副溶血性弧菌三重實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種副溶血性弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，包括三對(duì)特異性引物、EvaGreenPCR預(yù)混液、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，特異性引物包括副溶血性弧菌耐熱直接溶血素基因（tdh）、耐熱相關(guān)溶血素基因（trh）和毒素表達(dá)調(diào)控蛋白基因（toxR）的特異性引物。本發(fā)明試劑盒不但具有實(shí)時(shí)熒光PCR快速、靈敏和自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn)，而且基于熔解曲線技術(shù)進(jìn)行三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，不需要合成昂貴的檢測(cè)探針，檢測(cè)成本低，只需最為常規(guī)的FAM/SYBR通道即可完成3個(gè)靶基因的檢測(cè)，對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR儀的要求低，幾乎適用于所有市售實(shí)時(shí)熒光PCR儀。所述檢測(cè)周期短、檢測(cè)成本低、檢測(cè)結(jié)果可靠。
【專利說(shuō)明】副溶血性弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及副溶血性弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是1953年由Fujino等從日本一起食物中毒患者體內(nèi)分離到的一種革蘭氏陰性嗜鹽弧菌，是弧菌屬內(nèi)比較重要的致病菌之一，進(jìn)食被該菌污染的食物會(huì)引起食物中毒，臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。副溶血性弧菌是一種海洋細(xì)菌，主要來(lái)源于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品。該菌存活能力強(qiáng)，是沿海地區(qū)細(xì)菌性食物中毒中最為常見(jiàn)的病原菌。副溶血性弧菌傳統(tǒng)的檢測(cè)方法包括前增菌、選擇性增菌、選擇性培養(yǎng)、生化鑒定和血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等過(guò)程，操作繁瑣，鑒定周期長(zhǎng)。如果要確定菌株是否含有毒力因子，還需增加其他特殊的生化鑒定等實(shí)驗(yàn)，鑒定周期更加漫長(zhǎng)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)被越來(lái)越多的運(yùn)用到病原菌的鑒定中來(lái)。PCR技術(shù)包括普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR，普通PCR雖然具有操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是需要對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳跑膠等后處理，不易自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。實(shí)時(shí)熒光PCR是利用熒光信號(hào)伴隨著PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增而增加的原理，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，連續(xù)不斷地檢測(cè)反應(yīng)體系中熒光信號(hào)的變化，實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程，再結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，一次上機(jī)即可完成結(jié)果檢測(cè)，易自動(dòng)化。實(shí)時(shí)熒光PCR主要分為探針類和染料類兩種，探針類實(shí)時(shí)熒光PCR需要合成熒光標(biāo)記的探針，由于探針的合成成本較高，所以造成探針類實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)成本高；染料類實(shí)時(shí)熒光PCR雖然檢測(cè)成本低，但是由于早期主要使用非飽和熒光染料SYBR Green I，存在著穩(wěn)定性差和染料重分布等問(wèn)題，檢測(cè)靈敏度低而且不適用于多重實(shí)時(shí)熒光PCR，限制了染料類實(shí)時(shí)熒光PCR在檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用，隨著飽和熒光染料Eva Green和LC Green等的出現(xiàn)，染料類實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)靈敏度顯著提高，而且由于解決了染料重分布問(wèn)題可以結(jié)合熔解曲線技術(shù)用于多重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，因此已經(jīng)在檢驗(yàn)檢測(cè)領(lǐng)域顯示出了巨大的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種基于熔解曲線技術(shù)的副溶血性弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，通過(guò)一次反應(yīng)快速、經(jīng)濟(jì)和可靠的完成對(duì)副溶血性弧菌的特異性檢測(cè)和毒力基因檢測(cè)。
[0004]本發(fā)明試劑盒由EvaGreen PCR預(yù)混液、三對(duì)特異性引物、陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照組成，EvaGreen PCR預(yù) 混液包括PCR緩沖液、dNTP混合物、DNA聚合酶和飽和熒光染料EvaGreen ;陽(yáng)性對(duì)照為tdh、trh雙陽(yáng)性的副溶血性弧菌DNA提取液；陰性對(duì)照為超純水。
[0005]EvaGreen PCR預(yù)混液可購(gòu)買商品化的EvaGreen PCR預(yù)混液,也可自行配制。
[0006]三對(duì)特異性引物如下:
tdh 上游引物:5’ -CTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCC-3’tdh 下游引物:5’ -CCTGACGTTGTGAATACTGATTGACCATA-3’
trh 上游引物:5’ -TACCTTTTCCTTCTCCAGGTTCGG-3’
trh 下游引物:5’ -TCGTTTTATGTTTCGGTTTGTCCAGT-3’
toxR 上游引物:5’ -TCTTCTGACGCAATCGTTGAACCA-3’
toxR 下游引物:5’ -CTGATACTCACCAATCTGACGGAACTG-3’。
[0007]本發(fā)明利用該試劑盒檢測(cè)方法如下:
(1)提取待測(cè)樣品DNA；
(2)取特異性引物和EvaGreenPCR預(yù)混液，分別加入陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照或待測(cè)樣品DNA形成擴(kuò)增反應(yīng)體系；
【權(quán)利要求】
1.一種副溶血性弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含三對(duì)特異性引物、EvaGreen PCR預(yù)混液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，其中EvaGreen PCR預(yù)混液包括PCR緩沖液、dNTP混合物、DNA聚合酶和飽和熒光染料EvaGreen，陽(yáng)性對(duì)照為tdh、trh雙陽(yáng)性副溶血性弧菌DNA提取液，陰性對(duì)照為超純水，所述三對(duì)特異性引物的序列如下: tdh 上游引物:5’ -CTTCCATCTGTCCCTTTTCCTGCC-3’ tdh 下游引物:5’ -CCTGACGTTGTGAATACTGATTGACCATA-3’ trh 上游引物:5’ -TACCTTTTCCTTCTCCAGGTTCGG-3’ trh 下游引物:5’ -TCGTTTTATGTTTCGGTTTGTCCAGT-3’ toxR 上游引物:5’ -TCTTCTGACGCAATCGTTGAACCA-3’ toxR 下游引物:5 ’ -CTGATACTCACCAATCTGACGGAACTG-3，。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種副溶血性弧菌三重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，EvaGreen PCR預(yù)混液可購(gòu)買商品化的EvaGreen PCR預(yù)混液,也可自行配制。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103773858SQ201410010767
【公開日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】何培彥 申請(qǐng)人:嘉興市疾病預(yù)防控制中心