莉 申請人:哈爾濱醫(yī)科大學