分泌抗鴨源ndv分離株單克隆抗體的雜交瘤細胞株的建立的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分泌抗鴨源NDV分離株單克隆抗體的雜交瘤細胞株的建立，屬于分子免疫學和病毒學【技術領域】。本發(fā)明以鴨NDV分離株SD03原核表達純化的HN蛋白為免疫原，研制了1株能分泌抗鴨源NDV分離株單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號為保藏號為CCTCC?C2013173。該雜交瘤細胞株分泌的NDV特異性單克隆抗體不會和新城疫疫苗株發(fā)生特異性結合，而能和新城疫臨床野毒株發(fā)生特異性結合；從而能作為鑒別試劑用于新城疫疫苗毒LaSota和臨床野毒株的鑒別。該單克隆抗體可作為實驗室鑒別試劑用于鑒別新城疫疫苗毒和臨床野毒株，其特異性強；其靈敏度為1：212血凝單位；具備靈敏度高的優(yōu)點。
【專利說明】分泌抗鴨源NDV分離株單克隆抗體的雜交瘤細胞株的建立
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分泌抗鴨源NDV分離株單克隆抗體的雜交瘤細胞株的建立，屬于分子免疫學和病毒學【技術領域】。
【背景技術】
[0002]新城疫(Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒引起多種禽類的一種急性、高度接觸性傳染病，是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的重要傳染病之一，給各國養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。新城疫病毒屬于副粘病毒科(Paramyxoviridae)副粘病毒亞科(Paramyxovirus)腿腺炎病毒屬成員，其宿主范圍廣泛，迄今已知能自然或人工感染的鳥類超過250種。自1926年從印度尼西亞爪哇首次分離到NDV以來，世界上已發(fā)生了 4次ND大流行，雖然NDV只有一個血清型，但是每次ND流行都會有新的基因型出現(xiàn)，且具有一定的地域性。ND病毒(NDV)的分子流行病學研究表明:自20世紀90年代中期以來，我國流行的NDV強毒，在鴿上主要為VI b亞型，其他家禽90%以上為基因VII型?；騐II型病毒與我國使用最廣泛的基因II型疫苗病毒(LaSota)之間存在明顯的遺傳差異和抗原差異，這是我國免疫雞群發(fā)生非典型ND的最重要的原因。
[0003]目前區(qū)分疫苗株LaSota和野毒株的方法有:一，分離病毒測定生物學毒力指標，包括雞胚平均死亡時間(MDT)U日齡雞胚腦內(nèi)接種指數(shù)(ICPI)、6周齡雞靜脈內(nèi)接種致病指數(shù)(IPVI) ;二，通過一對NDV特異的簡并引物，進行RT-PCR擴增，獲得的PCR擴增片段并送公司進行測序，根據(jù)序列即可判斷強弱毒。上述方法均繁瑣費時。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明以鴨NDV分離株SD03原核表達純化的HN蛋白為免疫原，研制了 I株能分泌抗鴨源NDV分離株單克隆`抗體的雜交瘤細胞株。該雜交瘤細胞株分泌的NDV特異性單克隆抗體不會和新城疫疫苗株發(fā)生特異性結合，而能和新城疫臨床野毒株發(fā)生特異性結合；從而能作為鑒別試劑用于新城疫疫苗毒LaSota和臨床野毒株的鑒別。
[0005]本發(fā)明的雜交瘤細胞株，保藏號為CCTCC C2013173。該雜交瘤細胞株能分泌抗鴨源NDV單克隆抗體；雜交瘤細胞株生長至上清變黃時，開始分泌抗鴨源NDV單克隆抗體。
[0006]本發(fā)明還提供了一種抗鴨源NDV單克隆抗體，由保藏號為CCTCC C2013173的雜交瘤細胞株產(chǎn)生。該單克隆抗體在雜交瘤細胞株生長至上清變黃開始分離，說明本發(fā)明的抗體物理宏觀特征明顯，易于獲取。該單克隆抗體可作為實驗室鑒別試劑用于鑒別新城疫疫苗毒和臨床野毒株，其特異性強；其靈敏度為1:212血凝單位；具備靈敏度高的優(yōu)點。
[0007]本發(fā)明還提供了一種用于鑒別新城疫疫苗毒和臨床野毒株的試劑，含有保藏號為CCTCC C2013173的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的抗鴨源NDV單克隆抗體。該試劑，其中抗鴨源NDV單克隆抗體的濃度為1.51mg/mL。
[0008]本發(fā)明還提供了一種采用上述抗鴨源NDV單克隆抗體鑒別新城疫疫苗毒和臨床野毒株的方法，是以碳酸鹽緩沖液稀釋的10%體積濃度的病毒液包被96孔ELISA板，100 μ I/孔，4°C過夜;PBST洗板3次，拍干;加入封閉液，350 μ I/孔，37°C培養(yǎng)箱孵育2h，洗滌3次，拍干；將1.51mg/mL抗鴨源NDV單克隆抗體加入各孔，100 μ I/孔，37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗3次，拍干；用封閉液將HRP羊抗鼠IgG酶標二抗按1:5000稀釋，ΙΟΟμΙ/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，拍干；以TMB底物顯色液，按100 μ?/孔加入包被板，室溫下避光顯色20min加終止液，2M H2S04終止顯色，450nm檢測各孔的OD值；0D值小于等于0.3865為陰性，表示被測病毒為新城疫疫苗毒；0D值大于0.3865為陽性，表示被測病毒為新城疫臨床野毒株。所述封閉液、終止液均為本領域常規(guī)試劑。
[0009]本發(fā)明的保藏號為CCTCC C2013173的雜交瘤細胞株是通過對SEQ ID N0.1所示基因序列的NDV-HN蛋白的表達和純化，免疫動物，細胞融合等實驗步驟實現(xiàn)的。
[0010]制備分泌抗鴨源NDV單克隆抗體雜交瘤細胞株的具體步驟如下:
采用PCR擴增法獲取如SEQ ID N0.1所示基因片段，所用正向引物為5 '-CCGGAATTCATACCCTCATTTGACATGAG-3'如 SEQ ID N0.2 所示，含 EcoRI 酶切位點；所用反向引物為:5' - CCCAAGCTTTTAAACTCTATCATCCTTGAGG-3'如 SEQ ID N0.3 所示，含 Hind III酶切位點。然后段利用pET28(a)質粒獲得P ET28(a)-HN重組質粒。用IPTG誘導表達帶有HIS標簽的His-HN融合蛋白，采用蛋白純化試劑盒純化His-HN融合蛋白。純化后的His-HN融合蛋白免疫Balb/C小鼠，然后獲取小鼠脾淋巴細胞。將瘤細胞SP2/0與被免疫的小鼠的脾淋巴細胞融合，然后滴加于提前鋪入飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后每個細胞培養(yǎng)孔補加原孔一半體積的新鮮配置的HAT培養(yǎng)基，待融合的雜交瘤細胞生長至孔底十分之一，且上清變黃時進行檢測和篩選。
[0011]篩選雜交瘤細 胞的方法:
方法一、酶聯(lián)免疫吸附實驗將純化后的原核表達產(chǎn)物HiS-HN融合蛋白包被ELISA板，將雜交瘤細胞分泌的單抗(即細胞培養(yǎng)物上清)與之結合，陽性孔的OD值與陰性對照的OD值得比值不小于2 ;
方法二、Western Blot采用蛋白轉印免疫印跡方法確定與單抗發(fā)生結合反應的蛋白分子量，出現(xiàn)特異性反應的蛋白條帶，篩選得到抗NDV-HN的單克隆抗體；
方法三、細胞間接免疫熒光將SD03病毒接種雞胚成纖維細胞，使該單抗與病毒結合，采用間接免疫熒光篩選抗NDV-HN的單克隆抗體，在熒光顯微鏡下觀察。
[0012]通過上述方法一篩選得到陽性克隆，將其擴大培養(yǎng)并進行3次亞克隆得到一株穩(wěn)定分泌抗新城疫病毒SD03的雜交瘤細胞1C8。利用方法二和方法三對利用該雜交瘤細胞制備的單抗進行生物免疫學技術研究，進一步鑒定其生物學特性。
[0013]本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的蛋白質和核酸化學、分子生物學、細胞和組織培養(yǎng)、微生物學、免疫學相關技術術語和實驗室操作步驟均為相應領域內(nèi)廣泛使用的術語和常規(guī)步驟。
[0014]保藏信息
保藏時間:2013年11月30日 保藏單位名稱:中國典型培養(yǎng)物保藏中心 保藏編號:CCTCC NO:C2013173 保藏單位地址:中國.武漢.武漢大學分類命名:雜交瘤細胞株1C8【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為His-HN蛋白純化后的十二烷基煩酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)圖， 圖中M為Protein marker (KD) 1:未純化的重組蛋白；2:過柱純化的重組蛋白；
圖2為單抗1C8與HN蛋白特異性結合蛋白質免疫印跡(Western blot)圖，
圖中M為Protein Marker (KD) ; 1: 1C8與表達蛋白的免疫印跡2: 1C8與SD03病毒尿囊液蛋白的免疫印跡；
圖3為間接免疫熒光檢測法檢測單克隆抗體(200倍)圖，
圖中A為陽性對照；B為單抗1C8;C為陰性對照。
【具體實施方式】
[0016]實施例1
NDV-HN基因的克隆及測序
參照NDV鴨源分離株SD03的HN基因序列，設計合成HN基因表達引物，正向引物為5' - CCGGAATTCATACCCTCATTTGACATGAG-3'如 SEQ ID N0.2所示，含EcoRI 酶切位點，反向引物為 5' - CCCAAGCTTTTAAACTCTATCATCCTTGAGG-3'如 SEQ ID N0.3 所示，含 Hind III酶切位點。利用上述引物PCR擴增SD03的HN基因開放閱讀框內(nèi)523-1716位核苷酸，DNA純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，將其插入pET28 (a)載體，獲得pET28 (a) -HN重組質粒。將該重組質粒按常規(guī)方法轉化入CaCl2法制備的感受態(tài)細胞BL21，酶切法鑒定陽性克隆，陽性克隆送往測序公司測序，所述NDV-HN基因的基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0017]上述所采用的PCR擴增、EcoRI和Hind III雙酶切、DNA回收、連接與轉化等均為現(xiàn)有技術。
[0018]實施例2
His-HN蛋白的表達和純化
1）將含有重組質粒的BL21菌接種于含卡那霉素(Kan)的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)挑取單菌落接種于含Kan (終濃度為50 μ g/ml)的500ml LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩(200rpm)，培養(yǎng)至0D600=0.6，加入IPTG至終濃度為0.6mmol/L，37°C繼續(xù)培養(yǎng)6h，大量誘導表達HN蛋白。
[0019]2)將上述菌液12，000g，4°C，20min離心后棄上清，用15ml PBS重懸。超聲波破碎菌體。
[0020]3) 4°C, 12, OOOg 離心 20min,收集沉淀。
[0021]4)用Washimg buffer對上一步獲得的沉淀進行充分的洗漆，12, 000g,4°C離心20min，棄去上清，盡量的將細菌碎片除去。
[0022]5)將上一步得到的沉淀再用Resuspension buffer進行充分的懸浮，12, 000g, 4°C離心20min,棄去上清,稱量包涵體的重量。
[0023]然后按照His ^Bind Purification Kit說明書的實驗步驟對獲得的包涵體進行純化，具體步驟略，SDS-PAGE分析蛋白純化的結果，用考馬斯亮藍法(Bradford)法測定純化蛋白的濃度。[0024]上述蛋白純化按照His.Bind Purification Kit蛋白純化試劑盒說明書步驟進行，Washimg buffer、Resuspension buffer為試劑盒中試劑；Bradford法測蛋白濃度及SDS-PAGE電泳的具體實驗步驟參照分子克隆實驗指南(科學出版社2002 [美]J.薩姆布魯克D.W拉塞爾著，黃培堂等譯)進行。
[0025]實施例3 動物免疫
以上述提純的His-HN融合蛋白免疫6周齡Balb/C雌性小鼠，每次每只的免疫劑量為50ug，免疫方法為腹腔注射，共免疫四次。每次免疫的間隔期為2周，首免用弗氏完全佐劑按體積比1:1的比例乳化蛋白，二免至四免用弗氏不完全佐劑按體積比1:1乳化蛋白。三次免疫一周后，小鼠眼眶采血測其效價，監(jiān)測血清抗體效價。四免兩周后，選擇效價最高的小鼠，用不加佐劑的蛋白腹腔注射加強免疫一次，3d后取小鼠脾臟淋巴細胞與SP2/0細胞融合。
[0026]實施例4 細胞融合
融合前I~2d按照常規(guī)方法制備腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞，將其密度調(diào)整為2-5 X105/ml，按照IOOul/孔鋪入96孔板。將培養(yǎng)板放入37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。
免疫小鼠眼球采血，制備血清備用。無菌操作取小鼠脾臟，剔除脂肪組織后，按照常規(guī)方法制備脾臟淋巴細胞， 活細胞計數(shù)后備用。
[0027]用無血清DMEM培養(yǎng)基將處于對數(shù)生長期的SP2/0吹下，加入融合管內(nèi)，將免疫脾臟淋巴細胞也加入同一融合管內(nèi)；1000rpm離心IOmin后棄上清,將融合管置手掌上來回輕輕震動以使沉淀松散。45s內(nèi)加入I mL預熱的濃度為50%的PEG1500，再于90s內(nèi)加入DMEM培養(yǎng)基30mL，37°C溫育15min后800rpm離心lOmin，用60mLHAT培養(yǎng)基懸浮，滴加于提前鋪入飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，置37°C，5-6%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后每個細胞培養(yǎng)孔補加原孔一半體積的新鮮配置的HAT培養(yǎng)基，然后每天觀察SP2/0細胞和脾細胞對照孔，當SP2/0細胞和脾細胞全部死亡時，用新鮮配制的HT培養(yǎng)基全部置換出HAT培養(yǎng)基。逐日觀察，待融合的雜交瘤細胞生長至孔底十分之一，且上清變黃時進行檢測。
[0028]實施例5
陽性克隆的篩選與亞克隆
克隆的篩選主要采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA):
O包被:取純化的重組蛋白His-HN，以碳酸鹽緩沖液(每200ml碳酸鹽緩沖液含Na2CO3
0.32g，NaHCO3 0.58g)稀釋至 lug/mL 包被反應板，100 μ I/ 孔，4°C過夜。
[0029]2)洗滌:甩去酶標板中的包被液，用PBST (PBS,0.05%Tween-20)加滿各孔，室溫靜置3min，棄去PBST，洗滌3次，拍干。
[0030]3)封閉:各孔加入封閉液(含5% BSA的PBST)，350y I/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育2h,洗洚3次，3min/次,拍干。
[0031]4)加樣:將待檢血清按梯度稀釋后加入包被板，ΙΟΟμΙ/孔，同時設立陰陽性血清對照。置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，拍干。
[0032]5)用封閉液將HRP羊抗鼠IgG酶標二抗按1:5000稀釋，ΙΟΟμΙ/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，拍干。[0033]6)顯色:使用TMB單組份顯色試劑盒(TIANGEN公司產(chǎn)品)按100 μ?/孔加入包被板，室溫下避光顯色20min加終止液，2M H2SO4終止顯色。
[0034]7)用酶聯(lián)免疫檢測儀測其在波長450nm檢測各個孔的OD值，陰性對照OD45tl值為N，陽性對照OD45tl值為P。
[0035]ELISA陽性孔細胞留作擴大培養(yǎng)用，再經(jīng)3次亞克隆獲得穩(wěn)定分泌抗SD03單抗的雜交瘤細胞株1C8。
[0036]實施例6
I CS的生物學特性的進一步鑒定
(I)間接免疫熒光檢測法(IFA)
使用9日齡SPF雞胚按常規(guī)方法制備雞胚成纖維細胞，鋪入96孔細胞培養(yǎng)板，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)待細胞長成單層時接種SD03毒株，37°C作用2h后，更換含1%胎牛血清的DMEM，3天后做IFA檢測，步驟如下:
倒出細胞培養(yǎng)液，用PBS洗3次每次3min ;丙酮:乙醇(3:2)固定細胞7-8 min，用PBS洗3次，每次5min ；以細胞培養(yǎng)上清為一抗按100 μ L/孔加入，37°C溫箱撫育60 min,用PBS洗3次，每次5min ;以FITC標記羊抗鼠IgG為二抗，37°C溫箱60 min，用PBS洗3次，每次5min ;每孔加入100 μ I 50%甘油；倒置熒光顯微鏡下觀察,拍照,其結果如圖3所示。
[0037](2) Western-blot 檢測
I)取ImL誘導表達的菌液，12000r/min,離心2min,棄上清,加100 μ I滅菌雙蒸水,懸浮沉淀，加100 μ I 2χ上樣緩沖液，煮沸5-10min。取20 μ I/孔加樣，進行SDS-PAGE電泳。
[0038]2)剪一張與凝膠大小相同的NC膜，用去離子水浸透，同時將與凝膠大小相同的兩張濾紙及纖維墊用轉印緩沖液浸透。
[0039]3)按三明治法安裝轉印裝置，即負極夾-纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-纖維墊-正極夾，使NC膜位于轉印的正極面，凝膠位于負極面，其間無任何氣泡間隙。將轉印裝置放入轉移電泳儀中，加入轉移緩沖液，140mA電泳2h。
[0040]4)轉印結束后，將轉移后的NC膜用去離子水漂洗一遍，將NC膜浸泡于封閉液中，4°C封閉過夜。用PBST洗滌NC膜三遍，每次10 min。
[0041]5)—抗孵育:棄去封閉液，將NC膜放入用TBST按一定比例稀釋好的一抗(針對NDVHN蛋白上與血凝特性和中和活性有關抗原位點的單抗和兔多抗)中，于平緩搖動的水平搖床上37°C溫育2h (或4°C過夜)。
[0042]6)二抗孵育:棄去一抗，用TBST洗滌NC膜3次，每次lOmin。將NC膜移至用封閉液按一定比例稀釋好的二抗(HRP標記的山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG)中，于平緩搖動的水平搖床上37°C溫育2h。
[0043]7)蛋白檢測:棄去二抗溶液，用TBST洗滌3次，每次lOmin。之后于暗室中將NC膜移至新鮮配制的ECL超敏發(fā)光液中顯色。將發(fā)光顯色的NC膜用保鮮膜覆蓋，平鋪于曝光夾內(nèi)。在其上放入一張適當大小的X光膠片，曝光5min~30min。取出膠片放入顯影液內(nèi)，振蕩直至條帶可見后定影，清水沖洗，結果如圖2所示。1C8與SD03全病毒蛋白及表達的HN蛋白均能反應。
[0044]實施例7 單抗亞型的鑒定利用SBA單克隆抗體分型試劑盒(5300-01)對1C8雜交瘤細胞培養(yǎng)上清進行亞型的鑒定，具體步驟參見試劑盒說明書。該試劑盒主要是采取雙抗體夾心法，先在96孔板上包被抗體捕獲二抗，然后加入待測的分泌1C8雜交瘤細胞的培養(yǎng)物上清液，37°C溫育lh。培養(yǎng)上清液中的目標蛋白(即1C8單抗)便會與96孔板上固相二抗結合，PBST洗板去除未結合的游離物質，然后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的酶標二抗，37 °C孵育Ih，洗板去除游離物質，加入TMB底物顯色液顯色15~30min，加入終止液終止反應，在450nm處測定OD值。
[0045]通過實驗分析，1C8單抗屬于IgGl，κ鏈。
[0046]實施例8
單抗1C8與疫苗株及實驗室分離株的反應性
采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定單抗1C8與NDV疫苗株及其他毒株包括標準強毒株、實驗室分離株的反應性。具體是以碳酸鹽緩沖液稀釋的1:10的病毒液包被96孔ELISA板，100 μ I/孔，4°C過夜；PBST洗板3次，拍干；加入封閉液，350 μ I/孔，37°C培養(yǎng)箱孵育2h，洗滌3次，拍干；將1:20000稀釋的1C8 (1.51mg/mL)純化的單抗加入各孔，100 μ I/孔，同時設立陰、陽性對照，37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗3次，拍干；用封閉液將HRP羊抗鼠IgG酶標二抗按1:5000稀釋，ΙΟΟμΙ/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，拍干；以TMB底物顯色液，按100 μ?/孔加入包被板，室溫下避光顯色20min加終止液，2M H2S04終止顯色，450nm檢測各孔的OD值。(病毒和碳酸鹽緩沖液的體積比為1:10)
表1是1C8與NDV疫苗株及其他毒株的ELISA反應性結果，結果表明1C8與疫苗株LaSota ELISA結果陰性，與其他不同亞群和不同基因型的NDV分離株ELISA反應陽性，1C8單抗可作為實驗室診斷試劑用于鑒別診斷新城疫疫苗毒和臨床野毒株。
[0047]表1，單抗1C8與NDV疫苗株和其他毒株在ELISA實驗中的反應性
【權利要求】
1.一種分泌抗鴨源NDV分離株單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏號為CCTCCC2013173。
2.一種抗鴨源NDV單克隆抗體，由保藏號為CCTCC C2013173的雜交瘤細胞株產(chǎn)生。
3.一種用于鑒別新城疫疫苗毒和臨床野毒株的試劑，含有權利要求2所述的抗鴨源NDV單克隆抗體。
4.根據(jù)權利要求3所述的試劑，其中抗鴨源NDV單克隆抗體的濃度為1.51mg/mL。
5.根據(jù)權利要求1所述的雜交瘤細胞株，是通過對SEQID N0.1所示基因序列的NDV-HN蛋白的表達和純化，免疫動物，細胞融合等實驗步驟實現(xiàn)的。
6.一種采用上述抗鴨源NDV單克隆抗體鑒別新城疫疫苗毒和臨床野毒株的方法，是以碳酸鹽緩沖液稀釋的10%體積濃度的病毒液包被96孔ELISA板，100 μ I/孔，4°C過夜；PBST洗板3次，拍干；加入封閉液，350 μ I/孔，37°C培養(yǎng)箱孵育2h，洗滌3次，拍干；將`1.51mg/mL抗鴨源NDV單克隆抗體加入各孔，100 μ I/孔，37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗3次，拍干；用封閉液將HRP羊抗鼠IgG酶標二抗按1:5000稀釋，ΙΟΟμΙ/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，拍干；以TMB底物顯色液，按100 μ?/孔加入包被板，室溫下避光顯色20min加終止液，2M H2S04終止顯色，450nm檢測各孔的OD值；0D值小于等于0.3865為陰性，表示被測病毒為新城疫臨床野毒株；0D值大于0.3865`為陽性，表示被測病毒為新城疫疫苗毒。
【文檔編號】C12N5/20GK103773736SQ201410010006
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權日:2014年1月9日
【發(fā)明者】楊少華, 許傳田, 胡北俠, 黃慶華, 張琳, 張秀美 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所