一種控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種對(duì)綿羊毛色基因檢測的試劑盒，特別是一種控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒。本發(fā)明的控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒內(nèi)有序列分別為SEQIDNO：1和SEQIDNO：2的兩條引物核苷酸和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒載體SEQIDNO：3核苷酸序列。檢測試劑盒提供了一種快速、簡便、準(zhǔn)確的新檢測手段，擺脫了測序儀等大型儀器設(shè)備的依賴，而且操作步驟簡單，普通獸醫(yī)臨床人員易于熟練掌握應(yīng)用。
【專利說明】—種控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對(duì)綿羊毛色基因檢測的試劑盒，特別是一種控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]綿羊、山羊被毛顏色種類很多，其遺傳現(xiàn)象也十分復(fù)雜。綿羊毛、山羊絨、羔皮、
裘皮等的顏色均具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，例如，白色山羊絨比其他顏色的山羊絨價(jià)格高。
毛色還是品種的重要標(biāo)志，有些品種的毛色對(duì)適應(yīng)自然環(huán)境還起著重要的作用。對(duì)細(xì)毛羊養(yǎng)羊業(yè)來講，人們的主要目的是為了獲得白色優(yōu)質(zhì)細(xì)毛。近年來，由于國際市場對(duì)不經(jīng)人工染色的天然有色毛織品興趣增加，有色毛(黑色、褐色)的價(jià)格比白色毛貴30%~40%。因此，澳大利亞正在培育黑色美利奴羊，目前數(shù)量已達(dá)5萬只左右。綿、山羊被毛纖維的顏色是由直徑約0.1~0.3 y m的深色素顆粒形成的，參見:趙有璋.羊生產(chǎn)學(xué)(第二版)[M].北京.中國農(nóng)業(yè)出版社.2007。綿羊、山羊毛色的形成主要取決于黑色素及其衍生物的有無與多少，參見:里德U.N，魏H.著.病理學(xué)總論與各論.武忠弼主譯.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996，129-131.，
而毛色的種類主要取決于黑色素的種類和分布情況，見:方美英.豬的毛色遺傳[J].中國畜牧雜志，2002,38(2):51-52.。黑色素是一種不溶于水與幾乎所有溶劑的無定型小顆粒生物色素，合成和儲(chǔ)存場所是黑素小體，參見:Li XL, Zheng GR, Zhou RY, etal.Evolution and differentiation ofMSHR gene in different Species[J]J Hered,2007,98(2):165-168 ;Klungland H, Vage D1.Pigmentary switches in domesticanimal species [J] Ann N Y Acad Sci，2003，994:331-338?，并由多個(gè)基因共同作用以及環(huán)境因素影響而形成，見:Sturm RA, Teasdele RD, Box NF.Human pigmentationgenes !identification, structure and consequences of polymorphic variation[J]Gene.2001,277:49-62.。黑色素有兩種，一種為真黑色素，以黑色和褐色兩種形式存在，不含硫原子；另一種是褐黑色素，以黃色和紅色兩種形式存在，見:師科榮，王愛國，鄧學(xué)梅.豬毛色性狀遺傳機(jī)制研究進(jìn)展[J]養(yǎng)豬，2003，4:24-28.，含硫原子，易溶于堿性溶液。真黑色素跟褐黑色素都是由酪氨酸和苯丙氨酸經(jīng)一系列酶的催化形成的，合成過程的每個(gè)階段都受到了很多信號(hào)分子與特定成分的調(diào)節(jié)和限制，見:伍革民，彭光旭.動(dòng)物黑色素研究進(jìn)展[J]甘肅畜牧獸醫(yī)，2005，1:39-41。近年來，大量試驗(yàn)成果表明，與黑色素合成調(diào)控相關(guān)的基因有很多，如 TYR、MC1R、C-KIT、MSH、ACIH、ATRN、Agout1、LYST, EDN、Dmbxl 及 MGF等，其中Agouti就是一個(gè)重要的黑色素調(diào)控基因，參見:師科榮，王愛國，李寧等.中國地方豬種黑素皮質(zhì)激素受體I基因(MClR)的單核苷酸多態(tài)性.中國科學(xué)C輯，2004，34 (2):144-149.。Parsons等通過經(jīng)典遺傳學(xué)方式分析得知Agouti基因座與被毛顯性白色相關(guān)，參見:Parsons Y.M, Fleet M.R, Cooper D.ff.1nvestigation of the gene responsible forrecessive pig mentation in Australian Merino sheep.ProcAssocAdvancAnimBreed.Genet,1997,6th~10th:447-451.；Parsons Y.M, Fleet M.R, Cooper D.ff.1solation of theovine Agouti coding sequence.Pigment Cell Research, 1999, 12(7):394-397.。Royo等研究Xalda羊Agouti基因在皮膚中mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)白色個(gè)體Agouti表達(dá)量高，見:Royo L.J, Alvarez I,Arranz J.J, Fernandez I, Rodriguez A, Perez-Pardal L, GoyacheF.Differences in the expression ofthe ASIP gene are involved in the recessiveblack coat colour pattern in sheep:evidence from the rare Xalda sheep breed.Animal Genetics, 2008, 39 (3):290-293.。Norris 等研究表明在 Soay、澳洲美利奴羊中顯性白色是由于一段包含ASIP編碼基因、AHCY編碼區(qū)和ATCH啟動(dòng)子序列多拷貝的190Kb串聯(lián)片段，由于多拷貝的ATCH啟動(dòng)子啟動(dòng)多拷貝的Agouti基因高表達(dá)而形成，參見:NorrisBelinda J, Whan Vicki A.A gene duplication affecting expression of the ovineASIP gene is responsible for white and black sheep.Genome Research, 2008,18(8):1282-1293.。因而開展Agouti基因拷貝數(shù)變異檢測對(duì)于開展綿羊毛色分子標(biāo)記輔助選擇育種的研究具有指導(dǎo)意義。[0003]目前檢測拷貝數(shù)變異CNV的方法包括:基于芯片和DNA測序的高通量分析方法的比較基因組雜交技術(shù)(CGH芯片)、BAC芯片技術(shù)、SNP分型芯片和寡核苷酸芯片技術(shù)等，此外還有基于PCR技術(shù)的靶向分析的多重?cái)U(kuò)增探針雜交技術(shù)和依賴于連接的多重探針擴(kuò)增技術(shù)以及高分辨率TILING芯片以及基于芯片技術(shù)的MAPH(程玉強(qiáng)，郭衛(wèi)星，程樹群.基因拷貝數(shù)異常的研究進(jìn)展.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33 (7):789-795.)。目前的新方法的基礎(chǔ)也是基于DNA測序建立的，但以上方法都不適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室操作。SouthernBlot 也能用于測定基因拷貝數(shù)，參見:QIU Jie-ren, XU Ying, YU Fu-gen.Determiningthe Copy Number of Exogenous Gene in Transgenic Plant by SYBR Green Real-timeQuantitative PCR.Agricultural Science Technology, 2011,12 (6):829-831 ;李緩，任長虹，吳永紅，葉巧，石錦平，屈武斌，鄭曉飛，劉虎岐，張成崗.多重PCR在質(zhì)?？截悢?shù)檢測中的應(yīng)用.中國生物工程雜志，2011,31(6):93-98.，但其操作繁瑣且很難絕對(duì)定量。Norris等設(shè)計(jì)一種檢測Agouti基因拷貝數(shù)的非對(duì)稱性競爭PCR方法，該設(shè)計(jì)是基于測序技術(shù)通過測定競爭性PCR擴(kuò)增同一起始位點(diǎn)到連接點(diǎn)峰圖面積A242或5斷裂點(diǎn)峰圖面積A238，通過 A242/(A242+A238)比值來確定拷貝數(shù)，參見:Norris Belinda J, Whan Vicki A.A geneduplication affecting expression of the ovine ASIP gene is responsible forwhite and black sheep.Genome Research, 2008,18(8):1282-1293 ;Henshall JM, WhanVA,Norris BJ.Reconstructing CNV genotypes using segregation analysis !combiningpedigree information with CNV assay.Genetics Selection Evolution, 2010, 42 (34):2-8.。但這種方法比較復(fù)雜，臨床獸醫(yī)難以熟練掌握操作性技術(shù)，并且需要測序儀等大型儀器，因此不適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種可克服現(xiàn)有技術(shù)不足，可用于檢測控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異的試劑盒。
[0005]本發(fā)明的控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒內(nèi)有序列分別為SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2的兩條引物核苷酸和標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒載體SEQ ID NO:6核苷酸序列。
[0006]為方便使用，本發(fā)明的控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒內(nèi)還可放置有相關(guān)試劑，如:SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(含 Ex Taq HS, dNTPMixture, Mg2+, Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II,等。
[0007]本發(fā)明試劑盒的最佳使用方法是:PCR最佳反應(yīng)體系為18 iiL，其中包含SYBRPremix Ex Taq (2 X) 9 U L, Rox Reference Dye0.4 U L, SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 引物(10 u tM/ u L) # 0.8 u L, ddH206 u L,模板 DNAl u L。PCR 條件:95°C預(yù)變性 3min ;95°C變性10s，60°C復(fù)性延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，然后加溶解曲線階段，65°C升溫至95°C，根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性和Ct值。
[0008]本發(fā)明試劑盒的使用方法是首先將已知濃度的pMD19_Agouti標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒倍比稀釋5個(gè)梯度，選取其中5個(gè)濃度梯度作為計(jì)算Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，然后分別中加入試劑盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:
2和SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(含 Ex Taq HS, dNTP Mixture,Mg2+, TliRNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II 后，在熒光定量 PCR 上進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性，根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的Ct值計(jì)算Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程。然后將待檢羊只的DNA為熒光定量PCR模板，然后再分別中加入試劑盒中的引物核苷酸序列 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2 和SYBR? Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)(含 Ex Taq HS, dNTP Mixture, Mg2+，Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROXReference Dye II后，在熒光定量PCR上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性，將獲得的待測樣品的Ct值代入Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算待測樣品拷貝數(shù)。
[0009]本發(fā)明實(shí)質(zhì)上是一種Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒，這一檢測試劑盒提供了一種快速、簡便、準(zhǔn)確的新檢測手段。本發(fā)明改進(jìn)了現(xiàn)有技術(shù)中Agouti基因拷貝變異檢測中的缺點(diǎn)。由于該方法引入了特異性擴(kuò)增引物和SYBR Green Buffer體系,使得Agouti基因拷貝變異檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，并避免了漏檢和誤檢。用大量已知不同Agouti基因拷貝數(shù)的標(biāo)本和進(jìn)行比對(duì)實(shí)驗(yàn)并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測序驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)，本試劑盒特異性較好，吻合度為100%。本發(fā)明的試劑盒經(jīng)過多次不同的重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。在實(shí)驗(yàn)樣本基因組DNA應(yīng)用本發(fā)明中試劑盒中的特異引物進(jìn)行擴(kuò)增后，可直接應(yīng)用熒光定量PCR儀分析儀進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析，而無需現(xiàn)有技術(shù)中Agouti基因拷貝變異檢測方法在PCR擴(kuò)增后在大型測序儀中進(jìn)行毛細(xì)電泳檢測后還需要應(yīng)用不對(duì)稱競爭性PCR技術(shù)進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析，從而擺脫了測序儀等大型儀器設(shè)備的依賴，而且操作步驟簡單，普通獸醫(yī)臨床人員易于熟練掌握應(yīng)用。總之，本發(fā)明較上述已有Agouti基因拷貝變異檢測方法準(zhǔn)確、快速、簡便、成本低、實(shí)用，具有很好的實(shí)用價(jià)值和市場價(jià)值。
[0010]由前述內(nèi)容可知，本發(fā)明所涉及的檢測方法是建立利用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Agouti基因拷貝數(shù)變異的簡單方便的方法，采用這本發(fā)明的用于檢測Agouti基因拷貝數(shù)變異可克服現(xiàn)有技術(shù)不足。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1為質(zhì)粒DNA和待測樣本基因組DNA PCR擴(kuò)增Agouti片段電泳圖，顯示常規(guī)PCR擴(kuò)增特異性片段，2%的瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳在紫外燈下觀察，可看到與目的片段大小一致的電泳條帶，從右到左依次是DNA分子量Marker (IOObp DNA Ladder Marker)、pMD19_Agouti 和待測綿羊 Agouti 基因?qū)崟r(shí)突光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果。圖中Marker為DNA分子量Marker，1、2為樣本基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，3、4為質(zhì)粒DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0012]圖2為pMD19-Agouti質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示pMD19_Agouti質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖中:橫坐標(biāo)表示pMD19-Agouti質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的DNA濃度，縱坐標(biāo)表示循環(huán)閾值(Ct值)。
[0013]表1顯示待測綿羊Agouti基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)Ct值和基因拷貝數(shù)?！揪唧w實(shí)施方式】
[0014]綿羊Agouti基因拷貝變異檢測標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程的制備
(1)引物設(shè)計(jì)和合成
參照綿羊 Agouti 基因 DNA 序列(Genbank N0.EU420023.1)和 mRNA 序列(GenbankN0.NM001134303.1)在內(nèi)含子3和外顯子4之間的一段保守序列，運(yùn)用primer5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，引物序列(5' —3' )SEQ ID NO:1:GTTAAGTGTTGATGGCGGAG ；SEQ IDNO:2:GTTCTTCATCGGAGCCTTTC，擴(kuò)增長度193bp，以構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD19_Agouti。所有引物均由上海生工合成并采用LLTRAPAGE純化方式純化。
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【權(quán)利要求】
1.一種控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)有序列分別為SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的兩條引物核苷酸和pMD19- Agouti標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒載體SEQ ID NO: 3核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒，其特征在于試劑盒內(nèi)還放置有 SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)(含 Ex Taq HS, dNTPMixture, Mg2+, Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的試劑盒的使用方法，其特征是:PCR最佳反應(yīng)體系為18μ?，其中包含 SYBR Premix Ex Taq (2 X) 9 μ?,--οχ Reference Dye 0.4 μ?, SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2 引物(10μΜ/μ L)各(λ 8 μ?, ddH20 6 μ?，模板 DNA I μ?，PCR 條件:95 °〇預(yù)變性3 min ；95 °C變性10 s，60 1:復(fù)性延伸30 S，共40個(gè)循環(huán)，然后加溶解曲線階段，65°C升溫至95 °C，根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性和循環(huán)閾值Ct。
4.權(quán)利要求1或2所述的控制綿羊毛色Agouti基因拷貝變異檢測試劑盒的使用方法，其特征在于首先將權(quán)利要求1中已知濃度的pMD19- Agouti標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒倍比稀釋6個(gè)梯度，選取其中5個(gè)濃度梯度作為計(jì)算Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程的熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板，然后分別中加入權(quán)利要求1所述所述試劑盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 和權(quán)利要求 2 中所述的 SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)(含 ExTaq HS, dNTP Mixture,Mg2+, Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II 后，在熒光定量PCR上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性，根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的Ct值計(jì)算Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程；再以待檢羊只的DNA為熒光定量PCR模板，然后分別中加入權(quán)利要求1所述所述試劑盒中的引物核苷酸序列SEQ ID NO:I 和 SEQ ID NO:2 和權(quán)利要求 2 中所述的 SYBR? Premix Ex Taq? (Tli RNaseH Plus)(含Ex Taq HS, dNTP Mixture,Mg2+, Tli RNaseH, SYBR? Green I)和 ROX Reference Dye II 后，在熒光定量PCR上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)根據(jù)溶解曲線判斷產(chǎn)物特異性，將獲得的待測樣品的Ct值代入權(quán)利要求4所得的Ct值標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程計(jì)算待測樣品拷貝數(shù)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103740825SQ201410009422
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2014年1月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月8日
【發(fā)明者】岳耀敬, 楊博輝, 郭婷婷, 劉建斌, 韓吉龍, 孫曉萍, 郭健, 牛春娥, 馮瑞林 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所