一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，包括以下步驟：（1）種子制備：將釀酒酵母接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液；（2）發(fā)酵培養(yǎng)：將步驟（1）中的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后加入無(wú)菌的氧載體，氧載體的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.5～10%，發(fā)酵得到谷胱甘肽。本發(fā)明通過(guò)在培養(yǎng)基中加入合適的氧載體，在沒(méi)有添加其它物質(zhì)，沒(méi)有額外能源消耗的條件下，大幅提高了培養(yǎng)基中的溶解氧濃度和細(xì)胞膜的通透性；本發(fā)明的載體在工藝中不僅起到氧載體的作用，同時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性，可成功實(shí)現(xiàn)明顯提高表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的，縮短了發(fā)酵周期，提高了生產(chǎn)效率。
【專利說(shuō)明】一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種微生物發(fā)酵方法，尤其涉及的是一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]谷胱甘肽(GSH)是一種由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽化合物，是生物體內(nèi)一種重要的生理活性物質(zhì)，特別對(duì)維持生物體內(nèi)氧化還原環(huán)境起到十分重要的作用。谷胱甘肽是屬于含有巰基的、小分子肽類物質(zhì)，具有兩種重要的抗氧化作用和整合解毒作用。谷胱甘肽分子結(jié)構(gòu)中半胱氨酸上的巰基為其活性基團(tuán)，故谷胱甘肽常簡(jiǎn)寫(xiě)為GSH，易與碘乙酸、芥子氣(一種毒氣)、鉛、汞、砷等重金屬鹽絡(luò)合，而具有了整合解毒作用。谷胱甘肽(尤其是肝細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽)具有非常重要的生理作用就是整合解毒作用，能與某些藥物(如撲熱息痛)、毒素(如自由基、重金屬)等結(jié)合，參與生物轉(zhuǎn)化作用，從而把機(jī)體內(nèi)有害的毒物轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，排泄出體外。它在臨床醫(yī)藥、食品工業(yè)、運(yùn)動(dòng)營(yíng)養(yǎng)上的應(yīng)用不斷增加，需求量不斷增加。在臨床上谷胱甘肽用于治療和預(yù)防腫瘤、肝炎及肝損傷、解毒、輻射病及輻射防護(hù)、抗過(guò)敏、改善某些疾病的病程和癥狀、養(yǎng)顏美容護(hù)膚、增加視力及眼科疾病和抗衰老等作用。在內(nèi)分泌調(diào)節(jié)的治療中效果明顯，并具有改善性功能、消除疲勞及抑制艾滋病病毒的作用。作為抗氧化劑在現(xiàn)代食品加工業(yè)中廣泛使用，并能增強(qiáng)食品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，改善食品風(fēng)味。
[0003]谷胱甘肽的另一主要生理作用是作為體內(nèi)一種重要的抗氧化劑，它能夠清除掉人體內(nèi)的自由基，清潔和凈化人體內(nèi)環(huán)境污染，從而增進(jìn)了人的身心健康。由于還原型谷胱甘肽本身易受某些物質(zhì)氧化，所以它在體內(nèi)能夠保護(hù)許多蛋白質(zhì)和酶等分子中的巰基不被如自由基等有害物質(zhì)氧化，從而讓蛋白質(zhì)和酶等分子發(fā)揮其生理功能。人體紅細(xì)胞中谷胱甘肽的含量很多，這對(duì)保護(hù)紅細(xì)胞膜上蛋白質(zhì)的巰基處于還原狀態(tài)，防止溶血保護(hù)紅細(xì)胞免遭氧化性破壞具有重要意義，而且還可以保護(hù)血紅蛋白不受過(guò)氧化氫氧化、自由基等氧化從而使它持續(xù)正常在發(fā)揮運(yùn)輸氧的能力。紅細(xì)胞中部分血紅蛋白在過(guò)氧化氫等氧化劑的作用下，其中二價(jià)鐵氧化為三價(jià)鐵，使血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，從而失去了帶氧能力。還原型谷胱甘肽既能直接與過(guò)氧化氫等氧化劑結(jié)合，生成水和氧化型谷胱甘肽，也能夠?qū)⒙勮F血紅蛋白還原為血紅蛋白，提聞體內(nèi)血紅蛋白的含量。
[0004]另外，維生素C也是體內(nèi)一種重要的抗氧化劑。由于維生素C能可逆地加氫或脫氫，故維生素C在體內(nèi)許多氧化還原反應(yīng)中有重要作用。例如，許多酶的活性基團(tuán)是巰基(-SH)，維生素C能夠維持-SH處于還原狀態(tài)而保持酶的活性；維生素C可以使氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型谷胱甘肽(GSH)，使機(jī)體代謝產(chǎn)生的過(guò)氧化氫(H2O2)還原；維生素C還可保護(hù)維生素A、E及某些B族維生素免受氧化。因此，運(yùn)用谷胱甘肽時(shí)，與維生素C并用，能夠提聞其功效。
[0005]GSH對(duì)于放射線、放射性藥物或由于抗腫瘤藥物引起的白細(xì)胞減少等癥狀能起到保護(hù)作用。GSH能與進(jìn)入機(jī)體的有毒化合物、重金屬離子或致癌物質(zhì)等相結(jié)合，并促其排出體外，起到中和解毒作用。SH還可保護(hù)細(xì)胞膜，使之免遭氧化性破壞，防止紅細(xì)胞溶血及促進(jìn)高鐵血紅蛋白的還原，對(duì)缺氧血癥、惡心及肝臟疾病引起的不適具有緩解作用。最新研究還表明，GSH能夠糾正乙酰膽堿、膽堿酯酶的不平衡，起到抗過(guò)敏作用，還可防止皮膚老化及色素沉著，減少黑色素的形成，改善皮膚抗氧化能力并使皮膚產(chǎn)生光澤，另外，GSH在治療眼角膜病及改善性功能方面也有很好作用。谷胱甘肽具有的廣譜解毒作用，不僅可用于藥物，更可作為功能性食品的基料，在延緩衰老、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤等功能性食品廣泛應(yīng)用，隨著肽類物質(zhì)研究的不斷深入，肽類物質(zhì)具有的神奇功能不斷發(fā)現(xiàn)，對(duì)人體的健康事業(yè)發(fā)揮越來(lái)越大的作用。
[0006]第一個(gè)谷胱甘肽制備專利發(fā)表在1938年，隨后各國(guó)科學(xué)家對(duì)它的生產(chǎn)開(kāi)發(fā)進(jìn)行了大量研究。總的說(shuō)來(lái)生產(chǎn)谷胱甘肽的方法有萃取法、化學(xué)合成法、酶轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法。萃取法是從含GSH的動(dòng)植物中提取。由于含量太低此方法沒(méi)有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。化學(xué)合成法曾用于早期GSH生產(chǎn)，但工藝復(fù)雜，得到的產(chǎn)品為混旋體，分離困難，產(chǎn)品純度不高。酶轉(zhuǎn)化法目前還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。在目前的4種方法中微生物發(fā)酵法最具有潛力。
[0007]微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GSH在我國(guó)研究主要是從上世紀(jì)90年代開(kāi)始的，取得了一些成績(jī)，但國(guó)內(nèi)發(fā)酵水平一直停留在2~3g/L，如:中國(guó)專CN200710036925.1公開(kāi)的發(fā)酵法合成谷胱甘肽的方法。雖然中國(guó)專利CN200810019761.6 一種谷胱甘肽的發(fā)酵工藝，也公開(kāi)了利用經(jīng)過(guò)基因工程改造甲醇利用型酵母生產(chǎn)谷胱甘肽的方法，谷胱甘肽產(chǎn)量可以達(dá)到
6.6g/L，但與國(guó)際水平7~10g/L (日本協(xié)和發(fā)酵)還有較大的距離。近年來(lái)，利用發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的報(bào)道較多，發(fā)酵水平也逐漸提高。例如譚天偉等人在Process Biochemistry(2006) 41:2424~2428中利用啤酒酵母高密度發(fā)酵，通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中加入前體氨基酸，發(fā)酵液中菌體干重達(dá)到了 140g/L，谷胱甘肽的濃度達(dá)到了 2190mg/L。發(fā)酵法生產(chǎn)的谷胱甘肽多存在于微生物的胞內(nèi)，所以在提高谷胱甘肽含量的同時(shí)，產(chǎn)物還原性谷胱甘肽對(duì)Y -L-谷氨酰基-L-半胱氨酸合成酶的反饋抑制也在加重，限制了谷胱甘肽產(chǎn)量的進(jìn)一步提高。另外，發(fā)酵過(guò)程中的菌體細(xì)胞通透性不好，使得加入的底物氨基酸很難進(jìn)入胞內(nèi)用于合成谷胱甘肽，導(dǎo)致谷胱甘肽相對(duì)于所加入的氨基酸的得率不高，且發(fā)酵生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)率低，也不利于產(chǎn)物的分離提取。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，利用氧載體促進(jìn)釀酒酵母高密度發(fā)酵。
[0009]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟:
[0010](I)種子制備:將釀酒酵母接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液；
[0011](2)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(1)中的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，然后加入無(wú)菌的氧載體，氧載體的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.5~10%，發(fā)酵得到谷胱甘肽。
[0012]所述步驟(1)中，在種子培養(yǎng)基中加入氧載體，所述氧載體的加入量為種子培養(yǎng)基體積的I~8%。在種子培養(yǎng)基中加入氧載體，一方面提高細(xì)胞膜的通透性，另一方面提高供體能量，增加系統(tǒng)整體的供氧能力。
[0013]所述步驟(1)中，釀酒酵母在種子培養(yǎng)基中，30~40°C，150~200rpm恒溫培養(yǎng)10~15小時(shí)。
[0014]所述步驟(1)中，種子培養(yǎng)基為:酵母提取物5~10g/L、蛋白胨10~20g/L、葡萄糖5~20g/L，pH=7, pH值采用氨水調(diào)節(jié)。
[0015]所述步驟(2)中，將步驟(1)得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30~40°C，200~300rpm，在發(fā)酵罐中加入無(wú)菌的氧載體，氧載體的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.5~10%，恒溫培養(yǎng)，控制溶解氧30~50%，流加葡萄糖100~500g/L維持菌體生長(zhǎng)，待菌體密度達(dá)到0D600nm=50以上，加入前體氨基酸L-谷氨酸5~30mmol/L、L_半胱氨酸5~20mmol/L和甘氨酸5~30mmol/L,最終發(fā)酵得到谷胱甘肽。
[0016]所述步驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖70g，酵母提取物20g，氯化鈣0.2g，磷酸二氫鉀5g,硫酸鎂IOg,無(wú)機(jī)離子溶液Iml,水1000ml,pH7,流加用葡萄糖100~500g/L,pH值采用氨水調(diào)節(jié)。
[0017]所述無(wú)機(jī)離子溶液的制備方法為:在1000ml蒸餾水中，加入以下物質(zhì)配制而成=ZnCl20.65 ~0.70g、MnCl2I0.10 ~10.20g、H3BO30.05 ~0.07g、CuCl20.45 ~0.50g、FeCl35.2 ~5.6g,CoCl2Il ~15g、(NH4)6Mo7O24.4Η200.23 ~0.27g、3mol/LH2S0418 ~22ml。
[0018]所述步驟(2)中，氧載體為正十二烷、正己烷或大豆油中的一種或多種的混合物。
[0019]本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明通過(guò)在培養(yǎng)基中加入合適的氧載體，在沒(méi)有添加其它物質(zhì)，沒(méi)有額外能源消耗的條件下，大幅提高了培養(yǎng)基中的溶解氧濃度和細(xì)胞膜的通透性，并且不會(huì)影響菌種的催化能力，改變了細(xì)胞與環(huán)境進(jìn)行物質(zhì)交換的過(guò)程，從而促進(jìn)釀酒酵母高密度發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束時(shí)靜置分層回收氧載體循環(huán)再利用；本發(fā)明的載體在工藝中不僅起到氧載體的作用，同時(shí)提高細(xì)胞膜的通透性，可成功實(shí)現(xiàn)明顯提高表達(dá)產(chǎn)物產(chǎn)量的目的，縮短了發(fā)酵`周期，提高了生產(chǎn)效率。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0021]實(shí)施例1
[0022]本實(shí)施例包括以下步驟:
[0023](I)種子制備:取釀酒酵母接入種子培養(yǎng)基中，在30°C，攪拌速度150~200rpm條件下培養(yǎng)8h，然后轉(zhuǎn)入二代種子培養(yǎng)基中，條件為pH6.5~7，溫度30°C培養(yǎng)10~15小時(shí)，制備~ 級(jí)種子備用；
[0024]種子培養(yǎng)基為:酵母提取物5~10g/L、蛋白胨10~20g/L、葡萄糖5~20g/L，pH=7, pH值采用氨水調(diào)節(jié)；
[0025]本實(shí)施例中釀酒酵母為市面購(gòu)買而得，所述釀酒酵母由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心保存，其編號(hào)為CICC1898 ；
[0026](2)發(fā)酵培養(yǎng):將得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，200~300rpm，在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入無(wú)菌的氧載體正己烷，氧載體的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%恒溫培養(yǎng)，控制溶解氧30~50%，流加葡萄糖100g/L維持菌體生長(zhǎng)，pH值用氨水調(diào)節(jié)至7，菌體密度0D600nm=90，加入前體氨基酸L-谷氨酸20mmol/L、L-半胱氨酸20mmol/L、甘氨酸30mmol/L,最終發(fā)酵液中谷胱甘肽3g/L。
[0027]實(shí)施例2
[0028]本實(shí)施例中，氧載體正十二烷、正己烷和大豆油的混合物，加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.5%，最終發(fā)酵液中谷胱甘肽2.lg/L，其他實(shí)施方式和實(shí)施例1相同。實(shí)施例3
[0029]本實(shí)施例包括以下步驟:
[0030](I)種子制備:取釀酒酵母接入種子培養(yǎng)基中，在35°C,攪拌速度150~200rpm條件下培養(yǎng)8h，然后轉(zhuǎn)入二代種子培養(yǎng)基中，同時(shí)加入無(wú)菌的氧載體正十二烷，氧載體的加入量為種子培養(yǎng)基體積的8%，pH=7，溫度35°C培養(yǎng)10~15小時(shí)，制備二級(jí)種子備用；
[0031](2)發(fā)酵培養(yǎng):將得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，35°C，200~300rpm，在發(fā)酵罐中加入無(wú)菌的氧載體正十二烷，氧載體的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8%恒溫培養(yǎng)，控制溶解氧30~50%，流加葡萄糖500g/L維持菌體生長(zhǎng)，pH值用氨水調(diào)節(jié)至7，菌體密度0D600nm=120,加入前體氨基酸L-谷氨酸20mmol/L、L-半胱氨酸20mmol/L、甘氨酸20mmol/L，最終發(fā)酵液中谷胱甘肽6.5g/L。其他實(shí)施方式和實(shí)施例1相同。
[0032]實(shí)施例4
[0033]本實(shí)施例中，氧載體為正十二烷和大豆油的混合物，氧載體在步驟(1)的種子培養(yǎng)基內(nèi)加入量的種子培養(yǎng)基體積的3% ;在步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%，制得谷胱甘肽的濃度為7.2g/L。其他實(shí)施方式和實(shí)施例3相同。
[0034]實(shí)施例5
[0035]本實(shí)施例中，氧載體為正己烷和大豆油的混合物，氧載體在步驟(1)的種子培養(yǎng)基內(nèi)加入量的種子培養(yǎng)基體積的1% ;在步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的10%，制得谷胱甘肽的濃度為5.4g/L。其他實(shí)施方式和實(shí)施例3相同。
[0036]實(shí)施例6
[0037]本實(shí)施例中，氧載體為大豆油，氧載體在步驟(1)的種子培養(yǎng)基內(nèi)加入量的種子培養(yǎng)基體積的5% ;在步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的8%，制得谷胱甘肽的濃度為4.5g/L。其他實(shí)施方式和實(shí)施例3相同。
[0038]實(shí)施例7
[0039]本實(shí)施例中，沒(méi)有加入氧載體，其他實(shí)施方式和實(shí)施例1相同，制得的谷胱甘肽濃度為 1.5g/L。
[0040]由實(shí)施例1~7可以看出，加入氧載體后，制得的谷胱甘肽濃度顯著提高。
【權(quán)利要求】
1.一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)種子制備:將釀酒酵母接種到種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液； (2)發(fā)酵培養(yǎng):將步驟(1)中的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中,然后加入無(wú)菌的氧載體，氧載體的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.5~10%，發(fā)酵得到谷胱甘肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，在種子培養(yǎng)基中加入氧載體，所述氧載體的加入量為種子培養(yǎng)基體積的I~8%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，釀酒酵母在種子培養(yǎng)基中，30~40°C，150~200rpm恒溫培養(yǎng)10~15小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，其特征在于，所述步驟(1)中，種子培養(yǎng)基為:酵母提取物5~10g/L、蛋白胨10~20g/L、葡萄糖5~20g/L, pH=7, pH值采用氨水調(diào)節(jié)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，將步驟(1)得到的種子培養(yǎng)液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30~40°C, 200~300rpm，在發(fā)酵罐中加入無(wú)菌的氧載體，氧載體的加入量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的0.5~10%，恒溫培養(yǎng)，控制溶解氧30~50%，流加葡萄糖100~500g/L維持菌體生長(zhǎng)，待菌體密度達(dá)到0D600nm=50以上，加入前體氨基酸L-谷氨酸5~30mmol/L、L-半胱氨酸5~20mmol/L和甘氨酸5~30mmol/L,最終發(fā)酵得到谷胱甘肽。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，其特征在于，所述步 驟(2)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖70g，酵母提取物20g，氯化鈣0.2g,磷酸二氫鉀5g,硫酸鎂IOg,無(wú)機(jī)離子溶液Iml,水1000ml, pH7,流加用葡萄糖100~500g/L，pH值采用氨水調(diào)節(jié)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，其特征在于，所述無(wú)機(jī)離子溶液的制備方法為:在1000ml蒸餾水中，加入以下物質(zhì)配制而成=ZnCl20.65 ~0.70g、MnCl210.10 ~10.20g、H3BO30.05 ~0.07g、CuCl20.45 ~0.50g、FeCl3 5.2 ~5.6g、CoCl2 11 ~15g、(NH4) 6Μο7024.4H20 0.23 ~0.27g、3mol/LH2S04 18 ~22ml ο
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種利用氧載體提高釀酒酵母發(fā)酵液中谷胱甘肽效價(jià)的方法，其特征在于，所述氧載體 為正十二烷、正己烷或大豆油中的一種或多種的混合物。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK103757076SQ201410012170
【公開(kāi)日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月10日
【發(fā)明者】邵千飛, 汪德林, 崔秀云, 黃緒民 申請(qǐng)人:安徽立興化工有限公司