柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟：柚木無性系基因組DNA提取，基因組DNA的SSR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上測序儀分型，獲得柚木無性系指紋圖譜；本發(fā)明通過試驗(yàn)研究，優(yōu)化了柚木SSR分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增體系和程序，設(shè)計(jì)和篩選出柚木SSR多態(tài)性引物。本發(fā)明用篩選出來的15對具有多態(tài)性的柚木SSR引物，構(gòu)建了26個柚木無性系的DNA指紋圖譜。該方法經(jīng)濟(jì)、精確、快速和高效，為今后快速進(jìn)行無性系指紋圖譜構(gòu)建和鑒定、柚木種質(zhì)資源遺傳評價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種提供了技術(shù)支撐。
【專利說明】柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種喬木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，具體涉及一種柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]袖木(Tectonagrandis L.f.)為馬鞭草科(Verbenaceae)袖木屬(Tectona)高大喬木，天然分布于北緯9°~26°，東經(jīng)73°~104°的印度南部與中部、泰國北部、緬甸和老撾，是世界著名的熱帶珍貴用材樹種，素有“萬木之王”的美譽(yù)，其心材材質(zhì)堅(jiān)韌耐久，結(jié)構(gòu)致密，紋理美觀，是制造軍艦、碼頭、橋梁、建筑、家具、雕刻和木地板等的高級用材。全球木材貿(mào)易網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，2011年6月16~30日緬甸柚木市場的4類原木離岸價(jià)都已達(dá)到3471美元.m-3。國內(nèi)市場進(jìn)口柚木原木價(jià)格較高，杭州木材市場柚木價(jià)格為9000~18000元.m-3。正是具有生長快，材質(zhì)優(yōu)良，用途廣和投資回報(bào)率高等特點(diǎn)，柚木在熱帶、南亞熱帶地區(qū)廣為種植，是世界上人工林種植面積最大的4個樹種之一，也是單位面積產(chǎn)值最高的造林樹種。
[0003]我國引進(jìn)柚木栽培已有180多年的歷史，20世紀(jì)70年代初我國開始了柚木遺傳改良和培育技術(shù)的系統(tǒng)研究，為我國發(fā)展柚木事業(yè)提供了栽培材料和技術(shù)的保障。目前，我國柚木推廣種植范圍遍及10個省(自治區(qū))60多個縣(市)，總面積約1.5萬hm2。近年來，云南省、海南省把柚木列為主要造林樹種，廣東、廣西、福建、貴州省采用柚木造林的私人與企業(yè)也越來越多。柚木商品林種植多以組培優(yōu)良無性系為主,選育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和多抗的柚木優(yōu)良新品系并加以推廣 利用，提高良種化程度，是大力發(fā)展柚木種植業(yè)的前提。我國柚木研究人員經(jīng)過多年的努力，已獲得了一批適合我國不同立地條件和氣候的柚木優(yōu)良無性系，授權(quán)指定了個別組培單位進(jìn)行生產(chǎn)繁殖和推廣。
[0004]但是，目前市場上出售的柚木苗繁殖方法多樣，繁殖材料來源不清，苗木質(zhì)量良莠不齊，而現(xiàn)有技術(shù)憑人工經(jīng)驗(yàn)難以辨別出柚木不同無性系，導(dǎo)致我國柚木商品林發(fā)展良種使用率低，在很大程度上制約了我國柚木事業(yè)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供通過上述方法構(gòu)建的柚木無性系指紋圖譜在柚木無性系品種鑒定上的應(yīng)用。本發(fā)明通過研制一套柚木無性系鑒定方法，構(gòu)建出我國柚木無性系指紋圖譜，為柚木無性系的鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供技術(shù)支撐，并可有效監(jiān)督和規(guī)范我國各地柚木種植苗木的良種信息情況，提高柚木商品林發(fā)展良種化程度。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟:
[0008](I)柚木無性系基因組DNA提取[0009]以柚木無性系的葉片為材料，提取柚木無性系的基因組DNA，得到基因組DNA樣品;
[0010](2)柚木無性系基因組DNA的SSR擴(kuò)增
[0011]以步驟(1)中得到的基因組DNA樣品為模板，用柚木SSR多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0012](3)柚木無性系PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上測序儀分型
[0013]取步驟(2)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入超純甲酰胺和LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)，得到上樣液；將上樣液變性，降溫，然后進(jìn)行柚木無性系SSR分型；
[0014](4)獲得柚木無性系的指紋圖譜
[0015]用GeneMapper4.0軟件進(jìn)行譜帶分析，讀取每對引物擴(kuò)增出的SSR片段的大小(單位bp)，得到柚木SSR多態(tài)性引物構(gòu)建出的柚木無性系指紋圖譜(見表7)。
[0016]步驟(1)中所述的提取柚木無性系的基因組DNA優(yōu)選采用CTAB法提??；
[0017]步驟(1)中所述的基因組DNA樣品優(yōu)選是放于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> [0018] 步驟(2)中所述的柚木SSR多態(tài)性引物包括15對柚木SSR多態(tài)性引物，分別是 AJ968929、AJ968930、AJ968931、AJ968932、AJ968933、AJ968934、AJ968935、AJ968936、AJ968938、AJ968940、AJ968941、AJ968942、AJ968943、AJ511753、AJ511764，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID N0.1~30所示；
[0019]步驟(2)中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系優(yōu)選為:含濃度為25mM Mg2+的IOXbufferl.5 μ L,濃度為 IOmM 的 dNTPs0.03 μ L,酶活為 5U/μ L 的 Taq DNApolymerase(Taq DNA 酶)0.3 μ L,濃度為 IOng/ μ L 的 DNA1.5 μ L,濃度為 5 μ M 的 forward primer (正向引物)0.15 μ L,濃度為5 μ M的reverse primer (反向引物)0.15 μ L,濃度為Inmol/μ L的 fluorescent-dUTP (熒光-dUTP) 0.015 μ L,加 ddH20 至 15 μ L ;
[0020]步驟(2)中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序優(yōu)選為:采用Touch-Down PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、Tm+10°C至Tm°C退火30s、72°C延伸lmin，20個循環(huán)，每個循環(huán)降低0.50C ;94°C變性30s、Tm°C退火30s、72°C延伸lmin，26個循環(huán)；72°C延伸IOmin ；4 °C forever ；
[0021]所述的Tm (退火溫度)優(yōu)選為51、53或56°C ；
[0022]步驟(3)中所述的上樣液的體系優(yōu)選為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2yL，超純甲酰胺7.82yL，LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)0.18 μ L ;
[0023]步驟(3)中所述的變性的條件優(yōu)選為95°C變性5min ；
[0024]步驟(3)中所述的降溫的條件優(yōu)選是放入冰浴或4°C中進(jìn)行降溫4分鐘；降溫后盡快上樣分析；
[0025]步驟(3)中所述的進(jìn)行柚木無性系SSR分型優(yōu)選是將變性后PCR產(chǎn)物在ABI3130X1測序儀上進(jìn)行柚木無性系SSR分型；
[0026]步驟(5)中所述的讀取每對引物擴(kuò)增出的SSR片段的大小，其中，不同無性系能得到不同或相同大小的SSR片段，也有的無性系不含有個別引物擴(kuò)增的SSR片段，因此擴(kuò)增沒有產(chǎn)物；
[0027]—種柚木無性系指紋圖譜，通過上述方法構(gòu)建得到，如表7所示。
[0028]所述的柚木無性系指紋圖譜在柚木無性系品種鑒定上的應(yīng)用。[0029]利用柚木無性系指紋圖譜進(jìn)行柚木品種鑒別；依據(jù)15對柚木SSR多態(tài)性引物的檢測結(jié)果進(jìn)行判定:利用上述構(gòu)建方法，提取未知柚木無性系的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物上測序儀分型，獲得每對引物擴(kuò)增出的SSR片段大小(單位bp)，若與上述柚木無性系指紋圖譜中的片段完全一致，即獲得該未知柚木無性系的品系名稱。
[0030]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0031](I)本發(fā)明通過EMBL-EBI網(wǎng)站找到了柚木基因組DNA微衛(wèi)星序列，利用Serafer等相關(guān)軟件設(shè)計(jì)出了柚木SSR引物，通過試驗(yàn)研究，篩選出了 15對柚木SSR多態(tài)性引物，確定了每對引物的退火溫度；同時(shí)優(yōu)化了柚木SSR分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增體系和程序，最終獲得了基于熒光-dUTP和自動化測序儀的柚木SSR分子標(biāo)記技術(shù)體系。該方法經(jīng)濟(jì)、精確、快速和高效，為今后快速進(jìn)行柚木種質(zhì)資源遺傳評價(jià)、遺傳圖譜構(gòu)建、分子標(biāo)記輔助育種、無性系指紋圖譜構(gòu)建和鑒定提供了技術(shù)支撐。
[0032](2)利用上述方法，用適宜數(shù)量的具有多態(tài)性的柚木SSR引物，對柚木無性系基因組DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增和上測序儀進(jìn)行SSR分型，由于不同無性系所含的微衛(wèi)星片段重復(fù)數(shù)不同，從而對不同無性系擴(kuò)增分析得到的微衛(wèi)星片段大小不同，由此構(gòu)建出無性系的指紋圖譜。本發(fā)明用篩選出來的15對具有多態(tài)性的柚木SSR引物，構(gòu)建了 26個柚木無性系的DNA指紋圖譜，可把26個柚木無性系區(qū)分開，將為柚木無性系的鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供技術(shù)支撐，同時(shí)可有效監(jiān)督和規(guī)范我國各地柚木種植苗木的良種信息情況，提高柚木商品林發(fā)展良種化程度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1是26個柚木無性系的遺傳聚類圖。
[0034]圖2為5對引物29、30、31、32、33擴(kuò)增柚木無性系70-13的峰圖；
[0035]其中，29為 AJ968929、30 為 AJ968930、31 為 AJ96893U32 為 AJ968932、33 為AJ968933。
[0036]圖3為5對引物34、35、36、38、40擴(kuò)增柚木無性系70-13的峰圖；
[0037]其中34 為 AJ968934、35 為 AJ968935、36 為 AJ968936、38 為 AJ968938、40 為AJ968940。
[0038]圖4為5對引物41、42、43、53、64擴(kuò)增柚木無性系70-13的峰圖；
[0039]其中，41為 AJ96894U42 為 AJ968942、43 為 AJ968943、53 為 AJ511753、64 為AJ511764。
[0040]圖5為5對引物29、30、31、32、33擴(kuò)增柚木無性系70-29的峰圖；
[0041]其中，29為 AJ968929、30 為 AJ968930、31 為 AJ96893U32 為 AJ968932、33 為AJ968933。
[0042]圖6為5對引物34、35、36、38、40擴(kuò)增柚木無性系70-29的峰圖；
[0043]其中34 為 AJ968934、35 為 AJ968935、36 為 AJ968936、38 為 AJ968938、40 為AJ968940。
[0044]圖7為5對引物41、42、43、53、64擴(kuò)增柚木無性系70-29的峰圖；
[0045]其中，41為 AJ96894U42 為 AJ968942、43 為 AJ968943、53 為 AJ511753、64 為AJ511764?！揪唧w實(shí)施方式】
[0046]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0047]以下材料在文獻(xiàn)“抽木種源主要性狀聚合遺傳值的評價(jià).林業(yè)科學(xué)研究.1996，9 (I): 7-14”公開:印度種源3070、印度種源3071、印度種源3072、印度種源3074和尼日利亞種源3078。
[0048]以下材料在文獻(xiàn)“農(nóng)桿菌介導(dǎo)柚木腋芽原基遺傳轉(zhuǎn)化的研究.中國林業(yè)科學(xué)研究院.博士學(xué)位論文.2007”公開:無性系7531、無性系7544、無性系7552、無性系8301和無性系108。 [0049]以下材料在文獻(xiàn)“柚木無性系促萌與采穗圃營建技術(shù).中國林業(yè)科學(xué)研究院.碩士學(xué)位論文.2007”公開:無性系7514和無性系7559。
[0050]以下材料在文獻(xiàn)“柚木愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的研究.中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào).2012，32(3):53-58” 公開:無性系 7114。
[0051]以下材料在文獻(xiàn)“柚木種子園無性系開花特性與結(jié)實(shí)差異分析.種子.2011，30(8):5-8”公開:無性系70-13、無性系70-29、無性系71-5、無性系71-22、無性系71-38、無性系71-46、無性系72-10、無性系72-19和無性系7549。
[0052]以下材料在文獻(xiàn)“柚木嫩枝扦插.中南林學(xué)院學(xué)報(bào).2005，25 (3) ”公開:無性系71-12。
[0053]無性系7137、無性系7412、無性系J731、無性系Z408、無性系7509、無性系7542、無性系7555和無性系3078-5，均購自中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所。
[0054]實(shí)施例1
[0055](I)柚木無性系基因組DNA提取。
[0056]柚木無性系70-13 (已在“柚木種子園無性系開花特性與結(jié)實(shí)差異分析”公開)的葉片材料，采用CTAB法提取柚木無性系70-13的基因組DNA，將DNA樣品放于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0057]所述的CTAB法的具體步驟如下:
[0058](a)取柚木無性系葉片0.2g于研缽中，液氮冷凍下迅速研磨成粉末。
[0059](b)將粉末轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入600 μ L65°C預(yù)熱的CTAB提取液，加入20 μ LRNase溶液(10mg/mL),充分混勻。
[0060](c)將離心管放入65°C水浴中溫浴30min，每隔7~8分鐘混勻I次。
[0061]Cd)取出離心管，加入600 μ L的Tris飽和酌.:氯仿(I:1),輕輕混勻5min后4~25°C、12000rpm,離心 IOmin0
[0062](e)取上清液于新離心管中，加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)，輕輕混勻5min后4 ~25°C、12000rpm,離心 IOmin0
[0063](f)取上清液于新離心管中，加入預(yù)冷的I倍體積的預(yù)冷異丙醇，輕輕搖勻，室溫放置2~3min。
[0064](g) 4~25°C、12000rpm,離心lOmin。倒去上清液,用75%的酒精顛倒漂洗沉淀2~3次。將酒精倒出后放入通風(fēng)櫥，把酒精揮發(fā)干后加入50 μ LI X TE溶解DNA。[0065]所述的CTAB 提取液包括如下成分:100mmol/L Tris-HCl (pH8.0), 20mmol/L EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，1.4mol/L NaCl,2%CTAB (w/v)，2%PVP (聚乙烯毗咯烷酮)，1%β -琉基乙醇(每次提取之前混合均勻后使用)。
[0066]所述的IXTE 包括如下成分:10mmol/L Tris-HCl、lmmol/L EDTA, ΡΗ=8.0。
[0067](2)柚木無性系基因組DNA的SSR擴(kuò)增。
[0068]以步驟(1)中得 到的基因組DNA樣品為模板，用篩選出的15對柚木SSR多態(tài)性引物(見表3)分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系見表2。
[0069]柚木SSR多態(tài)性引物篩選的具體步驟如下:
[0070]從EMBL網(wǎng)站上搜索到143條柚木基因組DNA微衛(wèi)星，用SSRhunter軟件分別找到其SSR序列的重復(fù)單元和重復(fù)數(shù)，再根據(jù)每條SSR序列兩端的側(cè)翼序列，用Primerf.0、01igo6.0或Serafer軟件設(shè)計(jì)出對應(yīng)的143對SSR引物。從26個柚木無性系(見表6)中任選5個柚木無性系基因組DNA樣品混合后作為樣品，用所設(shè)計(jì)的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系見表1。
[0071]表1柚木SSR引物預(yù)篩選PCR體系
[0072]
【權(quán)利要求】
1.一種柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟: (1)柚木無性系基因組DNA提取 以柚木無性系的葉片為材料，提取柚木無性系的基因組DNA，得到基因組DNA樣品； (2)柚木無性系基因組DNA的SSR擴(kuò)增 以步驟(1)中得到的基因組DNA樣品為模板，用柚木SSR多態(tài)性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)柚木無性系PCR擴(kuò)增產(chǎn)物上測序儀分型 取步驟(2)中獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入超純甲酰胺和LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)，得到上樣液；將上樣液變性， 降溫，然后進(jìn)行柚木無性系SSR分型； (4)獲得柚木無性系的指紋圖譜用GeneMapper4.0軟件進(jìn)行譜帶分析,讀取每對引物擴(kuò)增出的SSR片段的大小，得到柚木SSR多態(tài)性引物構(gòu)建出的柚木無性系指紋圖譜； 步驟(2 )中所述的柚木S S R多態(tài)性引物包括15對柚木S S R多態(tài)性引物，分別是AJ968929、AJ968930、AJ968931、AJ968932、AJ968933、AJ968934、AJ968935、AJ968936、AJ968938、AJ968940、AJ968941、AJ968942、AJ968943、AJ511753、AJ511764，其核苷酸序列依次如序列表SEQ ID N0.1~30所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(1)中所述的基因組DNA樣品是放于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(2)中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:含濃度為25mM Mg2+的IOXbufferl.5 μ L，濃度為IOmM的dNTPs0.03 μ L,酶活為 5U/ μ L 的 Taq DNA 酶 0.3 μ L，濃度為 IOng/ μ L 的 DNAL 5 μ L,濃度為5μ M的正向引物0.15yL，濃度為5μΜ的反向引物0.15 μ L，濃度為Inmol/μ L的熒光-dUTP0.015 μ L，加 ddH20 至 15 μ L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(2)中所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?采用Touch-Down PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30s、Tm+10°C至Tm°C退火30s、72°C延伸lmin，20個循環(huán),每個循環(huán)降低0.5°C;94°C變性30s、Tm°C退火 30s、72°C延伸 lmin, 26 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；4°C forever ； 所述的Tm為51、53或56°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(3)中所述的上樣液的體系為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物2yL，超純甲酰胺7.82 μ L, LIZ-500分子量內(nèi)標(biāo)0.18 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(3)中所述的變性的條件為95°C變性5min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(3)中所述的降溫是放入冰浴或4°C中進(jìn)行降溫4分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的柚木無性系指紋圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于:步驟(3)中所述的進(jìn)行柚木無性系SSR分型是將變性后PCR產(chǎn)物在ABI3130X I測序儀上進(jìn)行柚木無性系SSR分型。
9.通過權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法得到的柚木無性系指紋圖譜在柚木無性系品種鑒定上的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于:利用柚木無性系指紋圖譜進(jìn)行柚木品種鑒別；依據(jù)15對柚木SSR多態(tài)性引物的檢測結(jié)果進(jìn)行判定:利用權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，提取未知柚木無性系的基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物上測序儀分型，獲得每對引物擴(kuò)增出的SSR片段的大小，若與上述柚木無性系指紋圖譜中的片段完全一致，即獲得該未知柚木無性系的`品系名稱。
【文檔編號】C12Q1/68GK103725785SQ201410010871
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月9日
【發(fā)明者】黃桂華, 梁坤南, 周再知, 馬華明 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所